CN112841409B - 半固定化益生菌湿热淬灭生产后生元的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了半固定化益生菌湿热淬灭生产后生元的方法，包括以下步骤：将乳酸菌菌株通过MRS培养基进行培养，得到乳酸菌发酵液；将乳酸菌发酵液浓缩至菌液浓度为1×1011cfu/g；将乳酸菌浓缩液与大豆纤维粉混合，得到混合物；采用蒸汽湿热灭菌法对混合物进行灭活处理得到灭活混合物；对灭活混合物进行急速冷却，使混合物的温度在1～3min内降至常温；将冷却灭活混合物干燥直至水分在8～10％。本发明能够生产出具有益生功能、保存期长的后生元产品。同时，通过湿热淬灭、急速冷却技术，能够减少菌体裂解与变性，保持菌体的完整性。另外，湿基热传导性高，后期干燥成本低，松散便于加工。
Description
技术领域
本发明属于微生物制剂领域，涉及一种半固定化益生菌湿热淬灭技术生产后生元的方法。
背景技术
随着经济的发展，人们的生活水平不断提高，功能性食品的开发越来越受到人们的重视。益生菌，也称为活菌制剂，能够促进肠内菌群生态平衡、排斥与竞争病原菌在消化道上皮细胞定殖，与病原菌竞争营养物质，产生抗菌产物，改善肠道内环境与维护黏膜屏障功能，激活宿主免疫反应、增强机体免疫功能。但在实际应用过程中，由于益生菌对外环境抵抗力差，在运输、储藏和应用过程中会出现大量死亡，严重影响微生物制剂的效价。
后生元是指益生菌经加工处理后的益生菌代谢物成分统称，包括微生物细胞、细胞成分和代谢产物。后生元属于灭活益生菌，菌本身自带有益代谢物。灭活菌并不等同于死菌，死菌是细菌细胞破裂，没有完整结构导致功效丧失，而通过特殊灭活技术生产的后生元可使细菌保留有益菌原有结构及特性，只是不具备生长繁殖能力。后生元的益生功能包括但不限于维持肠道菌群稳定、保护肠道上皮屏障功能、免疫调节作用、抗肿瘤及抗氧化作用等。总之，后生元具有益生菌无法比拟的优点，包括明确的化学结构、安全的剂量参数和更长的保存期、以及更好的吸收性、代谢性和机体分布性。使用后生元可以在获得益生菌类似益生功效的同时，避免了活菌本身生物利用度低、效果不稳定、保存期短等问题。同时，后生元可不受温度环境影响，更易存储运输，而且更能承受胃液、消化酶、胆汁对菌体的破坏性，从而对人体健康作用更加显著。但是后生元属于近年来新兴的概念，目前现有关于后生元制备方法的相关报道较少。所以，现在需要一种能够生产出具有益生功能、保存期长的后生元的制备方法。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种半固定化益生菌湿热淬灭技术生产后生元的方法，通过本发明的方法，能够生产出具有益生功能、保存期长的后生元产品。同时，通过湿热淬灭、急速冷却技术，能够减少菌体裂解与变性，保持菌体的完整性。另外，湿基热传导性高，后期干燥成本低，松散便于加工。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供半固定化益生菌湿热淬灭生产后生元的方法，包括以下步骤：
(1)乳酸菌发酵液的制备：将乳酸菌菌株通过MRS培养基进行培养，得到乳酸菌发酵液；
(2)发酵液离心浓缩：将乳酸菌发酵液离心浓缩至菌液浓度为1×1011cfu/g，得到乳酸菌浓缩液；
(3)乳酸菌吸附固定：将乳酸菌浓缩液与大豆纤维粉混合，得到混合物；
(4)蒸汽湿热淬灭活性：采用蒸汽湿热灭菌法对混合物进行灭活处理得到灭活混合物；
