CN109527580A - 一种制备高活性益生菌粉末的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备高活性益生菌粉末的方法，包括：（1）确定所生产益生菌菌株的最适培养温度，即生长速率最高时的培养温度；（2）在益生菌培养过程中，在最适培养温度加3至6度的温度进行培养，提高益生菌对温度与氧气的耐受性；（3）将步骤（2）中培养得到的菌细胞悬液经离心处理弃掉培养液后收集菌细胞，将菌细胞兑保护载体，提升益生菌对于渗透压的耐受性，制备喷雾干燥进料液；（4）将进料液在喷雾干燥塔中进行喷雾干燥；（5）自喷雾干燥塔塔底收集所得干燥菌粉，得到所需要的益生菌粉末。本发明的制备高活性益生菌粉末的方法可以有效减少益生菌在喷雾干燥过程中的活性损失，提升干粉中益生菌的活性，操作方法简易，颗粒性能优良。
Description
技术领域
本发明涉及益生菌培养技术以及活性益生菌干粉制备技术，属于食品和生物工程领域，特别是涉及一种制备高活性益生菌粉末的方法。
背景技术
益生菌（Probiotics）是一类对宿主有益的活性微生物，是定植于人体肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称。益生菌是一种对人体健康有益的细菌，可直接作为食品添加剂服用，以改善人体内菌群的平衡。
随着社会的不断发展，这种较为特殊的保健品也越来越被人们所关注并使用。为保证到达肠道的益生菌数目能够发挥功效，我国乳酸菌标准明确规定酸奶中活菌的数量要达到106 cfu/mL，因此，生产具有高活性的益生菌产品尤为必要。
目前，市场上的益生菌产品分为两种形式，一种是液态，另一种是固体制剂，包括干粉、片剂等形式。同其他的液体益生菌产品相比，活性益生菌干粉具有运输成本低，保质期长且易于加工成其他产品的众多优势，市场上日益增大的需求更多地导向活性固态的益生菌制剂，代替液态益生菌产品。因此，制备益生菌干粉的必要性远远高于其他液态益生菌产品。
生产益生菌干粉的方法主要包括：冷冻干燥法、喷雾干燥法、流化床干燥法、真空干燥法、空气对流干燥法。传统制备益生菌粉末的方法主要为冷冻干燥，目前在益生菌制剂工业中仍在广泛使用。冷冻干燥是首先将细胞冷冻至冰点以下，然后在高真空的环境下将冷冻的水分经过升华脱去，该方法能使干燥后细胞活性保存长达 10-20 年，但其生产成本高，设备投资巨大，并且因冷冻干燥设备为间歇式批量生产，导致其产量较低。因此，工业生产中亟需一种生产成本较低，生产能力强，而且能够连续大量生产的活性益生菌制粉技术。
喷雾干燥的工作原理是将进料液雾化形成无数细小液滴，在喷雾塔中与热空气充分混合使溶剂快速蒸发，所形成的干颗粒通过自然沉降或旋风分离收集出塔。因此在喷雾干燥过程中，益生菌会在短时间内急剧升温脱水，暴露在热空气中，同时受到脱水胁迫、热胁迫、氧化胁迫等多种威胁，导致益生菌存活率较低。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种制备高活性益生菌粉末的方法，通过该方法进行干粉生产可以提升干粉中益生菌的活性。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：在益生菌菌体培养过程和干燥过程中提高菌体对于不利环境因素的耐受性，从而提供一种制备高活性益生菌粉末的方法，包括以下步骤：
