CN116751878A - 检测象牙色克罗彭施泰特氏菌的分子标记、试剂盒、方法及应用 - Google Patents

检测象牙色克罗彭施泰特氏菌的分子标记、试剂盒、方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116751878A
CN116751878A CN202310916497.0A CN202310916497A CN116751878A CN 116751878 A CN116751878 A CN 116751878A CN 202310916497 A CN202310916497 A CN 202310916497A CN 116751878 A CN116751878 A CN 116751878A
Authority
CN
China
Prior art keywords
shitai
peng
kit
seq
ivory
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310916497.0A
Other languages
English (en)
Inventor
许正宏
涂荣坤
陆震鸣
唐胜硕
沈才洪
王松涛
张晓娟
柴丽娟
史劲松
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Luzhou Pinchuang Technology Co Ltd
Original Assignee
Jiangnan University
Luzhou Pinchuang Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University, Luzhou Pinchuang Technology Co Ltd filed Critical Jiangnan University
Priority to CN202310916497.0A priority Critical patent/CN116751878A/zh
Publication of CN116751878A publication Critical patent/CN116751878A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及鉴定和/或特异性定量象牙色克罗彭施泰特氏菌的分子标记、试剂盒、方法及应用。为了解决传统微生物特异性检测结果缺乏稳定性和可靠性，且耗时费力的不足，本发明提供一种分子标记和特异性定量象牙色克罗彭施泰特氏菌的试剂盒，并构建了一种用于酿造生产过程或酿造产品中象牙色克罗彭施泰特氏菌的快速鉴定、准确定量的实时荧光定量PCR方法，有助于在酿造生产过程或酿造产品中对该细菌的特异性定量和定性监测。

Description

检测象牙色克罗彭施泰特氏菌的分子标记、试剂盒、方法及 应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及鉴定和/或特异性定量象牙色克罗彭施泰特氏菌的分子标记、试剂盒、方法及应用。
背景技术
象牙色克罗彭施泰特氏菌(Kroppenstedtia eburnea)属于高温放线菌科，在形态上接近放线菌，在自然界中广泛分布，常见于高温环境，如陆生性热泉、高温大曲、堆肥、稻草、甘蔗渣等，内生孢子具有抗性，可在土壤、水或海洋基质中存活。象牙色克罗彭施泰特氏菌为革兰氏阳性菌、化能异养、好氧；嗜热，生长温度在25-50℃(最适温度45℃)；生长pH范围为5-8.5；菌落形态不规则，颜色为象牙色或淡黄灰色，菌落表面有放射状或随机状皱纹。
象牙色克罗彭施泰特氏菌在大曲中大量存在，为高温大曲细菌群落中的高丰度细菌，属于酿造功能微生物。常规扩增子测序技术可以解析样本的物种组成和其相对丰度信息，对微生态研究具有重要的促进作用，但是微生物的相对丰度往往忽视了不同样本之间微生物量存在的差异，而绝对定量分析则是计量样本每种微生物的基因拷贝数或者数目，从而计算出微生物的绝对含量，更能反映样本每种微生物的真实数量和组间样本的真实差异，因此在酿造微生物群落中对象牙色克罗彭施泰特氏菌进行特异性定量分析将有助于酿造生产过程的监测与优化。
对大曲中微生物定量检测的方法，一般采用选择培养基的筛选和纯培养分离计数的方法，但是，该方法受到外界环境因素，菌种特性等影响，检测结果缺乏稳定性和可靠性，且耗时费力，并不能对整个酿造过程中存在的微生物快速进行定量以进行条件的监测与优化。近年来，以实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR，qPCR)为代表的分子生物学技术也逐渐被广泛应用到益生菌的定量检测工作中。由于qPCR技术的简单、定量准确、便宜、重复性较好，利于其鉴定和特异性的定量象牙色克罗彭施泰特氏菌，对于象牙色克罗彭施泰特氏菌在酿造生产过程或酿造产品领域应用具有重要意义。
