CN114794466B - 一种后生元及其精制方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种后生元及其精制方法，属于生物技术领域。该后生元的精制方法，包括以下步骤：S1、将嗜酸乳杆菌接入乳酸菌培养液中培养，在35‑39℃下培养得到第一发酵液，向所述第一发酵液中加入柠檬酸，之后在所述第一发酵液中加入嗜热链球菌继续在35‑39℃下培养得到第二发酵液；S2、将所述第二发酵液过滤得到上清液，将所述上清液浓缩得到浓缩液；S3、向所述浓缩液中加入明胶，之后在5‑10℃下冷藏得到第三发酵液；S4、将所述第三发酵液进行灭活处理。本发明还包括上述精制方法制得的后生元。该方法确保嗜酸乳杆菌数量的同时提高了抗菌肽的得率。

Description

一种后生元及其精制方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种后生元及其精制方法。
背景技术
后生元是益生菌经加工处理后的益生菌代谢物成分统称，包括菌体与代谢产物。近年来的研究发现，灭活的益生菌(non-viable probiotics)以及益生菌的溶胞产物(lysate)、提取产物或分离部分[被称为后生元(postbiotics)]具有相近于益生菌的功效，并且相较于益生菌具有更高的胃酸耐受性且更易于保存。
嗜酸乳杆菌作为乳酸菌的一种，在代谢过程产生很多抗菌物质，主要包括酸性物质、抗菌肽等，可有效抵抗食物变质和食源性病原微生物。抗菌肽具有广谱抗菌活性，对细菌有很强的杀伤作用，尤其是其对某些耐药性病原菌的杀灭作用更引起了人们的重视；提高后生元中的抗菌肽的含量是现有技术急需解决的技术问题，现有技术有通过向乳酸菌中添加沙门氏菌作为竞争关系促进抗菌肽的产生，但竞争过程中会影响乳酸菌的存活率，进而还是会影响抗菌肽的得率，如何在确保嗜酸乳杆菌数量的同时提高抗菌肽的得率是现有技术急需解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术不足，提供一种后生元及其精制方法，解决现有技术中如何确保嗜酸乳杆菌数量的同时提高抗菌肽的得率的技术问题。
我们在之前的研究过程中，通过控制温度的变化并加入水解蛋白和柠檬酸实现了确保嗜酸乳杆菌数量的同时提高抗菌肽的得率。但控制温度的升降增加了工艺的复杂程度，我们在查阅资料发现嗜热链球菌能够产生弹性胞外多糖，该多糖能够为微生物的培养提供营养物质，嗜热链球菌是否会协助嗜酸乳杆菌生成抗菌肽呢，基于此，我们进行了进一步研究并提出了以下技术方案。
为达到上述技术目的，本发明的技术方案提供一种后生元的精制方法，包括以下步骤：
S1、将嗜酸乳杆菌接入乳酸菌培养液中培养，在35-39℃下培养得到第一发酵液，向所述第一发酵液中加入柠檬酸，之后在所述第一发酵液中加入嗜热链球菌继续在35-39℃下培养得到第二发酵液；
S2、将所述第二发酵液过滤得到上清液，将所述上清液浓缩得到浓缩液；
S3、向所述浓缩液中加入明胶，之后在5-10℃下冷藏得到第三发酵液；
S4、将所述第三发酵液进行灭活处理。
进一步地，在步骤S4之后还包括：步骤S5、向灭活后的所述第三发酵液中加入壳聚糖，之后喷雾干燥得到后生元缓释胶囊。
进一步地，在步骤S5之后还包括：步骤S6、将嗜热链球菌粉、淀粉、水和后生元缓释胶囊混合，之后干燥得到所述后生元。
进一步地，在步骤S6中，所述嗜热链球菌粉、所述淀粉的质量比1:1-2，所述淀粉和所述水的质量比为1:0.1-0.3。
进一步地，在步骤S6中，所述嗜热链球菌粉和所述后生元缓释胶囊的质量比为1:1-2。
进一步地，在步骤S1中，所述柠檬酸的添加量为所述第一发酵液体积的0.1-0.5％，所述柠檬酸的浓度为0.3mol/L-0.5mol/L。
进一步地，在步骤S3中，所述明胶的加入量为所述浓缩液质量的0.5-1％。
