CN115944665A - 一种改善肠道菌群平衡的益生菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种改善肠道菌群平衡的益生菌剂及其制备方法和应用，属于益生菌技术领域。从甘蔗和山楂中提取得到多糖经过复合酶酶解后，经嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌、多形拟杆菌发酵得到多糖酶解发酵产物，与多糖酶解发酵产物、短链脂肪酸组合物、益生元组合物和凝结芽孢杆菌TQ33混合均匀得到活性组合物，以交联羧基化壳聚糖为壁材，制得改善肠道菌群平衡的益生菌剂，能够有效改善肠道菌群结构、调节肠道功能紊乱、维持肠道内菌群平衡和提高机体免疫水平、促进营养物质代谢和利用，且能在进入肠道后被降解释放出来，直接作用于肠道，起到高效的调节肠道菌群的作用。

Description

一种改善肠道菌群平衡的益生菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及益生菌技术领域，具体涉及一种改善肠道菌群平衡的益生菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

益生菌(probiotics)是指定植于宿主肠道或生殖系统内，其益生作用主要是通过改善宿主菌群平衡，激活宿主内源性微生物群或者免疫系统的活性来实现的，对机体产生有益影响的活性微生物。目前研究的大多数益生菌来自乳杆菌属和双歧杆菌属乳杆菌和双歧杆菌是胃肠道内正常微生区系中的重要成员并与宿主终身相伴。在肠道的近端和末端，从胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠到直肠都有乳杆菌的存在。

益生菌可以改善肠道健康，平衡菌群，被称为微生态调节剂，是一种取代平衡系统中的一种或者是多种菌系作用的微生物添加物，为了提升机体的抗病能力、新陈代谢能力和消化吸收能力，有效地改善消化道菌群的平衡，对宿主产生有益的作用，运用益生菌制剂主要是为了防治致病菌感染，具有改善肠道功能、增强免疫力、抗高血压，调控泌尿系统健康等功能。

凝结芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，属厚壁菌门，营养细胞呈杆状，两端钝圆，单个、成对、少数呈短链状，芽孢端生，无鞭毛，最适生长温度为45℃-50℃，最适pH为6.6-7.0，其能分解小分子糖类生成L-1乳酸，为同型乳酸发酵菌，过氧化氢酶阳性。凝结芽孢杆菌除具有和乳酸菌及双歧杆菌同样的保健功效外，还具有耐胃酸、耐热、耐胆碱盐、降解亚硝酸盐、容易培养和保存等特点。

凝结芽胞杆菌是一种兼性厌氧菌，能适应肠道内低氧环境，进入肠道后，在肠道内定植，通过消耗游离氧，抑制需氧型有害菌的生长，同时促进厌氧益生菌如乳酸菌、双歧杆菌等的增殖；产生乳酸降低肠道pH值，并分泌多种抗菌的细菌素类多肽物质如凝固素等，能够抑制肠道有害菌的生长，从而有效恢复并维持肠道微生态平衡，进而提高生物体免疫力，减少肠道疾病的发生。除此之外，它能产生双乙酰、有机酸等多种代谢产物，减少胺类等有害物质的产生，不仅能改善肠道内微生态环境，同时也改善体外环境，从而减少疾病的发生与传播。

另外，为了让益生菌产品进入宿主肠道前能保持休眠状态，益生菌产品的剂型或填充剂的选择和配比至关重要，若剂型或填充剂选择不当，产品中水分含量过高，或者益生菌过早释放，益生菌会快速失去活性，进入宿主肠道后也无法发挥最佳作用。现有技术中对益生菌的填充剂的选择和配比还具有缺陷，如中国发明专利申请CN103478530A中公开了一种低聚糖益生菌组合物以及应用，该文献主要采用低聚糖粉、羟丙级甲基纤维素组成，中国发明专利申请CN103478530A中主要采用益生元、膳食纤维、氨基酸以及维生素B来作为填充剂，但都存在容易失活的缺陷。

发明内容

本发明的目的在于提出一种改善肠道菌群平衡的益生菌剂及其制备方法和应用，能够有效改善肠道菌群结构、调节肠道功能紊乱、维持肠道内菌群平衡和提高机体免疫水平、促进营养物质代谢和利用，且不易于在胃部被人体分解，从而能在进入肠道后被降解释放出来，使得大量的益生菌、凝结芽孢杆菌、益生元和短链脂肪酸等能直接作用于肠道，起到高效的调节肠道菌群的作用。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供一种改善肠道菌群平衡的益生菌剂的制备方法，从甘蔗和山楂中提取得到多糖经过复合酶酶解后，经嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌、多形拟杆菌发酵得到多糖酶解发酵产物，与多糖酶解发酵产物、短链脂肪酸组合物、益生元组合物和凝结芽孢杆菌TQ33混合均匀得到活性组合物，以交联羧基化壳聚糖为壁材，制得改善肠道菌群平衡的益生菌剂；所述复合酶为纤维素酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶的复配混合物。

作为本发明的进一步改进，包括以下步骤：

S1.甘蔗多糖的提取：将新鲜甘蔗去皮，切段，榨汁，过滤，得到甘蔗汁，加热至35-45℃后加入磷酸，搅拌混合均匀，加入碳酸钠调节溶液pH值为6.9-7.1，加热至55-65℃后加入亚硫酸溶液，搅拌均匀，加入碳酸钠调节溶液pH值为6.9-7.1，加热至75-85℃后加入聚丙烯酰胺溶液，搅拌混合均匀，沉淀，过滤，得到甘蔗清汁；向甘蔗清汁中加入三氯乙酸-乙腈溶液，沉淀，过滤，滤液中加入乙醇，沉淀，离心，沉淀物复溶于水后，再次加入乙醇沉淀，离心，洗涤沉淀物，干燥，得到甘蔗多糖；

S2.山楂多糖的提取：将新鲜山楂去核，干燥，粉碎，得到山楂粉，加入水中，加热至沸腾提取，加入乙醇，沉淀，离心，沉淀物复溶于水后，再次加入乙醇沉淀，离心，洗涤沉淀物，干燥，得到山楂多糖；

S3.甘蔗和山楂多糖的酶解：将步骤S1制得的甘蔗多糖和步骤S2制得的山楂多糖混合溶于水中，加入复合酶酶解，灭酶，过滤，得到甘蔗和山楂多糖的酶解产物；

S4.菌种的活化：将嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌、多形拟杆菌接种于高氏培养基中，微缺氧条件下培养成菌种种子液；

S5.甘蔗和山楂多糖酶解产物的发酵：将步骤S4中制得的嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌、多形拟杆菌菌种种子液接种至步骤S3制得的甘蔗和山楂多糖的酶解产物中，微缺氧条件下发酵培养第一时间段，然后加入含有铁离子和维生素组合物的水溶液，继续发酵培养第二时间段，过滤，浓缩，冷冻干燥，得到多糖酶解发酵产物；

S6.短链脂肪酸组合物的制备：将乙酸、丙酸、丁酸混合均匀，制得短链脂肪酸组合物；

S7.益生元组合物的制备：将菊粉、人乳寡糖、蓝莓多酚混合均匀，制得益生元组合物；

S8.活性组合物的制备：将步骤S5制得的多糖酶解发酵产物、步骤S6制得的短链脂肪酸组合物、步骤S7制得的益生元组合物和凝结芽孢杆菌TQ33混合均匀，制得活性组合物；