(5)快速冷却：对灭活混合物进行急速冷却，使混合物的温度在1～3min内降至常温得到冷却灭活混合物；
(6)低温干燥：将冷却灭活混合物干燥直至水分在8～10％。
优选的，步骤(1)中，所述乳酸菌为植物乳杆菌，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号：CICC 6076。
优选的，步骤(2)中，所述离心采用碟式离心机，碟式离心机的转速为7000rpm/min。
优选的，步骤(3)中，所述乳酸菌发酵液与大豆纤维粉的质量比为(2～2.5):(1～1.2)。
优选的，步骤(4)中，所述蒸汽湿热灭菌法的处理温度为100℃，时间为5～10min，同时进行搅拌和气流沸腾，保证蒸汽和物料快速均匀结合。
优选的，步骤(5)中，所述急速冷却为：通过液氮、干冰或冰水同时通入冷风进行急速冷却。
优选的，步骤(6)中，所述干燥采用沸腾干燥机，干燥的温度为60～65℃。
本发明的第二方面，提供上述方法制备得到的后生元，所述后生元吸附于大豆纤维粉上。
本发明的第三方面，提供后生元作为饲料添加剂在提高动物免疫力中的应用。
本发明的有益效果：
1.本发明的方法能够保持菌体完整，减少菌体裂解。
2.本发明的方法能够与益生菌代谢产物一并处理；以大豆纤维粉为载体进行蒸汽湿热灭菌，通过升温方式的选择和快速降温来减少后生元的变性和结构变化；采用大豆纤维粉为载体，湿基热传导性快，后期干燥成本低。将载体、升温方式、快速降温进行有机结合，避免了后生元在升温和降温中的结构变化，保留有效成分。
3.本发明得到的后生元与一般活菌不同，它包含丰富的代谢产物，能够维持肠道菌群稳定，保护肠道上皮屏障功能；能快速提升肠道免疫，且耐热、耐酸、耐久存、耐加工，活性稳定不会受外在环境变化而失活，而且更能承受胃液、消化酶、胆汁对菌体的破坏性。本发明的后生元以大豆纤维粉为载体，作为饲料添加剂加入饲料中，大豆纤维粉可以为动物提供蛋白质，同时后生元可提高动物的免疫力。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
实施例1
(1)乳酸菌发酵液的制备：将乳酸菌菌株活化、纯化后，通过MRS培养基进行培养，得到乳酸菌发酵液。
(2)发酵液离心浓缩：将乳酸菌发酵液经碟式离心机离心浓缩至菌液浓度为1×1011cfu/g，得到乳酸菌浓缩液。
(3)乳酸菌吸附固定：将乳酸菌浓缩液与大豆纤维粉按照2：1比例混合，得到混合物。
(4)蒸汽湿热淬灭活性：采用蒸汽湿热灭菌法在100℃下对混合物进行灭活处理5min。
(5)快速冷却：通过液氮同时通入冷风的方式对灭活的混合物进行急速冷却，使混合物的温度在2min内快速降至常温。
(6)低温干燥：将混合物63℃沸腾干燥直至水分在9％。
实施例2
(1)乳酸菌发酵液的制备：将乳酸菌菌株活化、纯化后，通过MRS培养基进行培养，得到乳酸菌发酵液。
(2)发酵液离心浓缩：将乳酸菌发酵液经碟式离心机离心浓缩至菌液浓度为1×1011cfu/g，得到乳酸菌浓缩液。
(3)乳酸菌吸附固定：将乳酸菌浓缩液与大豆纤维粉按照2.5：1比例混合，得到混合物。
(4)蒸汽湿热淬灭活性：采用蒸汽湿热灭菌法在100℃下对混合物进行灭活处理10min。
(5)快速冷却：通过干冰同时通入冷风的方式对灭活的混合物进行急速冷却，使混合物的温度在3min内快速降至常温。
(6)低温干燥：将混合物65℃沸腾干燥直至水分在8％。
