KR101412064B1

KR101412064B1 - 아귀 원산지 판별용 폴리뉴클레오티드 및 이를 이용한 아귀 원산지 판별방법

Info

Publication number: KR101412064B1
Application number: KR1020140006755A
Authority: KR
Inventors: 황창남; 문성필
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2014-01-20
Filing date: 2014-01-20
Publication date: 2014-08-06
Also published as: KR20140024937A

Abstract

본 발명은 아귀(blackmouth angler)의 원산지를 판별할 수 있는 폴리뉴클레오티드 및 이를 이용한 아귀 원산지 판별방법에 대한 것으로, 특히 아귀 원산지 판별에 유용하게 이용될 수 있는 단일뉴클레오타이드다형성(SNP, Single Nucleotide Polymorphism) 마커, 이를 이용한 아귀의 원산지 판별 방법 및 이 방법에 사용되는 키트에 관한 것이다. 본 발명에서 제공되는 단일뉴클레오타이드 변이에 의한 SNP 마커를 사용하면 아귀의 원산지를 추적할 수 있다.

Description

아귀 원산지 판별용 폴리뉴클레오티드 및 이를 이용한 아귀 원산지 판별방법{Polynucleotide for identifying origin of blackmouth angler and Method for identifying origin of blackmouth angler the same}

본 발명은 아귀(blackmouth angler)의 원산지를 판별할 수 있는 폴리뉴클레오티드 및 이를 이용한 아귀 원산지 판별방법에 대한 것으로, 특히 아귀의 원산지를 정확하고 간단하게 판별할 수 있는 것이다.

전 세계적으로 분포하는 아귀품종은 아귀목 아귀과에 속하는 약 12과 60속 약 315종이 대륙붕에서 대륙붕사면의 상부 흙모래 바닥 환경에 서식하며, 주로 한국, 일본에서 호주에 이르는 태평양 서부 및 인도, 아프리카 동부를 포함하는 인도양, 대서양 등 세계 전역에 분포한다.

그 중에서도 대서양 서부의 아메리카황 아귀(Lophius americanus)와 동양의 아귀(Lophiomus setigerus)종 등이 주로 식용으로 이용된다. 국내에서는 주로 아귀 찜이나 탕으로 요리되고 있으며, 외국에서도 식용으로 쓰이는데 북미, 유럽 등지에서 머리는 스프의 재료, 담백한 살은 굽거나 쪄서 즐겨 먹는 것으로 알려져 있다.

NCBI Nucleoite에 보고되어 있는 Lophius americanus(accession: NC_004380.1)와 Lophiomus setigerus(accession:NC_008125.1)는 약 73%의 유전적 유사도가 나타났고, Miya 등(BMC Evolutionary Biology 2010)의 연구보고에 의하면 Lophiomus종과 Lophius종이 유사종으로 구분되어 있으며, CO유전자를 분석하면 두개 품종이 동일한 유전자를 가지고 있는 것으로 나타났다.

그러나, 국내에서 주로 유통되는 아귀는 대부분 절단상태로 유통되고, 가격면에서 국내산과 외국산의 차이가 없거나 오히려 외국산이 비싼 경우도 있어서, 원산지 둔갑 및 허위표시 문제가 있는바, 아귀의 원산지 또는 품종을 간단하고 용이하게 판별할 수 있는 기술이 필요하다.

이에, 본 발명자는 Lophius americanus종과 Lophiomus setigerus을 포함하는 아귀의 원산지를 간단하고 용이하게 판별할 수 있는 유전자 마커를 개발을 하고자 하였다.

본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 아귀의 원산지를 정확하고 간단하게 판별할 수 있는 폴리뉴클레오티드 및 이를 이용한 아귀 원산지 판별방법을 제공하는 것이 목적이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 아귀의 단일뉴클레오타이드다형성 마커를 제공하고, 상기 마커를 이용한 아귀의 원산지 판별방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 일 실시형태는, 서열번호 1의 54번째 뉴클레오타이드, 67번째 뉴클레오타이드, 103번째 뉴클레오타이드, 121번째 뉴클레오타이드, 122번째 뉴클레오타이드, 133번째 뉴클레오타이드, 148번째 뉴클레오타이드, 205번째 뉴클레오타이드, 307번째 뉴클레오타이드, 339번째 뉴클레오타이드, 393번째 뉴클레오타이드, 446번째 뉴클레오타이드, 447번째 뉴클레오타이드, 또는 452번째 뉴클레오타이드를 포함하는 8~100개의 연속 뉴클레오타이드로 구성되며 아귀 원산지 판별에 유용한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적(complementary) 폴리뉴클레오티드이다.

