CN105505927B - 草鱼耐糖性能相关的snp标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种草鱼耐糖性能相关的SNP标记及其应用，包括两个SNP位点H3和H4，所述H3位于SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中自5′端起第1817位，且该位置处碱基为T或C；所述H4位于SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中自5′端起第1818位，且该位置处碱基为G或T。本发明的SNP标记与草鱼耐糖性能密切相关，能够有效用于鉴定或选育耐高糖的草鱼品种。

Description

草鱼耐糖性能相关的SNP标记及其应用

【技术领域】

本发明涉及一种SNP标记及其应用，尤其涉及一种草鱼耐糖性能相关的SNP标记及其应用，属于分子标记领域。

【背景技术】

草鱼(Ctenopharyngodon idella)属雅罗鱼亚科(Leuciscinae)、草鱼属(Ctenopharyngodon)，是我国淡水养殖鱼类中年产量最大的养殖对象，因草鱼生长速度快，肉质鲜美，深受人们喜爱。目前养殖草鱼还有一定的效益空间，但从生产支出看，2008年以来饲料成本不断上涨，饲料成本占了草鱼养殖的70％以上成本。因糖类属于三大营养物质中最廉价的供能物质，生产中经常增加糖的含量来降低饲料成本，虽然草鱼属于草食性鱼类，相对比杂食性鱼类和肉食性鱼类对糖利用能力高，但还是远远低于陆生畜禽类。饲料中糖类水平超过一定限度，会引发鱼类免疫力下降、生长缓慢、死亡率增高等症状。选育出可高效利用高糖饲料的新品种可大幅度降低草鱼养殖成本，因此，开发快速可靠的育种技术，进行草鱼耐高糖品种(系)的培育也是十分必要。

在开展常规选育研究的同时，开发和应用分子标记辅助育种技术可加快草鱼良种选育进程。SNP是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸变异而产生的多态性，位于基因编码区的非同义SNP可导致氨基酸的变化，从而影响蛋白质的功能，特别是发生在结构功能区域的SNP尤其重要，最终引起生物表型的变化。此外，在SNP标记研究和应用中发现，基因组上相邻SNPs的等位位点倾向以整体形式遗传给后代，这种一组相关联的SNPs等位位点被称作单倍型(haplotype)。为了更有效的鉴定与性状密切相关的分子标记，必须对整个基因序列上的SNPs所构成的单倍型进行关联分析。

糖酵解是糖代谢的主要途径之一，丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK，EC2.7.1.40)是催化糖酵解的最后一步的关键酶，其催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)转变为丙酮酸，磷酸烯醇式丙酮酸的高能磷酸键在催化下转移给ADP生成ATP。饲料中糖的含量与鱼类PK的活性密切相关。因此，综合考虑PK在糖代谢过程中重要功能，开展草鱼PK基因多态性的研究很有必要。

【发明内容】

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种草鱼耐糖性能相关、能够有效用于鉴定或选育耐糖性能强的草鱼的SNP标记。本发明通过Bioedit2.0对样品的PKa序列进行比对，找到2个完全连锁的SNP标记的位点，并进一步分析这两个SNP标记组成的基因型与草鱼耐糖性能的关联性，以达到快速鉴别或选育耐糖性强的草鱼的目的。

所述的两个SNP标记的位点分别命名为H3(T+1817C)和H4(G+1818T)，其中，H3(T+1817C)位于SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列(草鱼PK基因片段)中自5′端起第1817位，且该位置处碱基为T或C；H4(G+1817T)位于SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中自5′端起第1818位，且该位置处碱基为G或T。上述两个SNP位点完全连锁组成三种基因型：TTGG、TCGT和CCTT，分别命名为AA，AB和BB，发明人发现，基因型为AA(TTGG)的草鱼耐糖能力显著高于AB(TCGT)和BB(CCTT)草鱼。因此，通过检测草鱼的上述SNP标记的基因型，能够有效确定其耐糖性能，进一步地，本发明的SNP标记能够有效用于草鱼的分子标记辅助育种。进而能够根据实际育种需求对耐糖草鱼进行早期选择，并可以大大节约时间、成本低廉，准确性高。