进一步地，在步骤S1中，在35-39℃下培养1-2天得到第一发酵液。
进一步地，在步骤S1中，所述第一发酵液中加入所述嗜热链球菌继续在35-39℃下培养1-2天得到所述第二发酵液。
此外，本发明还提出一种后生元，由上述精制方法制备得到。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：将嗜酸乳杆菌接入乳酸菌培养液中培养，在35-39℃下培养得到第一发酵液，向所述第一发酵液中加入柠檬酸，柠檬酸的加入为后续嗜热链球菌的加入提供了稳定的生长环境，之后在所述第一发酵液中加入嗜热链球菌继续在35-39℃下培养得到第二发酵液，嗜热链球菌能够产生弹性胞外多糖，为嗜酸乳杆菌的培养提供营养物质，嗜热链球菌对嗜酸乳杆菌的培养具有协助作用，而且嗜热链球菌因为弹性胞外多糖的消耗也能促进嗜热链球菌生产更多的抗菌肽，进而确保嗜酸乳杆菌数量的同时提高了抗菌肽的得率。
具体实施方式
本具体实施方式提供了一种后生元的精制方法，包括以下步骤：
S1、将嗜酸乳杆菌接入乳酸菌培养液中培养，在35-39℃下培养1-2天得到第一发酵液，向所述第一发酵液中加入柠檬酸，之后在所述第一发酵液中加入嗜热链球菌继续在35-39℃下培养1-2天得到第二发酵液；所述柠檬酸的添加量为所述第一发酵液体积的0.1-0.5％，所述柠檬酸的浓度为0.3mol/L-0.5mol/L；
S2、将所述第二发酵液过滤得到上清液，将所述上清液浓缩得到浓缩液；所述浓缩液的体积为所述上清液体积的0.3-0.5倍；
S3、向所述浓缩液中加入明胶，之后在5-10℃下冷藏30-60min得到第三发酵液；所述明胶的加入量为所述浓缩液质量的0.5-1％；
S4、将所述第三发酵液在80-85℃下进行灭活处理30-60min；
S5、向灭活后的所述第三发酵液中加入壳聚糖，之后喷雾干燥得到后生元缓释胶囊；所述壳聚糖的加入量为所述灭活后的所述第三发酵液质量的1-3％。后生元缓释胶囊进入肠道会开始释放后生元，且在后生元中明胶的作用下提高与肠道的粘附力，进而延长后生元的作用时间，有利于提高对肠道炎症的治疗效果。
在某些实施例中，还包括步骤S6：
将嗜热链球菌粉、淀粉、水和后生元缓释胶囊混合，之后干燥得到所述后生元；所述嗜热链球菌粉和所述淀粉的质量比1:1-2，所述淀粉和所述水的质量比为1:0.1-0.3；所述嗜热链球菌粉和所述后生元缓释胶囊的质量比为1:1-2。我们发现步骤S5制得的后生元缓释胶囊主要粘附在小肠，通过步骤S6将嗜热链球菌粉、淀粉、水和后生元缓释胶囊混合，之后干燥得到所述后生元，淀粉具有粘接作用，可将嗜热链球菌粉粘附于后生元缓释胶囊的外表面，后生元进入肠道后，后生元胶囊表面的嗜热链球菌粉能够快速释放，进而较快的抑制肠道的致病菌，进而在后生元缓释胶囊释放后生元的作用下，对肠道炎症具有更好的治疗效果，治疗周期短。
此外，明胶具有粘结作用，在较低温度下能够稳固嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌的所在位置，进一步进行灭活处理能够提高灭活的精准性，进而提高灭活的效率，仅需要在80-85℃下灭活30-60min即可实现嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌的全部灭活。
本具体实施方式还提出一种后生元，由上述精制方法制备得到。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下述实施例中，乳酸菌培养基由水1000ml、牛肉膏10g、蛋白胨20g、酵母膏10g、番茄汁200g、葡萄糖10g、吐温0.5ml、碳酸钙17g、溴甲酚绿0.1g、琼脂15g构成。下述实施例中的嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌均为自己采集的现有技术中的已知菌种，嗜热链球菌粉购买自市场。