发明内容
为了解决传统微生物特异性检测结果缺乏稳定性和可靠性，且耗时费力的不足，本发明目的是提供一种分子标记，鉴定和/或特异性的定量和定性检测象牙色克罗彭施泰特氏菌，既提高检测象牙色克罗彭施泰特氏菌含量的准确性、稳定性和可靠性，又节省定量的时间。
第一方面，本发明提供鉴定和/或特异性定量象牙色克罗彭施泰特氏菌(Kroppenstedtia eburnea)的分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
SEQ ID NO：4：
aggcatccgctcctttgtggaacacttgaacaaaaaccgggaaagtctgcatcaaccgccgattttcattgaaggggagaaagaggagctggtggtccagatcgctctccagtacaatgatggattttccagcaacctgtattcctatgccaacaatattcacacccatgagggaggcacccacgaggcgggtttcaagtcggccctcacccgtgtgatcaacgattatgcccggcgtcacaatctgctcaaggagaatgacaacaacctgagcgga
第二方面，本发明还提供鉴定和/或特异性定量象牙色克罗彭施泰特氏菌的分子标记的引物组，含有扩增SEQ ID NO：4所示分子标记的引物对，所述引物对如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。
SEQ ID NO：1：
aggcatccgctcctttgtgg
SEQ ID NO：2：
tccgctcaggttgttgtcattc。
第三方面，本发明还提供鉴定和/或特异性定量象牙色克罗彭施泰特氏菌的试剂盒，其含有如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对，所述引物对扩增SEQ ID NO：4所示分子标记。
进一步地，所述试剂盒还含有荧光基团，选自FAM、VIC、HEX、CY5、TET、JOE、CY3、TAMRA、ROX中的至少一种。
优选地，所述试剂盒还包括SYBR Green Master Mix、标准品DNA和ddH2O。
其中，所述标准品DNA是含有SEQ ID NO：4所示分子标记的质粒。
第四方面，本发明还提供所述试剂盒特异性定量象牙色克罗彭施泰特氏菌的方法，其包括以下步骤：
(1)提取待测样本总DNA；
(2)利用SEQ ID NO：1～2所示的引物对，以步骤(1)获得的总DNA为模板进行荧光定量PCR反应，以式Ι和式Ⅱ确定象牙色克罗彭施泰特氏菌的含量copies/ml；
式Ι：copies/ml＝6.02×10(23)×DNA浓度/MW；
式Ⅱ：MW＝扩增产物碱基数×DNA浓度；
所述待测样本总DNA浓度为50ng/μL～100ng/μL。
进一步地，步骤(2)中，所述荧光定量PCR反应的反应体系为：引物各0.5～1μL，SYBR Green Master Mix 12.5μL，待检测样本中微生物的总DNA 1μL，ddH2O 4.5～10.5μL。
进一步地，步骤(2)中，所述荧光定量PCR反应的反应条件为：95℃预变性2.5～5min；94～95℃变性15s～1min，65℃退火45s，25～40个循环。
本发明还提供上述分子标记、引物组或试剂盒在酿造生产过程或酿造产品上的应用，所述应用是鉴定和/或特异性定量象牙色克罗彭施泰特氏菌。
其中，所述酿造产品包括低、中、高温大曲、酒醅、果酒、白酒、酱油、面包中至少一种。
有益效果：本发明利用基因工程技术设计获得一种能够鉴定和/或特异性定量象牙色克罗彭施泰特氏菌(Kroppenstedtia eburnea)的分子标记，其核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示。同时基于扩增该分子标记的引物对和分子标记设计获得一种能够特异性定量象牙色克罗彭施泰特氏菌的试剂盒，并通过该分子标记或试剂盒构建了一种能用于酿造生产过程或发酵食品中快速鉴定、准确定量象牙色克罗彭施泰特氏菌的实时荧光定量PCR方法，该方法有助于在酿造生产过程或酿造产品中对象牙色克罗彭施泰特氏菌的特异性定量和定性监测。
附图说明
图1为实施例1引物特异性评价，其中，1是Kroppenstedtia eburnea，2是Kroppenstedtia sanguinis，3是Thermoactinomyces vulgaris，4是Thermoactinomycesintermedius，5是Laceyella sacchari，6是Laceyella tengchongensis，7是Virgibacillus necropolis，8是Pediococcus pentosaceus，9是Bacillus sonorensis，10是Bacillus methylotrophicus，11是Staphylococcus saprophyticus，12是Streptomycesalbus，13是Scopulibacillus daqui，14是Oceanobacillus caeni，15是Oceanobacillussojae，16是ddH2O，M是1000bp marker；