일 구체예로써, 본 발명은 서열번호 2의 54번째 뉴클레오타이드, 55번째 뉴클레오타이드, 56번째 뉴클레오타이드, 57번째 뉴클레오타이드, 58번째 뉴클레오타이드, 59번째 뉴클레오타이드, 60번째 뉴클레오타이드, 61번째 뉴클레오타이드, 62번째 뉴클레오타이드, 63번째 뉴클레오타이드, 81번째 뉴클레오타이드, 157번째 뉴클레오타이드, 160번째 뉴클레오타이드, 173번째 뉴클레오타이드, 241번째 뉴클레오타이드, 301번째 뉴클레오타이드, 340번째 뉴클레오타이드, 및 393번째 뉴클레오타이드를 포함하는 연속 뉴클레오타이드로 구성되며 아귀 원산지 판별에 유용한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적(complementary) 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

일 구체예로써, 본 발명은 서열번호 3의 39번째 뉴클레오타이드, 54번째 뉴클레오타이드, 73번째 뉴클레오타이드, 100번째 뉴클레오타이드, 114번째 뉴클레오타이드, 259번째 뉴클레오타이드, 265번째 뉴클레오타이드, 267번째 뉴클레오타이드, 274번째 뉴클레오타이드, 289번째 뉴클레오타이드, 295번째 뉴클레오타이드, 305번째 뉴클레오타이드, 393번째 뉴클레오타이드, 또는 399번째 뉴클레오타이드를 포함하는 8~100개의 연속 뉴클레오타이드로 구성되며 아귀 원산지 판별에 유용한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적(complementary) 폴리뉴클레오티드인 것도 가능하다.

본 발명의 다른 실시형태는, 서열번호 4의 염기서열이나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 5의 염기서열이나 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드;를 쌍으로 포함하는 아귀 원산지 판별용 프라이머이다.

본 발명의 또 다른 실시형태는, 아귀에서 핵산분자를 분리하는 단계; 및 상기 분리한 핵산분자에 대하여, 상기 서열번호 1 내지 3의 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 뉴클레오타이드의 염기타입을 확인하는 단계;를 포함하는 아귀 원산지 판별 방법이다.

이러한 본 발명에 의하면, 아귀의 원산지를 정확하고 간단하게 판별할 수 있는 폴리뉴클레오티드 및 이를 이용한 아귀 원산지 판별방법을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 아귀 원산지 판별에 유용하게 이용될 수 있는 단일뉴클레오타이드다형성(SNP, Single Nucleotide Polymorphism) 마커, 이를 이용한 아귀의 원산지 판별 방법 및 이 방법에 사용되는 키트를 제공할 수 있다. 본 발명에서 제공되는 단일뉴클레오타이드 변이에 의한 SNP 마커를 사용하면 아귀의 원산지를 추적하는 것도 가능하다.

도 1은 본 발명에 따른 유전자 마커를 선별하기 위하여, 랜덤(random) 프라이머를 이용하여 증폭시킨 한국, 미국, 브라질 아귀 증폭 산물의 전기영동 결과 일례를 나타내는 사진이고,
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 1 내지 서열번호 3의 염기서열과 이에 따른 컨센서스(consensus)를 나타내는 모식도이고,
도 3은 본 발명의 비교예로써 서열번호 6 및 서열번호 7의 프라이머를 이용하여 증폭시킨 한국, 미국, 브라질 아귀 증폭 산물의 전기영동 결과를 나타내는 사진이고,
도 4는 본 발명의 비교예로써 서열번호 8 및 서열번호 9의 프라이머를 이용하여 증폭시킨 한국, 미국, 브라질 아귀 증폭 산물의 전기영동 결과를 나타내는 사진이고,
도 5는 본 발명의 비교예로써 다범위 적용 프라이머(URP1)를 이용하여 증폭시킨 한국, 미국, 브라질 아귀 증폭 산물의 전기영동 결과를 나타내는 사진이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시 예를 가질 수 있는 바, 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.

본 명세서에서 용어, "뉴클레오타이드"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

그리고, 본 명세서에서 용어 "핵산분자"는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, ChemicalReviews, 90:543-584(1990)).

본 명세서에서, 용어 "프로브"는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 바람직하게는, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이다. 프로브는 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오타이드이다.

본 발명의 명세서에서 용어 "프라이머(primer)"는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로서, 적합한 조건 (4 가지의 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 또는 RNA 폴리머라아제와 같은 중합효소의 존재), 적합한 온도 및 적합한 버퍼하에서 주형-지시적 DNA 합성을 개시할 수 있는 개시점으로서 작용하는 것을 의미한다.

본 발명은 서열번호 1의 54번째 뉴클레오타이드, 67번째 뉴클레오타이드, 103번째 뉴클레오타이드, 121번째 뉴클레오타이드, 122번째 뉴클레오타이드, 133번째 뉴클레오타이드, 148번째 뉴클레오타이드, 205번째 뉴클레오타이드, 307번째 뉴클레오타이드, 339번째 뉴클레오타이드, 393번째 뉴클레오타이드, 446번째 뉴클레오타이드, 447번째 뉴클레오타이드, 및/또는 452번째 뉴클레오타이드를 포함하는 8~100개의 연속 뉴클레오타이드로 구성되며, 아귀 원산지 판별용 폴리뉴클레오티드 또는 이것의 상보적(complementary) 폴리뉴클레오티드이다.

