CN117904002A - 一株野尻链霉菌zzl-3d及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域，涉及一株野尻链霉菌ZZL‑3D及其应用，野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)ZZL‑3D保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25164；应用于防治由植物病原菌引起的花生病害，以及促进花生生长。鉴于化学农药在防治花生病害方面的种种弊端，本发明在花生生产种植中应用该野尻链霉菌，借助生防菌株，促进花生的生长，提高花生对多种病原菌的抗性，拮抗效果显著，且对环境友好，有利于花生的绿色健康生产，为花生病害的综合防治提供技术支撑。

Description

一株野尻链霉菌ZZL-3D及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种野尻链霉菌，具体地，涉及一种对多种植物病原菌具有广谱抗性的野尻链霉菌ZZL-3D及其在促进花生生长和防治花生致病真菌上的应用。

背景技术

花生是重庆市第二大油料作物，也是重要的特色出口农产品，具有高产、优质、高效、用地兼养地、抗逆能力强、加工增值等综合经济优势，发展前景广阔。但在花生种植过程中，主产区连年重茬，花生茎腐病、根腐病等病害发生日趋严重。花生上的病原菌以真菌为主，由齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)引起的白绢病，核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)引起的菌核病，层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)引起的根腐病，黑曲霉(Aspergillus niger)引起的冠腐病，均为花生土传性真菌病害。目前防治真菌性病害的主要方法是化学防治，但是化学农药的过量使用不仅会使病原菌产生抗药性，还会造成环境污染和农药残留问题，影响花生产品质量。

植物根际微生物在促进植物生长、抵御病原菌、增产等方面发挥作用，而且对环境友好，在土传病害生物防治的研究中引起广泛关注。链霉菌属是放线菌门中菌种数目最多的属，是最高等的放线菌，其环境适应性强，是植物根际最常见的微生物之一。链霉菌功能多样，有的能够产生抗生素与植物激素类物种，促进植物生长，提高植物对生物和非生物胁迫的抵御能力；有些能够产生次生代谢产物、胞外水解酶，抑制病原菌蛋白质和核苷酸的合成，裂解细胞壁，从而阻止病原菌的生长。

生物防治将是农业绿色发展的重要方向，利用生防菌株防治花生致病真菌是绿色农业发展的迫切需要。

发明内容

鉴于化学农药在防治花生病害方面的种种弊端，本发明提出了一株野尻链霉菌ZZL-3D及其应用，通过在花生生产种植中应用野尻链霉菌，借助生防菌株，促进花生的生长，提高花生对多种病原菌的抗性。

本发明的技术方案是：

本发明提供一株野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)ZZL-3D，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25164。

本发明还提供了所述的野尻链霉菌ZZL-3D在防治由植物病原菌引起的花生病害中的应用。

进一步的，所述植物病原菌包括花生白绢病菌、核盘菌、层生镰刀菌和冠腐病菌。

本发明又提供了一种菌剂，所述菌剂的活性成分为野尻链霉菌ZZL-3D。

进一步的，所述菌剂包括野尻链霉菌ZZL-3D菌悬液、野尻链霉菌ZZL-3D无菌发酵液和/或野尻链霉菌ZZL-3D挥发性气体。

本发明还提供了所述的野尻链霉菌ZZL-3D在促进花生生长中的应用。

本发明还提供了所述的野尻链霉菌ZZL-3D在制备用于促进花生生长的产品中的应用，所述产品的活性成分为野尻链霉菌ZZL-3D。

生物材料样品保藏信息：

野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)ZZL-3D，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2022年06月23日，保藏编号为CGMCC No.25164。

本发明的有益效果：

本发明所提供的野尻链霉菌ZZL-3D，能够促进花生的生长；将其应用于花生病害的防治上，还能够抑制或者拮抗花生白绢病菌、核盘菌、层生镰刀菌和冠腐病菌引起的花生病害，效果显著，且对环境友好，摒弃了化学农药在防治花生病害方面的种种弊端，提高了花生对白绢病菌、核盘菌、层生镰刀菌和冠腐病菌的抗性，有利于花生的绿色健康生产，提高了经济效益。