上述SEQ ID NO：1的核苷酸序列如下(XY表示两个SNP位点)：

ATGCCCCACACTAAAGTTCAAGATATGGGATCTGCCTTCATCCAGACGCAGCAGCTCAACGCTGCCATGGCCGACACCTTCCTGGAGCACATGTGTCTGCTGGACATCGACTCTGAGCCCACCATCGCCCGCAACACTGGGATCATCTGCACCATCGGACCGGCTTCTCGCTCTGTGGACATGCTGAAGGAGATGATCAAGTCTGGCATGAACGTTGCTCGCATGAACTTCTCTCACGGCTCACACGAGTATCATGGAGAGACGATTAAAAATGTACGTGAAGCTTGTGCCAGCTTCCAGCCGGGCAGCATCCACTACAGGCCAGTGGGCATCGCCCTGGATACCAAGGGGCCAGAAATCCGAACCGGGCTCATTAAAGGGAGTGGCACGGCTGAGGTCGAGCTGAAGAAGGGAAATAAGATCAAAGTGACCTTAGATGATTCTTTCATGGAGAGCTGTGATGAGGAAACCCTCTGGCTGGACTACAAGAACATCACCAAGGTGGTGGAAGTGGGCAGTAAAGTCTACATTGATGATGGACTCATTTCTCTCCAGGTCCGAGAGATCGGCTCTGACTATCTGGTGTGTGAAATTGAGAACGGAGGAACTCTGGGTAGCAAGAAGGGTGTCAATCTGCCAGGAGCCGCTGTTGACCTACCTGCCGTTTCGGAAAAAGACATCCAAGACCTGCAGTTTGGTGTAGAGATGGGAGTCGACATGGTCTTTGCCTCCTTTATTCGCAAGGCAGCTGATGTGCATGAAGTTAGAAAGGTGCTCGGAGAGAAGGGCAAGAACATCAAGATCATCAGCAAGCTGGAGAACCACGAGGGTGTGCGCAAGTTTGATGAAATCATGGAGGCCAGTGACGGCATCATGGTTGCTCGTGGTGACCTGGGTATTGAAATCCCCACTGAGAAGGTGTTCCTGGCCCAGAAGATGATGATCGGTCGCTGCAACAAGGCAGGAAAGCCAATCATCTGTGCCACACAGATGCTGGAGAGCATGATCAAGAAGCCTCGTCCTACACGTGCCGAGGGCAGCGACGTGGCCAACGCCGTTCTGGATGGTGCTGACTGCATCATGTTGAGTGGAGAGACTGCAAAGGGAGACTATCCTCTGGAGGCCGTGCGCACCCAGCACATGATCGCTCGCGAGGCAGAGGCAGCCATGTTCCATCGGCAGGTGTTTGAGGACCTGCGTCGCTGTTTGGGCCACTCCACCGACCCCGCCGAGGCCATCGCCATTGGCGCCGTGGAGGCCTCCTTTAAAATCCTGGCCTCTGCGTTTATAGTCCTCACTGGGTCTGGCAGGTCTGCTCATCTGCTCTCCCGGTACCGCCCACGTGCCCCAATCATAGCCGTGACCCGTAACGAGCAGACGGCCCGACAGGCTCATCTGTACCGCGGCATCTTCCCCGTATTCTACAACAACCCCTCTAATGACGTCTGGGCCGAGGATGTGGACCTGCGTGTCAATTTTGCCATGGAAGTTGGTAAAGCTCGTGGATTCTTCAAGACCGGTGATGTCGTCATCGTCCTGACCGGCTGGCGCCCAGGTTCCGGTTACACCAACACCATGCGCGTCGTCCCGGTGCCATAAGCGCCACAGGACCGTAACGCACTCCTCTACTGTTCATACATCACTCCCCTCCCTCACTCCCGCCCCTCCCCGACTCAAACAGGCTTACCAGACTGGTGACCTGATGTCATCACAGAAGCCTGGCTCCTCCCACACAGGCCAGTGGACCATCATCACTTAGACGTTCTCACTTTTTTTTCATTTTCAGTCTCAATGGCACACTTGCCAACCATAATCTXYTTCATCCATGGTTGTTACTCATTAAAGCAGAGCTGTCTGTGCGCTTGTCTGTCTGCATGTCTGGCACAGAGACGGGTCGTGAACGTGACCATTGAACAAACAGCAGCTTACTGAAACTAACCTTCTCCTTTAACAGTTCCCGAGTGGCGAAGGGCTCACGCGTGACTCTAGTTTGTGTTGTTTTTATTTGTAGTGTGCGCTTTATTTGCACCGTGTCTGTGTTCACACTCCTTATGATGTTACATTCTGTGTTGCACTAGACCATGAGACCATTTTGTTTGGGATGAGGCAACCAATGTGCTACAGTAAATATATTTTTTTGAAATGTTGACGTTGGGATGTCCAGCTCATTTCATTTGTGTCTGAGTAGGAGAACGATGATGAGCGAGAGATGAATATTGATTGAGCAGCAATGGTCACATTCCCAGCCATCTCTCCTGTTCATTTCCTTTCTCTCTGCTGCTCGTGTGTGTGTTTGAGTGAGAGTGTGTGTGTTTAGATCTACCCGCTTTGTGTCGCTAGGGTGCAAGATGTACTTATAACTGTAAGAGAAAACTATAGTATCATCTGAAGTGTTGTATTATTCAAGACTGAATTAATAAAGGAGATGAGCATCTGTCCAGAAAAAA

