CN113755632A - 用于橡胶树白粉菌群体遗传结构分析的ssr引物组及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于橡胶树白粉菌群体遗传结构分析的SSR引物组及其应用。所述用于橡胶树白粉菌群体遗传结构分析的SSR引物组包括16对引物，引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.17～48所示。本发明还提供了所述引物组在橡胶树白粉菌群体遗传结构分析中的应用。所述引物组具有特异性好、扩增稳定、多态性丰富、重复性好、便于统计等特点，为橡胶树白粉菌群体遗传结构的研究提供了新的技术和手段。
Description
技术领域
本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种用于橡胶树白粉菌群体遗传结构分析的SSR引物组及其应用。
背景技术
天然橡胶是重要的国家战略物资，也是国家粮食生产功能区和重要农产品生产保护区中的对象之一。由专性寄生的橡胶树粉孢(Oidium heveae Steinm)引起的白粉病是我国橡胶树上为害最严重的病害之一，病原菌只侵染橡胶树嫩叶、嫩芽、嫩稍和花序，因此病害主要流行于橡胶树大量抽嫩叶的春季。该病一旦爆发流行将导致胶树新抽嫩叶大面积脱落，胶树长势衰弱，新梢枯死，严重影响胶乳产量，推迟胶树开割时间。
通过研究病原菌的群体遗传结构可以深入了解病原菌的起源、变异和传播等，从而为制定病害综合防控策略提供理论依据。简单重复序列(SSR)是一种由2-6个核苷酸为单位均匀分布于基因组中的重复序列，在各种生物体内广泛分布。由于其具有共显性遗传、多态性高、重复性好、基因组广泛分布等诸多优点，已成为植物病原菌群体遗传结构分析中应用最多的分子标记之一，但还未见关于橡胶树白粉菌SSR标记的研究报道。目前橡胶树白粉菌的全基因组测序已经完成，为橡胶树白粉菌SSR分子标记的开发提供了非常便利的条件。
发明内容
针对目前尚未见橡胶树白粉菌SSR分子标记的报道，本发明的目的在于提供一种用于橡胶树白粉菌群体遗传结构分析的SSR引物组及其应用。
本发明所提供的用于橡胶树白粉菌群体遗传结构分析的SSR引物组，包括16对引物：OH-SSR10、OH-SSR11、OH-SSR15、OH-SSR17、OH-SSR26、OH-SSR28、OH-SSR34、OH-SSR36、OH-SSR38、OH-SSR46、OH-SSR47、OH-SSR48、OH-SSR49、OH-SSR50、OH-SSR51、OH-SSR63；其中，
引物对OH-SSR10的正向引物为序列表中序列17所示，反向引物如序列表中序列18所示；引物对OH-SSR11的正向引物为序列表中序列19所示，反向引物如序列表中序列20所示；引物对OH-SSR15的正向引物为序列表中序列21所示，反向引物如序列表中序列22所示；引物对OH-SSR17的正向引物为序列表中序列23所示，反向引物如序列表中序列24所示；引物对OH-SSR26的正向引物为序列表中序列25所示，反向引物如序列表中序列26所示；引物对OH-SSR28的正向引物为序列表中序列27所示，反向引物如序列表中序列28所示；引物对OH-SSR34的正向引物为序列表中序列29所示，反向引物如序列表中序列30所示；引物对OH-SSR36的正向引物为序列表中序列31所示，反向引物如序列表中序列32所示；引物对OH-SSR38的正向引物为序列表中序列33所示，反向引物如序列表中序列34所示；引物对OH-SSR46的正向引物为序列表中序列35所示，反向引物如序列表中序列36所示；引物对OH-SSR47的正向引物为序列表中序列37所示，反向引物如序列表中序列38所示；引物对OH-SSR48的正向引物为序列表中序列39所示，反向引物如序列表中序列40所示；引物对OH-SSR49的正向引物为序列表中序列41所示，反向引物如序列表中序列42所示；引物对OH-SSR50的正向引物为序列表中序列43所示，反向引物如序列表中序列44所示；引物对OH-SSR51的正向引物为序列表中序列45所示，反向引物如序列表中序列46所示；引物对OH-SSR63的正向引物为序列表中序列47所示，反向引物如序列表中序列48所示。
其中，用于橡胶树白粉菌群体遗传结构分析的SSR引物组中的每对引物的正向引物带有FEX、TAMRA或HEX特异性荧光标记。
本发明所提供的引物组可用于橡胶树白粉菌群体遗传结构分析。
本发明还提供了一种橡胶树白粉菌群体遗传结构分析方法，包括以下步骤：
提取待测样品的DNA；以所述待测样品的DNA为模板，分别使用用于橡胶树白粉菌群体遗传结构分析的SSR引物组的每对引物进行PCR扩增，得到扩增产物；对得到的扩增产物进行毛细管电泳检测，利用GeneMarker软件统计条带结果；基于所述条带结果进行橡胶树白粉菌群体遗传结构分析。
其中，所述橡胶树白粉菌群体遗传结构分析的方法包括：
基于所述条带结果，利用GenAlEx 6.5软件计算各引物对和群体的观察等位基因数Na、有效等位基因数Ne、香农多样性指数I和多样性指数h。
其中，所述橡胶树白粉菌群体遗传结构分析的方法还包括：
基于所述条带结果，利用Alequin 3.5软件的分子变异方差分析AMOVA和群体间的遗传分化系数FST，采用R语言软件对群体进行主成分判别分析，获得病原菌的群体遗传结构。
其中，所述PCR扩增体系为：1μL模板DNA、5μL的2×Taq PCR MasterMix、0.5μL浓度为10pmol/L带特异性荧光标记的正向引物、0.5μL浓度为10pmol/μL的反向引物、ddH2O补充至10μL。