S9.羧基化壳聚糖的制备：将壳聚糖溶于酸液中后，加入α-酮戊二酸，加热搅拌反应第一时间段后，加入硼氢化钠，继续搅拌反应第二时间段，加入乙醇，过滤，洗涤，干燥，研细，得到羧基化壳聚糖；

S10.改善肠道菌群平衡的益生菌剂的制备：将步骤S8制得的活性组合物溶于水中，加入羧基化壳聚糖，搅拌混合均匀后，用SPG膜进行快速膜乳化，形成乳液，加入金属离子溶液，常温固化，过滤，干燥，得到改善肠道菌群平衡的益生菌剂。

作为本发明的进一步改进，步骤S1中所述亚硫酸溶液的浓度为5-8wt%，所述聚丙烯酰胺溶液的浓度为0.02-0.07%；所述三氯乙酸-乙腈溶液中三氯乙酸和乙腈的体积比为3-5：1；所述甘蔗汁、磷酸、亚硫酸溶液、聚丙烯酰胺溶液的体积比为1000：0.5-1：10-20：0.5-1；所述甘蔗清汁和三氯乙酸-乙腈溶液的体积比为2-5:1；所述乙醇的添加量为加至乙醇的含量为80-85wt%；步骤S2中所述加热至沸腾提取的时间为1-2h；所述乙醇的添加量为加至乙醇的含量为80-85wt%。

作为本发明的进一步改进，步骤S3中所述复合酶为纤维素酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶按照质量比为4:2-3:1-2的复配混合物；所述酶解时间为3-5h，酶解温度为40-50℃；所述甘蔗多糖、山楂多糖和复合酶的质量比为2-5:1-3:0.2-0.3。

作为本发明的进一步改进，步骤S4中所述微缺氧条件为氧气含量为7-12%，二氧化碳含量为3-5%，余量为氮气，其中，%为体积百分比；所述培养的温度为35-38℃，时间为18-24h，所述菌种种子液的含菌量为10⁷-10⁹cfu/mL；步骤S5中所述的嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌、多形拟杆菌的接种量分别为1-3%、2-4%、1-3%；所述微缺氧条件为氧气含量为7-12%，二氧化碳含量为3-5%，余量为氮气，其中，%为体积百分比；所述发酵培养的温度为37-39℃，所述第一时间段为24-36h；所述第二时间段为18-24h；所述含有铁离子和维生素组合物的水溶液中铁离子含量为3-5wt%；维生素组合物为维生素B1和维生素C，含量分别为1-3wt%和3-5wt%。

作为本发明的进一步改进，步骤S6中所述乙酸、丙酸、丁酸的质量比为3-5:1:5-7；步骤S7中所述菊粉、人乳寡糖、蓝莓多酚的质量比为5-7:1-2:2-3；步骤S8中所述多糖酶解发酵产物、短链脂肪酸组合物、益生元组合物和凝结芽孢杆菌TQ33的质量比为10:1-3:3-5:1-2。

作为本发明的进一步改进，步骤S9中所述酸液为1-3wt%的醋酸溶液，所述壳聚糖、α-酮戊二酸、硼氢化钠的质量比为1:2-3:0.2-0.4；所述加热至温度为40-50℃，所述第一时间段为16-20h；所述第二时间段为3-5h；步骤S9中所述活性组合物和羧基化壳聚糖的质量比为10:12-17；所述SPG膜的孔隙为5-10µm；所述金属离子溶液为含有1-3wt%的钙离子、铁离子、锌离子或铜离子溶液；所述固化时间为2-3h。

作为本发明的进一步改进，具体包括以下步骤：

S1.甘蔗多糖的提取：将新鲜甘蔗去皮，切段，榨汁，过滤，得到1000体积份甘蔗汁，加热至35-45℃后加入0.5-1体积份磷酸，搅拌混合均匀，加入碳酸钠调节溶液pH值为6.9-7.1，加热至55-65℃后加入10-20体积份5-8wt%亚硫酸溶液，搅拌均匀，加入碳酸钠调节溶液pH值为6.9-7.1，加热至75-85℃后加入0.5-1体积份0.02-0.07%聚丙烯酰胺溶液，搅拌混合均匀，沉淀，过滤，得到甘蔗清汁；向2-5体积份甘蔗清汁中加入1体积份三氯乙酸-乙腈溶液，所述三氯乙酸-乙腈溶液中三氯乙酸和乙腈的体积比为3-5：1，沉淀，过滤，滤液中加入乙醇至乙醇的含量为80-85wt%，沉淀，离心，沉淀物复溶于水后，再次加入乙醇至乙醇的含量为80-85wt%，沉淀，离心，洗涤沉淀物，干燥，得到甘蔗多糖；

甘蔗清汁中加入三氯乙酸-乙腈溶液其目的在于沉淀蛋白质，从而去除甘蔗清汁中非多糖的组分。

S2.山楂多糖的提取：将新鲜山楂去核，干燥，粉碎，得到山楂粉，加入水中，加热至沸腾提取1-2h，加入乙醇至乙醇的含量为80-85wt%，沉淀，离心，沉淀物复溶于水后，再次加入乙醇至乙醇的含量为80-85wt%，沉淀，离心，洗涤沉淀物，干燥，得到山楂多糖；

S3.甘蔗和山楂多糖的酶解：将2-5质量份步骤S1制得的甘蔗多糖和1-3质量份步骤S2制得的山楂多糖混合溶于水中，加入0.2-0.3质量份复合酶，40-50℃酶解3-5h，灭酶，过滤，得到甘蔗和山楂多糖的酶解产物；所述复合酶为纤维素酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶按照质量比为4:2-3:1-2的复配混合物；

经过复合酶酶解，可以将多糖酶解产生大量的小分子糖，寡糖等易于被吸收的糖类物质，是一种很好的肠道益生元物质。

S4.菌种的活化：将嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌、多形拟杆菌接种于高氏培养基中，微缺氧条件下，35-38℃培养18-24h，得到菌种种子液，含菌量为10⁷-10⁹cfu/mL；

所述微缺氧条件为氧气含量为7-12%，二氧化碳含量为3-5%，余量为氮气，其中，%为体积百分比；

S5.甘蔗和山楂多糖酶解产物的发酵：将步骤S4中制得的嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌、多形拟杆菌菌种种子液接种至步骤S3制得的甘蔗和山楂多糖的酶解产物中，接种量分别为1-3%、2-4%、1-3%，微缺氧条件下，37-39℃发酵培养24-36h，然后加入体系总质量的3-5wt%的含有铁离子和维生素组合物的水溶液，所述含有铁离子和维生素组合物的水溶液中铁离子含量为3-5wt%；维生素组合物为维生素B1和维生素C，含量分别为1-3wt%和3-5wt%；继续发酵培养18-24h，过滤，浓缩，冷冻干燥，得到多糖酶解发酵产物；

将经过酶解后的产物进一步发酵，进一步得到分子量更小的单糖、寡糖等，易于被益生菌吸收利用，是一种很好的肠道益生元物质。

加入含有铁离子和维生素组合物的水溶液，一方面，铁离子能明显提高益生菌的抗逆性从而促进其发酵和增殖；另一方面，维生素组合物能延长益生菌在稳定期的时间，增加有益产物的生成，提高产量。