本发明方法属于生物防治的范畴，安全、快速、有效，有利于花生的绿色健康生产，为花生病害的综合防治提供技术支撑。

附图说明

图1为菌株ZZL-3D在LB培养基上的菌落形态；

图2为菌株ZZL-3D基于16S rDNA和gyrB基因构建的系统发育树；

图3为菌株ZZL-3D菌悬液对靶标病原菌的拮抗作用及分析；其中，A为ZZL-3D对4种花生病原菌的拮抗效果图；B为病原菌的菌落生长情况统计；C为ZZL-3D对4种花生病原菌的抑菌率统计；注：**差异在0.01水平差异极显著；

图4为菌株ZZL-3D发酵液对4种病原菌抑菌能力的测定；其中，A为ZZL-3D对4种花生病原菌的拮抗效果图；B为病原菌的菌落生长情况统计；C为ZZL-3D对4种花生病原菌的抑菌率统计；注：**差异在0.01水平差异极显著；

图5为菌株ZZL-3D挥发性气体对4种病原菌抑菌能力的测定；其中，A为ZZL-3D对4种花生病原菌的拮抗效果图；B为病原菌的菌落生长情况统计；C为ZZL-3D对4种花生病原菌的抑菌率统计；注：**差异在0.01水平差异极显著；

图6为菌株ZZL-3D有菌发酵液对花生生长的影响。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为了进一步理解本发明，将结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

野尻链霉菌ZZL-3D的分离鉴定

(1)菌株ZZL-3D的分离：

于花生根际周围，称取距离地表约6cm深处约100g土壤样品，带回实验室，4℃保存。取10g土壤样品加到90mL无菌水中，25℃，140rpm振荡20min，静置10min，取上清液，采用10倍系列稀释法，依次稀释到10^-2～10^-5，最后三个浓度吸取100μL分别涂于LB固体培养基上，每个浓度重复3次，28℃暗培养。待培养基上出现细菌菌落时，用移菌环挑取单菌落，在LA固体培养基上进行纯化培养，用冠腐病菌对纯化后的菌株进行初筛；最终挑选得到一株抑菌圈明显的菌株，菌体呈淡黄色，表面湿润，不透明，命名为ZZL-3D，见图1。菌株ZZL-3D单菌落用LB液体培养基摇菌后，加入甘油，于-80℃保存。

(2)菌株ZZL-3D的菌种鉴定：

根据细菌基因组DNA提取试剂盒(Solarbio)提取ZZL-3D的基因组DNA，分别利用16SrDNA通用引物27F(5’AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3’)(SEQ ID NO：3)和16S-R(5’AAGGAGGTGATCCAGCCGCA 3’)(SEQ ID NO：4)，gyrB基因引物UP-1E(5’CAGGAAACAGCTATGACCAYGSNGGNGGNAARTTYR 3’)(SEQ ID NO：5)和APrU(5’TGTAAAACGACGGCCAGTGCNGGRTCYTTYTCYTGRCA 3’)(SEQ ID NO：6)对基因组进行PCR扩增。PCR产物送生工生物(上海)有限公司测序。16S rDNA序列全长为1401bp，序列如SEQ ID NO：1所示；gyrB基因序列全长为1204bp，序列如SEQ ID NO：2所示。

所获得的序列进行BLAST分析比对，并联合16S rDNA和gyrB基因用MEGA7软件构建系统发育树，见图2。结果表明菌株ZZL-3D与野尻链霉菌Streptomyces nojiriensis在同一分支上，说明菌株ZZL-3D为野尻链霉菌Streptomyces nojiriensis。对菌株ZZL-3D进行保藏，保藏编号为CGMCC No.25164。

实施例2

菌株ZZL-3D菌悬液对4种花生病原菌菌丝生长的抑制作用

(1)菌悬液的制备：将菌株ZZL-3D的单菌落放入液体LB培养基中，28℃振荡培养2d，静置10min，弃上清。

(2)病原菌的活化：分别取花生白绢病菌、核盘菌、层生镰刀菌和冠腐病菌的菌饼接种到PDA培养基中央，25℃暗培养7d，备用。

(3)LB固体培养基中央接种直径为5mm的病原菌的菌饼，菌饼两侧约20mm处用ZZL-3D的菌悬液划2条粗壮的平行线，以不接种菌悬液作为对照(CK)，每个处理重复6次，25℃恒温培养。如图3A所示，为ZZL-3D对4种花生病原菌的拮抗效果。