图2为实施例1引物有效性评价，其中，1-3是不同低温大曲样品；4-6为不同中温大曲样品，7-9为不同高温大曲样品，10-12为Kroppenstedtia eburnea纯菌株，13为ddH2O，M为1000bp marker；
图3为实施例2中RT-qPCR熔解曲线与标准曲线，其中，A是熔解曲线，横坐标是温度，纵坐标是表示荧光强度的变化值；B是标准曲线，横坐标是每个反应管内荧光值达到阈值时的循环数Cq值，纵坐标是标准品浓度的对数；
图4(A)为不同样本中象牙色克罗彭施泰特氏菌含量，LT、MT、HT分别代表低温大曲、中温大曲和高温大曲，FJQC、FJHX和FJHH分别代表种不同的低温大曲、LJ1、LJ2和LJ3分别代表种不同的中温大曲，ZJB、ZJW和ZJY分别代表种不同的高温大曲，横坐标是不同的样本，纵坐标是样本中象牙色克罗彭施泰特氏菌含量；图(B)代表酒醅堆积发酵过程。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
样品的采集：
高温大曲样品：取样自贵州、江西和四川某白酒生产企业；
中温大曲样品：取样自四川某白酒生产企业；
低温大曲样品：取样自江苏某白酒生产企业；
酒醅堆积发酵过程样品：取样自贵州某白酒生产企业，堆积发酵时间为第1天至第7天；
样品采集后如不能及时提取DNA应立即放入-80℃冰箱保存。
细菌基因组DNA提取：采用细菌基因组提取试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)提取标准菌株基因组DNA；大曲样品中微生物基因组DNA提取采用CTAB法。提取的DNA样品适当稀释后采用NanoDrop 2000确定DNA浓度，以A260/A280评价DNA纯度。
实施例1鉴定象牙色克罗彭施泰特氏菌
一、引物的设计：根据象牙色克罗彭施泰特氏菌的gyrB基因(一种蛋白质编码基因，编码DNA旋酶B亚单位，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示)为模板序列设计特异性引物：KE-P-1f：5'-AGGCATCCGCTCCTTTGTGG-3'(核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)，KE-P-1r：5'-TCCGCTCAGGTTGTTGTCATTC-3'(核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)。扩增片段长度277bp，GC含量51.6％，Tm值89.3℃，不存在互补序列。
二、引物的特异性：根据象牙色克罗彭施泰特氏菌的gyrB基因(一种蛋白质编码基因，编码DNA旋酶B亚单位，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示)为模板序列设计特异性引物：KE-P-1f：5'-AGGCATCCGCTCCTTTGTGG-3'(核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)，KE-P-1r：5'-TCCGCTCAGGTTGTTGTCATTC-3'(核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)。扩增片段长度277bp，GC含量51.6％，Tm值89.3℃，不存在互补序列。
SEQ ID NO：3：
gtgaccgttgagaagaaaaactatgatgaatcgcagattcaggtgctggaggggctggaggcggtccggaagcggcccgggatgtatatcggggccaccagcagccgggggttgcaccacttggtatgggaagtggtcgacaacagtatcgacgaagccttggccggacgctgtgacacgattcaagtgaccgtcaatgaagacaacagtgtcaccgtggaggacaacggacgcggaattccggtggggatccagcccaaggtgggccggcccgcagtggaggtggtgatgaccgtcctccatgccggcgggaaattcgataatgaaggatacaaattttccggcggcctgcacggagtgggcgtatccgtcgtcaatgccctctccgaatggttggaagtgcaagtgaagcgggaagggaaaattcatgtccaacggtatcgaaaaggggtgccggagtccgatctccaagtgaccgggaagacgaaggagacagggacgcgcatcaccttcaaaccggacccggagattttcacagagaccaccgaatatgattatgagatcttgcaaaatcgcctgcgggaattggcatttctcaaccaggggctccggatcatgctgtcggatgaacggggtgaagggaagtccaatgagttcaagtatgacggaggcatccgctcctttgtggaacacttgaacaaaaaccgggaaagtctgcatcaaccgccgattttcattgaaggggagaaagaggagctggtggtccagatcgctctccagtacaatgatggattttccagcaacctgtattcctatgccaacaatattcacacccatgagggaggcacccacgaggcgggtttcaagtcggccctcacccgtgtgatcaacgattatgcccggcgtcacaatctgctcaaggagaatgacaacaacctgagcggagacgacacccgggagggcttgacagccattatcagcatcaaaatcccggatccccagtttgaagggcagaccaagaccaaactgggcaactccgaagcccggacagtgacggaatccattttcgccgaacagttcctcgccttcctggaggagaatcccgcggtctccaaaaaagtgatcaacaaagcggtgatggccgcccgggcacgggaagccgcccgcaaagcacgggagctgacccggcgcaaaaacgccctggaagtgagttccctcccggggaaattggccgactgcacctcccgcaaagcggaaatcagtgaactgtatctggtggagggggattccgcagggggaacggccaagcagggaagggaccgcatgtttcaggcgatcctccccttgcgcggaaagattctcaatgtggagaaggcccggctggataaagccctgtccaatgaagaaatccgcaccatcaccaccgccctgggaaccgggatcggagaggactttcagctggagaaggcccgttatcacaaaatcatgatcatgaccgatgccgatgtggacggagcccatatccgcaccttgctcctcaccttcttttaccggtatatgcgtcctctggttgaagcgggctatgtctatatcgcccagcctcccctctacaagatcacccagggcaaaaaagtcctgtatgcttttgatgaccgggagaaagaaagaatcgtctcagagctggaagacaagggaaaagtggagctgcaacggtataagggtctgggggagatgaccgccacccagctgtgggaaacgacgatggatccggaaagccggacgttgctgcaggtctccctggaggacgccctggatgcggaccaggtctttgaaaccctgatgggagagaaagtggagccacgccgggaatttatccaggagtatgccaagcaggtgcgtaatctggatatctga
以象牙色克罗彭施泰特氏菌Kroppenstedtia eburnea基因组作为阳性对照，高温大曲中常见的14种细菌：血液克罗彭施泰特氏菌(Kroppenstedtia sanguinis)，普通高温放线菌(Thermoactinomyces vulgaris，中间型高温放线菌(Thermoactinomycesintermedius)，甘蔗莱西氏菌(Laceyella sacchari)、腾冲莱西氏菌(Laceyellatengchongensis)，墓地枝芽孢杆菌(Virgibacillus necropolis)，戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)，索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillus sonorensis)，甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)，腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)，白色链霉菌(Streptomyces albus)，大曲岩石芽孢杆菌(Scopulibacillus daqui)，卡氏海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus caeni)和大豆海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus sojae)基因组作为阴性对照，不加样品作为空白对照进行PCR。经Nano Drop 2000测定DNA浓度后将其统一稀释为50ng/μL用作PCR的模板。