所述微缺氧条件为氧气含量为7-12%，二氧化碳含量为3-5%，余量为氮气，其中，%为体积百分比；

S6.短链脂肪酸组合物的制备：将3-5质量份乙酸、1质量份丙酸、5-7质量份丁酸混合均匀，制得短链脂肪酸组合物；

S7.益生元组合物的制备：5-7质量份将菊粉、1-2质量份人乳寡糖、2-3质量份蓝莓多酚混合均匀，制得益生元组合物；

S8.活性组合物的制备：将10质量份步骤S5制得的多糖酶解发酵产物、1-3质量份步骤S6制得的短链脂肪酸组合物、3-5质量份步骤S7制得的益生元组合物和1-2质量份凝结芽孢杆菌TQ33混合均匀，制得活性组合物；

S9.羧基化壳聚糖的制备：将1质量份壳聚糖溶于1-3wt%的醋酸溶液中后，加入2-3质量份α-酮戊二酸，加热至40-50℃，搅拌反应16-20h后，加入0.2-0.4质量份硼氢化钠，继续搅拌反应3-5h，加入乙醇至乙醇的含量为65-70wt%，过滤，洗涤，干燥，研细，得到羧基化壳聚糖；

S10.改善肠道菌群平衡的益生菌剂的制备：将10质量份步骤S8制得的活性组合物溶于水中，加入12-17质量份羧基化壳聚糖，搅拌混合均匀后，用孔隙为5-10µm的SPG膜进行快速膜乳化，形成乳液，加入含有1-3wt%的钙离子、铁离子、锌离子或铜离子溶液，常温固化2-3h，过滤，干燥，得到改善肠道菌群平衡的益生菌剂。

本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的改善肠道菌群平衡的益生菌剂。

本发明进一步保护一种上述的改善肠道菌群平衡的益生菌剂在制备预防及治疗肠炎、便秘的产品中的应用。

本发明具有如下有益效果：肠道微生物对于人体的新陈代谢和免疫调节十分重要。肠道微生物的优势菌群主要包括拟杆菌门和厚壁菌门，其编码了大量的碳水化合物活性酶（CAZymes），并将大部分碳水化合物降解为能量和营养物质；肠道菌群的丰富度和多样性与肠道相关疾病通常呈负相关，拟杆菌门（Bacteroidetes）是肠道微生物维持机体健康状态和稳态的主要参与者，在免疫失调、代谢综合征等疾病中具有积极的作用，厚壁菌门（ Firmicutes）丰度的降低会导致肝脂质代谢增强。甘蔗多糖主要由核糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成，山楂多糖主要由阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，两者均具有较强的体外抗氧化活性及免疫调节等活性，将甘蔗多糖和山楂多糖经过提取，酶解和发酵后，产生大量的易于肠道吸收的小分子糖、寡糖类物质，能够调节厚壁菌门（ Firmicutes）和拟杆菌门（ Bacteroidetes）菌群组成，提高了肠道菌群的多样性和丰富度，从而有效的促进人体健康。

凝结芽孢杆菌既能像乳酸菌和双歧杆菌具有益生作用，又具有芽孢菌的抗逆性强、耐高温高压和易贮藏等优点，可以长时间保持丰度不减；能够改善肠道菌群结构、调节肠道功能紊乱、维持肠道内菌群平衡和提高机体免疫水平、促进营养物质代谢和利用；

短链脂肪酸（SCFAs）作为重要的菌群代谢产物，可以驱动宿主与肠道微生物之间的相互作用，并与G蛋白偶联受体结合提高宿主免疫力，为上皮细胞提供能量以刺激细胞增殖、分化和成熟，减少细胞的凋亡。本发明多糖酶解发酵产物可使肠道中菌属丰度发生改变，增加拟杆菌属（ Bacteroides）、瘤胃球菌属（ Ruminococcus）、颤螺菌属（ Oscillospira）、异杆菌属（ Allobaculum）、乳酸杆菌属（ Lactobacillus）和副拟杆菌（ Parabacteroides）等分解碳水化合物菌属及产SCFAs菌属的丰度，其中，异杆菌属（ Allobaculum ）的丰度与ANGPTL4的表达呈正相关，血管生成素样蛋白4（ANGPTL4）是脂质代谢的关键调节剂，也是肠道微生物群和脂肪沉积的循环介质，从而能够发挥肠道微生物调节作用，改善宿主肠道微生态健康。

乙酸可以被吸收入血液，进入肝中代谢，用于脂质和胆固醇的合成并作为周边组织的能源。丙酸经结肠吸收后可作为糖异生的底物，并能抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶活性而降低胆固醇的合成。丁酸能被结肠上皮细胞吸收利用，是结肠、盲肠能量的首选来源。三者的合适比例下，通过激活G蛋白偶联受体和抑制组蛋白脱乙基酶（HDAC）两条途径抑制肠道炎症，维持结肠上皮细胞屏障功能，还具有抗炎、免疫调节及抗肿瘤等作用。

益生菌可以维持肠道上皮细胞紧密连接蛋白的完整性，防止过度的渗透，抑制病原菌的定植，在宿主体内与其他肠道菌共同作用，维持宿主肠道菌群的动态平衡，形成一个可自我调节的平衡的微生物系统，益生菌在宿主体内正常生长繁殖后，代谢产生的细菌素、肽聚糖和蛋白质可以活化机体内部免疫细胞，激发机体产生免疫抗体，提高机体免疫力，同时，益生菌的代谢产物对致病菌有很强的拮抗作用，可以通过抑制引起人体腹泻的外源性致病菌和肠道内固有腐败菌的生长繁殖来防止腹泻的发生；嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌还可以发酵多种糖类物质产生有利于宿主肠道健康的各种短链脂肪酸；多形拟杆菌一方面可以抑制有害菌的定植，另一方面还可以可以有效利用碳水化合物，通过将本发明制得的甘蔗和山楂多糖的酶解产物代谢复成为单糖，从而进一步利于其他益生菌的生长；

益生元是被宿主体内微生物选择利用且有益于宿主健康的物质，不同于大多数膳食纤维（果胶、纤维素、木聚糖等）可以促进肠道中大部分微生物的生长，益生元仅选择性地促进宿主体内的有益微生物或者是摄入到体内的益生菌的生长，简而言之，益生元是益生菌的食物。其中，蓝莓多酚可以促进多形拟杆菌的生长，改善肝脏和脂肪组织中的脂代谢，调节肠道菌群；菊粉能有效促进益生菌嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌的增殖，人乳寡糖能显著改善结肠炎，促进凝结芽孢杆菌的增殖，调节肠道菌群、增强免疫应答，三者协同作用下，对于调节肠道菌群比例，平衡肠道微生态，减轻肠道炎症，减少便秘，促进营养吸收，增强免疫等方面均有明显的促进作用。

壳聚糖分子链上带有大量的羟基和氨基，本发明壳聚糖经过α-酮戊二酸改性后，表面带有大量的羧基，羧基可与金属离子发生配位交联作用形成稳定的结构，将活性组合物溶于水中，加入羧基化壳聚糖，经过乳化，加入金属离子溶液，羧基化的壳聚糖交联形成微胶囊的壁材，将活性组合物包裹在微胶囊内部，形成从而形成了缓释结构，送入人体后，不易于在胃部被人体分解，从而能在进入肠道后被降解释放出来，使得大量的益生菌、凝结芽孢杆菌、益生元和短链脂肪酸等能直接作用于肠道，起到高效的调节肠道菌群的作用。