（1）针对不同生长培养基，确定所培养菌株的最适生长温度，即生长速率最高时的培养温度，此步骤包括以下具体分步骤：
（a）分别采用LGG鼠李糖乳杆菌、LC干酪乳杆菌、LL乳酸乳球菌作为益生菌菌株；
（b）制作不同的培养基，将固含量为5.2%的MRS培养基在 121℃下进行15-20 min的高温蒸汽灭菌，作为一种待使用的培养基；将固含量在10%左右的脱脂奶或复原脱脂奶RSM作为培养基在105℃下进行10 min的高温蒸汽灭菌，作为一种待使用的培养基；将固含量为4.23%的 M17培养基在 121℃下高温蒸汽灭菌15-20 min后作为一种待使用的培养基；
（c）将LGG鼠李糖乳杆菌在MRS培养基中分别在不同的温度条件下培养24小时，对比生长曲线，测得LGG鼠李糖乳杆菌生长速率最高的培养温度为37℃；
（d）将LC干酪乳杆菌在脱脂奶或复原脱脂奶RSM培养基中分别在不同的温度条件下培养24小时，对比生长曲线，测得LC干酪乳杆菌生长速率最高的培养温度为37℃；
（e）将LL乳酸乳球菌分别在脱脂奶或复原脱脂奶RSM培养基以及M17培养基中，分别在在不同的温度条件下培养24小时，对比生长曲线，测得LL乳酸乳球菌生长速率最高的培养温度为30℃；
（2）将步骤（c）中培养制得的LGG鼠李糖乳杆菌转接入新鲜MRS培养基，接种量为1-5%（v/v），在40-43℃温度条件下培养24小时，提高LGG鼠李糖乳杆菌对温度与氧气的耐受性；将步骤（d）中培养制得的LC干酪乳杆菌转接入新鲜脱脂奶或复原脱脂奶RSM培养基，接种量为1-5%（v/v），在40-43℃温度条件下培养24小时，提高LC干酪乳杆菌对温度与氧气的耐受性；将步骤（e）中培养制得的LL乳酸乳球菌分别转入复原脱脂奶RSM培养基或M17培养基中，接种量为1-5%（v/v），在33-36℃温度条件下培养24小时，提高LL乳酸乳球菌对温度与氧气的耐受性；
（3）制备喷雾干燥保护载体，将脱脂奶粉溶于蒸馏水中，制备固含量为25-45%（w/w）的保护载体溶液；
（4）将步骤（2）中在MRS与M17培养基中培养得到的LGG鼠李糖乳杆菌与LL乳酸乳球菌细胞悬液离心处理，弃掉培养液后收集菌细胞，将菌细胞分别兑入配好的保护载体，分别制备喷雾干燥进料液；对于采用脱脂奶或复原脱脂奶RSM培养得到的LC干酪乳杆菌与LL乳酸乳球菌，无须离心处理，直接往菌细胞悬液中兑入保护载体，制备每株菌的喷雾干燥进料液，并控制最终进料液的固体含量在25-45%（w/w）；
（5）将每种进料液在顺流式喷雾干燥塔中分别进行喷雾干燥，雾化器与热空气入口均置于塔顶，控制喷雾干燥塔的出口温度在45-65 °C之间，进口温度在100-150 °C，雾化液滴大小20-200 μm，雾化液滴在塔内的停留时间为5-50 s；
（6）自喷雾干燥塔塔底收集所得干燥菌粉，得到所需要的益生菌粉末。
在本发明一个较佳实施例中，在步骤（2）中采用MRS培养基，在40-43度下培养LGG鼠李糖乳杆菌菌体；采用复原脱脂奶培养基，在40-43度下培养LC干酪乳杆菌，优选40℃；分别采用M17培养基和复原脱脂奶培养基，在33-36℃下培养LL乳酸乳球菌，优选34℃。在进行步骤（3）与（4）之前，模拟喷雾干燥过程中菌体受到的热胁迫，分别取少量步骤（1）和步骤（2）中的LGG鼠李糖乳杆菌、LC干酪乳杆菌、LL乳酸乳球菌，将它们分别放置在60℃的水中进行水浴加热处理，加热处理时间为2-10 min，加热后将它们分别放置在常温水中进行冷却，然后分别测定残余益生菌的活性，计算两个步骤所培养出的菌体在同样热处理条件下的存活率，以此判断益生菌培养后对温度的耐受性提升情况。结果显示，经提升温度后培养的三株菌在热处理后的存活率相较最适温度下培养的菌株可提升25%-75%左右。