实施例1
本实施例提出一种后生元，由以下步骤制备制得：
S1、将104个嗜酸乳杆菌接入乳酸菌培养液中培养，在35℃下培养2天得到第一发酵液，向所述第一发酵液中加入柠檬酸，之后在所述第一发酵液中加入103个嗜热链球菌继续在35℃下培养1天得到第二发酵液；所述柠檬酸的添加量为所述第一发酵液体积的0.1％，所述柠檬酸的浓度为0.3mol/L；检测第二发酵液，嗜酸乳杆菌的数量为2.8×1010CFU/mL；嗜热链球菌的数量为1.4×107CFU/mL；
S2、将所述第二发酵液过滤得到上清液，将所述上清液浓缩得到浓缩液；所述浓缩液的体积为所述上清液体积的0.3倍；
S3、向所述浓缩液中加入明胶，之后在5℃下冷藏60min得到第三发酵液；所述明胶的加入量为所述浓缩液质量的0.6％；
S4、将所述第三发酵液在80℃下进行灭活处理60min；灭活率为100％；
S5、向灭活后的所述第三发酵液中加入壳聚糖，之后喷雾干燥得到后生元缓释胶囊；所述壳聚糖的加入量为所述灭活后的所述第三发酵液质量的3％。得到的后生元缓释胶囊的质量为216g，采用现有技术的透析浓缩法重复本实施例的方法制得的抗菌肽的质量为1.824g。
计算抗菌肽的得率为1.824g/(216g+1.824g)*100％＝0.837％。
实施例2
本实施例提出一种后生元，由以下步骤制备制得：
S1、将104个嗜酸乳杆菌接入乳酸菌培养液中培养，在37℃下培养1.5天得到第一发酵液，向所述第一发酵液中加入柠檬酸，之后在所述第一发酵液中加入103个嗜热链球菌继续在37℃下培养1.5天得到第二发酵液；所述柠檬酸的添加量为所述第一发酵液体积的0.5％，所述柠檬酸的浓度为0.4mol/L；
S2、将所述第二发酵液过滤得到上清液，将所述上清液浓缩得到浓缩液；所述浓缩液的体积为所述上清液体积的0.5倍；检测第二发酵液，嗜酸乳杆菌的数量为2.9×1010CFU/mL；嗜热链球菌的数量为1.0×108CFU/mL；
S3、向所述浓缩液中加入明胶，之后在10℃下冷藏30min得到第三发酵液；所述明胶的加入量为所述浓缩液质量的0.5％；
S4、将所述第三发酵液在85℃下进行灭活处理30min；灭活率为100％；
S5、向灭活后的所述第三发酵液中加入壳聚糖，之后喷雾干燥得到后生元缓释胶囊；所述壳聚糖的加入量为所述灭活后的所述第三发酵液质量的2％。得到的后生元缓释胶囊的质量为208g，采用现有技术的透析浓缩法重复本实施例的方法制得的抗菌肽的质量为1.724g。
计算抗菌肽的得率为1.724g/(208g+1.724g)*100％＝0.822％。
实施例3
本实施例提出一种后生元，由以下步骤制备制得：
S1、将104个嗜酸乳杆菌接入乳酸菌培养液中培养，在39℃下培养1天得到第一发酵液，向所述第一发酵液中加入柠檬酸，之后在所述第一发酵液中加入103个嗜热链球菌继续在39℃下培养2天得到第二发酵液；所述柠檬酸的添加量为所述第一发酵液体积的0.3％，所述柠檬酸的浓度为0.5mol/L；
S2、将所述第二发酵液过滤得到上清液，将所述上清液浓缩得到浓缩液；所述浓缩液的体积为所述上清液体积的0.4倍；检测第二发酵液，嗜酸乳杆菌的数量为3.3×1010CFU/mL；嗜热链球菌的数量为1.8×107CFU/mL；
S3、向所述浓缩液中加入明胶，之后在8℃下冷藏45min得到第三发酵液；所述明胶的加入量为所述浓缩液质量的1％；
S4、将所述第三发酵液在80℃下进行灭活处理50min；灭活率为100％；
S5、向灭活后的所述第三发酵液中加入壳聚糖，之后喷雾干燥得到后生元缓释胶囊；所述壳聚糖的加入量为所述灭活后的所述第三发酵液质量的2％。得到的后生元缓释胶囊的质量为211g，采用现有技术的透析浓缩法重复本实施例的方法制得的抗菌肽的质量为1.792g。
计算抗菌肽的得率为1.792g/(211g+1.792g)*100％＝0.842％。
实施例4