所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，共10个循环，每个循环下降1℃；接着95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共25个循环；最后72℃末端延伸20min。
本发明还提供了用于橡胶树白粉菌群体遗传结构分析的试剂盒，包含所述的用于橡胶树白粉菌群体遗传结构分析的SSR引物组。
其中，用于橡胶树白粉菌群体遗传结构分析的SSR引物组中的每对引物的正向引物带有FEX、TAMRA或HEX特异性荧光标记。
本发明提供了一种用于橡胶树白粉菌遗传多样性分析的引物组，具有多态性丰富、扩增稳定、重复性好、便于统计等优点，可以揭示橡胶树白粉菌的遗传多样性及其群体遗传结构。
附图说明
将参考本发明的实施方式，其示例可以在附图中示出。这些图仅是说明性的，而非限制性的。尽管一般在这些实施方式的上下文中描述了本发明，但是应当理解，其并不旨在将本发明的范围限制为这些特定实施方式。
图1为橡胶树白粉菌菌株以引物OH-SSR17扩增得到的毛细管荧光电泳检测峰图，其中图1-a为菌株S-35-2的扩增图谱，图1-b为菌株S-10-1的扩增图谱，图1-c为菌株S-32-1的扩增图谱。
图2为橡胶树白粉菌菌株以引物OH-SSR21扩增得到的毛细管荧光电泳检测峰图，其中图1-a为菌株S-35-2的扩增图谱，图1-b为菌株S-10-1的扩增图谱，图1-c为菌株S-32-1的扩增图谱。
图3为橡胶树白粉菌群体的主成分判别分析(DAPC)分析结果。
具体实施方式
在下面的描述中，出于解释的目的，阐述了具体细节以便提供对本公开的理解。
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1 SSR引物开发
(1)基因组SSR位点分析
从NCBI(National Center for Biotechnology Information)网站下载橡胶树白粉病菌的全基因组序列，利用MISA软件搜索基因组序列中的2～6个核苷酸的SSR位点，搜索条件为2个核苷酸的重复次数须≥6，3～6个核苷酸的重复次数须≥5。
一共发现了2720个符合搜索条件的SSR位点，其中以二核苷酸SSR位点最多，为1619个；其次为三核苷酸SSR位点，682个；它们分别占SSR位点总数的59.52和25.07％；四核苷酸SSR位点有330个，占比12.13％；而五、六核苷酸SSR位点均未超过50个，占比均小于2％。
表1.橡胶树白粉菌基因组SSR的分布
(2)SSR引物设计和筛选
随机选取2个核苷酸中重复次数大于10、3个核苷酸的重复次数大于8、4-6个核苷酸重复次数大于7的SSR位点，共45个设计引物(如表1所示)，提取SSR位点上下游200bp序列，利用Primer 5.0软件设计SSR引物，设置参数为：引物长度19～24bp，退火温度52～65℃，PCR产物长度120～350bp。
表2. 45个引物的序列
所有引物由武汉天一辉远生物科技有限公司合成。采用天根植物基因组提取试剂盒提取6个不同地区(海南、云南和广东)橡胶树白粉菌菌株的DNA后，进行PCR扩增。
表3. 6株橡胶树白粉菌的信息
| 序号 | 菌株编号 | 采集地 |
| 1 | S-20-10 | 广东省湛江市南亚所1队橡胶选育种基地 |
| 2 | S-38-3 | 广东省湛江市徐闻县五一农场12队 |
| 3 | S-32-1 | 云南省德宏市瑞丽农场四分场 |
| 4 | S-35-2 | 云南省德宏市遮放农场户拉一队 |
| 5 | S-10-1 | 海南省儋州市兰洋镇 |
| 6 | S-25-1 | 海南省儋州市大成镇 |
PCR扩增体系如下：1μL模板DNA、5μL的2×TaqPCR MasterMix、0.5μL浓度为10pmol/μL的带荧光标记的正向引物、0.5μL浓度为10pmol/μL的反向引物，ddH2O补充至10μL。
PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，共10个循环，每个循环下降1℃；接着95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共25个循环；最后72℃末端延伸20min。
使用DNA测序仪ABI3730x1对扩增产物进行毛细管荧光电泳检测，利用GeneMarkerV3.0.0读取毛细管电泳数据，统计检测结果(表4)。
表4. 45对SSR引物在6株橡胶树白粉菌的扩增结果
-表示未扩增出产物
结果共筛选出有多态性位点的SSR引物16对(表5)，其中二核苷酸SSR引物8对，三核苷酸SSR引物4对，四核苷酸SSR引物1对，五核苷酸SSR引物1对，六核苷酸SSR引物2对。筛选出的16对引物对应的SSR位点的上下游200bp序列如序列表中序列1-16所示。其中，对应OH-SSR10的SR位点的上下游200bp序列：序列1；对应OH-SSR11的SR位点的上下游200bp序列：序列2；对应OH-SSR15的SR位点的上下游200bp序列：序列3；对应OH-SSR17的SR位点的上下游200bp序列：序列4；对应OH-SSR26的SR位点的上下游200bp序列：序列5；对应OH-SSR28的SR位点的上下游200bp序列：序列6；对应OH-SSR34的SR位点的上下游200bp序列：序列7；对应OH-SSR36的SR位点的上下游200bp序列：序列8；对应OH-SSR38的SR位点的上下游200bp序列：序列9；对应OH-SSR46的SR位点的上下游200bp序列：序列10；对应OH-SSR47的SR位点的上下游200bp序列：序列11；对应OH-SSR48的SR位点的上下游200bp序列：序列12；对应OH-SSR49的SR位点的上下游200bp序列：序列13；对应OH-SSR50的SR位点的上下游200bp序列：序列14；对应OH-SSR51的SR位点的上下游200bp序列：序列15；对应OH-SSR63的SR位点的上下游200bp序列：序列16。