그리고, 본 발명의 다른 일 구체예는, 서열번호 2의 54번째 뉴클레오타이드, 55번째 뉴클레오타이드, 56번째 뉴클레오타이드, 57번째 뉴클레오타이드, 58번째 뉴클레오타이드, 59번째 뉴클레오타이드, 60번째 뉴클레오타이드, 61번째 뉴클레오타이드, 62번째 뉴클레오타이드, 63번째 뉴클레오타이드, 81번째 뉴클레오타이드, 157번째 뉴클레오타이드, 160번째 뉴클레오타이드, 173번째 뉴클레오타이드, 241번째 뉴클레오타이드, 301번째 뉴클레오타이드, 340번째 뉴클레오타이드, 및/또는 393번째 뉴클레오타이드를 포함하는 8~100개의 연속 뉴클레오타이드로 구성되며 아귀 원산지 판별에 유용한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 일 구체예는, 서열번호 3의 39번째 뉴클레오타이드, 54번째 뉴클레오타이드, 73번째 뉴클레오타이드, 100번째 뉴클레오타이드, 114번째 뉴클레오타이드, 259번째 뉴클레오타이드, 265번째 뉴클레오타이드, 267번째 뉴클레오타이드, 274번째 뉴클레오타이드, 289번째 뉴클레오타이드, 295번째 뉴클레오타이드, 305번째 뉴클레오타이드, 393번째 뉴클레오타이드, 및/또는 399번째 뉴클레오타이드를 포함하는 8~100개의 연속 뉴클레오타이드로 구성되며 아귀 원산지 판별에 유용한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드인 것도 가능하다.

본 발명자들은 원산지를 달리하는 아귀집단에서 원산지에 따라 서로 구분되는 다수의 염기서열, 즉 새로운 단일뉴클레오타이드다형성(SNP) 마커를 발견하였다. 이러한 마커는 아귀 원산지에 따라 서로 다른 염기를 가지는바, 상기 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 프라이머 또는 프로브로 사용하면, 아귀의 원산지를 간단하고 용이하게 판별하는 것이 가능하다.

상기와 같은 SNP 마커를 찾기 위하여, 본 발명자들은 다수의 랜덤(random) 프라이머를 이용하여 원산지가 다른 아귀의 염기서열을 분석하였고, 그 분석결과를 바탕으로 아귀 원산지 구별이 가능한 프라이머를 제작하였다. 그 중에서도 본 발명자들은 서열번호 4의 제1 폴리뉴클레오티드와 상기 서열번호 5의 제2 폴리뉴클레오티드를 프라이머 쌍으로 사용하여, 아귀 핵산 분자를 증폭시키면, 그 증폭된 산물이 상기 아귀의 원산지에 따라 다르다는 것을 확인한 후 본 발명을 완성하였다.

이에 따라, 본 발명의 다른 일 구체예는, 서열번호 4의 염기서열이나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 5의 염기서열이나 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드;를 쌍으로 포함하는 아귀 원산지 판별용 프라이머일 수 있다. 상기 제1폴리뉴클레오티드는 정방향 또는 역방향 프라이머이고, 상기 제2폴리뉴클레오티드는 역방향 또는 정방향 프라이머로 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 본 발명은 서열번호 4 및 서열번호 5의 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드를 프라이머 쌍으로 사용하는 것을 특징으로 하며, 이러한 프라이머를 이용하면 아귀의 원산지를 정확하고 간단하게 판별할 수 있다.

본 발명의 SNP 마커는 아귀에 적용되며, 바람직하게는 국내산, 브라질산 및/또는 미국산 아귀에 적용된다.

한편, 본 발명의 다른 실시형태는, 아귀에서 핵산분자를 분리하는 단계; 및 상기 분리한 핵산분자에 대하여, 상기 서열번호 1 내지 3의 뉴클레오타이드 중 상기 지정된 위치에 해당하는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 염기타입을 확인하는 단계;를 포함하는 아귀 원산지 판별 방법이다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 핵산분자는 아귀의 다양한 소스로부터 얻을 수 있으며, 예컨대, 근육, 표피, 혈액, 뼈, 장기로부터 얻을 수 있고, 가장 바람직하게는 근육 또는 혈액으로부터 얻는다. 본 발명의 방법에서 출발물질이 gDNA인 경우, gDNA의 분리는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Rogers & Bendich (1994)). 출발물질이 mRNA인 경우에는, 당업계에 공지된 통상의 방법에 총 RNA를 분리하여 실시된다 (참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 분리된 총 RNA는 역전사 효소를 이용하여 cDNA로 합성된다. 상기 총 RNA는 동물세포로부터 분리된 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)).