本发明的另一目的是提供用于获得上述SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的引物对1，所示引物对1具有SEQ ID NO：2-3所示的核苷酸序列，具体地，引物对1的序列如下：

上游引物：GGCATCTTCCCCGTATTCT(SEQ ID NO：2)下游引物：

CATCATCGTTCTCCTACTCAG(SEQ ID NO：3)

本发明的另一目的是提供一种用于检测上述SNP标记的引物对2，利用引物对2能够有效地对上述SNP标记位点所在的片段进行PCR扩增，达到快速检测SNP标记的基因型、降低检测成本的目的。所述引物对2具有SEQ ID NO：4-5所示的核苷酸序列，具体地，引物对2的序列如下：

上游引物：GCCACAGGACCGTAACGCACTC(SEQ ID NO：4)

下游引物：GACAAGCGCACAGACAGCTCTGCTTTAATGAGTAACAACCATGGATGTA(SEQ ID NO：5)

本发明的另一目的是提供所述SNP标记在鉴别或选育耐高糖草鱼品种中的应用。本发

明的另一目的是提供所述引物对1和引物对2在鉴别或选育耐高糖草鱼品种中的应用。

本发明的另一目的是提供一种鉴定草鱼耐糖性能的方法，具体包括以下步骤：

(1)提取待测草鱼的DNA；

(2)利用上述引物对1，将待测草鱼的DNA进行PCR扩增，以获得SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列产物；

(3)利用上述引物对2，将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列进行PCR扩增，并在引物对2的下游引物的3’端引入一个错配碱基，以使其扩增产物可以被BsrGI限制性内切酶进行识别；

(4)利用BsrGI限制性内切酶对步骤(3)获得的扩增产物进行酶切，酶切产物利用琼脂糖凝胶电泳并在紫外灯下显色，如果具有216bp单条谱带，则其SNP标记为AA(TTGG)基因型，其对应的草鱼个体为耐高糖品种，有266bp和216bp两条谱带的为AB(TGCT)基因型，具有266单条谱带的为BB(CCTT)基因型，其对应的草鱼为非耐高糖品种。进一步

的，提取待测草鱼DNA的方法不受特别限制，可以采用任何已知的DNA提取方

法或试剂盒进行。本发明实施例中采用常规酚氯仿方法抽提待测草鱼的DNA。

进行酶切的条件不受特别限制，本发明实施例中优选的酶切体系为：ddH₂O 43μL，限制性内切酶1ul，PCR产物1ul，10×Buffer 5ul；酶切反应条件优选为37℃15min。

进一步的，琼脂糖凝胶电泳的优选条件为：2％琼脂糖凝胶，100V，60min。

本发明的优点及有益效果：

本发明利用分子遗传学及分子生物学的方法获得草鱼耐糖性能相关的SNP标记，依据丙酮酸激酶基因内部产生的碱基突变，因此不存在遗传的交换，也不需要表型的进一步验证。利用本发明的标记可以简单快速的鉴定耐高糖草鱼，同时也可以利用该标记指导选育耐糖草鱼新品系。

【具体实施方式】

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。在未作说明的情况下，本发明采用的试剂、设备和方法均为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。

实施例1

1饲料准备购买进口鱼粉、豆粕、酒糟、面粉、豆油、磷酸二氢钙、氯化胆碱、食盐、预混料(多维、多矿)，在珠江水产研究所饲料厂将这些饲料原料混合均匀后，加适量的水搅拌均匀，用制粒机制成两种颗粒大小为5mm左右的颗粒，将制好的颗粒饲料放入烘箱中，56℃恒温干燥24h，烘干后放入-20℃保存备用。将烘干后的饲料送广州分析测试中心检测其主要成分，分析结果见表1，这两种饲料的糖含量分别为39.4g/100g和45.4g/100g，分别记为普通饲料和高糖饲料。