反应体系：上下游引物各0.5μL，Taq PCR Mix 12.5μL，模板DNA1μL，ddH2O 10.5μL。
反应条件：95℃预变性2.5min；94℃变性15s，65℃退火45s，72℃延伸2min，40个循环。
利用引物KE-P-1f和KE-P-1r对上述不同菌株基因组DNA分别进行PCR，电泳结果显示在泳道1上出现条带单一且长度近300bp左右，非象牙色克罗彭施泰特氏菌的菌株(泳道2-15)均无目的条带(结果如图1所示)，表明引物KE-P-1f和KE-P-1r的特异性较好。经测序，PCR产物的序列长度277bp。
引物有效性：使用引物KE-P-1f和KE-P-1r对不同种大曲基因组DNA进行PCR扩增，PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果如图2。低温大曲FJQC、FJHX和FJHH，中温大曲LJ1、LJ2和LJ3，高温大曲ZJB、ZJW和ZJY均有条带显示，说明该引物可用于大曲中象牙色克罗彭施泰特氏菌的检测。
实施例2特异性定量象牙色克罗彭施泰特氏菌
以低温大曲、中温大曲和高温大曲样品每个样本的细菌总DNA为模板，使用含有目的片段的单拷贝克隆质粒，作为标准品，测定标准品浓度，并对其进行10倍稀释，设置10个梯度，以不同浓度标准品作为模板进行RT-qPCR。
其中，单拷贝克隆质粒制备方法为：利用SEQ ID NO:1所示特异性引物KE-P-1f和SEQ ID NO:2所示的KE-P-1r对象牙色克罗彭施泰特氏菌进行PCR得到特异性目的片段(核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示)，再将目的片段与pMD19-T Vector连接，获得重组质粒，再将重组质粒转化JM109大肠杆菌感受态细胞，挑取成功转化的转化子进行扩大培养，获得质粒。
上下游引物各0.5μL，SYBR Green Master Mix 12.5μL，模板DNA1μL，ddH2O 10.5μL，反应条件：95℃预变性2.5min，94℃变性15s，65℃退火45s，40个循环；以每个反应管内荧光值达到阈值时的循环数Cq值作为横轴，标准品浓度的对数作为纵轴，绘制定量标准曲线，扩增完成后绘制熔解曲线，RT-qPCR熔解曲线与标准曲线，对于象牙色克罗彭施泰特氏菌的RT-qPCR方法。
引物灵敏度：检测拷贝数在2.089lg(copies·μL-1)-9.089lg(copies·μL-1)范围时，象牙色克罗彭施泰特氏菌Real-time PCR的扩增曲线为一组典型的倒S曲线，扩增曲线基线平整，指数区较明显且陡度大，平台区能够汇于一起，线性范围比较宽。质粒标准品的浓度越高，循环阈值CT越低。获得的标准曲线斜率为-0.3050，截距为11.12，线性R2为0.9990，根据公式E＝10(-k)-1(k-标准曲线的斜率)，算得Real-time PCR的扩增效率为101.8％。另外象牙色克罗彭施泰特氏菌Real-time PCR熔解曲线，在86℃左右出现单一的熔解峰，无引物二聚体及非特异性产物，曲线平稳，峰尖且窄，说明各浓度质粒的熔解温度均一，扩增产物特异性好，以此为基础进行定量是可靠的。
按照公式计算象牙色克罗彭施泰特氏菌的含量：copies/ml＝6.02×10(23)×DNA浓度/MW，MW＝扩增产物的碱基数×DNA浓度。
对低温大曲、中温大曲和高温大曲样品中象牙色克罗彭施泰特氏菌的含量进行测定，阴性对照为无菌水，根据标准曲线计算象牙色克罗彭施泰特氏菌在低温大曲、中温大曲和高温大曲中的含量，结果如图4所示。图4中的(A)中LT、MT、HT分别代表低温大曲、中温大曲和高温大曲，FJQC、FJHX和FJHH分别代表不同的低温大曲、LJ1、LJ2和LJ3分别代表种不同的中温大曲，ZJB、ZJW和ZJY分别代表种不同的高温大曲，图(B)代表酒醅堆积发酵过程。根据特异性引物KE-P-1f和KE-P-1r对上述样品中象牙色克罗彭施泰特氏菌的含量进行测定，根据标准曲线计算出的象牙色克罗彭施泰特氏菌在低温大曲、中温大曲和高温大曲样品中的含量，图4中的(A)中的数据为：低温大曲FJQC中象牙色克罗彭施泰特氏菌含量为4.17±0.29lg(copies/g)，低温大曲FJHX中象牙色克罗彭施泰特氏菌含量为4.15±0.34lg(copies/g)，低温大曲FJHH中象牙色克罗彭施泰特氏菌含量为3.98±0.20lg(copies/g)；中温大曲LJ1中象牙色克罗彭施泰特氏菌含量为7.17±0.04lg(copies/g)，中温大曲LJ2中象牙色克罗彭施泰特氏菌含量为8.30±0.07lg(copies/g)，中温大曲LJ3中象牙色克罗彭施泰特氏菌含量为6.11±0.04lg(copies/g)；高温大曲ZJB中象牙色克罗彭施泰特氏菌含量为9.53±0.01lg(copies/g)，高温大曲ZJW中象牙色克罗彭施泰特氏菌含量为8.62±0.01lg(copies/g)，高温大曲ZJY中象牙色克罗彭施泰特氏菌含量为7.24±0.04lg(copies/g)，说明的就是各样品中含有象牙色克罗彭施泰特氏菌的拷贝数。