本发明改善肠道菌群平衡的益生菌剂能够有效改善肠道菌群结构、调节肠道功能紊乱、维持肠道内菌群平衡和提高机体免疫水平、促进营养物质代谢和利用，且不易于在胃部被人体分解，从而能在进入肠道后被降解释放出来，使得大量的益生菌、凝结芽孢杆菌、益生元和短链脂肪酸等能直接作用于肠道，起到高效的调节肠道菌群的作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1制得的改善肠道菌群平衡的益生菌剂的SEM图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

凝结芽孢杆菌TQ33，由天津科技大学应用微生物教研室提供，其为该教研室在进行乳酸芽胞菌的研究中，从脱脂奶粉中分离到的同型乳酸发酵的芽胞杆菌，经鉴定为凝结芽胞杆菌( Bacillus coagulans，TQ33)；纤维素酶，2.5万U/mL，试剂级，购于上海阿拉丁公司；木聚糖酶，5万U/g，食品级，购于北京麦瑞博生物科技有限公司，甘露聚糖酶，2.5万U/g，购于夏盛（北京）生物科技开发有限公司。嗜酸乳杆菌，纯度大于99%，购于河北鸿韬生物工程有限公司；乳双歧杆菌，纯度大于99%，购于山东丰泰生物科技有限公司；多形拟杆菌，冻干粉，ATCC 29148，购于上海晅科生物科技有限公司。菊粉，购于西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；人乳寡糖，CAS：60254-64-0，购于上海齐源生物科技有限公司；蓝莓多酚，纯度大于30%，120目，购于兰州沃特莱斯生物科技有限公司；壳聚糖购于西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。

实施例1

本实施例提供一种改善肠道菌群平衡的益生菌剂的制备方法，具体包括以下步骤：

S1.甘蔗多糖的提取：将新鲜甘蔗去皮，切段，榨汁，过滤，得到1000mL甘蔗汁，加热至35℃后加入0.5mL磷酸，搅拌混合均匀，加入碳酸钠调节溶液pH值为6.9，加热至55℃后加入10mL 5wt%亚硫酸溶液，搅拌均匀，加入碳酸钠调节溶液pH值为6.9，加热至75℃后加入0.5mL 0.02%聚丙烯酰胺溶液，搅拌混合均匀，沉淀1h，过滤，得到甘蔗清汁；向200mL甘蔗清汁中加入100mL三氯乙酸-乙腈溶液，所述三氯乙酸-乙腈溶液中三氯乙酸和乙腈的体积比为3：1，沉淀1h，过滤，滤液中加入乙醇至乙醇的含量为80wt%，沉淀1h，离心，沉淀物复溶于水后，再次加入乙醇至乙醇的含量为80wt%，沉淀1h，离心，洗涤沉淀物，干燥，得到甘蔗多糖；

S2.山楂多糖的提取：将新鲜山楂去核，干燥，粉碎，得到山楂粉，加入水中，固液比为1：10g/mL，加热至沸腾提取1h，加入乙醇至乙醇的含量为80wt%，沉淀，离心，沉淀物复溶于水后，再次加入乙醇至乙醇的含量为80wt%，沉淀，离心，洗涤沉淀物，干燥，得到山楂多糖；

S3.甘蔗和山楂多糖的酶解：将2g步骤S1制得的甘蔗多糖和1g步骤S2制得的山楂多糖混合溶于水中，加入0.2g复合酶，40℃酶解3h，105℃灭酶10min，过滤，得到甘蔗和山楂多糖的酶解产物；所述复合酶为纤维素酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶按照质量比为4:2:1的复配混合物；

S4.菌种的活化：将嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌、多形拟杆菌接种于高氏培养基中，微缺氧条件下，35℃培养18h，得到菌种种子液，含菌量为10⁷cfu/mL；

所述微缺氧条件为氧气含量为7%，二氧化碳含量为3%，余量为氮气，其中，%为体积百分比；

S5.甘蔗和山楂多糖酶解产物的发酵：将步骤S4中制得的嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌、多形拟杆菌菌种种子液接种至步骤S3制得的甘蔗和山楂多糖的酶解产物中，接种量分别为1%、2%、1%，微缺氧条件下，37℃发酵培养24h，然后加入体系总质量的3wt%的含有氯化铁和维生素组合物的水溶液，所述含有氯化铁和维生素组合物的水溶液中铁离子含量为3wt%；维生素组合物为维生素B1和维生素C，含量分别为1wt%和3wt%；继续发酵培养18h，过滤，浓缩，冷冻干燥，得到多糖酶解发酵产物；

所述微缺氧条件为氧气含量为7%，二氧化碳含量为3%，余量为氮气，其中，%为体积百分比；

S6.短链脂肪酸组合物的制备：将3g乙酸、1g丙酸、5g丁酸混合均匀，制得短链脂肪酸组合物；

S7.益生元组合物的制备：5g将菊粉、1g人乳寡糖、2g蓝莓多酚混合均匀，制得益生元组合物；

S8.活性组合物的制备：将10g步骤S5制得的多糖酶解发酵产物、1g步骤S6制得的短链脂肪酸组合物、3g步骤S7制得的益生元组合物和1g凝结芽孢杆菌TQ33混合均匀，制得活性组合物；

S9.羧基化壳聚糖的制备：将1g壳聚糖溶于20mL 1wt%的醋酸溶液中后，加入2gα-酮戊二酸，加热至40℃，搅拌反应16h后，加入0.2g硼氢化钠，继续搅拌反应3h，加入乙醇至乙醇的含量为65wt%，过滤，洗涤，干燥，研细，得到羧基化壳聚糖；

S10.改善肠道菌群平衡的益生菌剂的制备：将10g步骤S8制得的活性组合物溶于50mL水中，加入12g羧基化壳聚糖，搅拌混合均匀后，用孔隙为5µm的SPG膜进行快速膜乳化，形成乳液，加入10mL含有1wt%的铜离子的溶液，常温固化2h，过滤，干燥，得到改善肠道菌群平衡的益生菌剂。图1为制得的改善肠道菌群平衡的益生菌剂的SEM图，由图可知，该改善肠道菌群平衡的益生菌剂为微胶囊形结构。

实施例2

本实施例提供一种改善肠道菌群平衡的益生菌剂的制备方法，具体包括以下步骤：

S1.甘蔗多糖的提取：将新鲜甘蔗去皮，切段，榨汁，过滤，得到1000mL甘蔗汁，加热至45℃后加入1mL磷酸，搅拌混合均匀，加入碳酸钠调节溶液pH值为7.1，加热至65℃后加入20mL 8wt%亚硫酸溶液，搅拌均匀，加入碳酸钠调节溶液pH值为7.1，加热至85℃后加入1mL0.07%聚丙烯酰胺溶液，搅拌混合均匀，沉淀1h，过滤，得到甘蔗清汁；向500mL甘蔗清汁中加入100mL三氯乙酸-乙腈溶液，所述三氯乙酸-乙腈溶液中三氯乙酸和乙腈的体积比为5：1，沉淀1h，过滤，滤液中加入乙醇至乙醇的含量为85wt%，沉淀1h，离心，沉淀物复溶于水后，再次加入乙醇至乙醇的含量为85wt%，沉淀1h，离心，洗涤沉淀物，干燥，得到甘蔗多糖；

S2.山楂多糖的提取：将新鲜山楂去核，干燥，粉碎，得到山楂粉，加入水中，固液比为1：10g/mL，加热至沸腾提取2h，加入乙醇至乙醇的含量为85wt%，沉淀，离心，沉淀物复溶于水后，再次加入乙醇至乙醇的含量为85wt%，沉淀，离心，洗涤沉淀物，干燥，得到山楂多糖；