表1实验饲料的组成成分

2实验鱼养殖

从现有的珠江水产研究所良种基地、广东海大集团百容水产种苗有限公司草鱼繁育群体中，选取400尾体长、体质量较为均匀的鱼，体重为43±0.5g，随机分成2组(普通组和高糖组)，每组200尾草鱼，饥饿24小时后进行初始体重的测量，并给每尾鱼打入电子芯片标记后分别饲养在2个260cm×300cm×150cm的水泥池内。用2种不同糖水平的人工配合饲料喂养8周，在饲养过程中，保持两组鱼的饲养条件基本一致，每天早晚各投喂一次，饲养过程中做好病害预防工作和水质调控管理。喂养结束以后，扫描电子芯片，记录每尾鱼的体质量，并剪取每尾鱼的尾鳍保存于无水乙醇中用于后续实验分析。

3样品DNA的提取

(1)取待检测鱼的鳍条组织3mg剪碎后，加入0.5mL的裂解液(10mmol/L Tris-HCl；0.1mol/L EDTA；0.5％SDS；30mg/L RNase；100mg/L蛋白酶K，pH8.0)，55℃消化1小时，其间不时轻轻摇动；

(2)加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，颠倒混匀，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液，再用氯仿抽提一次，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液；

(3)加入2倍体积的无水乙醇，室温静置10分钟沉淀DNA，12000转/分钟离心10分钟；

(4)用70％乙醇洗涤1次，12000转/分钟离心2分钟，吸去上清，室温静置干燥10分钟，加入50μl TE(10mmol/L Tris－HCl；1mmol/L EDTA，pH8.0)溶解DNA，4℃贮存备用。

4、草鱼PK基因的获取：利用引物对1，将待测草鱼的DNA进行PCR扩增，以获得SEQID NO：1所示的核苷酸序列，即草鱼PK基因片段。

本实施例中PCR扩增的反应体系如下：

名称	浓度	体积
			ddH2O		14.9μL
10×PCR Buffer		2.0μL
			MgCl2	25mmol/L	0.8μL
4×dNTP	10mmol/L	0.3μL
			Taq酶	5U/μL	0.2μL
上、下游引物	10μmol/L	0.4μL
			模板DNA	40ng/μL	1.0μL

反应条件为：(1)94℃预变性4min，(2)94℃变性30s，(3)57℃退火30s，(4)72℃延伸45s；(5)循环步骤2)～4)32次，(6)72℃延伸7min。

5、SNP标记基因片段扩增：利用上述引物对2，将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列进行PCR扩增，并在引物对2的下游引物的3’端引入一个错配碱基，以使其扩增产物可以被BsrGI限制性内切酶进行识别。PCR扩增的反应体系和反应条件同4，引物对2对应的DNA片段位置如下，获得的扩增产物大小为266bp。

上游引物：GCCACAGGACCGTAACGCACTC

ACACCATGCGCGTCGTCCCGGTGCCATAAGCGCCACAGGACCGTAACGCACTCCTCTACTGTTCATACATCACTCCCCTCCCTCACTCCCGCCCCTCCCCGACTCAAACAGGCTTACCAGACTGGTGACCTGATGTCATCACAGAAGCCTGGCTCCTCCCACACAGGCCAGTGGACCATCATCACTTAGACGTTCTCACTTTTTTTTCATTTTCAGTCTC

注：方框内的碱基为人工引入的错配碱基，XY为两个SNP标记位点H3(T+1817C)和H4(G+1818T)，X处为T或G，Y处为C或T。

6、基因型判定

利用BsrGI限制性内切酶对上述5中的266bp扩增产物进行酶切(本实施例优选的酶切体系为：ddH₂O 43μL，限制性内切酶1ul，PCR产物1ul，10×Buffer 5ul；酶切反应条件为37℃15min)。酶切产物利用2％琼脂糖凝胶，于100V，60min条件下电泳，在紫外灯下显色。

