CN103387979A - 一种提高鲤鱼体重的胰岛素样生长因子受体2基因位点 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种能显著提高鲤鱼体重的胰岛素样生长因子受体2基因位点，属于鱼类育种领域，是一种能够显著提高鲤鱼体重的分子标记，该标记杂合型的比例与不同世代体重的大小排序是一致的，根据这个原理可通过提高群体中杂合型的比例来获得群体生长性能的提高。

Description

一种提高鲤鱼体重的胰岛素样生长因子受体2基因位点
 
技术领域
本发明涉及一种能显著提高鲤鱼体重的胰岛素样生长因子受体2基因位点，是考虑从分子标记的角度显著提高鲤鱼体重的方法，属于鱼类分子辅助育种领域。
 
背景技术
在鲤生产中种质混杂现象比较严重，造成成鱼规格不齐，经济效益不高，而提高生长速度依然是渔业生产关心的主要问题。与生长紧密相关的胰岛素样生长因子系统是一类小分子单链多肽物质，被证明在多种动物中对生长发育具有重要调控作用，包括胰岛素样生长因子1、胰岛素样生长因子2、胰岛素样生长因子结合蛋白、胰岛素样生长因子1受体以及胰岛素样生长因子2受体。其中IGF2基因对生长速度的标记作用成为近年来的研究热点，其主要靠其受体胰岛素样生长因子2受体（insulin like growth factor receptor 2, IGF2R）进行信号转导。单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism, SNP）是第三代分子遗传标记，SNP数据构建高密度的遗传连锁图谱可以更精确地进行标记辅助选择。因此，通过SNP来检测IGF2R基因对鲤生长速度的标记作用是研究该基因功能以及开展分子辅助育种的重要途径。
 
发明内容
本发明的目的是针对鲤生长选育中的分子标记筛选的问题，提供一种通过IGF2R基因的一个SNP位点进行分子辅助选择的方法，是一种可用于待选育鲤植入特异性标记的方法。
一种提高鲤鱼体重的胰岛素样生长因子受体2基因位点，所述的基因位点是鲤鱼IGF2R基因的第130位的为G或者T的snp位点。
本发明的另一个目的是提供了上述基因位点的PCR检测试剂盒，其特征在于，包括如下检测用引物：上游引物：5'-->3' ATGACAGCCCATGGTACAAGGATCTGT(SEQ NO.1)；下游引物：5'-->3' ACCGCGCTTTCTTTTCCACATTCTGT(SEQ NO.2)。
进一步地，上述检测试剂盒中还包括有：10×buffer 15 μL，25mmol/L的Mg2+1μL，各2mmol/L的dNTPs 1 μL，10 mmol/L的上游引物1uL、10 mmol/L的下游引物1μL、模板 DNA 1 μL，TaqDNA聚合酶1U，其余为dd H2O，总量25μL。
本发明还提供了上述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
以包含鲤鱼IGF2R基因的待测全基因组DNA为模板，以引物对目标基因组进行PCR扩增，再进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行PCR产物的切胶回收及纯化、测序。
进一步地，上述的PCR 反应程序为： 94℃预变性3 min；94℃变性20s，温度66℃退火20s，72℃延伸30s，33个循环；72℃延伸10min。
进一步地，上述琼脂糖凝胶电泳中使用的是8%非变性聚丙烯酰胺凝胶。
本发明提供的提高鲤鱼体重的胰岛素样生长因子受体2基因位点，可以用于鲤鱼分子育种或辅助选择的分子标记。
 
技术效果
用该分子标记，可通过检测所关注群体的杂合型来进行家系选育中的早期选择，也可在选配中提供分子依据。此种分析方法还可应用于选育不同世代中提高GT杂合型、降低GG纯合型来提高后代的生产性能。
 
