CN103146659A

CN103146659A - 与黄瓜果实β胡萝卜素含量相关的SNP标记及其应用

Info

Publication number: CN103146659A
Application number: CN2013100487361A
Authority: CN
Inventors: 黄三文; 张忠华; 尚轶; 沈嫡
Original assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-02-06
Filing date: 2013-02-06
Publication date: 2013-06-12

Abstract

本发明提供了一种与黄瓜果实β胡萝卜素含量相关的SNP标记及其应用，其位于编码黄瓜Csa3G183920蛋白的基因序列第770bp处，此处碱基为A的黄瓜果实β胡萝卜素含量高，果肉颜色呈橙黄色；此处碱基为C的黄瓜β胡萝卜素含量低，果肉颜色为白色。本发明利用变异组学和群体遗传学等方法筛选到与黄瓜果实β胡萝卜素含量及果肉颜色性状相关的SNP标记，并通过生物化学方法阐明了Csa3G183920通过降解β胡萝卜素调控果实颜色的分子机制。通过测序或dCAPS等方法检测待测黄瓜的基因型，根据基因型即可判断黄瓜果实β胡萝卜素含量高低以及果肉颜色，从而加快高营养黄瓜品种的培育进程。

Description

与黄瓜果实β胡萝卜素含量相关的SNP标记及其应用

技术领域

本发明属于基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及一种与黄瓜果实β胡萝卜素含量及果肉颜色性状相关的SNP标记及其应用。

背景技术

β胡萝卜素是类胡萝卜素家族中的典型代表，是人体健康不可缺少的营养素之一。在绝大部分黄瓜品种中，果实中的β胡萝卜素含量非常低，但在适应西双版纳地区种植的黄瓜品种中，果实β胡萝卜素的含量非常高，果肉颜色呈橙黄色。果实颜色与β胡萝卜素的含量呈正相关，β胡萝卜素含量高，则果肉颜色深。为了提高黄瓜果实的营养价值，育种家们一直在努力尝试将西双版纳黄瓜品种高β胡萝卜素含量这一特性转入其它黄瓜品种中。传统的遗传研究发现果实颜色是由一个隐形ore基因控制的（Cuevas等）。在黄瓜全基因组和高分辨率SSR遗传图谱陆续公布之后，研究人员将ore基因定位在3号染色体的SSR20710-SSR11633之间（Bo等）。然而由于尚未找到控制果肉颜色的ore基因，因此有关β胡萝卜素如何在西双版纳黄瓜果实中大量积累等分子机制还不清楚，导致相关的分子育种工作进展缓慢。

发明内容

本发明的目的是提供一种与黄瓜果实β胡萝卜素含量及果肉颜色性状相关的SNP标记及其应用。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种黄瓜Csa3G183920蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明还提供编码所述Csa3G183920蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供含有编码所述Csa3G183920蛋白的基因的载体。

本发明还提供含有编码所述Csa3G183920蛋白的基因的转基因细胞系。

本发明还提供含有编码所述Csa3G183920蛋白的基因的工程菌。

本发明还提供含有编码所述Csa3G183920蛋白的基因的转化植物细胞。

本发明还提供编码所述Csa3G183920蛋白的基因在下调黄瓜果实β胡萝卜素含量中的应用。

本发明还提供编码所述Csa3G183920蛋白的基因在调控黄瓜果肉颜色性状中的应用。

进一步地，本发明提供一种与黄瓜果实β胡萝卜素含量相关的SNP标记，其位于黄瓜Csa3G183920基因序列第770bp处，此处碱基为A的黄瓜果实β胡萝卜素含量高，果肉颜色呈橙黄色；此处碱基为C的黄瓜β胡萝卜素含量低，果肉颜色为白色；所述黄瓜Csa3G183920基因序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供用于检测上述述与黄瓜果实β胡萝卜素含量相关的SNP标记的引物对，包括正向引物F5’-GGCTTGTTCCTGGACTCTGCTTTGG-3’和反向引物R5’-AAGAAAAGTTTACCTGGTGAGCAGC-3’。

本发明还提供上述与黄瓜果实β胡萝卜素含量相关的SNP标记在鉴定黄瓜品种中的应用，其包括步骤：1）提取待测黄瓜的基因组DNA；2）以待测黄瓜的基因组DNA为模板，利用上述引物F和R，进行PCR扩增反应；3）检测PCR扩增产物，如果扩增产物序列第338bp处碱基为A，则待测黄瓜属于富含β胡萝卜素的黄瓜品种，如果扩增产物序列第338bp处碱基为C（SEQ ID No.3），则待测黄瓜属于果实中β胡萝卜素含量低的黄瓜品种。