그런 다음에서는, 상기 분리한 핵산분자의 특정 서열을 규명한다. 즉, 상기 분리한 핵산분자의 상기 서열번호 1 내지 서열번호 3의 지정된 위치에 해당하는 뉴클레오타이드의 염기타입을 확인하는 것이다. 아귀 원산지에 따라 상기 지정된 위치에 해당하는 뉴클레오타이드의 염기서열이 다르므로, 원산지를 알고자 하는 아귀의 상기 염기서열을 확인하면 아귀의 원산지 구분이 가능하고, 이것을 미리 기 저장된 원산지별 아귀 염기서열과 비교함으로써 정확한 원산지 판별이 가능하다.

상기 분리한 핵산분자의 특정 서열을 규명하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 응용될 수 있는 기술은, 형광 인 시투 혼성화 (FISH), 직접적 DNA 서열결정, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석 (SSCA, Orita et al., PNAS, USA 86:2776(1989)), RNase 보호 분석 (Finkelstein et al., Genomics, 7:167(1990)), 닷트 블롯 분석, 변성 구배 젤 전기영동 (DGGE, Wartell et al., Nucl.Acids Res., 18:2699(1990)), 뉴클레오타이드 미스매치를 인식하는 단백질 (예: E. coli의 mutS 단백질)을 이용하는 방법 (Modrich, Ann. Rev. Genet., 25:229-253(1991)), 및 대립형-특이 PCR을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

그러면, 아귀의 원산지에 따라 다른 서열변화가 단일-가닥 분자내 염기 결합의 차이를 초래하여, 이동성이 다른 밴드를 출현하게 하는데, SSCA는 이 밴드를 검출한다. DGGE 분석은 변성 구배 젤을 이용하여, 야생형 서열과 다른 이동성을 나타내는 서열을 검출한다. 다른 기술들은 일반적으로 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 프로브 또는 프라이머를 이용할 수 있다. 예를 들어, RNase 보호 분석에서, 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 리보프로브가 이용된다. 상기 리보프로브와 식물체로부터 분리한 DNA 또는 mRNA를 혼성화시키고, 이어 미스매치를 검출할 수 있는 RNase A 효소로 절단한다. 만일, 미스매치가 있어 RNase A가 인식을 한 경우에는, 보다 작은 밴드가 관찰된다.

혼성화 시그널(hybridization signal)을 이용하는 분석에서는, 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 프로브가 이용된다. 이러한 기술에서, 프로브와 타깃 서열의 혼성화 시그널을 검출하여 직접적으로 SNP 변이체 여부를 결정한다.

본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 SNP를 포함하는 서열에 완전하게 (perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로 (substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다.

바람직하게는, 본 발명에 이용되는 프로브는 본 발명의 서열번호 1 내지 서열번호 3의 서열 중 어느 하나의 서열의 SNP 뉴클레오타이드를 포함하는 8-100 개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 서열에 혼성화될 수 있는 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 프로브의 3'-말단 또는 5'-말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스 (duplex)의 안정성은 말단의 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 3'-말단 또는 5'-말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다. 혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach , IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건 (stringent condition)은 온도, 이온세기 (완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 이러한 유전자 증폭은 본 발명의 SNP 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머쌍(primer pair)을 기본적으로 이용한다.

바람직하게는 서열번호 4의 제1 폴리뉴클레오티드와 상기 서열번호 5의 제2 폴리뉴클레오티드를 프라이머 쌍으로 이용하는 것이 가능하다. 이에 따라, 아귀에서 분리한 핵산분자의 지정된 위치에 해당하는 뉴클레오타이드의 염기타입을 확인하는 것은, 상기 분리한 핵산분자를, 서열번호 4의 염기서열이나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머와 서열번호 5의 염기서열이나 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머로 증폭시킨 증폭 산물을 얻고, 이렇게 얻은 증폭 산물의 염기서열을 분석함으로써 이루어지는 것이 가능하다.

프라이머의 적합한 길이는 사용하고자하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30bp의 길이로서 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.

본 발명의 방법에 이용될 수 있는 증폭 기술은 PCR 증폭 (참조: Miller, H. I. (WO 89/06700) 및 Davey, C. et al. (EP 329,822)), 리가아제 체인 반응 (LCR, Wu, D.Y. et al., Genomics 4:560 (1989)), 중합효소 리가아제 체인 반응 (Barany, PCR Methods and Applic., 1:5-16(1991)), Gap-LCR (WO 90/01069), 리페어체인 반응 (EP 439,182), 3SR (Kwoh et al., PNAS, USA, 86:1173(1989)) 및 NASBA (U.S. Pat. No. 5,130,238)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는 PCR 증폭 단계에 따라 증폭한다. 증폭기술이 적용되는 경우에, 본 발명의 SNP 염기를 확인하기 위해 적합한 프라이머를 디자인하는 것이 중요하다. PCR에 의한 증폭 반응의 조건 및 사용되는 시약과 효소는 당업계에서 통상적으로 공지된 것을 사용할 수 있다.