附图说明
图1是上游引物和下游引物的PCR扩增部分结果
图上方数字表示样品编号，M表示marker；左边数字表示marker对应的条带大小
图2是Loc130基因型间体重差异的显著性分析
具体实施方式
针对分子辅助育种的特点，为了控制试验误差，要求在整个选育过程中，营养等环境因子尽可能的保持一致。具体操作步骤如下：
（1）本实验选用的鲤均养殖于中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴屺亭养殖试验基地，随机选取的实验群体为连续三代的群体。选取经过家系选育，并随机挑选的连续三代群体。实验样本共选取108个，样本分别来自于不同的世代，其中，世代一F1采样40个，世代二F2采样28个，世代三F3采样40个。进行体重称重时，三个世代的样品均为2龄鱼，采用丁香油与乙醇的混合液将福瑞鲤鱼麻醉后，采用电子天平称量体重（精确到1g）。均采用剪取尾鳍的方式，采样的同时记录采样个体的性别。剪取的尾鳍立即于95%的酒精中固定，采样完毕，样品置于-20℃冰箱保存。按照DNA提取试剂盒说明书提取DNA。
（2）根据基因库中斑马鱼IGF2R基因（NM_152968）序列设计引物，PCR 反应体系为 25uL，包括10×buffer 15 uL，Mg2+（25m mol/L）1uL，dNTPs（各2mmol/L ）1 uL，上下游引物（10 mmol/L ）各1uL模板 DNA 1 uL，TaqDNA聚合酶(Promega)1U, dd H2O；扩增反应均在TAKARA公司PCR仪（参考）上完成。
所用上下游引物如下：
上游引物：5'-->3' ATGACAGCCCATGGTACAAGGATCTGT；
下游引物：5'-->3' ACCGCGCTTTCTTTTCCACATTCTGT。
PCR 反应程序为： 94℃预变性3 min；94℃变性20s，温度66℃退火20s，72℃延伸30s，33个循环；72℃延伸10min。将反应后的 PCR 产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合goldview显色进行检测。
获得PCR扩增产物，结果如图1所示。可见条带清晰、单一，表明PCR扩增有效，获得单一的IGF2R第一内含子的DNA片段，条带大小显示约为500bp，将样品送测序。
（3）在（2）的基础上，将成功测序的108个样本的序列使用DNAMAN V6软件进行序列比对，一致性达77.17%，并通过Chromas2.22软件核查，在约500bp的范围内共获得SNP位点8个，根据这8个位点在测序结果中出现位置分别命名为Loc84、Loc106、Loc119、Loc130、Loc145、Loc163、Loc167、Loc265(Loc后的数字代表相应的SNP位点在序列中的位置)。利用SAS软件分析8个SNP位点与体重间的相关性，只发现Loc130两种基因型GG和GT之间体重具有显著性差异，并且杂合子GT体重高于GG。如表1所示，对Loc130的两种基因型在3代中分布进行统计，纯合型GG频率高达87.96%。
经检测，随机选取的这些群体，全部108个样本中的G/T杂合子的平均体重与G/G纯合子的平均体重的柱状图对比如图2所示，从图中可以看出，G/T杂合子的平均体重明显大于G/G纯合子的平均体重。另外，各个世代之间存在有一定的差异，其中世代一最大，世代二居中，世代三最小，这是抽取的样本有关。但是，单独从各个世代来看，G/G纯合样本与G/T杂合样本之间的体重存在有明显的差异，总体的趋势是杂合子的平均体重大于纯合子的平均体重。
表1 Loc130基因型在3代中的分布情况(P>0.05)
综合以上步骤，我们可以得到一种能显著提高鲤鱼体重的胰岛素样生长因子受体2基因位点，该位点杂合可以使得样本量为108的鲤群体体重增加，并且在各代中的比例与选取群体体重平均值大小趋势一致，这也从另一方面说明杂合子对体重的标记作用。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  中国水产科学研究院淡水渔业研究中心
 
<120>  一种提高鲤鱼体重的胰岛素样生长因子受体2基因位点
 
<130>  none
 
<160>  2    
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
<210>  1
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
atgacagccc atggtacaag gatctgt                                           27
 
 
<210>  2
<211>  26
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
accgcgcttt cttttccaca ttctgt                                            26
 
 

Claims (7)

1. 一种提高鲤鱼体重的胰岛素样生长因子受体2基因位点，其特征在于：所述的基因位点是鲤鱼IGF2R基因的第130位的为G或者T的snp位点。
2. 一种检测权利要求1所述的提高鲤鱼体重的胰岛素样生长因子受体2基因位点的试剂盒，其特征在于，包括如下检测用引物：
上游引物：5'-->3' ATGACAGCCCATGGTACAAGGATCTGT；
下游引物：5'-->3' ACCGCGCTTTCTTTTCCACATTCTGT。
3. 根据权利要求2所述的检测提高鲤鱼体重的胰岛素样生长因子受体2基因位点的试剂盒，其特征在于，还包括有10×buffer 15 μL，25mmol/L的Mg2+1μL，各2mmol/L的dNTPs 1 μL，10 mmol/L的上游引物1uL、10 mmol/L的下游引物1μL、模板 DNA 1 μL，TaqDNA聚合酶1U，其余为dd H2O，总量25μL。
4. 一种根据权利要求2所述的检测提高鲤鱼体重的胰岛素样生长因子受体2基因位点的试剂盒的使用方法，其特征在于:包括如下步骤：以包含鲤鱼IGF2R基因的待测全基因组DNA为模板，以引物对目标基因组进行PCR扩增，再进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行PCR产物的切胶回收及纯化、测序。
5. 根据权利要求4所述的检测提高鲤鱼体重的胰岛素样生长因子受体2基因位点的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述的PCR 反应程序为： 94℃预变性3 min；94℃变性20s，温度66℃退火20s，72℃延伸30s，33个循环；72℃延伸10min。
6. 根据权利要求4所述的检测提高鲤鱼体重的胰岛素样生长因子受体2基因位点的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述的琼脂糖凝胶电泳中使用的是8%非变性聚丙烯酰胺凝胶。
7. 权利要求1所述的提高鲤鱼体重的胰岛素样生长因子受体2基因位点在鲤鱼分子育种或辅助选择的分子标记中的应用。
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