表5. 16对多态性SSR引物的信息
实施例2、利用SSR引物对不同地区橡胶树白粉菌进行群体遗传结构分析
(1)从广东、云南和海南各获得15个白粉菌菌株(表6)，用天根植物基因组提取试剂盒提取DNA后，进行PCR扩增，具体操作同实施例1。
表6. 45株橡胶树白粉菌的信息
(2)使用DNA测序仪ABI3730x1对扩增产物进行毛细管荧光电泳检测，利用GeneMarker V3.0.0读取毛细管电泳数据，统计检测结果(表7)。
表7. 16对SSR引物在45个橡胶树白粉菌的扩增结果
(3)利用GenAlEx 6.5软件计算各引物对观察等位基因数Na、有效等位基因数Ne、香农多样性指数I和多样性指数h等。各引物对的等位基因数在2-8之间，有效等位基因数在1.093-3.771之间，其中引物OH-SSR50的香农多样性指数I和多样性指数h最高，分别为1.563和0.735，引物OH-SSR38的最低，分别为0.182和0.085(表8)。
表8. 16对橡胶树白粉菌SSR引物的遗传多样性
| 引物名称 | 菌株数量 | Na | Ne | I | h |
| OH-SSR10 | 45 | 2 | 1.528 | 0.530 | 0.346 |
| OH-SSR11 | 45 | 2 | 1.586 | 0.556 | 0.369 |
| OH-SSR15 | 45 | 5 | 1.614 | 0.814 | 0.380 |
| OH-SSR17 | 45 | 3 | 1.314 | 0.478 | 0.239 |
| OH-SSR26 | 45 | 2 | 1.642 | 0.580 | 0.391 |
| OH-SSR28 | 44 | 6 | 3.752 | 1.465 | 0.733 |
| OH-SSR34 | 45 | 7 | 2.661 | 1.267 | 0.624 |
| OH-SSR36 | 45 | 4 | 1.377 | 0.556 | 0.274 |
| OH-SSR38 | 45 | 2 | 1.093 | 0.182 | 0.085 |
| OH-SSR46 | 45 | 6 | 2.288 | 1.147 | 0.563 |
| OH-SSR47 | 45 | 6 | 2.391 | 1.183 | 0.582 |
| OH-SSR48 | 45 | 7 | 2.166 | 1.124 | 0.538 |
| OH-SSR49 | 45 | 3 | 1.991 | 0.861 | 0.498 |
| OH-SSR50 | 45 | 8 | 3.771 | 1.563 | 0.735 |
| OH-SSR51 | 45 | 7 | 2.914 | 1.325 | 0.657 |
| OH-SSR63 | 45 | 3 | 1.611 | 0.631 | 0.379 |
注：Na表示观察等位基因数，Ne表示有效等位基因数，I表示香农多样性指数，h表示多样性指数。
(4)同样利用GenAlEx 6.5软件计算不同地区的遗传多样性(表9)，可以看出云南地区菌株的遗传多样性最高，其观察等位基因数、有效等位基因数、香农多样性指数和多样性指数分别为3.188、1.938、0.813和0.458，而广东地区病原菌的遗传多样性最低，其观察等位基因数、有效等位基因数、香农多样性指数和多样性指数分别为2.375、1.548、0.472和0.262，海南地区的居中。
表9.不同地区橡胶树白粉菌的遗传多样性
| 群体 | 菌株数量 | Na | Ne | I | h |
| 广东 | 15 | 2.375 | 1.548 | 0.472 | 0.262 |
| 云南 | 15 | 3.188 | 1.938 | 0.813 | 0.458 |
| 海南 | 15 | 2.750 | 1.516 | 0.531 | 0.283 |
注：Na表示观察等位基因数，Ne表示有效等位基因数，I表示香农多样性指数，h表示多样性指数。
(5)进一步利用利用Alequin 3.5软件进行分子变异方差(AMOVA)分析(表10)和群体间的遗传分化系数FST比较(表11)，发现群体间的遗传变异占总变异的31.8％，而群体内的遗传变异占总变异的68.2％。群体遗传分化分析表明(表11)云南橡胶树白粉菌群体与广东、海南橡胶树白粉菌群体之间有显著的遗传分化(P<0.001)，而广东群体和海南群体之间无显著的遗传分化(P＝0.7119)。
表10.橡胶树白粉菌群体间和群体内的分子变异(AMOVA)分析
表11.橡胶树白粉菌群体的遗传分化值Fst(下三角)和对应P值(上三角)
(6)利用R语言软件对群体进行主成分判别分析(DAPC)(图3)发现，供试橡胶树白粉菌可以分为3个亚群，其中第1亚群和第2亚群分别包括2个菌株和9个菌株，均来自云南群体，而第3亚群包括34个菌株，包括所有供试的15个来自海南的菌株和15个来自广东的菌株，以及4个来自云南的菌株，再次证明的云南群体和广东、海南群体之间有显著的遗传分化，而广东和海南群体之间的遗传分化不显著。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所
<120> 用于橡胶树白粉菌群体遗传结构分析的SSR引物组及其应用
<130> WHOI210058
<160> 48
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 444
<212> DNA