(4)对菌丝生长情况进行测量，得到图3B的病原菌的菌落生长情况统计结果(注：**差异在0.01水平差异极显著)。采用菌丝生长速率法计算抑菌率：抑菌率(％)＝(对照菌落增长直径－处理菌落增长直径)/对照菌落增长直径×100，结果发现菌株ZZL-3D对四种病原菌均具有显著的抑菌效果，从图3C中可以看出，ZZL-3D对白绢病菌、核盘菌、层生镰刀菌和冠腐病菌的菌丝生长抑制率分别为68.02％、90.45％、74.19％、92.30％。

实施例3

菌株ZZL-3D无菌发酵液对4种花生病原菌菌丝生长的抑制作用

用牙签挑取菌株ZZL-3D的单菌落放入盛有100mL LB培养基的三角瓶中，28℃振荡培养4d，高速离心后收集上清液，用0.22μm滤膜过滤得到无菌发酵液。将无菌发酵液以1:10的比例与加热冷却至约50℃的LB培养基混合倒平板，在平板中央接入直径为5mm病原菌的菌饼，以添加等量LB液体培养基的平板作为对照(CK)，每个处理设6个重复，25℃培养，对菌丝生长情况进行测量，计算抑菌率。

结果如图4所示，同相应对照(CK)相比，菌株ZZL-3D的无菌发酵液极显著的降低了白绢病菌、核盘菌、层生镰刀菌和冠腐病菌菌丝的生长(见图4A和图4B)，菌丝生长抑制率分别为20.94％、75.53％、20.37％和10.54％(见图4C)。

实施例4

菌株ZZL-3D挥发性气体对4种花生病原菌菌丝生长的抑制作用

用牙签蘸取ZZL-3D的菌悬液，于LB平板上均匀划线，另一LB平板中央接入直径为5mm病原菌的菌饼。以空白LB平板作为对照(CK)，每个处理设6个重复，对菌丝生长情况进行测量，计算抑菌率。

结果如图5所示，发现菌株ZZL-3D的挥发性气体极显著的降低了白绢病菌、核盘菌、层生镰刀菌和冠腐病菌菌丝的生长(见图5A和图5B)，菌丝生长抑制率分别为48.03％、37.03％、5.70％和3.93％(见图5C)。

实施例5

菌株ZZL-3D有菌发酵液对花生生长的影响

花生种子播种于花盆中，2周后用菌株ZZL-3D的有菌发酵液灌根(2mL/株)，4周后再次用ZZL-3D的有菌发酵液灌根，以接种等量LB培养基为对照(CK)。对照和处理各3盆，重复3次，8周后处理花生，称量植株总鲜重，烘干后称量植株总干重。统计结果如图6所示，同对照(CK)相比，菌株ZZL-3D的有菌发酵液能够极显著增加植株的鲜重和干重，比对照分别增加16.90％和24.76％。

上述说明仅为本发明的优选实施例，并非是对本发明的限制，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改型等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)ZZL-3D，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25164。

2.权利要求1所述的野尻链霉菌ZZL-3D在防治由植物病原菌引起的花生病害中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述植物病原菌包括花生白绢病菌、核盘菌、层生镰刀菌和冠腐病菌。

4.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂的活性成分为野尻链霉菌ZZL-3D。

5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂包括野尻链霉菌ZZL-3D菌悬液、野尻链霉菌ZZL-3D无菌发酵液和/或野尻链霉菌ZZL-3D挥发性气体。

6.权利要求1所述的野尻链霉菌ZZL-3D在促进花生生长中的应用。

7.权利要求1所述的野尻链霉菌ZZL-3D在制备用于促进花生生长的产品中的应用，其特征在于，所述产品的活性成分为野尻链霉菌ZZL-3D。