在本发明一个较佳实施例中，步骤（4）中采用固体含量为25-45%的复原脱脂奶作为保护载体溶液。
在本发明一个较佳实施例中，步骤（4）中将离心得到的LGG鼠李糖乳杆菌与LL乳酸乳球菌细胞兑入复原脱脂奶保护载体溶液，将复原脱脂奶RSM培养基中培养得到的LC干酪乳杆菌与LL乳酸乳球菌菌悬液直接与复原脱脂奶保护载体溶液混合，使菌细胞在液态保护载体中均匀分散，菌细胞数在载体干重中含量在107-1010 cfu/g间。
在本发明一个较佳实施例中，步骤（6）中所得干燥菌粉的含水量在3-4.5%之间。
在本发明一个较佳实施例中，当步骤（6）中所得干燥菌粉的含水量高于4.5%时，则进一步对干燥菌粉进行流化床干燥，通过温度居于20-40 °C区间的凉风使干燥菌粉进一步脱水，直至干燥菌粉的颗粒含水量达到2.5-4.5%。
在本发明一个较佳实施例中，所得菌粉中含有活益生菌为107-1010 cfu/g，颗粒的主要成分为脱脂奶固体，脱脂奶固体占粉体总量的质量分数不小于60%w/w。
在本发明一个较佳实施例中，将步骤（6）中所得的干燥菌粉密封在避光干燥容器中，于室温、冷藏或冷冻条件下存储，可实现长时间的活性保存。
本发明的有益效果是：本发明的制备高活性益生菌粉末的方法通过改变培养条件与干燥条件的方法提升菌体自身耐受性，有效保护多种益生菌在经过喷雾干燥制粉后的菌体活性，有效减少益生菌在喷雾干燥过程中的活性损失，从而提升干粉中益生菌的活性，操作方法简易，通过调整益生菌生长温度、调整保护载体固含量、采用可增加细胞稳定性的保护载体三条途径，实现高活性益生菌粉的制备，不需加入其他生产加工步骤如菌体预适应操作，所得干粉性质与脱脂奶粉类似，具有优秀的复溶性、流动性与稳定性；是一种通用的高活性益生菌干粉的制备方法。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例：
一、培养基与喷雾干燥进料液的制备，包括：
（1）制备MRS培养基：将标准培养基MRS溶解于去离子水中，制备浓度为5.2%（w/w）的菌体生长培养基，121 °C高压蒸汽灭菌15-20 min后，于室温下冷却；
（2）制备M17培养基：将标准培养基M17溶解于去离子水中，制备浓度为4.23%（w/w）的菌体生长培养基，121 °C高压蒸汽灭菌15-20 min后，于室温下冷却；
（3）制备脱脂奶培养基：以市面上出售的成品脱脂奶作为培养基，通常固含量在9-10%（w/w）之间，于105 °C高压蒸汽灭菌10 min后，于室温下冷却；
（4）制备复原脱脂奶RSM培养基：将市面上出售的成品脱脂奶粉，溶解于去离子水中，制备浓度为10%（w/w）的复原奶，于105 °C高压蒸汽灭菌10 min后，于室温下冷却；
（5）制备保护载体，采用市面上出售的成品脱脂奶粉制备喷雾干燥保护载体，直接将奶粉溶解于无菌去离子水中，制备固含量为25-45%（w/w）的复原脱脂奶；
（6）对于MRS培养基或M17培养基培养得到的菌体，离心去除上清液后，直接兑入配制好的复原脱脂奶，制备固含量25-45%（w/w）、含菌量为107-1010 cfu/g载体干重的喷雾干燥进料液；