S3.甘蔗和山楂多糖的酶解：将5g步骤S1制得的甘蔗多糖和3g步骤S2制得的山楂多糖混合溶于水中，加入0.3g复合酶，50℃酶解5h，105℃灭酶10min，过滤，得到甘蔗和山楂多糖的酶解产物；所述复合酶为纤维素酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶按照质量比为4:3:2的复配混合物；

S4.菌种的活化：将嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌、多形拟杆菌接种于高氏培养基中，微缺氧条件下，38℃培养24h，得到菌种种子液，含菌量为10⁹cfu/mL；

所述微缺氧条件为氧气含量为12%，二氧化碳含量为5%，余量为氮气，其中，%为体积百分比；

S5.甘蔗和山楂多糖酶解产物的发酵：将步骤S4中制得的嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌、多形拟杆菌菌种种子液接种至步骤S3制得的甘蔗和山楂多糖的酶解产物中，接种量分别为3%、4%、3%，微缺氧条件下，39℃发酵培养36h，然后加入体系总质量的5wt%的含有氯化铁和维生素组合物的水溶液，所述含有氯化铁和维生素组合物的水溶液中铁离子含量为5wt%；维生素组合物为维生素B1和维生素C，含量分别为3wt%和5wt%；继续发酵培养24h，过滤，浓缩，冷冻干燥，得到多糖酶解发酵产物；

所述微缺氧条件为氧气含量为12%，二氧化碳含量为5%，余量为氮气，其中，%为体积百分比；

S6.短链脂肪酸组合物的制备：将5g乙酸、1g丙酸、7g丁酸混合均匀，制得短链脂肪酸组合物；

S7.益生元组合物的制备：7g将菊粉、2g人乳寡糖、3g蓝莓多酚混合均匀，制得益生元组合物；

S8.活性组合物的制备：将10g步骤S5制得的多糖酶解发酵产物、3g步骤S6制得的短链脂肪酸组合物、5g步骤S7制得的益生元组合物和2g凝结芽孢杆菌TQ33混合均匀，制得活性组合物；

S9.羧基化壳聚糖的制备：将1g壳聚糖溶于20mL 3wt%的醋酸溶液中后，加入3gα-酮戊二酸，加热至50℃，搅拌反应20h后，加入0.4g硼氢化钠，继续搅拌反应5h，加入乙醇至乙醇的含量为70wt%，过滤，洗涤，干燥，研细，得到羧基化壳聚糖；

S10.改善肠道菌群平衡的益生菌剂的制备：将10g步骤S8制得的活性组合物溶于50mL水中，加入17g羧基化壳聚糖，搅拌混合均匀后，用孔隙为10µm的SPG膜进行快速膜乳化，形成乳液，加入10mL含有3wt%的铁离子的溶液，常温固化3h，过滤，干燥，得到改善肠道菌群平衡的益生菌剂。

实施例3

本实施例提供一种改善肠道菌群平衡的益生菌剂的制备方法，具体包括以下步骤：

S1.甘蔗多糖的提取：将新鲜甘蔗去皮，切段，榨汁，过滤，得到1000mL甘蔗汁，加热至40℃后加入0.7mL磷酸，搅拌混合均匀，加入碳酸钠调节溶液pH值为7，加热至60℃后加入15mL 7wt%亚硫酸溶液，搅拌均匀，加入碳酸钠调节溶液pH值为7，加热至80℃后加入0.7mL0.05%聚丙烯酰胺溶液，搅拌混合均匀，沉淀1h，过滤，得到甘蔗清汁；向350mL甘蔗清汁中加入100mL三氯乙酸-乙腈溶液，所述三氯乙酸-乙腈溶液中三氯乙酸和乙腈的体积比为4：1，沉淀1h，过滤，滤液中加入乙醇至乙醇的含量为82wt%，沉淀1h，离心，沉淀物复溶于水后，再次加入乙醇至乙醇的含量为82wt%，沉淀1h，离心，洗涤沉淀物，干燥，得到甘蔗多糖；

S2.山楂多糖的提取：将新鲜山楂去核，干燥，粉碎，得到山楂粉，加入水中，固液比为1：10g/mL，加热至沸腾提取1.5h，加入乙醇至乙醇的含量为82wt%，沉淀，离心，沉淀物复溶于水后，再次加入乙醇至乙醇的含量为82wt%，沉淀，离心，洗涤沉淀物，干燥，得到山楂多糖；

S3.甘蔗和山楂多糖的酶解：将3.5g步骤S1制得的甘蔗多糖和2g步骤S2制得的山楂多糖混合溶于水中，加入0.25g复合酶，45℃酶解4h，105℃灭酶10min，过滤，得到甘蔗和山楂多糖的酶解产物；所述复合酶为纤维素酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶按照质量比为4:2:1的复配混合物；

S4.菌种的活化：将嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌、多形拟杆菌接种于高氏培养基中，微缺氧条件下，37℃培养21h，得到菌种种子液，含菌量为10⁸cfu/mL；

所述微缺氧条件为氧气含量为10%，二氧化碳含量为4%，余量为氮气，其中，%为体积百分比；

S5.甘蔗和山楂多糖酶解产物的发酵：将步骤S4中制得的嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌、多形拟杆菌菌种种子液接种至步骤S3制得的甘蔗和山楂多糖的酶解产物中，接种量分别为2%、3%、2%，微缺氧条件下，38℃发酵培养30h，然后加入体系总质量的4wt%的含有氯化铁和维生素组合物的水溶液，所述含有氯化铁和维生素组合物的水溶液中铁离子含量为4wt%；维生素组合物为维生素B1和维生素C，含量分别为2wt%和4wt%；继续发酵培养21h，过滤，浓缩，冷冻干燥，得到多糖酶解发酵产物；

所述微缺氧条件为氧气含量为10%，二氧化碳含量为4%，余量为氮气，其中，%为体积百分比；

S6.短链脂肪酸组合物的制备：将4g乙酸、1g丙酸、6g丁酸混合均匀，制得短链脂肪酸组合物；

S7.益生元组合物的制备：6g将菊粉、1.5g人乳寡糖、2.5g蓝莓多酚混合均匀，制得益生元组合物；

S8.活性组合物的制备：将10g步骤S5制得的多糖酶解发酵产物、2g步骤S6制得的短链脂肪酸组合物、4g步骤S7制得的益生元组合物和1.5g凝结芽孢杆菌TQ33混合均匀，制得活性组合物；

S9.羧基化壳聚糖的制备：将1g壳聚糖溶于20mL 2wt%的醋酸溶液中后，加入2.5gα-酮戊二酸，加热至45℃，搅拌反应18h后，加入0.3g硼氢化钠，继续搅拌反应4h，加入乙醇至乙醇的含量为67wt%，过滤，洗涤，干燥，研细，得到羧基化壳聚糖；

S10.改善肠道菌群平衡的益生菌剂的制备：将10g步骤S8制得的活性组合物溶于50mL水中，加入15g羧基化壳聚糖，搅拌混合均匀后，用孔隙为7µm的SPG膜进行快速膜乳化，形成乳液，加入10mL含有2wt%的钙离子的溶液，常温固化3h，过滤，干燥，得到改善肠道菌群平衡的益生菌剂。