实施例3
(1)乳酸菌发酵液的制备：将乳酸菌菌株活化、纯化后，通过MRS培养基进行培养，得到乳酸菌发酵液。
(2)发酵液离心浓缩：将乳酸菌发酵液经碟式离心机离心浓缩至菌液浓度为1×1011cfu/g，得到乳酸菌浓缩液。
(3)乳酸菌吸附固定：将乳酸菌浓缩液与大豆纤维粉按照2：1.2比例混合，得到混合物。
(4)蒸汽湿热淬灭活性：采用蒸汽湿热灭菌法在100℃下对混合物进行灭活处理7.5min。
(5)快速冷却：通过冰水同时通入冷风的方式对灭活的混合物进行急速冷却，使混合物的温度在1min内快速降至常温。
(6)低温干燥：将混合物60℃沸腾干燥直至水分在10％。
对比例1
(1)乳酸菌发酵液的制备：将乳酸菌菌株活化、纯化后，通过MRS培养基进行培养，得到乳酸菌发酵液。
(2)发酵液离心浓缩：将乳酸菌发酵液经碟式离心机离心浓缩至菌液浓度为1×1011cfu/g，得到乳酸菌浓缩液。
(3)乳酸菌吸附固定：将乳酸菌浓缩液与大豆纤维粉按照2：1比例混合，得到混合物。
(4)蒸汽湿热淬灭活性：采用蒸汽湿热灭菌法在100℃下对混合物进行灭活处理25min。
(5)快速冷却：通过自然冷却的方式对灭活的混合物进行冷却，使混合物的温度降至常温。
(6)低温干燥：将混合物63℃沸腾干燥直至水分在9％。
对比例2
(1)乳酸菌发酵液的制备：将乳酸菌菌株活化、纯化后，通过MRS培养基进行培养，得到乳酸菌发酵液。
(2)发酵液离心浓缩：将乳酸菌发酵液经碟式离心机离心浓缩至菌液浓度为1×1011cfu/g，得到乳酸菌浓缩液。
(3)乳酸菌吸附固定：将乳酸菌浓缩液与大豆纤维粉按照2：1比例混合，得到混合物。
(4)冷冻干燥：将混合物放入真空冷冻干燥机中快速冷冻，保留乳酸菌的活性。
对比例3
(1)乳酸菌发酵液的制备：将乳酸菌菌株活化、纯化后，通过MRS培养基进行培养，得到乳酸菌发酵液。
(2)发酵液离心浓缩：将乳酸菌发酵液经碟式离心机离心浓缩至菌液浓度为1×1011cfu/g，得到乳酸菌浓缩液。
(3)乳酸菌吸附固定：将乳酸菌浓缩液与大豆纤维粉按照2：1比例混合，得到混合物。
(4)蒸汽湿热淬灭活性：采用蒸汽湿热灭菌法在121℃下对混合物进行灭活处理5min。
(5)快速冷却：通过液氮同时通入冷风的方式对灭活的混合物进行急速冷却，使混合物的温度在2min内快速降至常温。
(6)低温干燥：将混合物63℃沸腾干燥直至水分在9％。
试验例1
对实施例1～3和对比例1～3制备的干燥后混合物添加到动物饲料中，验证在动物实验中的应用效果。
选择5周龄(体重20±0.5g)健康清洁级雄性昆明白鼠60只，随机分为6个处理，每个处理10只小鼠。对照组饲喂小鼠正常日粮，试验组在对照组的基础上，分别添加实施例1～3和对比例1～3制备的混合物。预饲期3天，使试验动物适应环境和日粮，正式期42天。正式期结束后处死小鼠，眼眶取血并解剖取脾脏、胸腺及小肠，测定器官指数、细胞因子及IgG、IgM、sIgA含量，所得结果见表1～3。
表1混合物对小鼠器官指数的影响
表2混合物对小鼠血清细胞因子的影响
| 组别 | TNF-α，ng/L | IFN-γ，ng/L | IL-6，ng/L | IL-18，ng/mL |
| 对照组 | 8.19 | 482.21 | 53.27 | 62.02 |
| 实施例1 | 9.56 | 494.18 | 58.36 | 63.04 |
| 实施例2 | 9.74 | 497.83 | 59.75 | 63.82 |