（7）对于以脱脂奶或复原脱脂奶作为培养基培养得到的菌体，无须离心，直接在培养液中兑入配制好的复原脱脂奶，制备固含量为25-45%（w/w）、含菌量为107-1010 cfu/g载体干重的喷雾干燥进料液。
二、对于不同菌株，确定采用不同培养基进行培养时益生菌生长速率最高的培养温度，包括以下具体分步骤：
（a）分别采用LGG鼠李糖乳杆菌、LC干酪乳杆菌、LL乳酸乳球菌作为益生菌菌株；
（b）将LGG鼠李糖乳杆菌在MRS培养基中分别在不同的温度条件下培养24小时，对比生长曲线，测得LGG鼠李糖乳杆菌活性最高的培养温度为37℃；
（c）将LC干酪乳杆菌在脱脂奶或复原脱脂奶RSM培养基中分别在不同的温度条件下培养24小时，对比生长曲线，测得LC干酪乳杆菌活性最高的培养温度为37℃；
（d）将LL乳酸乳球菌分别在脱脂奶或复原脱脂奶RSM培养基以及M17培养基中，分别在不同的温度条件下培养24小时，对比生长曲线，测得LL乳酸乳球菌活性最高的培养温度为30℃。
三、益生菌培养后的耐热性提升和活性测定：
在最适益生菌生长的温度加5摄氏度的条件下培养益生菌，24小时培养后，将5ml左右益生菌菌悬液放置入控温在60-64 °C的水浴锅中，静置2-4 min后取出于凉水中冷却，测定残余益生菌活性，计算存活率，所得结果如下：
对于每一菌株，在不同培养基中进行培养时，在最适生长温度加5度的条件下所培养得到的菌细胞，相较最适生长温度下培养得到的菌细胞，在经过相同热处理后，均出现显著的存活率升高，证实在升温条件下培养益生菌细胞，能够有效提升菌体耐受性。
四、制备喷雾干燥进料液、制备含有活鼠李糖乳杆菌LGG的益生菌粉末：
采用标准MRS培养基，在42℃下培养LGG细胞，所得到的细胞离心后，重悬在固含量30%（w/w）的复原脱脂奶保护载体中，控制菌细胞浓度为0.5-1.1×109 cfu/g载体干重，通过喷雾干燥制粉。喷雾干燥条件为：进口温度在110 °C，出口温度55 °C,雾化液滴大小约150 μm，所得到的粉末中活LGG含量为0.5-1.1×109 cfu/g粉体干重，菌体存活率为80-100%。
采用标准MRS培养基，在37℃下培养LGG细胞，所得到的细胞离心后，重悬在固含量10%（w/w）的复原脱脂奶保护载体中，控制菌细胞浓度为0.5-1.1×109 cfu/g载体干重，通过喷雾干燥制粉。喷雾干燥条件为：进口温度在110 °C，出口温度55 °C,雾化液滴大小约150 μm，所得到的粉末中活LGG含量为0.2-0.5×109 cfu/g粉体干重，菌体存活率为30-45%。
采用标准MRS培养基，在37℃下培养LGG细胞，所得到的细胞离心后，重悬在固含量10%（w/w）的乳糖溶液载体中，控制菌细胞浓度为0.5-1.1×109 cfu/g载体干重，通过喷雾干燥制粉。喷雾干燥条件为：进口温度在110 °C，出口温度55 °C,雾化液滴大小约150 μm，所得到的粉末中活LGG含量为0.2-0.5×108 cfu/g粉体干重，菌体存活率为3-10%。
五、制备喷雾干燥进料液、制备含有活干酪乳杆菌LC的益生菌粉末：
采用脱脂奶粉在40℃下培养LC细胞，所得到的细胞离心后，重悬在固含量30%（w/w）的复原脱脂奶保护载体中，控制菌细胞浓度为0.8-1.2×108 cfu/g载体干重，通过喷雾干燥制粉。喷雾干燥条件为：进口温度在110 °C，出口温度55 °C，雾化液滴大小约150 μm，所得到的粉末中活LC含量为0.5-0.75×108 cfu/g粉体干重，存活率为50-80%。