实施例4

与实施例3相比，步骤S3中复合酶由木聚糖酶和甘露聚糖酶按照质量比为6:1的复配混合物替代，其他条件均不改变。

实施例5

与实施例3相比，步骤S3中复合酶由纤维素酶和甘露聚糖酶按照质量比为6:1的复配混合物替代，其他条件均不改变。

对比例1

与实施例3相比，未添加步骤S1制得的甘蔗多糖，其他条件均不改变。

对比例2

与实施例3相比，未添加步骤S2制得的山楂多糖，其他条件均不改变。

对比例3

与实施例3相比，未进行步骤S3酶解步骤，其他条件均不改变。

对比例4

与实施例3相比，步骤S5中未接种嗜酸乳杆菌，其他条件均不改变。

对比例5

与实施例3相比，步骤S5中未接种乳双歧杆菌，其他条件均不改变。

对比例6

与实施例3相比，步骤S5中未接种多形拟杆菌，其他条件均不改变。

对比例7

与实施例3相比，未进行步骤S5发酵步骤，其他条件均不改变。

对比例8

与实施例3相比，未添加步骤S6制得的短链脂肪酸组合物，其他条件均不改变。

对比例9

与实施例3相比，未添加步骤S7制得的益生元组合物，其他条件均不改变。

对比例10

与实施例3相比，未添加步骤S5制得的多糖酶解发酵产物，其他条件均不改变。

对比例11

与实施例3相比，未添加凝结芽孢杆菌TQ33，其他条件均不改变。

对比例12

与实施例3相比，未进行步骤S9和步骤S10的微胶囊化，直接得到活性组合物，其他条件均不改变。

测试例1 缓控释试验

将1g本发明实施例1-3和对比例12制得的改善肠道菌群平衡的益生菌剂分别加入到9mL人工模拟胃液和9mL人工模拟肠液中，在37℃、50r/min条件下分别反应2h和3h，另外，取等量的改善肠道菌群平衡的益生菌剂加入到9mL人工模拟胃液中，先置于摇床中，在37℃、50r/min条件下反应2h后，离心，再加入9mL人工模拟肠液继续反应3h。反应结束后进行益生菌群细胞计数。按照以下公式计算存活率：

存活率(%)=N_t/N₀×100%

式中，N_t为在体外人工模拟胃液或人工模拟肠液中孵育一定时间后存活的益生菌浓度(cfu/g)，N₀为人工模拟胃液或人工模拟肠液中添加的益生菌原始浓度(cfu/g)。

按照以下公式计算释放率：

释放率(%)=（W_t-W₀）/W₀×100%

式中，W_t为样品起始重量；W₀为样品在体外模拟人工模拟胃液和人工模拟肠液中孵育一定时间后重量。

结果见表1。

表1

由上表可知，本发明实施例1-3制得的改善肠道菌群平衡的益生菌剂在人工模拟胃液中能保持较好的完整性，转移至人工模拟肠液中后，微胶囊结构发生崩塌，说明该微胶囊具有pH响应性和抵抗模拟胃液的特性，具有较好的靶向输送活性组分的效果。

测试例2 对益生菌的增殖试验

将本发明实施例1-3和对比例1-11中步骤S8制得的活性组合物加入液体培养基中，然后将培养基紫外灭菌处理后，按照5%的比例接种已活化的青春双歧杆菌，在37℃下厌氧培养48h。于培养0h和48h后取样，用1.0%的无菌蛋白胨水稀释10⁷-10⁹倍，然后取0.1mL的10⁷、10⁸和10⁹倍稀释液用涂布法接种于固体平板培养基上，每个浓度做三个平行，在37℃下厌氧培养48h，用平板菌落计数法测定每毫升培养液中活菌的数量，通过公式计算培养液在48h和0h时的活菌数之差，得到益生菌的增殖数，结果以log cfu/mL表示。对青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、两歧双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的增殖作用测定方法同上。

青春双歧杆菌为ATCC 15703；婴儿双歧杆菌为ATCC 15697、两歧双歧杆菌为ATCC29521和嗜酸乳杆菌为ATCC 11073，均由上海信裕生物科技有限公司提供。

益生菌的增殖数（log cfu/mL）=log B-log A

其中，A为培养0h的活菌数（cfu/ml）；B为培养48h的活菌数（cfu/ml）。

结果见表2。

表2 活性组合物对益生菌的增殖作用（log cfu/mL）

由上表可知，本发明实施例1-3制得的活性组合物对各种益生菌均有明显的促进作用。

测试例3 便秘小鼠试验

将190只SPF级小鼠（平均体重为30±2g）随机分为19组，分别为空白对照组、模型组、实施例1-5组、对比例1-12组，除了空白对照组，其他组小鼠按30mg/kg的剂量灌胃复方地芬诺酯，2次/d，连续处理1周，造模完成后，小鼠的平均粪便质量为0.3g/粒，形成便秘小鼠；试验期间正常给水喂食。造模完成后，实施例1-5组、对比例1-12组每日灌胃给予实施例1-5和对比例1-12制得的改善肠道菌群平衡的益生菌剂，1次/d，每次1g/kg，连续给药7d。空白对照组、模型组给予等量的生理盐水灌胃。在第8d，记取单只小鼠首便时间、8h内排便粒数和质量及小鼠体质量变化情况（与给药前相比）。

结果见表3。

表3

注释，*为与空白对照组相比，P<0.05；#为与模型组相比，P<0.05。

由上表可知，本发明实施例1-3制得的改善肠道菌群平衡的益生菌剂具有明显改善小鼠便秘的效果。

实施例4、5步骤S3中复合酶由木聚糖酶和甘露聚糖酶按照质量比为6:1的复配混合物或由纤维素酶和甘露聚糖酶按照质量比为6:1的复配混合物替代，对比例3与实施例3相比，未进行步骤S3酶解步骤。其对益生菌的增殖效果下降，对小鼠便秘的治疗效果下降。可见，纤维素酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶三者的酶解作用下，具有协同增效的作用。对比例1、2与实施例3相比，未添加步骤S1制得的甘蔗多糖或步骤S2制得的山楂多糖，其对益生菌的增殖效果下降，对小鼠便秘的治疗效果下降，对比例10与实施例3相比，未添加步骤S5制得的多糖酶解发酵产物，其对益生菌的增殖明显效果下降，对小鼠便秘的治疗效果明显下降。甘蔗多糖主要由核糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成，山楂多糖主要由阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，两者均具有较强的体外抗氧化活性及免疫调节等活性，将甘蔗多糖和山楂多糖经过提取，酶解和发酵后，产生大量的易于肠道吸收的小分子糖、寡糖类物质，能够调节厚壁菌门（ Firmicutes）和拟杆菌门（ Bacteroidetes）菌群组成，提高了肠道菌群的多样性和丰富度，从而有效的促进人体健康。

对比例4、5、6与实施例3相比，分别未接种嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌或多形拟杆菌，对小鼠便秘的治疗效果下降。对比例7与实施例3相比，未进行步骤S5发酵步骤，对益生菌的增殖效果下降，对小鼠便秘的治疗效果下降。益生菌可以维持肠道上皮细胞紧密连接蛋白的完整性，防止过度的渗透，抑制病原菌的定植，在宿主体内与其他肠道菌共同作用，维持宿主肠道菌群的动态平衡，形成一个可自我调节的平衡的微生物系统，益生菌在宿主体内正常生长繁殖后，代谢产生的细菌素、肽聚糖和蛋白质可以活化机体内部免疫细胞，激发机体产生免疫抗体，提高机体免疫力，同时，益生菌的代谢产物对致病菌有很强的拮抗作用，可以通过抑制引起人体腹泻的外源性致病菌和肠道内固有腐败菌的生长繁殖来防止腹泻的发生；嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌还可以发酵多种糖类物质产生有利于宿主肠道健康的各种短链脂肪酸；多形拟杆菌一方面可以抑制有害菌的定植，另一方面还可以可以有效利用碳水化合物，通过将本发明制得的甘蔗和山楂多糖的酶解产物代谢复成为单糖，从而进一步利于其他益生菌的生长。