<213> 橡胶树白粉菌(Oidium heveae)
<400> 1
gggatcaaaa atccatgcat tgagtttttt tttttttttt tttttagata accgttaagt 60
ggtaggtaat tcgtacttta cgattacttg gatctaatat actcaaagaa atctcagacg 120
tctcgcttct aatgcatgcc atgccatcaa tacggtcaaa aaaaagaaaa aaaaatttcc 180
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<210> 2
<211> 430
<212> DNA
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ttctttaatt atgatcaaaa acggattaca tgtctaattt ctgatcctca ccatgcaaaa 180
tttgaagaaa tagaagaaat agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga agaagaagaa 240
gaagaagtct tctactaatt ttctctgagg aatcaacggt gttttgaagg gaccagatat 300
aaattgcaaa tcattcttcg aaatatttca gctactaatt tgacattaat atgtccgagt 360
tggctacttc tccgtaagcc ttggcattct ttcctcgatt aaaaatatca aaatcagacg 420
aagtcctcat gagttgagat actaa 445
<210> 6
<211> 490
<212> DNA
<213> 橡胶树白粉菌(Oidium heveae)
<400> 6
agagagagat agagaacata acaattgaat acatttggtt tactaaaatc atacatttac 60
tactcgagta gatacgtgat ctatccaaaa atattacttt ataccctact cctgagcgca 120
ttctaagacg ccgtgagcaa gctcgtccta atggaggaaa gatgatacag tacctcgtac 180
gattcactgg gcgacccgtg gaaaatgaaa atgaaaatga aaatgaaaat gaaaatgaaa 240
atgaaaatga aaatgaaaat gaaaatgaaa atgaaaatga aaatgaaaat gctagttctc 300
ttacttctct gggaatgtag gtgttataaa agtatacaga tgcgctgttg aacggaagtt 360
ttatttgtcc tgagattcta tattttatat tacttagaat caatgattgt atatagaatt 420
acttgtgtta agcatccctg gtagaagctc agctaagtta tcccttacag aaattaatat 480
atatgaaaat 490
<210> 7
<211> 436
<212> DNA
<213> 橡胶树白粉菌(Oidium heveae)
<400> 7
gggtgttaag cgaggtttgg agaatagtca ttggctacca aggaaacttg acaaagtaga 60
gatttagcgc agtggcccca acaacataca tttatgtggc gcgaaaagct gttcatttgc 120
ctctgcaaat gtgaggagtc gaaggcgggg gcatgactct ttcaatgacg cttttcattt 180
gctactgaaa atagataaag acacacacac acacacacac acacacacac acacacattt 240
agggctttcc gtccgtaatt aagctttcaa gggtatgctg gtaagtcaag ggtagtttag 300
ttattatttt ccgacgttct tgaggctatc accagatcat atcgttgctt atgatgttgt 360
gatgacgtga aagttataat atactgtgaa aaaaagggtt aatatggagg aatgaaaaaa 420
atcatctcgg gggaaa 436
<210> 8
<211> 442
<212> DNA
<213> 橡胶树白粉菌(Oidium heveae)
<400> 8
tattcaaaca tctctgagtt ataattaaac ttagatgggg ttttatgctt ctccatgcac 60
aagattaatc agtttcgtaa agtttgccgg tgaactttca caatgggcca gctaacttgc 120
catctcgccc gcgctcagaa agagggttct ccagctcgtt cagccccaga aatagaatcc 180
aacggtacaa gtgcaatagt gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga 240
gaaagggagg gagggagggg agggagacag aagatgctgg agataacagg ctctacgttg 300
ttgctgatca cattgacgac tttcactgca ctgactatgt ttctgtgatg tttaatatgt 360
ctctttcttt tgccagactg actggattca atcatttcgc gatttctcaa cacaggagag 420
aaactaacaa ggcatcagcc at 442
<210> 9
<211> 427
<212> DNA
<213> 橡胶树白粉菌(Oidium heveae)
<400> 9
cacatttgtt gaagtattag aatctgattt tgttttggga gatgggagct gtattttaat 60
cattaaattt gctttggaat cgtcatcgtt ttcattaact ttggcaggag tgatgttttt 120
tttacgtcgt tgagcaggag gtgcatttgg atcttttggt tttcgtactc gcttgggctt 180
agggacttct aagccatcaa ttgttgttgt tgttgttgtt gttgttgctg tcgctgttgc 240
agcagagccc ggtaagggat gggcttttga agctttcggc tgcgaaggtg cagtaggatc 300
ctttaatttt tttctaggtt ttcgtgattg tggcttttca gaggatgcat caagttttgt 360
ggcacttggt acagaagttg ccacactaga tgaagagatt aagggtgcat gtgaaggtaa 420
gagttta 427
<210> 10
<211> 485
<212> DNA
<213> 橡胶树白粉菌(Oidium heveae)
<400> 10
ctgtccctca ttgccatatt cttatccatt tttattcata taaatcactg acttatgcta 60
atatagctct cgcattcatt tcaatctttt aattctaaaa tttataaaga accaaacggt 120
gattaaagaa agttattggc tttttttgtt ctgttctctt aaaaacaagc tgaaaaatca 180
ctccttctga atctcctcat atcctctctc tccctctctc tctctctctc tctctctctc 240
tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctcacgt atattctaat 300
ggcaaaaagg ggttttggaa ttctgattta atgttataat aattatctaa cttgaagtca 360
ttgaacgtga ttaaggtaaa cgtactagtg tttaaagaca agggatttca aggatacgta 420
ttttaattga acagttgtaa ttaatacgtc tgtctgtgcg cctgtctgtg caacacgaca 480
gcact 485
<210> 11
<211> 454
<212> DNA
<213> 橡胶树白粉菌(Oidium heveae)
<400> 11
agtcccgtag aaaatcttta tccaaatttt agattaacat ttggaaaggg ttggattcca 60
tgcagttaga gattgaacgg ctttcttcgg ccctcaataa tcagaataaa acaactccag 120
cgcctcaaga taattcaaac aacaattcta atggaggtca tatgattact gagtcaagcc 180
aacaaaattc aaaaattacc gaagaagaag aagaagaaga agaagaagaa gaagaagaag 240
aagaagaaga agaaacagtc aacactagga caataaaaca accctctaaa aataaatctt 300
tatcaaaatc ttcttgtttg ttgaggttaa tgtcgatatt tggatacaaa accatcacaa 360
aatcagatgc tggattagtt accagatctg taagcgataa tttacttagc cctagtcgag 420
catctaaagg aaaaggcaaa gagattatag ctca 454
<210> 12
<211> 460
<212> DNA
<213> 橡胶树白粉菌(Oidium heveae)
<400> 12
caattttacg cttagtatgc acgagacctt cttcttgact tacaaatgca aagattaccc 60
acgatgcaga tagacaattc aaatattgta ttcaatatca gatcaaataa tgaaagcaat 120
gtgtatttga attagtgatg gtagtttatt ttctgatcta tagggaataa actaattgta 180
catttactgc ccttatatat ttcttcttct tcttcttctt cttcttcttc ttcttcttct 240
tcttcttctt cttcttcttc ttagtcaaag actgtatact aggaaatgaa aatttgccct 300
cattcctctt aatttgacaa tcatgatatc atctggttat gattgcaatg tcaaatccgt 360