本发明还提供含有上述引物F和R的用于检测黄瓜品种的试剂盒。优选所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液等中的至少一种。更优选所述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明提供了一种与黄瓜果实β胡萝卜素含量及果肉颜色性状相关的SNP标记及其应用，即根据基因型进行富含β胡萝卜素黄瓜品种的选育，从而加快黄瓜育种进程。

首先对114份黄瓜核心种质资源进行重测序分析。该114份黄瓜根据各自基因组的特点可以分为4个群体：印度、西双版纳、东亚、欧美型（Lv等）。其中印度群体是野生型黄瓜，其它3个群体均从印度黄瓜进化而来（图1）。为了适应当地的自然环境以及受到人文因素影响，不同群体的黄瓜以各自不同的方式进化。其中西双版纳黄瓜果实中β胡萝卜素含量非常高，果肉呈现橙红色。为了寻找控制黄瓜果实β胡萝卜素含量及果肉颜色性状相关的分子标记，首先利用生物信息学分析，寻找西双版纳群体与其它3个群体中存在的异义突变。通过这种方法，一共发现有49个SNP符合筛选标准。而其中一个SNP就位于之前定位的ore基因范围内（图2）。该SNP导致Csa3G183920蛋白257位的氨基酸发生改变。在西双版纳群体中，该位点为天冬氨酸，而在其它3个群体中则均为丙氨酸。因此Csa3G183920基因极有可能是之前要找的ore基因。进一步利用生化实验，证明了Csa3G183920蛋白是β胡萝卜素羟化酶，能够通过降解β胡萝卜素生成玉米黄质导致果肉颜色发生改变（图3）。此外，在西双版纳群体中，果实成熟时Csa3G183920基因的表达量几乎没有变化。而在其它3个群体中，果实成熟时Csa3G183920基因表达量迅速上升，加快了β胡萝卜素的降解过程，最终导致果实中β胡萝卜素含量下降，果肉颜色变浅。图4为本发明利用qPCR检测黄瓜果实发育不同时期Csa3G183920基因的表达情况。可以看出，在果实发育后期，Csa3G183920基因在西双版纳群体中表达变化不大，果肉呈橙黄色；而在东亚群体中迅速增加，最终导致黄瓜果实无β胡萝卜素积累，呈白色。通过以上实验，阐明了β胡萝卜素在西双版纳黄瓜中大量积累导致果实颜色呈现橙红色的分子机制。同时开发出与β胡萝卜素含量及果肉颜色共分离的SNP标记，可用于后期分子育种。

本发明可替代传统的鉴定黄瓜果实β胡萝卜素含量以及果实颜色的方法。在黄瓜果实未成熟前，即可根据基因型进行判断，完全排除人为因素的影响，结果更加准确可靠。可用于大规模筛选育种材料，大大加快高营养黄瓜的育种进程。

本发明首次克隆了控制黄瓜果实颜色性状相关的ore基因，阐明了黄瓜果实中β胡萝卜素含量积累及果实颜色改变的分子机制。而以往的研究仅确定了ore基因在染色体上的位置，并不清楚基因的序列及功能。

本发明还开发了与β胡萝卜素含量及黄瓜果肉颜色性状相关的SNP标记。与之前开发的与果肉颜色性状相关的SSR标记（Bo等）相比，SNP标记的遗传稳定性比SSR等遗传标记高得多，在进行遗传分析或基因诊断时的重现性和准确性都优于SSR，适于更准确、更加快捷的用于后期分子辅助育种工作中。

附图说明

图1为本发明实施例1中利用生物信息学方法分析黄瓜核心种质资源重测序的数据结果。

图2为本发明实施例1中利用生物信息学分析发现的西双版纳群体与其它3个群体完全不同的异义突变在黄瓜染色体上的分布情况（菱形点），其中一个SNP就位于之前定位的ore基因范围内。

图3为本发明实施例3中利用HPLC检测含有野生和突变的Csa3G183920基因大肠杆菌工程菌中的化学成分。Csa3G183920蛋白催化菌内β胡萝卜素降解生成玉米黄质。而突变后β胡萝卜素不能够被降解，菌体内无玉米黄质或隐黄质生成。正对照样品为表达拟南芥中的β胡萝卜素羟化酶，它催化β胡萝卜素降解生成隐黄质。

图4为本发明利用qPCR检测果实发育不同时期Csa3G183920基因的表达情况。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（New York:Gold Spring Harbor Laboratory Press,1989）。