对比例8与实施例3相比，未添加步骤S6制得的短链脂肪酸组合物，对益生菌的增殖效果下降，对小鼠便秘的治疗效果下降。短链脂肪酸（SCFAs）作为重要的菌群代谢产物，可以驱动宿主与肠道微生物之间的相互作用，其中，乙酸可以被吸收入血液，进入肝中代谢，用于脂质和胆固醇的合成并作为周边组织的能源。丙酸经结肠吸收后可作为糖异生的底物，并能抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶活性而降低胆固醇的合成。丁酸能被结肠上皮细胞吸收利用，是结肠、盲肠能量的首选来源。三者的合适比例下，通过激活G蛋白偶联受体和抑制组蛋白脱乙基酶（HDAC）两条途径抑制肠道炎症，维持结肠上皮细胞屏障功能，还具有抗炎、免疫调节及抗肿瘤等作用。

对比例9与实施例3相比，未添加步骤S7制得的益生元组合物，对益生菌的增殖效果明显下降，对小鼠便秘的治疗效果下降。益生元是被宿主体内微生物选择利用且有益于宿主健康的物质，不同于大多数膳食纤维（果胶、纤维素、木聚糖等）可以促进肠道中大部分微生物的生长，益生元仅选择性地促进宿主体内的有益微生物或者是摄入到体内的益生菌的生长，简而言之，益生元是益生菌的食物。其中，蓝莓多酚可以促进多形拟杆菌的生长，改善肝脏和脂肪组织中的脂代谢，调节肠道菌群；菊粉能有效促进益生菌嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌的增殖，人乳寡糖能显著改善结肠炎，促进凝结芽孢杆菌的增殖，调节肠道菌群、增强免疫应答，三者协同作用下，对于调节肠道菌群比例，平衡肠道微生态，减轻肠道炎症，减少便秘，促进营养吸收，增强免疫等方面均有明显的促进作用。

对比例11与实施例3相比，未添加凝结芽孢杆菌TQ33，对益生菌的增殖效果下降，对小鼠便秘的治疗效果明显下降。凝结芽孢杆菌既能像乳酸菌和双歧杆菌具有益生作用，又具有芽孢菌的抗逆性强、耐高温高压和易贮藏等优点，可以长时间保持丰度不减；能够改善肠道菌群结构、调节肠道功能紊乱、维持肠道内菌群平衡和提高机体免疫水平、促进营养物质代谢和利用。

对比例12与实施例3相比，未进行步骤S9和步骤S10的微胶囊化，直接得到活性组合物，对小鼠便秘的治疗效果下降，这是因为活性物质在胃部就被降解，益生菌失活，从而未能进入肠道发挥作用。其制得的产物在人工胃液、人工肠液中均大量释放，益生菌存活率大大下降。壳聚糖分子链上带有大量的羟基和氨基，本发明壳聚糖经过α-酮戊二酸改性后，表面带有大量的羧基，羧基可与金属离子发生配位交联作用形成稳定的结构，将活性组合物溶于水中，加入羧基化壳聚糖，经过乳化，加入金属离子溶液，羧基化的壳聚糖交联形成微胶囊的壁材，将活性组合物包裹在微胶囊内部，形成从而形成了缓释结构，送入人体后，不易于在胃部被人体分解，从而能在进入肠道后被降解释放出来，使得大量的益生菌、凝结芽孢杆菌、益生元和短链脂肪酸等能直接作用于肠道，起到高效的调节肠道菌群的作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种改善肠道菌群平衡的益生菌剂的制备方法，其特征在于，从甘蔗和山楂中提取得到多糖经过复合酶酶解后，经嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌、多形拟杆菌发酵得到多糖酶解发酵产物，与多糖酶解发酵产物、短链脂肪酸组合物、益生元组合物和凝结芽孢杆菌TQ33混合均匀得到活性组合物，以交联羧基化壳聚糖为壁材，制得改善肠道菌群平衡的益生菌剂；所述复合酶为纤维素酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶的复配混合物。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.甘蔗多糖的提取：将新鲜甘蔗去皮，切段，榨汁，过滤，得到甘蔗汁，加热至35-45℃后加入磷酸，搅拌混合均匀，加入碳酸钠调节溶液pH值为6.9-7.1，加热至55-65℃后加入亚硫酸溶液，搅拌均匀，加入碳酸钠调节溶液pH值为6.9-7.1，加热至75-85℃后加入聚丙烯酰胺溶液，搅拌混合均匀，沉淀，过滤，得到甘蔗清汁；向甘蔗清汁中加入三氯乙酸-乙腈溶液，沉淀，过滤，滤液中加入乙醇，沉淀，离心，沉淀物复溶于水后，再次加入乙醇沉淀，离心，洗涤沉淀物，干燥，得到甘蔗多糖；

S2.山楂多糖的提取：将新鲜山楂去核，干燥，粉碎，得到山楂粉，加入水中，加热至沸腾提取，加入乙醇，沉淀，离心，沉淀物复溶于水后，再次加入乙醇沉淀，离心，洗涤沉淀物，干燥，得到山楂多糖；

S3.甘蔗和山楂多糖的酶解：将步骤S1制得的甘蔗多糖和步骤S2制得的山楂多糖混合溶于水中，加入复合酶酶解，灭酶，过滤，得到甘蔗和山楂多糖的酶解产物；

S4.菌种的活化：将嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌、多形拟杆菌接种于高氏培养基中，微缺氧条件下培养成菌种种子液；

S5.甘蔗和山楂多糖酶解产物的发酵：将步骤S4中制得的嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌、多形拟杆菌菌种种子液接种至步骤S3制得的甘蔗和山楂多糖的酶解产物中，微缺氧条件下发酵培养第一时间段，然后加入含有铁离子和维生素组合物的水溶液，继续发酵培养第二时间段，过滤，浓缩，冷冻干燥，得到多糖酶解发酵产物；

S6.短链脂肪酸组合物的制备：将乙酸、丙酸、丁酸混合均匀，制得短链脂肪酸组合物；

S7.益生元组合物的制备：将菊粉、人乳寡糖、蓝莓多酚混合均匀，制得益生元组合物；

S8.活性组合物的制备：将步骤S5制得的多糖酶解发酵产物、步骤S6制得的短链脂肪酸组合物、步骤S7制得的益生元组合物和凝结芽孢杆菌TQ33混合均匀，制得活性组合物；

S9.羧基化壳聚糖的制备：将壳聚糖溶于酸液中后，加入α-酮戊二酸，加热搅拌反应第一时间段后，加入硼氢化钠，继续搅拌反应第二时间段，加入乙醇，过滤，洗涤，干燥，研细，得到羧基化壳聚糖；