图4中的(B)的数据如表1所示：
表1酒醅堆积发酵过程象牙色克罗彭施泰特氏菌含量结果
时间(天) 含量(lg(copies/g干醅))
1 3.94±0.29
2 4.43±0.27
3 5.13±0.24
4 6.19±0.20
5 6.95±0.37
6 7.99±0.30
7 8.07±0.31
实施例3特异性定量象牙色克罗彭施泰特氏菌的试剂盒的制备
试剂盒成分：SEQ ID NO：1～2所示的引物对、SYBR Green Master Mix、标准品DNA(含有SEQ ID NO:4的质粒)和ddH2O。
试剂盒的使用方法：以待检测的样本DNA为模板，利用上述试剂盒进行荧光定量PCR反应，对检测的结果进行分析。按照公式计算象牙色克罗彭施泰特氏菌的含量：copies/ml＝6.02×10(23)×DNA浓度/MW，MW＝扩增产物的碱基数×DNA浓度，计算待检测样品中象牙色克罗彭施泰特氏菌的含量。
其中，所述试剂盒的成分及使用方法与实施例2一致。
需要说明的是，本说明书中描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例以及不同实施例的特征进行结合和组合。

Claims (10)

1.鉴定和/或特异性定量象牙色克罗彭施泰特氏菌(Kroppenstedtia eburnea)的分子标记，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
2.鉴定和/或特异性定量权利要求1所述象牙色克罗彭施泰特氏菌的分子标记的引物组，其特征在于：含有扩增SEQ ID NO：4所示分子标记的引物对，所述引物对如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。
3.鉴定和/或特异性定量象牙色克罗彭施泰特氏菌的试剂盒，其特征在于：含有如SEQID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对，所述引物对扩增权利要求1所述分子标记。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还含有荧光基团，选自FAM、VIC、HEX、CY5、TET、JOE、CY3、TAMRA、ROX中的至少一种。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括SYBR Green MasterMix、标准品DNA和ddH2O；其中，所述标准品DNA是含有SEQ ID NO：4所示分子标记的质粒。
6.权利要求3～5任一项所述试剂盒特异性定量象牙色克罗彭施泰特氏菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)提取待测样本总DNA；
(2)利用SEQ ID NO：1～2所示的引物对，以步骤(1)获得的总DNA为模板进行荧光定量PCR反应，以式Ι和式Ⅱ确定象牙色克罗彭施泰特氏菌的含量copies/ml；
式Ι：copies/ml＝6.02×10(23)×DNA浓度/MW；
式Ⅱ：MW＝扩增产物碱基数×DNA浓度；
所述待测样本总DNA浓度为50ng/μL～100ng/μL。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于：步骤(2)中，所述荧光定量PCR反应的反应体系为：引物各0.5～1μL，SYBR Green Master Mix 12.5μL，待检测样本中微生物的总DNA 1μL，ddH2O 4.5～10.5μL。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于：步骤(2)中，所述荧光定量PCR反应的反应条件为：95℃预变性2.5～5min；94～95℃变性15s～1min，65℃退火45s，25～40个循环。
9.权利要求1所述分子标记、权利要求2所述引物组或权利要求3～5任一项所述试剂盒在酿造生产过程或酿造产品上的应用，其特征在于：所述应用是鉴定和/或特异性定量象牙色克罗彭施泰特氏菌。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于：所述酿造产品包括低、中、高温大曲、酒醅、果酒、白酒、酱油、面包中至少一种。