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1: DNA 추출 , PCR 반응 및 sequencing 분석 방법

아귀 원산지별로 꼬리, 몸통 등 가식부위(근육)만을 1cm³ 크기로 토막·절단하고, 50ml 튜브에서 개별처리하였다. 처리시료는 장기간 보존을 위해 -70℃의 초저온냉동고에 보관하였다. 개체당 동일하게 0.03g을 계측하여 유전자분석에 이용하였고, 유전자추출은 DNeasy Blood & Tissue kit(Cat. No69506, Qiagen, German)를 이용하였으며, 분리된 유전자는 UV 분광광도계(ND-1000, Nano-drop, USA)로 유전자 농도를 측정하여 30ng/ul만을 정량한 후 유전자분석을 실시하였다.

또한, 프라이머를 이용하여, 아래와 같은 조건의 방법으로 PCR 반응을 DNA Engine(MJ Research사, 미국)에서 시행하였다.

반응조성	반응조건
멸균증류수 11.5ul 10X buffer 5ul 2mM dNTP 4ul 10uM forward 1ul 10uM reverse 1ul 1unit Ex-Taq 0.25ul 정제 DNA 8ul	94℃, 5분	1 cycle
	94℃, 30초 55℃, 30초 72℃, 45초	35 cycle
	72℃, 15 분	1 cycle

PCR이 끝난 후에는, 자동전기영동장치(Qiaxcel, Qiagen, Germany)를 통해 결과를 PCR 밴드로 확인하였다. 그리고, 이렇게 얻은 PCR 산물을 지앤시바이오사(대전, 대한민국)에 의뢰하여 염기서열을 분석하였다.

실시예 2: 유전자 마커 선발

국내산, 미국산, 브라질산 등의 아귀를 대상으로, 다음과 같은 과정을 통해 원산지별로 유전자를 분리하여 유전자마커를 선발하였다.

먼저, 원산지별 아귀에 대하여 랜덤 프라이머를 이용해서 동일한 PCR 조건과 정량된 gDNA유전자로 PCR을 수행했을 때, 원산지에 따라 특이적으로 단일 유전자 밴드(band)나 특이 위치에서 발현되는 20여개의 유전자를 유전자마커 후보군으로 1차 선발 분리하였다. 즉, 랜덤(random) 프라이머인 SUP primer(SRILS Uni- primer kit, Cat. SS4101, SEOULIN Scientific Co. Ltd., Korea)와 MUP primer(MUP strain-typing kit, TK6100, TaKaRa, Japan)를 이용해서 상기 아귀를 대상으로 PCR을 수행하였다. 상기 SUP primer와 MUP primer는 10 여개의　pirmer 들이 혼합된 키트이다. 도 1은 본 발명에 따른 유전자 마커를 선별하기 위하여, 랜덤(random) 프라이머를 이용하여 증폭시킨 한국, 미국, 브라질 아귀 증폭 산물의 전기영동 결과 일례를 나타내는 사진이다.

그러면, 다양한 PCR 밴드들이 나오는데　그 PCR 밴드가 3개 나라별 샘플에서 모두 나온 PCR 밴드와, 2개 지역의 샘플에서만 나온 PCR 밴드와, 한국산에서만 나논 PCR 밴드로 구분하였고, 각 PCR 밴드를 겔 추출(gel　extraction)한 후 염기서열분석(sequencing)을 실시하였다.

실시예 3: 프라이머 합성

그런 다음, 상기 실시예 2에 따른 염기서열분석 결과로부터 2차 프라이머를 제작하여 원산지 특이적 밴드를 선발하고자 하였다.

즉, 상기 1차 선발된 마커 후보군 유전자 20여 개 중에서 2차 선발을 위하여, 상기 염기서열분석하여 도출된 결과로부터 다음과 같은 2차 프라이머를 제작하였다. 프라이머는 바이오니아사(대한민국)를 통하여 합성하였다.

제1 프라이머 쌍 : 전위 프라이머(10-3-3F) CCTCTGCAGCTTCTCCA(서열번호 4)

후위 프라이머(10-3-3R) GATAACAGGCTCCTTGCA(서열번호 5)

제2 프라이머 쌍 : 전위 프라이머(26-3-1F) TgTcTggggTTcTAgTcA(서열번호 6)

후위 프라이머(26-3-1R) gggTAAgATggATTccA(서열번호 7)

제3 프라이머 쌍 : 전위 프라이머(26-3-2F) TgTcTggggTTcTAgTcA(서열번호 8)

후위 프라이머(26-3-2R) TATcAgcAcgTccTAccA(서열번호 9)

실시예 4: 원산지 판별

상기 실시예 3의 2차 프라이머(제1, 2, 3 프라이머 쌍) 각각으로 다시 아귀에서 추출한 DNA를 증폭시키는 PCR을 수행하였고, 그 PCR 산물을 전기영동하여 원산지별로 구분가능한 단일 밴드가 형성되는 유전자 및 그 조건을 결정하였다.

하기 표 2는 본 발명에 따른 상기 제1 프라이머 쌍으로 한국산, 브라질산, 미국산 아귀 각각에 대하여 얻은 PCR 산물의 염기서열 분석 결과이다.