| 实施例3 | 9.46 | 506.42 | 58.20 | 64.12 |
| 对比例1 | 8.55 | 481.03 | 53.73 | 62.53 |
| 对比例2 | 9.03 | 490.82 | 54.43 | 62.79 |
| 对比例3 | 9.37 | 493.62 | 57.93 | 62.87 |
表3混合物对小鼠免疫球蛋白的影响
| 组别 | IgM，ug/mL | IgG，ug/mL | sIgA，ng/mg |
| 对照组 | 0.82 | 263.57 | 6.83 |
| 实施例1 | 0.99 | 277.61 | 7.57 |
| 实施例2 | 0.96 | 275.73 | 7.62 |
| 实施例3 | 0.98 | 278.78 | 7.60 |
| 对比例1 | 0.84 | 263.66 | 6.90 |
| 对比例2 | 0.89 | 266.81 | 6.95 |
| 对比例3 | 0.93 | 272.86 | 7.35 |
由表1～表3数据可知，小鼠饲粮中添加实施例1～3制备的后生元能够提高小鼠的免疫器官指数、细胞因子含量和小鼠血清IgM、IgG和肠道sIgA含量，增强小鼠免疫能力。
对比例1与实施例1相比，区别在于对比例1采用自然冷却的方式；对比例2与实施例1相比，区别在于对比例2将乳酸菌与大豆纤维混合后不经蒸汽湿热淬灭，直接将乳酸菌进行冷冻处理；对比例3与实施例1相比，区别在于对比例3的蒸汽湿热淬灭温度高于实施例1。由表1～3可知，采用自然冷却的方式其效果远低于快速冷却；乳酸菌的效果也低于后生元；蒸汽湿热淬灭的温度高，虽然能够对乳酸菌进行灭菌，但其产生的后生元效果不如本发明，温度高则耗能高，但其效果却低于实施例1。所以本发明的方法是通过对温度、冷却方式、后生元等多方面的研究得出的。
另外，对于大豆纤维对乳酸菌的吸附效果，发明人通过试验发现，当乳酸菌浓缩至菌液浓度为1×1011cfu/g，得到乳酸菌浓缩液时，其与大豆纤维按(2～2.5):(1～1.2)质量比进行混合，吸附效果最好。乳酸菌菌液浓度小于1×1011cfu/g，大豆纤维吸附的乳酸菌数量少，效果差；乳酸菌菌液浓度大于1×1011cfu/g，大豆纤维吸附乳酸菌的数量并没有增加，为了不浪费乳酸菌、增加生产成本，本发明将乳酸菌的浓度确定为1×1011cfu/g。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (2)
1.半固定化益生菌湿热淬灭生产后生元，其特征在于，由以下方法制备：
（1）乳酸菌发酵液的制备：将乳酸菌菌株活化、纯化后，通过MRS培养基进行培养，得到乳酸菌发酵液；
（2）发酵液离心浓缩：将乳酸菌发酵液经碟式离心机离心浓缩至菌液浓度为1×1011cfu/g，得到乳酸菌浓缩液；
（3）乳酸菌吸附固定：将乳酸菌浓缩液与大豆纤维粉按照2：1比例混合，得到混合物；
（4）蒸汽湿热淬灭活性：采用蒸汽湿热灭菌法在100℃下对混合物进行灭活处理5min；
（5）快速冷却：通过液氮同时通入冷风的方式对灭活的混合物进行急速冷却，使混合物的温度在2 min内快速降至常温；
（6）低温干燥：将混合物63℃沸腾干燥直至水分在9%。
2.权利要求1所述的后生元在制备提高动物免疫力的添加剂中的应用。
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