本实施例提出一种后生元，由以下步骤制备制得：
S1、将104个嗜酸乳杆菌接入乳酸菌培养液中培养，在38℃下培养2天得到第一发酵液，向所述第一发酵液中加入柠檬酸，之后在所述第一发酵液中加入103个嗜热链球菌继续在38℃下培养2天得到第二发酵液；所述柠檬酸的添加量为所述第一发酵液体积的0.4％，所述柠檬酸的浓度为0.3mol/L；
S2、将所述第二发酵液过滤得到上清液，将所述上清液浓缩得到浓缩液；所述浓缩液的体积为所述上清液体积的0.3倍；检测第二发酵液，嗜酸乳杆菌的数量为3.2×1010CFU/mL；嗜热链球菌的数量为1.2×108CFU/mL；
S3、向所述浓缩液中加入明胶，之后在10℃下冷藏60min得到第三发酵液；所述明胶的加入量为所述浓缩液质量的0.6％；
S4、将所述第三发酵液在85℃下进行灭活处理30min；灭活率为100％；
S5、向灭活后的所述第三发酵液中加入壳聚糖，之后喷雾干燥得到后生元缓释胶囊；所述壳聚糖的加入量为所述灭活后的所述第三发酵液质量的2％。得到的后生元缓释胶囊的质量为207g，采用现有技术的透析浓缩法重复本实施例的方法制得的抗菌肽的质量为1.698g。
计算抗菌肽的得率为1.698g/(207g+1.698g)*100％＝0.814％。
实施例5
本实施例的后生元与实施例1的区别仅在于，在步骤S5之后还包括步骤S6、将嗜热链球菌粉、淀粉、水和后生元缓释胶囊混合，之后干燥得到所述后生元；所述嗜热链球菌粉、所述淀粉的质量比1:1，所述淀粉和所述水的质量比为1:0.3；所述嗜热链球菌粉和所述后生元缓释胶囊的质量比为1:1。
实施例6
本实施例的后生元与实施例1的区别仅在于，在步骤S5之后还包括步骤S6、将嗜热链球菌粉、淀粉、水和后生元缓释胶囊混合，之后干燥得到所述后生元；所述嗜热链球菌粉、所述淀粉的质量比1:2，所述淀粉和所述水的质量比为1:0.2；所述嗜热链球菌粉和所述后生元缓释胶囊的质量比为1:2。
实施例7
本实施例的后生元与实施例1的区别仅在于，在步骤S5之后还包括步骤S6、将嗜热链球菌粉、淀粉、水和后生元缓释胶囊混合，之后干燥得到所述后生元；所述嗜热链球菌粉、所述淀粉的质量比1:1.5，所述淀粉和所述水的质量比为1:0.1；所述嗜热链球菌粉和所述后生元缓释胶囊的质量比为1:1。
对比例1
本对比例与实施例1的区别仅在于：在步骤S1中没有加入嗜热链球菌，具体地：
本对比例提出一种后生元，由以下步骤制备制得：
S1、将104个嗜酸乳杆菌接入乳酸菌培养液中培养，在35℃下培养2天得到第一发酵液，向所述第一发酵液中加入柠檬酸，之后在所述第一发酵液继续在35℃下培养1天得到第二发酵液；所述柠檬酸的添加量为所述第一发酵液体积的0.1％，所述柠檬酸的浓度为0.3mol/L；检测第二发酵液，嗜酸乳杆菌的数量为3.2×107CFU/mL；
S2、将所述第二发酵液过滤得到上清液，将所述上清液浓缩得到浓缩液；所述浓缩液的体积为所述上清液体积的0.3倍；
S3、向所述浓缩液中加入明胶，之后在5℃下冷藏60min得到第三发酵液；所述明胶的加入量为所述浓缩液质量的0.6％；
S4、将所述第三发酵液在80℃下进行灭活处理60min；
S5、向灭活后的所述第三发酵液中加入壳聚糖，之后喷雾干燥得到后生元缓释胶囊；所述壳聚糖的加入量为所述灭活后的所述第三发酵液质量的3％。得到的后生元缓释胶囊的质量为101g，采用现有技术的透析浓缩法重复本实施例的方法制得的抗菌肽的质量为0.326g。
计算抗菌肽的得率为0.326g/(101g+0.326g)*100％＝0.322％。
该对比例得到的嗜酸乳杆菌的数量较少，而且抗菌肽的得率较低，说明嗜热链球菌的加入能够提高抗菌肽的得率且能够促进嗜酸乳杆菌的培养。
为了进一步确认抗菌肽是不是主要由嗜热链球菌产生，我们做了对比例2，只采用嗜热链球菌进行培养，具体方法如下：
对比例2
本对比例提出一种后生元，由以下步骤制备制得：