원산지	염기서열
국내산 (Korea X0)	GTCTTTGAGACTTTTATCAGGGATCCCGATGAGAAGTGAGTTACAGTAATCCAGTCTGGAGGAGACAAACGCGTGGACCAGCTTTTCAGCATCACTCAAGGTGAGTGAAGAACGGAGTTTGGAAATATTTCTGAGATGGTGAAAGGAGATCTTGCAGATGTGTTTGATGTGGGATTCAAAAGTGAGTTGAGGGTCAAATCTTACGCCGAGGTTGGTGACTGATGAAGAGAGGGGAATGTCGTGACCAGAGAAGGTAATACTGGTTATGGAGGAAGACTGGGTCTGATGTGGGGTGCCAATTAAAATTGCTTCGGTTTTGGAGCTGTTCAACTGGAGAAAGTTGTTTTTCATCCACACCTTTATCTCCTCCAGACAAGCGCGGAGAGTTGACAGGGGAGATGATGATGACGATGAGGATGGAGAGGCTGAGGAGGAACTTGTGTCTTTTTTTATGTAGATTTGCTGCCCTCAAAATAACTAAAAGTACGAAGTAAACTAGTCAAGAAAACCCTGTACGTCAAATCCATCCGTCCACGCCTTGGAATCGGA
브라질산 (Brazil)	GTCTTTGAGACTTTTATCAGGGATCCCGATGAGAAGTGTGTTACAGTAATCCAATCTGGAGGAGACGAACGCCTGGACCAGCTTTTCAGCATCACTCAACGTTAGTGAAGAACAGAGTTTCAAAATATTTCTAAGATGGTGAAAGGACATCTTGCAGATGTGTTTGATGTGGGATTCAAAAGTGAGTTGAGGGTCAAATCTTACACCGAGGTTGGTGACTGATGAAGAGAGGGGAATGTCGTGACCAGAGAAGGTAATGCTGGTCACGGAGGAGGACTGGGTCTGATGAGGGGTACCAATTAAATTAGCTTCGGTTTTGGAGCTGTTCAACTGGAGAAAGTTGTTTTTCATCCACACCTTTATCTCCTCCAGACAAGCGCGGAGAGTTGACAAGGGGATATGATGATGACGATGAGGATGGAGAGGCTGAGGAGGAACATGTGTCAGTTTTCATGTAGATTTGCGTCCGTTCAGTGTAAACCTATCCCGATGAGTCTGTGTTACAGTCTCCATCTGGAGGAGACGAACGCCTGGACCAGCTTTTCAGCATCACTCAACGTTTGTGAAGAACAGAGTTTCAAAATATTTCTTAGATGGTGAAAGGACATCTAGCATATCTGTTTGATGTGGGATTCAAAAGTGAGTTGAGGGTCAAATCTTACACCGAGGTTGGTGACAGATGAAGAGAGGGGAATGTCGTGACCAGAGAAGGTCATGCTAGTCACGGAGGAGGACTGGGTCTGATGAAGGGTACCAATTAAATAGCGGCGGTATTGGAGCTGTTCAACTAGAGAAGGTTGTTTTTCATCCACACCTTTTTCCTACGACTGCGCGAGGATGAGAGGGATATGATATACATAGATGAGAGGCTGAGGAGAACATGTGTCAGTTTTCAGTAATGTGCGTGTCATCGGTATCAGC
미국산 (USA xxx2)	GTCTTTGAGACTTTTATCAGGGATCCCGATGAGAAGTGTGTTACAGTAATCCAATCTGGAGGAGACGAACGCCTGGACCAGCTTTTCAGCATCACTCAACGTTAGTGAAGAACAGAGTTTCAAAATATTTCTAAGATGGTGAAAGGACATCTTGCAGATGTGTTTGATGTGGGATTCAAAAGTGAGTTGAGGGTCAAATCTTACACCGAGGTTGGTGACTGATGAAGAGAGGGGAATGTCGTGACCAGAGAAGGTAATGCTGGTCACGGAGGAGGACTGGGTCTGATGAGGGGTACCAATTAAATTAGCTTCGGTTTTGGAGCTGTTCAACTGGAGAAAGTTGTTTTTCATCCACACCTTTATCTCCTCCAGACAAGCGCGGAGAGTTGACAAGGGGATATGATGATGACGATGAGGATGGAGAGGCTGAGGAGGAACATGTGTCAGTTTTCATGTAGATTTGCGTCCGTTCAGTGTAAACCTATCCCGATGAGTCTGTGTTACAGTCTCCATCTGGAGGAGACGAACGCCTGGACCAGCTTTTCAGCATCACTCAACGTTTGTGAAGAACAGAGTTTCAAAATATTTCTTAGATGGTGAAAGGACATCTAGCATATCTGTTTGATGTGGGATTCAAAAGTGAGTTGAGGGTCAAATCTTACACCGAGGTTGGTGACAGATGAAGAGAGGGGAATGTCGTGACCAGAGAAGGTCATGCTAGTCACGGAGGAGGACTGGGTCTGATGAAGGGTACCAATTAAATAGCGGCGGTATTGGAGCTGTTCAACTAGAGAAGGTTGTTTTTCATCCACACCTTTTTCCTACGACTGCGCGAGGATGAGAGGGATATGATATACATAGATGAGAGGCTGAGGAGAACATGTGTCAGTTTTCAGTAATGTGCGTGTCATCGGTATCAGC