六、制备喷雾干燥进料液、制备含有活乳酸乳球菌LL的益生菌粉末：
采用标准M17培养基，在34 ℃下培养LL细胞，所得到的细胞离心后，重悬在固含量30%（w/w）的复原脱脂奶保护载体中，控制菌细胞浓度为0.8-1.2×108 cfu/g载体干重，通过喷雾干燥制粉。喷雾干燥条件为：进口温度在105 °C，出口温度52 °C，雾化液滴大小约150 μm，所得到的粉末中活LC含量为0.6-0.8×108cfu/g粉体干重，存活率为60-90%。
本发明的益生菌粉末制备方法具有以下优点：
（1）有效保护多种益生菌在经过喷雾干燥制粉后的菌体活性，有效减少益生菌在喷雾干燥过程中的活性损失，存活率普遍保持在50-100%，干粉中菌体活性可达107-1010 cfu/g粉体干重；
（2）操作方法简易，通过调整益生菌生长温度、调整载体固含量、和采用可增加细胞稳定性的保护载体三条途径，提升菌体对于不利环境因素的耐受性，实现高活性益生菌粉的制备，不需加入其他生产步骤如菌体预适应操作；
（3）本方法采用脱脂奶做载体时，所得干粉性质与脱脂奶粉类似，具有优秀的复溶性、流动性与稳定性；
（4）保护载体的配方可更改，这种制备方法允许在以脱脂奶固体作为主要保护组分时，往保护载体溶液中加入其他组分，以适应特定菌种的需要；
（5）采用脱脂奶或复原脱脂奶作为菌体生长的培养基时，可以向培养好的菌悬液中直接兑入脱脂奶，进一步去掉离心这步加工操作。
本发明通过提升培养温度、提升保护载体固含量、和采用脱脂奶固体作为主要保护组分三种方式，提高喷雾干燥后所得干粉中的益生菌活性。对粉体中所含有的活益生菌进行计数表明，采用本发明中阐述的生产技术制备得到的益生菌干粉菌体活性高达108-1010 cfu/g载体干重，适用于工业中大批量生产活性益生菌干粉。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (8)
1.一种制备高活性益生菌粉末的方法，其特征在于在菌体培养与喷雾干燥过程中提高菌体自身耐受性，从而提升所得干粉中益生菌的活性，包括以下步骤：
（1）针对不同生长培养基，确定所培养菌株的最适生长温度，即生长速率最高时的培养温度，此步骤包括以下具体分步骤：
（a）分别采用LGG鼠李糖乳杆菌、LC干酪乳杆菌、LL乳酸乳球菌作为益生菌菌株；
（b）制作不同的培养基，将固含量为5.2%的MRS培养基在 121℃下进行15-20 min的高温蒸汽灭菌，作为一种待使用的培养基；将固含量在10%左右的脱脂奶或复原脱脂奶RSM作为培养基在105℃下进行10 min的高温蒸汽灭菌，作为一种待使用的培养基；将固含量为4.23%的 M17培养基在 121℃下高温蒸汽灭菌15-20 min后作为一种待使用的培养基；
（c）将LGG鼠李糖乳杆菌在MRS培养基中分别在不同的温度条件下培养24小时，对比生长曲线，测得LGG鼠李糖乳杆菌生长速率最高的培养温度为37℃；
（d）将LC干酪乳杆菌在脱脂奶或复原脱脂奶RSM培养基中分别在不同的温度条件下培养24小时，对比生长曲线，测得LC干酪乳杆菌生长速率最高的培养温度为37℃；
（e）将LL乳酸乳球菌分别在脱脂奶或复原脱脂奶RSM培养基以及M17培养基中，分别在不同的温度条件下培养24小时，对比生长曲线，测得LL乳酸乳球菌生长速率最高的培养温度为30℃；