gaccttgtag tcattattgc tgagtcaagc taatttttaa tctcaacata atctgtatga 420
taattattat gtgaggctaa ttatatcaca gtttcctata 460
<210> 13
<211> 440
<212> DNA
<213> 橡胶树白粉菌(Oidium heveae)
<400> 13
ttctaaaaag cccggtgaag aataacatat tgatgacttt aagtcaaaat ttgagacagt 60
aaggaatgag attcccgcaa ttattgatac tttgagtagg ctctctgtac ctagaccaat 120
cactcgaagg ccagatactg cctgggacta tgttatcaat ggtaatgtta ttcatgatct 180
atggattaaa aattcgaacg gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga 240
aagaaattga cggaaagttt gagtcgtata atctaagggc aaaaacggtt gatcctagcc 300
aacctggtat tgatactgta aaataataca gtggttacct tgacgataat aaaaatgata 360
aacacttgtt tcagtgtaag tttaatggaa tcattgcttt gtgaaatcta aagggaatca 420
gggttttgga aactcgcaat 440
<210> 14
<211> 490
<212> DNA
<213> 橡胶树白粉菌(Oidium heveae)
<400> 14
agttttattt attggataca aataatgtca acagagttta tttacatgca atattaactt 60
tctgagttac cacagtaact agtataatga gcctaagaaa tgtggggaaa atatataaag 120
ctcatccctg cgggtgttaa aataagaaaa ccgggagtca gcaaatgagg tctctaaatc 180
aaatatcttt ttctgaaatg tttgatttga tttgatttga tttgatttga tttgatttga 240
tttgatttga tttgatttga tttgatttga tttgatttga tttgatttga tttcaattaa 300
cccgaccagg aagcccaggg gcccatgcag gtgtctgtct aattgtttaa atttacacgg 360
gggaaaccct ttggtaaaaa ctccccaaaa ctgccatcta atatctatct agtctttcta 420
aaatgttgtt tatcattagc gcttgtttag ccataaaaac acactaattt catacaagac 480
ttgtcatcac 490
<210> 15
<211> 456
<212> DNA
<213> 橡胶树白粉菌(Oidium heveae)
<400> 15
tttagcagta caagcttcgc accaaaatct gttactggcg gttgagtggt ccaaatatat 60
gtgcttctgt ggttaacagt caaataatat ctgtttagtg gtttctttac agcctaccgg 120
cagtggcagt ttaaccgctc cctgaagtag taaggtagtg ggggaatatg atcgaggtga 180
tgataaagca cattagactt tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc 240
tctctctctc tctctctgaa taaatcatat ttcttgaact aagaatatgc tgaataagcg 300
agcgagcgtg aatcaatgta aagctttttt taatcgaaag gatctttgct aaaaaatagg 360
cttcactaat tagtcgtagt gaattggggg tttcttttgt ctaatttggg gattcaacgc 420
ttgtgggctt atgaatttat tgactattta tcgtag 456
<210> 16
<211> 444
<212> DNA
<213> 橡胶树白粉菌(Oidium heveae)
<400> 16
ctttgagaag tgttacgggc ggtagttggg gtgcgggatg gtacagagcc tccccccaag 60
agtgagtgtt tacacttttt tgttttcctt ttctatcttg cttattttac agatggcagc 120
gccatatcag gcagagttag ttagtagatc gactctgcaa ataggccccc cctccccggt 180
ctccccccgt ccgctgttca caatcaatca atcaatcaat caatcaatca atcaatcaat 240
caatcttact tttgacatgc ggaccacata ccagaccaga ctcgagggcg gggacgggcc 300
gacgctgccc catctccgct gcaactggca aatctaatca atctttgctt acagtacaac 360