그리고는, 상기 분석한 염기서열이 대응되도록 순서 변동 없이 재배열하여 도 2에 나타내었다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 1(Korea X0), 서열번호 2(Brazil) 및 서열번호 3(USA xxx2)의 염기서열과 이에 따른 컨센서스(consensus)를 나타내는 모식도이다.

여기에 도시된 바와 같이, 서열번호 1의 39번째 뉴클레오티드는 일반적으로 "A"를 염기로 가지지만, 특별히 미국산 아귀의 경우 "T"를 염기로 가지는바, 이것이 미국산 아귀를 판별하기 위한 마커가 된다.

그리고, 54번째 뉴클레오티드의 경우 서열번호 1의 한국산 아귀는 "G"를 염기로 가지고, 서열번호 3의 미국산 아귀는 "A"를 염기로 가지며, 서열번호 2의 브라질산 아귀는 확인할 수 없거나(unsure) 해당 위치에서 염기를 가지지 않는 것(blank)으로 판명되었다. 이에 따르면 서열번호 1, 2, 또는 3의 54번째 뉴클레오티가 가지는 염기타입을 확인함으로써, 아귀의 원산지를 판별하는 것이 가능하다.

또한, 이와 같이 원리로 상기한 바와 같은 본 발명에 따른 서열번호 1 내지 3의 지정된 위치에 해당하는 뉴클레오타이드의 염기를 확인하면, 아귀의 원산지를 간단하고 용이하게 판별할 수 있다는 것을 알 수 있다.

이와 비교하여, 도 3은 본 발명의 비교예로써 서열번호 6 및 서열번호 7의 프라이머(제2 프라이머 쌍)를 이용하여 증폭시킨 한국, 미국, 브라질 아귀 증폭 산물의 전기영동 결과를 나타내는 사진이고, 도 4는 본 발명의 비교예로써 서열번호 8 및 서열번호 9의 프라이머(제3 프라이머 쌍)를 이용하여 증폭시킨 한국, 미국, 브라질 아귀 증폭 산물의 전기영동 결과를 나타내는 사진이며, 도 5는 본 발명의 비교예로써 다범위 적용 프라이머(URP1)를 이용하여 증폭시킨 한국, 미국, 브라질 아귀 증폭 산물의 전기영동 결과를 나타내는 사진이다.

여기에 도시된 바와 같이 일부 다른 프라이머나 다범위 적용 프라이머를 이용하면 원산지별 특이유전자 밴드가 나타나지 않고 동일한 원산지내에서도 개체간에 유의적인 결과를 판단할 수 있는 결과를 도출할 수 없었다.

한편, 상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 것이다.