（2）将步骤（c）中培养制得的LGG鼠李糖乳杆菌转接入新鲜MRS培养基，接种量为1-5%（v/v），在40-43℃温度条件下培养24小时，提高LGG鼠李糖乳杆菌对温度与氧气的耐受性；将步骤（d）中培养制得的LC干酪乳杆菌转接入新鲜脱脂奶或复原脱脂奶RSM培养基，接种量为1-5%（v/v），在40-43℃温度条件下培养24小时，提高LC干酪乳杆菌对温度与氧气的耐受性；将步骤（e）中培养制得的LL乳酸乳球菌分别转入复原脱脂奶RSM培养基或M17培养基中，接种量为1-5%（v/v），在33-36℃温度条件下培养24小时，提高LL乳酸乳球菌对温度与氧气的耐受性；
（3）制备喷雾干燥保护载体，将脱脂奶粉溶于蒸馏水中，制备固含量为25-45%（w/w）的保护载体溶液；
（4）将步骤（2）中在MRS与M17培养基中培养得到的LGG鼠李糖乳杆菌与LL乳酸乳球菌细胞悬液离心处理，弃掉培养液后收集菌细胞，将菌细胞分别兑入配好的保护载体，分别制备喷雾干燥进料液；对于采用脱脂奶或复原脱脂奶RSM培养得到的LC干酪乳杆菌与LL乳酸乳球菌，无须离心处理，直接往菌细胞悬液中兑入保护载体，制备每株菌的喷雾干燥进料液，并控制最终进料液的固体含量在25-45%（w/w）；
（5）将每种进料液在顺流式喷雾干燥塔中分别进行喷雾干燥，雾化器与热空气入口均置于塔顶，控制喷雾干燥塔的出口温度在45-65 °C之间，进口温度在100-150 °C，雾化液滴大小20-200 μm，雾化液滴在塔内的停留时间为5-50 s；
（6）自喷雾干燥塔塔底收集所得干燥菌粉，得到所需要的益生菌粉末。
2.根据权利要求1所述的制备高活性益生菌粉末的方法，其特征在于，在步骤（2）完成之后，在进行步骤（3）与（4）之前，对培养得到的LGG鼠李糖乳杆菌、LC干酪乳杆菌、LL乳酸乳球菌进行热耐受性测试，得到益生菌存活率增加的结果。
3.根据权利要求1所述的制备高活性益生菌粉末的方法，其特征在于，步骤（3）中采用脱脂奶或复原脱脂奶作为保护载体，保护载体中脱脂奶固体占载体总固含量不小于60%w/w。
4.根据权利要求1所述的制备高活性益生菌粉末的方法，其特征在于，步骤（4）中将保护载体与菌细胞混合后，最终制得的喷雾干燥进料液中保护载体的固含量质量分数为25-45%，在混合时使培养好的菌细胞在液态保护载体中均匀分散，控制菌细胞数在载体干重中含量在107-1010 cfu/g间。
5.根据权利要求1所述的制备高活性益生菌粉末的方法，其特征在于，步骤（6）中所得干燥菌粉的含水量在2.5-4.5%之间。
6.根据权利要求1所述的制备高活性益生菌粉末的方法，其特征在于，若步骤（6）中所得干燥菌粉的含水量高于4.5%，则进一步对干燥菌粉进行流化床干燥，通过温度居于20-40°C区间的凉风使干燥菌粉进一步脱水，直至干燥菌粉的颗粒含水量达到2.5-4.5%。
7.根据权利要求1所述的制备高活性益生菌粉末的方法，其特征在于，所得菌粉中含有活益生菌为107-1010 cfu/g，颗粒的主要成分为脱脂奶固体，脱脂奶固体占粉体总量的质量分数不小于60%w/w。
8.根据权利要求1所述的制备高活性益生菌粉末的方法，其特征在于，将步骤（6）中所得的干燥菌粉密封在避光干燥容器中，于室温、冷藏或冷冻条件下存储，以长期保存粉体中益生菌的活性。
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