aatcctgtcg ctgttccgtc ccgtcccata aacaacgcac agccgagatg tgtgcaggca 420
gcgaagagta tcaaaatgac aaca 444
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tgccatgcca tcaatacggt 20
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tctctgttcc catcattgct t 21
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ggtgcagata tgttctggct 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gtttagggaa gctcacggtc 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ggtcgacagt ttgcccatct 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
acattggcgt cctcgtgatt 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cgagttcctg tgataagcgt 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ggccacagta gtgcaaaagg 20
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gggtatccca ttgaccttgc t 21
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
atctggtccc ttcaaaacac cg 22
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
taccctactc ctgagcgcat 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cttccgttca acagcgcatc 20
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
aagctgttca tttgcctctg c 21
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tagcctcaag aacgtcggaa a 21
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
tcacaatggg ccagctaact t 21
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gtgcagtgaa agtcgtcaat gt 22
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tttcgtactc gcttgggctt 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gatcctactg caccttcgca 20
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ctgtccctca ttgccatatt ct 22
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gaattccaaa accccttttt gc 22
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
actccagcgc ctcaagataa 20
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
tccagcatct gattttgtga tg 22
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
acccacgatg cagatagaca a 21
<210> 40
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
tcaaattaag aggaatgagg gca 23
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
ccaatcactc gaaggccaga t 21
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ggatcaaccg tttttgccct 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
cgggagtcag caaatgaggt 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
caaagggttt cccccgtgta 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
ctaccggcag tggcagttta 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