<110> Animal plant & fisheries quarantine & inspection agency <120> Primer for identifying origin of blackmouth angler and Method for identifying origin of blackmouth angler the same <130> P11-0005 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 550 <212> DNA <213> blackmouth angler(KOR) <220> <221> unsure <222> (393) <223> blank <400> 1 gtctttgaga cttttatcag ggatcccgat gagaagtgag ttacagtaat ccagtctgga 60 ggagacaaac gcgtggacca gcttttcagc atcactcaag gtgagtgaag aacggagttt 120 ggaaatattt ctgagatggt gaaaggagat cttgcagatg tgtttgatgt gggattcaaa 180 agtgagttga gggtcaaatc ttacgccgag gttggtgact gatgaagaga ggggaatgtc 240 gtgaccagag aaggtaatac tggttatgga ggaagactgg gtctgatgtg gggtgccaat 300 taaaattgct tcggttttgg agctgttcaa ctggagaaag ttgtttttca tccacacctt 360 tatctcctcc agacaagcgc ggagagttga caaggggaga tgatgatgac gatgaggatg 420 gagaggctga ggaggaactt gtgtcttttt ttatgtagat ttgctgccct caaaataact 480 aaaagtacga agtaaactag tcaagaaaac cctgtacgtc aaatccatcc gtccacgcct 540 tggaatcgga 550 <210> 2 <211> 678 <212> DNA <213> blackmouth angler(BRA) <220> <221> unsure <222> (51)..(63) <223> blank <220> <221> unsure <222> (393) <223> blank <400> 2 gtctttgaga cttttatcag ggatcccgat gagaagtgag ttacagtaat ccaatctgga 60 ggagacgaac gcgtggacca acttttcagc atcactcaag gttagtgaag aacggagttt 120 caaaatattt ctaagatggt gaaaggacat cttgcaaatc tgtttgatgt ggtattcaaa 180 agtgagttga gggtcaaatc ttacaccgag gttggtgact gatgaagaga ggggaatgtc 240 atgaccagag aaggtaatac tggttatgga ggaagactgg gtctgatgtg gggtgccaat 300 aaaaatagct tcggttttgg agctgttcaa ctggagaaaa ttgtttttca tccacacctt 360 tatctcctcc agacaagcgc ggagagttga caaggggaga tgatgatgac gatgaggatg 420 gagaggctga ggaggaacat gtgtcagttt tcatgtagat ttgcgacatc actgttaata 480 gtgtagcctt tatttgattg aactattctt gtgaccacta ttcttctcct cctatcactt 540 ccagttcttg cagcagggat tacaatatta cttacagatc gtaaccttaa aactacattc 600 tttgatcctg caggtggagg agacccaatc ctttattaac ggttttcttt tttttttggt 660 gccggaaaaa aaaaaaaa 678 <210> 3 <211> 921 <212> DNA <213> blackmouth angler(USA) <400> 3 gtctttgaga cttttatcag ggatcccgat gagaagtgtg ttacagtaat ccaatctgga 60 ggagacgaac gcctggacca gcttttcagc atcactcaac gttagtgaag aacagagttt 120 caaaatattt ctaagatggt gaaaggacat cttgcagatg tgtttgatgt gggattcaaa 180 agtgagttga gggtcaaatc ttacaccgag gttggtgact gatgaagaga ggggaatgtc 240 gtgaccagag aaggtaatgc tggtcacgga ggaggactgg gtctgatgag gggtaccaat 300 taaattagct tcggttttgg agctgttcaa ctggagaaag ttgtttttca tccacacctt 360 tatctcctcc agacaagcgc ggagagttga caaggggata tgatgatgac gatgaggatg 420 gagaggctga ggaggaacat gtgtcagttt tcatgtagat ttgcgtccgt tcagtgtaaa 480 cctatcccga tgagtctgtg ttacagtctc catctggagg agacgaacgc ctggaccagc 540 ttttcagcat cactcaacgt ttgtgaagaa cagagtttca aaatatttct tagatggtga 600 aaggacatct agcatatctg tttgatgtgg gattcaaaag tgagttgagg gtcaaatctt 660 acaccgaggt tggtgacaga tgaagagagg ggaatgtcgt gaccagagaa ggtcatgcta 720 gtcacggagg aggactgggt ctgatgaagg gtaccaatta aatagcggcg gtattggagc 780 tgttcaacta gagaaggttg tttttcatcc acaccttttt cctacgactg cgcgaggatg 840 agagggatat gatatacata gatgagaggc tgaggagaac atgtgtcagt tttcagtaat 900 gtgcgtgtca tcggtatcag c 921 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> blackmouth angler <400> 4 cctctgcagc ttctcca 17 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> blackmouth angler <400> 5 gataacaggc tccttgca 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> blackmouth angler <400> 6 tgtctggggt tctagtca 18 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> blackmouth angler <400> 7 gggtaagatg gattcca 17 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> blackmouth angler <400> 8 tgtctggggt tctagtca 18 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> blackmouth angler <400> 9 tatcagcacg tcctacca 18

Claims

서열번호 2의 54번째 뉴클레오타이드, 55번째 뉴클레오타이드, 56번째 뉴클레오타이드, 57번째 뉴클레오타이드, 58번째 뉴클레오타이드, 59번째 뉴클레오타이드, 60번째 뉴클레오타이드, 61번째 뉴클레오타이드, 62번째 뉴클레오타이드, 63번째 뉴클레오타이드, 81번째 뉴클레오타이드, 157번째 뉴클레오타이드, 160번째 뉴클레오타이드, 173번째 뉴클레오타이드, 241번째 뉴클레오타이드, 301번째 뉴클레오타이드, 340번째 뉴클레오타이드, 및 393번째 뉴클레오타이드를 포함하는 연속 뉴클레오타이드로 구성되며 아귀 원산지 판별에 유용한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적(complementary) 폴리뉴클레오티드.
아귀에서 핵산분자를 분리하는 단계; 및
상기 분리한 핵산분자에 대하여, 제1항에 기재된 서열번호 2의 54번째 뉴클레오타이드, 55번째 뉴클레오타이드, 56번째 뉴클레오타이드, 57번째 뉴클레오타이드, 58번째 뉴클레오타이드, 59번째 뉴클레오타이드, 60번째 뉴클레오타이드, 61번째 뉴클레오타이드, 62번째 뉴클레오타이드, 63번째 뉴클레오타이드, 81번째 뉴클레오타이드, 157번째 뉴클레오타이드, 160번째 뉴클레오타이드, 173번째 뉴클레오타이드, 241번째 뉴클레오타이드, 301번째 뉴클레오타이드, 340번째 뉴클레오타이드, 및 393번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 뉴클레오타이드의 염기타입을 확인하는 단계;를 포함하는 아귀 원산지 판별 방법.