S10.改善肠道菌群平衡的益生菌剂的制备：将步骤S8制得的活性组合物溶于水中，加入羧基化壳聚糖，搅拌混合均匀后，用SPG膜进行快速膜乳化，形成乳液，加入金属离子溶液，常温固化，过滤，干燥，得到改善肠道菌群平衡的益生菌剂。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述亚硫酸溶液的浓度为5-8wt%，所述聚丙烯酰胺溶液的浓度为0.02-0.07%；所述三氯乙酸-乙腈溶液中三氯乙酸和乙腈的体积比为3-5：1；所述甘蔗汁、磷酸、亚硫酸溶液、聚丙烯酰胺溶液的体积比为1000：0.5-1：10-20：0.5-1；所述甘蔗清汁和三氯乙酸-乙腈溶液的体积比为2-5:1；所述乙醇的添加量为加至乙醇的含量为80-85wt%；步骤S2中所述加热至沸腾提取的时间为1-2h；所述乙醇的添加量为加至乙醇的含量为80-85wt%。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述复合酶为纤维素酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶按照质量比为4:2-3:1-2的复配混合物；所述酶解时间为3-5h，酶解温度为40-50℃；所述甘蔗多糖、山楂多糖和复合酶的质量比为2-5:1-3:0.2-0.3。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中所述微缺氧条件为氧气含量为7-12%，二氧化碳含量为3-5%，余量为氮气，其中，%为体积百分比；所述培养的温度为35-38℃，时间为18-24h，所述菌种种子液的含菌量为10⁷-10⁹cfu/mL；步骤S5中所述的嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌、多形拟杆菌的接种量分别为1-3%、2-4%、1-3%；所述微缺氧条件为氧气含量为7-12%，二氧化碳含量为3-5%，余量为氮气，其中，%为体积百分比；所述发酵培养的温度为37-39℃，所述第一时间段为24-36h；所述第二时间段为18-24h；所述含有铁离子和维生素组合物的水溶液中铁离子含量为3-5wt%；维生素组合物为维生素B1和维生素C，含量分别为1-3wt%和3-5wt%。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S6中所述乙酸、丙酸、丁酸的质量比为3-5:1:5-7；步骤S7中所述菊粉、人乳寡糖、蓝莓多酚的质量比为5-7:1-2:2-3；步骤S8中所述多糖酶解发酵产物、短链脂肪酸组合物、益生元组合物和凝结芽孢杆菌TQ33的质量比为10:1-3:3-5:1-2。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S9中所述酸液为1-3wt%的醋酸溶液，所述壳聚糖、α-酮戊二酸、硼氢化钠的质量比为1:2-3:0.2-0.4；所述加热至温度为40-50℃，所述第一时间段为16-20h；所述第二时间段为3-5h；步骤S9中所述活性组合物和羧基化壳聚糖的质量比为10:12-17；所述SPG膜的孔隙为5-10µm；所述金属离子溶液为含有1-3wt%的钙离子、铁离子、锌离子或铜离子溶液；所述固化时间为2-3h。

8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

S1.甘蔗多糖的提取：将新鲜甘蔗去皮，切段，榨汁，过滤，得到1000体积份甘蔗汁，加热至35-45℃后加入0.5-1体积份磷酸，搅拌混合均匀，加入碳酸钠调节溶液pH值为6.9-7.1，加热至55-65℃后加入10-20体积份5-8wt%亚硫酸溶液，搅拌均匀，加入碳酸钠调节溶液pH值为6.9-7.1，加热至75-85℃后加入0.5-1体积份0.02-0.07%聚丙烯酰胺溶液，搅拌混合均匀，沉淀，过滤，得到甘蔗清汁；向2-5体积份甘蔗清汁中加入1体积份三氯乙酸-乙腈溶液，所述三氯乙酸-乙腈溶液中三氯乙酸和乙腈的体积比为3-5：1，沉淀，过滤，滤液中加入乙醇至乙醇的含量为80-85wt%，沉淀，离心，沉淀物复溶于水后，再次加入乙醇至乙醇的含量为80-85wt%，沉淀，离心，洗涤沉淀物，干燥，得到甘蔗多糖；

S2.山楂多糖的提取：将新鲜山楂去核，干燥，粉碎，得到山楂粉，加入水中，加热至沸腾提取1-2h，加入乙醇至乙醇的含量为80-85wt%，沉淀，离心，沉淀物复溶于水后，再次加入乙醇至乙醇的含量为80-85wt%，沉淀，离心，洗涤沉淀物，干燥，得到山楂多糖；

S3.甘蔗和山楂多糖的酶解：将2-5质量份步骤S1制得的甘蔗多糖和1-3质量份步骤S2制得的山楂多糖混合溶于水中，加入0.2-0.3质量份复合酶，40-50℃酶解3-5h，灭酶，过滤，得到甘蔗和山楂多糖的酶解产物；所述复合酶为纤维素酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶按照质量比为4:2-3:1-2的复配混合物；

S4.菌种的活化：将嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌、多形拟杆菌接种于高氏培养基中，微缺氧条件下，35-38℃培养18-24h，得到菌种种子液，含菌量为10⁷-10⁹cfu/mL；

所述微缺氧条件为氧气含量为7-12%，二氧化碳含量为3-5%，余量为氮气，其中，%为体积百分比；

S5.甘蔗和山楂多糖酶解产物的发酵：将步骤S4中制得的嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌、多形拟杆菌菌种种子液接种至步骤S3制得的甘蔗和山楂多糖的酶解产物中，接种量分别为1-3%、2-4%、1-3%，微缺氧条件下，37-39℃发酵培养24-36h，然后加入体系总质量的3-5wt%的含有铁离子和维生素组合物的水溶液，所述含有铁离子和维生素组合物的水溶液中铁离子含量为3-5wt%；维生素组合物为维生素B1和维生素C，含量分别为1-3wt%和3-5wt%；继续发酵培养18-24h，过滤，浓缩，冷冻干燥，得到多糖酶解发酵产物；

所述微缺氧条件为氧气含量为7-12%，二氧化碳含量为3-5%，余量为氮气，其中，%为体积百分比；

S6.短链脂肪酸组合物的制备：将3-5质量份乙酸、1质量份丙酸、5-7质量份丁酸混合均匀，制得短链脂肪酸组合物；

S7.益生元组合物的制备：5-7质量份将菊粉、1-2质量份人乳寡糖、2-3质量份蓝莓多酚混合均匀，制得益生元组合物；

S8.活性组合物的制备：将10质量份步骤S5制得的多糖酶解发酵产物、1-3质量份步骤S6制得的短链脂肪酸组合物、3-5质量份步骤S7制得的益生元组合物和1-2质量份凝结芽孢杆菌TQ33混合均匀，制得活性组合物；

S9.羧基化壳聚糖的制备：将1质量份壳聚糖溶于1-3wt%的醋酸溶液中后，加入2-3质量份α-酮戊二酸，加热至40-50℃，搅拌反应16-20h后，加入0.2-0.4质量份硼氢化钠，继续搅拌反应3-5h，加入乙醇至乙醇的含量为65-70wt%，过滤，洗涤，干燥，研细，得到羧基化壳聚糖；

S10.改善肠道菌群平衡的益生菌剂的制备：将10质量份步骤S8制得的活性组合物溶于水中，加入12-17质量份羧基化壳聚糖，搅拌混合均匀后，用孔隙为5-10µm的SPG膜进行快速膜乳化，形成乳液，加入含有1-3wt%的钙离子、铁离子、锌离子或铜离子溶液，常温固化2-3h，过滤，干燥，得到改善肠道菌群平衡的益生菌剂。

9.一种如权利要求1-8任一项所述的制备方法制得的改善肠道菌群平衡的益生菌剂。

10.一种如权利要求9所述的改善肠道菌群平衡的益生菌剂在制备预防及治疗肠炎、便秘的产品中的应用。

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