attcacgctc gctcgcttat 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
gcgccatatc aggcagagtt 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
ctggtctggt atgtggtccg 20
Claims (10)
1.一种用于橡胶树白粉菌群体遗传结构分析的SSR引物组，其特征在于，所述引物组包括16对引物：OH-SSR10、OH-SSR11、OH-SSR15、OH-SSR17、OH-SSR26、OH-SSR28、OH-SSR34、OH-SSR36、OH-SSR38、OH-SSR46、OH-SSR47、OH-SSR48、OH-SSR49、OH-SSR50、OH-SSR51、OH-SSR63；其中，
引物对OH-SSR10的正向引物为序列表中序列17所示，反向引物如序列表中序列18所示；
引物对OH-SSR11的正向引物为序列表中序列19所示，反向引物如序列表中序列20所示；
引物对OH-SSR15的正向引物为序列表中序列21所示，反向引物如序列表中序列22所示；
引物对OH-SSR17的正向引物为序列表中序列23所示，反向引物如序列表中序列24所示；
引物对OH-SSR26的正向引物为序列表中序列25所示，反向引物如序列表中序列26所示；
引物对OH-SSR28的正向引物为序列表中序列27所示，反向引物如序列表中序列28所示；
引物对OH-SSR34的正向引物为序列表中序列29所示，反向引物如序列表中序列30所示；
引物对OH-SSR36的正向引物为序列表中序列31所示，反向引物如序列表中序列32所示；
引物对OH-SSR38的正向引物为序列表中序列33所示，反向引物如序列表中序列34所示；
引物对OH-SSR46的正向引物为序列表中序列35所示，反向引物如序列表中序列36所示；
引物对OH-SSR47的正向引物为序列表中序列37所示，反向引物如序列表中序列38所示；
引物对OH-SSR48的正向引物为序列表中序列39所示，反向引物如序列表中序列40所示；
引物对OH-SSR49的正向引物为序列表中序列41所示，反向引物如序列表中序列42所示；
引物对OH-SSR50的正向引物为序列表中序列43所示，反向引物如序列表中序列44所示；
引物对OH-SSR51的正向引物为序列表中序列45所示，反向引物如序列表中序列46所示；
引物对OH-SSR63的正向引物为序列表中序列47所示，反向引物如序列表中序列48所示。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组中的每对引物的正向引物带有FEX、TAMRA或HEX特异性荧光标记。
3.权利要求1或2所述的引物组在橡胶树白粉菌群体遗传结构分析中的应用。
4.一种橡胶树白粉菌群体遗传结构分析方法，包括以下步骤：
提取待测样品的DNA；
以所述待测样品的DNA为模板，分别使用权利要求1或2所述的引物组的每对引物进行PCR扩增，得到扩增产物；
对得到的扩增产物进行毛细管电泳检测，利用GeneMarker软件统计条带结果；
基于所述条带结果进行橡胶树白粉菌群体遗传结构分析。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
基于所述条带结果，利用GenAlEx 6.5软件计算各引物对和群体的观察等位基因数Na、有效等位基因数Ne、香农多样性指数I和多样性指数h。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
基于所述条带结果，利用Alequin 3.5软件的分子变异方差分析AMOVA和群体间的遗传分化系数FST，采用R语言软件对群体进行主成分判别分析，获得橡胶树白粉菌群体遗传结构。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增体系为：
1μL模板DNA、
5μL的2×Taq PCR MasterMix、
0.5μL浓度为10pmol/L带特异性荧光标记的正向引物、
0.5μL浓度为10pmol/μL的反向引物、
ddH2O补充至10μL。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，共10个循环，每个循环下降1℃；接着95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共25个循环；最后72℃末端延伸20min。
9.一种用于橡胶树白粉菌群体遗传结构分析的试剂盒，包含权利要求1或2所述的引物组。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述引物组中的每对引物的正向引物带有FEX、TAMRA或HEX特异性荧光标记。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114934130A (zh) * | 2022-06-17 | 2022-08-23 | 湖北省农业科学院中药材研究所 | 白绢病菌特异性ssr标记及其应用 |
| CN114934130B (zh) * | 2022-06-17 | 2023-01-13 | 湖北省农业科学院中药材研究所 | 白绢病菌特异性ssr标记及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113755632B (zh) | 2022-07-26 |
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