S1、将104个嗜热链球菌接入乳酸菌培养液中培养，在35℃下培养2天得到第一发酵液，向所述第一发酵液中加入柠檬酸，之后继续在35℃下培养1天得到第二发酵液；所述柠檬酸的添加量为所述第一发酵液体积的0.1％，所述柠檬酸的浓度为0.3mol/L；检测第二发酵液，嗜热链球菌的数量为2.8×107CFU/mL；
S2、将所述第二发酵液过滤得到上清液，将所述上清液浓缩得到浓缩液；所述浓缩液的体积为所述上清液体积的0.3倍；
S3、向所述浓缩液中加入明胶，之后在5℃下冷藏60min得到第三发酵液；所述明胶的加入量为所述浓缩液质量的0.6％；
S4、将所述第三发酵液在80℃下进行灭活处理60min；
S5、向灭活后的所述第三发酵液中加入壳聚糖，之后喷雾干燥得到后生元缓释胶囊；所述壳聚糖的加入量为所述灭活后的所述第三发酵液质量的3％。得到的后生元缓释胶囊的质量为115g，采用现有技术的透析浓缩法重复本实施例的方法制得的抗菌肽的质量为0.415g。
计算抗菌肽的得率为0.415g/(115g+0.415g)*100％＝0.36％。
从对比例2的结果可以看出，本发明提出的方法高效制得抗菌肽是嗜热链球菌与嗜酸乳杆菌共同作用产生的预料不到的技术效果。
实施例1-7制得的后生元均能在小鼠小肠的表面粘附48小时以上无破裂，从而确保后生元中的有效成分能够被小肠充分吸收。后生元的体外溶出实验中，在模拟肠液中实施例1-4制得的后生元中的有效成分12小时内释放95％，实施例5-7制得的后生元中嗜热链球菌粉1小时内的释放量为95％，后生元缓释微胶囊中的有效成分12小时内释放65％，24小时释放95％，故实施例5-7制得的后生元的缓释时间更长，实际治疗时间更长，具有更好的治疗效果。
选取20个肠道不适的人分为2组，分别服用实施例1和5制得的后生元，每天服用一次，每次服用5g，连续服用4天，改善率如表1所示。需要说明的是，改善率是指肠炎问题得到明显改善的患者与每组的总患者的百分比。
表1实施例1和5的后生元对肠道炎症的改善率
改善率(％)
实施例1 40
实施例5 90
从表1可以看出实施例5提出的后生元的改善率明显优于实施例1，服用实施例1的患者继续服用7天，改善率明显提高，高达90％。
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

Claims (4)

1.一种后生元的精制方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将嗜酸乳杆菌接入乳酸菌培养液中培养，在35-39℃下培养1-2天得到第一发酵液，向所述第一发酵液中加入柠檬酸，之后在所述第一发酵液中加入嗜热链球菌继续在35-39℃下培养1-2天得到第二发酵液；
S2、将所述第二发酵液过滤得到上清液，将所述上清液浓缩得到浓缩液；
S3、向所述浓缩液中加入明胶，之后在5-10℃下冷藏得到第三发酵液；
S4、将所述第三发酵液进行灭活处理；
S5、向灭活后的所述第三发酵液中加入壳聚糖，之后喷雾干燥得到后生元缓释胶囊；
S6、将嗜热链球菌粉、淀粉、水和后生元缓释胶囊混合，之后干燥得到所述后生元；所述嗜热链球菌粉、所述淀粉的质量比1:1-2，所述淀粉和所述水的质量比为1:0.1-0.3；所述嗜热链球菌粉和所述后生元缓释胶囊的质量比为1:1-2。
2.根据权利要求1所述的后生元的精制方法，其特征在于，在步骤S1中，所述柠檬酸的添加量为所述第一发酵液体积的0.1-0.5%，所述柠檬酸的浓度为0.3mol/L-0.5mol/L。
3.根据权利要求1所述的后生元的精制方法，其特征在于， 在步骤S3中，所述明胶的加入量为所述浓缩液质量的0.5-1%。
4.一种后生元，其特征在于，由权利要求1-3任一项所述的精制方法制备得到。
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