实施例1与黄瓜果实β胡萝卜素含量及果肉颜色性状相关的SNP标记的获得

从世界各地采集了3000多份黄瓜资源，从其中挑选114份作为黄瓜核心种质资源，它们代表了80%的遗传多样性（Lv等）。对每份资源进行重测序，产生5G左右的数据量，平均覆盖10x的黄瓜基因组。根据计算出的Fst值的大小，可以将世界上的黄瓜资源分为3个栽培群体和1个野生群体（图1）。为了适应当地的自然环境以及受到人文因素影响，这3个栽培群体发生了各自独立的进化。其中，西双版纳群体中果实β胡萝卜素含量很高，果肉颜色呈现橙红色，其它群体均没有这种特点。因此利用生物信息学，设定Fst=1，进一步寻找西双版纳群体与其它3个群体之间不同的异义突变。通过这种方法，共发现有49个SNP符合筛选标准。Bo等利用SSR标记，通过图位克隆的方法把控制果肉颜色的基因定位在3号染色体的SSR20710-SSR11633之间。而本发明发现的49个SNP中有一个SNP位于该区间（图2），因此，该SNP与果肉颜色性状共分离。进一步分析发现，该SNP位于Csa3G183920基因外显子上，导致Csa3G183920蛋白257位的氨基酸发生改变。在19份西双版纳群体中，重测序结果显示在Csa3G183920基因第770bp处碱基均为A，相应位点的氨基酸为天冬氨酸，而在其它3个群体，对95份黄瓜材料重测序结果显示该位点为C，相应地，氨基酸变为丙氨酸，因此推测Csa3G183920基因极有可能就是之前寻找的ore基因。

实施例2黄瓜Csa3G183920基因的获得

利用引物5’-GCCTCTCCGCCGCCACTCTC-3’和5’-TCAAGAACCATCTATTGATTTTCGAGCCGT-3’，分别从西双版纳和东亚黄瓜果实cDNA中扩增出突变的和野生型Csa3G183920基因，连接到T载体（TAKARA）上，测序保证无突变。

黄瓜Csa3G183920基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

实施例3利用生化实验验证Csa3G183920基因的功能

利用引物5’-CGGGATCCATGGCGGCCGGCCTCTCCGCCGCCACTC-3’和5’-ACGCGTCGACTCAAGAACCATCTATTGATTTTCGAGCCGT-3’，将野生型和突变的Csa3G183920基因构建到原核表达载体pET32（Novogen）上，测序鉴定正确后转入工程改造后的大肠杆菌中（Schwartz等）。这种大肠杆菌可以表达β胡萝卜素合成酶，使菌体内产生过量的β胡萝卜素，菌体颜色呈橙黄色。诱导Csa3G183920基因在菌体内表达，Csa3G183920蛋白具有β胡萝卜素羟化酶的活性，则可以降解β胡萝卜素，导致菌的颜色变浅。进一步用HPLC检测菌的化学成分，发现有玉米黄质产生，确定Csa3G183920可以降解β胡萝卜素生成玉米黄质，而突变的Csa3G183920则完全丧失催化功能（图3）。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.黄瓜Csa3G183920蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.含有权利要求2所述基因的载体。

4.含有权利要求2所述基因的转基因细胞系。

5.权利要求2所述基因在下调黄瓜果实β胡萝卜素含量中的应用。

6.权利要求2所述的基因在调控黄瓜果肉颜色性状中的应用。

7.一种与黄瓜果实β胡萝卜素含量相关的SNP标记，其特征在于，其位于编码黄瓜Csa3G183920蛋白的基因序列第770bp处，此处碱基为A的黄瓜果实β胡萝卜素含量高，果肉颜色呈橙黄色；此处碱基为C的黄瓜β胡萝卜素含量低，果肉颜色为白色；所述编码黄瓜Csa3G183920蛋白的基因序列如SEQ ID No.2所示。

8.用于检测权利要求7所述与黄瓜果实β胡萝卜素含量相关的SNP标记的引物对，其特征在于，包括正向引物F5’-GGCTTGTTCCTGGACTCTGCTTTGG-3’和反向引物R5’-AAGAAAAGTTTACCTGGTGAGCAGC-3’。

9.权利要求7所述与黄瓜果实β胡萝卜素含量相关的SNP标记在鉴定富含β胡萝卜素黄瓜品种中的应用，其包括步骤：

1）提取待测黄瓜的基因组DNA；

2）以待测黄瓜的基因组DNA为模板，利用权利要求8所述引物F和R，进行PCR扩增反应；

3）检测PCR扩增产物，如果扩增产物序列第338bp处碱基为A，则待测黄瓜属于富含β胡萝卜素的黄瓜品种，如果扩增产物序列第338bp处碱基为C，则待测黄瓜属于果实中β胡萝卜素含量低的黄瓜品种。

10.权利要求7所述与黄瓜果实β胡萝卜素含量相关的SNP标记在黄瓜分子标记辅助育种中的应用。