由于上述两个SNP位点完全连锁，H3(T+1817C)和H4(G+1818T)组成三种基因型AA(TTGG)、AB(TGCT)和BB(CCTT)，而BsrGI限制性内切酶的酶切位点为因此，AA基因型的所有核苷酸链均具有酶切位点，得到的酶切产物包括216bp片段和50bp片段；AB基因型的一部分部分核苷酸链具有酶切位点，另一部分核苷酸链没有酶切位点，酶切产物包括266bp片段、216bp片段和50bp片段；而BB基因型不具有酶切位点，酶切产物只有266bp片段。因为266bp和216bp差异较小，为了用琼脂糖进行完全区分，电泳时间需要跑60min，50bp片段已经跑出凝胶外，所以在凝胶图谱上观察到AA基因型为216bp单条谱带；AB基因型为266bp和216bp双条谱带；BB基因型为266bp单条谱带。所以根据各草鱼的凝胶图谱判定其SNP标记位点的基因型，并利用Popgene(Version3.2)分析处理等位基因频率(等位基因频率＝等位基因的样本数/总样本数)，统计结果如表2所示。

表2SNP位点在两组草鱼群体中的基因型频率

7、SNP标记的基因型与草鱼耐糖性能的关联性验证

根据前期记录的每尾鱼的体质量，统计分析所述草鱼PKa基因中SNP标记位点的基因型与草鱼耐糖性能的关联性，结果表3所示。在饲喂普通饲料的群体中，不同基因型在体质量上差异不显著(P>0.05)，但AA型增重率分别比AB型和BB型高4.9％和6.1％。而在饲喂高糖饲料的群体中，基因型AA的体质量显著大于AB型和BB型(P<0.05)，AA型的增重率

分别比AB型和BB型高36.8％和30.4％，AB型和BB型无之间无显著差异(P>0.05)。说明具有AA(TTGG)基因型的草鱼耐糖能力比较强，与预期一致。

表3SNP标记的基因型与草鱼耐糖性能的关联性

基因型	普通群体体质量/g	基因型	高糖群体体质量/g
				AA(62)	104.70±1.44	AA(41)	111.75±1.50b
AB(53)	101.84±1.25	AB(37)	93.24±1.01a
				BB(9)	101.15±1.33	BB(4)	95.69±1.02a

以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种草鱼耐糖性能相关SNP标记，其特征在于，所述标记为包括两个SNP位点H3和H4的SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述H3位于SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中自5′端起第1817位，且该位置处碱基为T或C；所述H4位于SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中自5′端起第1818位，且该位置处碱基为G或T。

2.根据权利要求1所述的SNP标记，其特征在于，TTGG基因型个体的耐糖能力显著高于TCGT基因型和CCTT基因型个体。

3.一种用于扩增权利要求1所述SNP标记的片段的引物对1，其特征在于，所述引物对1为SEQ ID NO：2-3所示的核苷酸序列。

4.一种用于检测权利要求1所述SNP标记的引物对2，其特征在于，所述引物对2为SEQID NO：4-5所示的核苷酸序列。

5.权利要求1或2所述SNP标记在鉴别或选育耐高糖草鱼品种中的应用。

6.权利要求3所述引物对1在鉴别或选育耐高糖草鱼品种中的应用。

7.权利要求4所述引物对2在鉴别或选育耐高糖草鱼品种中的应用。

8.一种鉴定草鱼是否为耐高糖品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测草鱼的DNA；

(2)利用权利要求3所述的引物对1，将待测草鱼的DNA进行PCR扩增，以获得SEQ ID NO：1所示的核苷酸片段产物；

(3)利用权利要求4所述的引物对2，将步骤(2)得到的产物进行PCR扩增，并在引物对2的下游引物的3’端引入一个错配碱基，以使获得的扩增产物可以被BsrGI限制性内切酶进行识别；

(4)利用BsrGI限制性内切酶对步骤(3)获得的扩增产物进行酶切，酶切产物利用琼脂糖凝胶电泳并在紫外灯下显色，如果具有216bp单条谱带，其对应的草鱼个体为耐高糖品种；如果具有266bp和216bp两条谱带或266单条谱带，其对应的草鱼个体为非耐高糖品种。

9.根据权利要求8所述的鉴定草鱼是否为耐高糖品种的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，酶切体系为：ddH₂O 43μL，限制性内切酶1μL，PCR产物1μL，10×Buffer 5μL，反应温度为37℃，反应时间为15min。

10.根据权利要求8所述的鉴定草鱼是否为耐高糖品种的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，酶切产物利用2％琼脂糖凝胶，在100V条件下电泳60min。