CN202310916497.0A 2023-07-25 2023-07-25 检测象牙色克罗彭施泰特氏菌的分子标记、试剂盒、方法及应用 Pending CN116751878A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310916497.0A CN116751878A (zh) 2023-07-25 2023-07-25 检测象牙色克罗彭施泰特氏菌的分子标记、试剂盒、方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310916497.0A CN116751878A (zh) 2023-07-25 2023-07-25 检测象牙色克罗彭施泰特氏菌的分子标记、试剂盒、方法及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116751878A true CN116751878A (zh) 2023-09-15

Family

ID=87951511

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310916497.0A Pending CN116751878A (zh) 2023-07-25 2023-07-25 检测象牙色克罗彭施泰特氏菌的分子标记、试剂盒、方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116751878A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112980980B (zh) 一种用于特异性定量金山醋酸乳杆菌的分子标记和试剂盒以及应用
CN114045358B (zh) 基于环介导等温扩增技术检测十二种马铃薯病害病原菌的引物组合物及检测方法
CN112226523B (zh) 耐乙酸乳杆菌特异性检测探针、试剂盒和应用
CN103993071A (zh) 酒醅微生物群落中乳酸菌、梭菌、芽孢杆菌的定量分析方法
CN116751878A (zh) 检测象牙色克罗彭施泰特氏菌的分子标记、试剂盒、方法及应用
CN116219040A (zh) 用于检测植物乳杆菌s58的分子标记、引物探针组和检测方法
KR101961652B1 (ko) 바이셀라 비리데센스의 특이적 프라이머 및 이를 이용한 바이셀라 비리데센스의 검출방법
CN113528614B (zh) 一种植物叶际表面微生物宏基因组检测方法
CN117165698A (zh) 检测血液克罗彭施泰特氏菌的分子标记、试剂盒、方法及应用
US5972617A (en) Oligonucleotides and methods for determining beer spoilage ability of lactic acid bacteria
CN116904624A (zh) 一种用于特异性定量普通高温放线菌的分子标记和试剂盒及其应用
KR102000463B1 (ko) 바실러스 벨레젠시스 특이 검출 및 선발을 위한 마커 및 이를 이용한 분석 방법
CN112695120A (zh) 用于酿酒酵母的快速鉴定及定量的引物、试剂盒、方法
CN112593002A (zh) 一种香菇L135菌株的InDel标记指纹图谱及其构建方法
CN116179722B (zh) 一种用于检测古菌Hadesarchaea的引物对、试剂盒及方法
CN115948595B (zh) 一种基于荧光定量pcr技术定量检测杜鹃花类菌根真菌的引物及检测方法
CN114277170B (zh) 一种检测九种食源性致病菌多重pcr检测用引物及试剂盒
KR102292711B1 (ko) 바실러스 서브틸리스 근연종의 분자적 동정을 위한 프라이머 및 이를 이용한 바실러스 서브틸리스 근연종 동정 방법
KR102301392B1 (ko) 바실러스 터린지엔시스 및 바실러스 세레우스 구별용 프라이머 세트 및 이를 이용하는 방법
KR102237098B1 (ko) 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 프로바이오틱 효모 사카로마이세스 유니스포러스의 검출 및 정량 방법
CN113897456B (zh) 四种杉木炭疽病病原菌的实时荧光pcr检测引物探针组合、检测试剂盒及其应用
CN112626255B (zh) 一种香菇CV108菌株的InDel标记指纹图谱及其构建方法
CN112899388B (zh) 一种香菇香如菌株的InDel标记指纹图谱及其构建方法
CN107828904B (zh) 一种小麦条斑病菌小种分离鉴定方法
CN117604130A (zh) 贝莱斯芽孢杆菌的特异性引物、Taqman探针及实时荧光定量PCR检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination