CN111172045B - 一株非洲哈茨木霉mu153及其应用 - Google Patents

一株非洲哈茨木霉mu153及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株非洲哈茨木霉MU153及其应用。本发明公开的非洲哈茨木霉MU153，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO.19036。实验证明，本发明的非洲哈茨木霉MU153能够产生抑菌作用较强的挥发性有机化合物，用于抑制病原菌：尖孢镰刀菌、链格孢和疫霉。本发明的非洲哈茨木霉MU153以及利用该菌株所制菌剂在生物防治方面具有巨大的应用潜力，同时也是开发天然生物活性物质的重要微生物资源，具有广泛的应用前景。

Description

一株非洲哈茨木霉MU153及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，一株非洲哈茨木霉MU153及其应用。
背景技术
枯萎病是主要的土传植物病害，可以随着种植面积的扩大和连作年限的增长而日益加重。以黄瓜枯萎病(Cucumber fusarium wilt)为例，该病可以发生在黄瓜生长的任何阶段，发病率在10～30％，严重时全部死亡。自然界的土壤中存在多种能够有效防治枯萎病的微生物，如木霉(Trichoderma spp.)、芽孢杆菌(Bacillus spp.)、链霉菌(Streptomycesspp.)等。木霉具有生长快、适应性强和抑菌谱广等特点，尤其对土壤中的镰刀菌(Fusariumspp.)、疫霉(Phytophthora spp.)和腐霉(Pythium spp.)等有很好的防治效果，广泛应用于病虫害防治。
木霉的生防机制包括营养和生态位竞争、重寄生、抗生、促生、拮抗、诱导植物产生系统抗性和分泌次级代谢产物等。木霉的次级代谢产物主要分为三类：一是挥发性有机化合物(volatile organic compounds,VOCs)，二是水溶性化合物(water-solublecompounds)，三是哌珀霉素类(peptaibols)。挥发性有机化合物可以作为一种信号在水、空气和土壤中传播，并且传播距离较远，因此较其他次级代谢产物在生防方面有更大的优势。近年来，人们对木霉产生的具有抑菌作用的挥发性有机化合物的研究日益增多，且不同木霉菌株之间存在明显差异。如木霉T36和T50产生的挥发性有机化合物均可抑制禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和腐霉(Pythium ultimum)的生长，但是T36对三种病原菌的抑制率均高于T50。同时对木霉挥发性有机化合物的调控机制也有了初步研究。Belén等人利用消减杂交技术确定了THCTF1调控的基因，识别了多蛋白桥连因子mbf1，发现Thmbf 1与哈茨木霉产生的挥发性有机化合物组分有关，即过表达Thmbf 1会降低哈茨木霉挥发性有机化合物对尖孢镰刀菌和灰霉菌(Botrytis cinerea)的抑制率。木霉挥发性有机化合物中有大量的萜类物质，其形成与3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)息息相关。然而，作为农业生产中使用最广泛的生物制剂之一，木霉野生株挥发性有机化合物的种类或产量较少，对病原菌的抑制效果较差。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以防治枯萎病的非洲哈茨木霉(Trichodermaafroharzianum)MU153及利用该菌株制备的菌剂。
本发明所提供的非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)MU153，为在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO.19036的菌株。
所述非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)MU153由非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)ACCC 33109经紫外诱变得到。
本发明所提供的菌剂，含有所述非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)MU153或/和所述非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)MU153的代谢物。
上述菌剂为具有如下任一用途的菌剂：
A1、防治尖孢镰刀菌所致疾病；
A2、防治致病疫霉所致疾病；
A3、防治长柄链格孢所致疾病；
A4、抑制尖孢镰刀菌；
A5、抑制致病疫霉；
A6、抑制长柄链格孢。
所述菌剂的活性成分可为所述非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)MU153或/和所述非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)MU153的代谢物，所述菌剂的活性成分还可为含有其他生物成分或非生物成分，上述菌剂的其他活性成分本领域技术人员可根据菌剂的效果确定。
所述菌剂还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体为矿物材料、生物材料；所述矿物材料可为草炭、粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述生物材料为各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生壳、玉米粉、豆粉、淀粉、草炭和动物的粪便中的至少一种；所述液体载体可为水；所述菌剂中，非洲哈茨木霉MU153或/非洲哈茨木霉MU153的代谢物可以以被培养的菌丝、分生孢子、厚垣孢子、不菌丝的发酵液、菌丝培养物的滤液或丝、分生孢子、厚垣孢子与滤液的混合物的形式存在。所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。
本发明还提供了所述非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)MU153的培养物，所述培养物为在微生物培养基中培养所述非洲哈茨木霉(Trichodermaafroharzianum)MU153得到的物质。
所述培养物可具有下述至少一种功能：
A1、防治尖孢镰刀菌所致疾病；
A2、防治致病疫霉所致疾病；
A3、防治长柄链格孢所致疾病；
A4、抑制尖孢镰刀菌；
A5、抑制致病疫霉；
A6、抑制长柄链格孢。
本发明还提供了所述非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)MU153或/和所述非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)MU153的代谢物在制备具有下述至少一种功能的产品中的应用：
A1、防治尖孢镰刀菌所致疾病；
A2、防治致病疫霉所致疾病；
A3、防治长柄链格孢所致疾病；
A4、抑制尖孢镰刀菌；
A5、抑制致病疫霉；
A6、抑制长柄链格孢。
本发明还提供了所述非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)MU153或所述菌剂的下述任一种应用：
A1、防治尖孢镰刀菌所致疾病；
A2、防治致病疫霉所致疾病；
A3、防治长柄链格孢所致疾病；
A4、抑制尖孢镰刀菌；
A5、抑制致病疫霉；
A6、抑制长柄链格孢。
本发明还提供了培养所述非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)MU153的方法，所述方法包括：将所述非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)MU153在用于培养非洲哈茨木霉的培养基中进行培养，完成所述非洲哈茨木霉(Trichodermaafroharzianum)MU153的培养。
上述方法中，所述培养基可以PDA、SNA、CMA或以α-D-葡萄糖、α-D-半乳糖、糊精、麦芽糖或Tween-80为碳源的培养基。
具体的，所述培养基可由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其在所述培养基中的浓度可为所述碳源20g/L，酵母膏3g/L，苏氨酸3g/L，磷酸氢二钾1g/L，四水硫酸镁0.5g/L，氯化钾0.5g/L，七水硫酸锌0.1g/L和硫酸铁0.01g/L。
所述培养基可通过添加琼脂制备成固体培养基。
进一步，所述培养基可为合成培养基1、合成培养基2、合成培养基3、合成培养基4或合成培养基5；
所述合成培养基1：α-D-葡萄糖20g，琼脂20g，酵母膏3g，苏氨酸3g，磷酸氢二钾1g，四水硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，七水硫酸锌0.1g，硫酸铁0.01g，以蒸馏水定容至1L。
所述合成培养基2：Tween-80 20g，琼脂20g，酵母膏3g，苏氨酸3g，磷酸氢二钾1g，四水硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，七水硫酸锌0.1g，硫酸铁0.01g，以蒸馏水定容至1L。
所述合成培养基3：糊精20g，琼脂20g，酵母膏3g，苏氨酸3g，磷酸氢二钾1g，四水硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，七水硫酸锌0.1g，硫酸铁0.01g，以蒸馏水定容至1L。
所述合成培养基4：麦芽糖20g，琼脂20g，酵母膏3g，苏氨酸3g，磷酸氢二钾1g，四水硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，七水硫酸锌0.1g，硫酸铁0.01g，以蒸馏水定容至1L。
所述合成培养基5：α-D-半乳糖20g，琼脂20g，酵母膏3g，苏氨酸3g，磷酸氢二钾1g，四水硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，七水硫酸锌0.1g，硫酸铁0.01g，以蒸馏水定容至1L。
本发明还提供了制备所述菌剂的方法，所述菌剂包括将所述非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)MU153和/或所述非洲哈茨木霉(Trichodermaafroharzianum)MU153的代谢物作为菌剂的成分，得到所述菌剂。
本发明中，所述非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)MU153的代谢物可从非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)MU153的发酵液中获得。所述非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)MU153的代谢物可为非洲哈茨木霉(Trichodermaafroharzianum)MU153的无菌代谢物或含菌代谢物。非洲哈茨木霉(Trichodermaafroharzianum)MU153的无菌代谢物(无菌发酵滤液)具体可按照如下方法制备，在液体培养基中培养非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)MU153，过滤除去液体培养物(发酵液)中的菌即得到非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)MU153的无菌代谢物。非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)MU153的含菌代谢物具体可按照如下方法制备，在液体发酵培养基中培养非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)MU153，收集液体培养物(发酵液)，即得到非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)MU153的含菌代谢物。
本发明中，所述产品可为菌剂、微生态制剂或生物肥料。
本发明中，所述尖孢镰刀菌可为黄瓜枯萎病菌或香蕉枯萎病菌。所述尖孢镰刀菌所致疾病可为黄瓜枯萎病或香蕉枯萎病。在本发明的一个实施例中，所述尖孢镰刀菌为香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense race4)ACCC 38875。在本发明的另一个实施例中，所述尖孢镰刀菌为尖镰孢黄瓜专化型(黄瓜枯萎病菌)(Fusarium oxysporumf.sp.cucumerinum)ACCC 37438。
所述致病疫霉为可致病的疫霉，如烟草黑胫病菌。所述致病疫霉所致疾病可为烟草黑胫病。在本发明的一个实施例中，所述致病疫霉为致病疫霉(Phytophthoranicotianae)ACCC 38636。
所述长柄链格孢可为烟草赤星病菌。所述长柄链格孢所致疾病可为烟草赤星病。在本发明的一个实施例中，所述长柄链格孢为长柄链格孢(烟草赤星病菌)(Alternarialongipes)ACCC 30002。
实验证明，本发明的非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)MU153能够产生抑菌作用较强的挥发性有机化合物，用于抑制病原菌：尖孢镰刀菌、长柄链格孢和致病疫霉。本发明的非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)MU153以及利用该菌株所制菌剂在生物防治方面具有巨大的应用潜力，同时也是开发天然生物活性物质的重要微生物资源。
生物材料保藏说明
生物材料的分类命名：非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)
生物材料的菌株编号：MU153
生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
生物材料的保藏单位简称：CGMCC
生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101
生物材料的保藏日期：2019年12月13日
生物材料的保藏中心登记入册编号：CGMCC NO.19036
附图说明
图1为非洲哈茨木霉挥发性气体对尖孢镰刀菌ACCC 38875的抑菌活性。
图2为非洲哈茨木霉ACCC 33109、MU153在不同培养基上的菌落形态。图2中第一行3张图片表示ACCC 33109、MU153在CMA培养基上生长3d后菌落形态差异，第二行和第三行分别表示ACCC 33109、MU153在PDA和SNA培养基上生长3d后菌落形态差异。
图3为非洲哈茨木霉ACCC 33109、MU153的分生孢子梗结构(PDA,28℃,72h)。
图4为不同底物对非洲哈茨木霉ACCC 33109、MU153抑菌作用的影响。横坐标为碳源，纵坐标为抑菌率。同种碳源下，标有不同字母的菌株间抑菌率差异显著。MU-153表示MU153。
图5为非洲哈茨木霉ACCC 33109和MU153产生的挥发性气体对尖孢镰刀菌、致病疫霉和长柄链格孢菌的抑菌情况。
图6为非洲哈茨木霉ACCC 33109和MU153对黄瓜枯萎病的防治效果。注：9表示非洲哈茨木霉ACCC 33109，153表示MU153；W表示清水对照，P表示尖孢镰刀菌(即病原菌。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)ACCC 33109为在中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心(又称中国农业微生物菌种保藏管理中心，简称ACCC，地址：北京市海淀区中关村南大街12号，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，邮编100081)保藏编号为ACCC 33109的非洲哈茨木霉(Trichodermaafroharzianum)，收藏日期为2016年12月31日，自该收藏日起公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得该菌株。
下述实施例中的香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense race4)ACCC38875于2014年07月01日收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心(又称中国农业微生物菌种保藏管理中心，简称ACCC，地址：北京市海淀区中关村南大街12号，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，邮编100081)，自该收藏日起公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得该菌株。
下述实施例中的尖镰孢黄瓜专化型(黄瓜枯萎病菌)(Fusarium oxysporumf.sp.cucumerinum)ACCC 37438于2008年11月30日收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心(又称中国农业微生物菌种保藏管理中心，简称ACCC，地址：北京市海淀区中关村南大街12号，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，邮编100081)，自该收藏日起公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得该菌株。
下述实施例中的长柄链格孢(烟草赤星病菌)(Alternaria longipes)ACCC 30002于1983年12月31日收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心(又称中国农业微生物菌种保藏管理中心，简称ACCC，地址：北京市海淀区中关村南大街12号，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，邮编100081)，自该收藏日起公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得该菌株。
下述实施例中的疫霉(Phytophthora nicotianae)ACCC 38636于2013年05月收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心(又称中国农业微生物菌种保藏管理中心，简称ACCC，地址：北京市海淀区中关村南大街12号，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，邮编100081)，自该收藏日起公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得该菌株。
实施例1、非洲哈茨木霉突变株MU153的获得与特性检测
本实施例通过原生质体紫外诱变非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)ACCC 33109，获得了对尖孢镰刀菌具有抑菌作用的突变株。
一、材料
菌种:非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)ACCC 33109；香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense race4)ACCC 38875为尖孢镰刀菌，下文简称为尖孢镰刀菌ACCC 38875。
培养基：
原生质体再生培养基：葡萄糖20g，琼脂20g，酵母膏1g，硫酸铵1.4g，磷酸二氢钾2.0g，七水合硫酸镁0.3g，七水合硫酸铁0.05g，硫酸锰0.01g，七水合硫酸锌0.01g，以0.6mol/L的氯化钠渗透压稳定剂定容至1L。
合成培养基：果糖20g，琼脂20g，酵母膏3g，苏氨酸3g，磷酸氢二钾1g，四水硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，七水硫酸锌0.1g，硫酸铁0.01g，以蒸馏水定容至1L。
主要试剂与仪器：蜗牛酶(helicase)、纤维素酶(cellulase)，CMA、PDA、PDB和SNA培养基均为北京百乐欣生物科技有限公司产品。紫外光催化/反应箱(CBIO21)为北京赛百奥科技有限公司产品。Biolog微生物检定系统(71000)为美国Biolog有限公司产品。
二、非洲哈茨木霉的诱变
1、原生质体制备
利用蜗牛酶与纤维素酶酶解非洲哈茨木霉ACCC 33109的菌丝，得到原生质体，悬浮于5mL的0.6mol/L NaCl缓冲液中，得到原生质体悬浮液。在显微镜下以血球计数板计数，调整原生质体浓度至1.0×106个/mL，4℃冰箱保存待用。
2、原生质体紫外诱变
无菌操作台经紫外灯(25W)照射30min灭菌后，将浓度为1.0×106个/mL的原生质体在距离紫外灯20cm处分别照射0min、0.5min、1.0min、1.5min、2.0min、2.5min、3min和3.5min后，分别取50μL涂布于原生质体再生培养基，28℃避光培养至长出单菌落。计算诱变致死率，致死率(％)＝[1-(诱变后原生质体再生菌落数/未诱变原生质体再生菌落数)]×100％。选取合适的剂量进行诱变处理，并在红光下涂布于原生质体再生培养基，28℃黑暗培养，挑取单菌落纯化待用。
当紫外诱变微生物的致死率为75～80％时，正突变率较高；随着紫外诱变时间的延长，原生质体的致死率逐渐上升。非洲哈茨木霉ACCC 33109的原生质体经紫外灯(25W)照射1～1.5min后致死率上升最快，3.5min后致死率致死率接近100％。紫外诱变2min时的致死率为76.63％，是紫外诱变的最佳时间。经多批次原生质体紫外诱变，优先挑取生长较快、菌落直径较大且菌丝较密的菌落，涂布于原生质体再生培养基，最终获得828个突变株，分别记为MU1-828。
3、对扣试验
将非洲哈茨木霉ACCC 33109、尖孢镰刀菌ACCC 38875和步骤2所得各突变株分别在PDA上活化，7d后以打孔器(Φ＝6mm)分别在菌落边缘打取菌饼并接种到PDA中央，将分别与非洲哈茨木霉ACCC 33109以及突变株的菌饼对扣，中间以无菌玻璃纸隔开，用两层封口膜密封，28℃恒温培养。以对扣无非洲哈茨木霉ACCC 33109以及突变株的PDA为对照(CK)，每个处理设置3个重复，连续5天测量菌落半径，并计算抑菌率。抑菌率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)×100％/对照菌落直径。
基于平板对扣实验，非洲哈茨木霉ACCC 33109和828个突变株均能不同程度地抑制尖孢镰刀菌ACCC 38875的菌丝生长，且抑制活性随着时间的延长而增强，表现为尖孢镰刀菌菌丝生长缓慢，色素减少，菌落边缘菌丝稀疏且不规则生长(图1)。测试菌株均能产生具有抑菌作用的挥发性有机物，但抑制活性差异较大。其中，抑制率低于10％的有145株，10-20％间有270株，20-30％间有313株，30-40％间有70株，40-50％间有25株，高于50％的有2株，27个突变株的抑菌率高于野生株非洲哈茨木霉ACCC 33109(37.18％)。其中，突变株MU153经过多次传代培养性状稳定，抑菌率为53.86％，且表型与野生株有明显差异。
4、菌落形态和分生孢子梗显微结构比较
将野生株非洲哈茨木霉ACCC 33109和突变株MU153在PDA上活化7d，以打孔器(Φ＝6mm)获得菌饼，分别接种到CMA、PDA和SNA培养基中央，28℃黑暗培养，每天在体式显微镜下观察记录各菌株生长和形态变化。
非洲哈茨木霉ACCC 33109和突变株MU153在CMA、PDA和SNA培养基、28℃培养3d后均长满平板，但菌落形态有较大差异(图2)。在CMA培养基上，非洲哈茨木霉ACCC 33109菌落白色，产生不明显轮纹，菌落圆形，气生菌丝丰富，为绒毛状，不产生色素；MU153菌落初为白色，第三天变为浅绿色，菌落圆形，气生菌丝丰富，菌落背面颜色从无色到浅黄色；在PDA培养基上，非洲哈茨木霉ACCC 33109菌落白色，菌落圆形，气生菌丝丰富，为絮状，不产生色素；MU153菌落初为白色，后变为浅绿色和绿色，菌落圆形，气生菌丝丰富，菌落背面颜色从无色变为浅绿色。在SNA培养基上，非洲哈茨木霉ACCC 33109菌落初为白色后变为浅绿色，呈放射状，菌落边缘不规则，气生菌丝稀疏，不产生色素；MU153菌落由白色变为浅绿色，呈放射状，气生菌丝稀疏，呈绒毛状，菌落背面颜色由白色变为浅绿色。
采用插片法，将野生株非洲哈茨木霉ACCC 33109和突变株MU153的菌饼分别接种到PDA培养基中央，同时将无菌盖玻片斜插到PDA培养基中，28℃黑暗培养3d，光学显微镜下观察菌丝、分生孢子和分生孢子梗的形态特征。
非洲哈茨木霉不同菌株的分生孢子梗显微结构：
非洲哈茨木霉ACCC 33109和MU153在PDA平板、28℃培养3d后均产生分生孢子梗和分生孢子(图3)。原生质体紫外诱变提高了MU153的瓶梗长度、瓶梗长/宽、支持细胞宽度、支持细胞长度、孢子长、宽和孢子长/宽，降低了MU153分生孢子梗最宽处和基部宽(表1)。
表1、非洲哈茨木霉ACCC 33109、MU153的分生孢子梗相关数据
参数 ACCC 33109 MU153
瓶梗长度(μm) 9.44±1.60 10.61±2.15
最宽处(μm) 3.00±0.33 2.71±0.39
瓶梗长/宽 3.16±0.65 3.99±1.01
基部宽度(μm) 2.19±0.33 2.03±0.34
支持细胞宽度(μm) 2.68±0.45 2.72±0.42
支持细胞长度(μm) 10.68±3.49 12.73±3.46
孢子长度(μm) 2.93±0.44 3.09±0.40
孢子宽度(μm) 2.36±0.22 2.44±0.19
孢子长/宽 1.24±0.17 1.27±0.15
5、营养利用比较
Biolog表型分析：利用Biolog微生物检定系统(71000)进行。将野生株非洲哈茨木霉ACCC 33109、突变株MU153在PDA上活化7d，分别进行如下操作：用无菌棉签沾取孢子并转入FF-IF接种液(Biolog)中，调节菌悬液浊度至75％T后取100μL加入到FF板微孔中，在Biolog培养箱、26℃条件下培养7d。利用Data File Converter、OL_FM_12和OL_PR_12软件以Area为参数进行数据分析，Area值越大表明菌株对该底物利用率越高。
本实验采用的FF板共有96种营养物质，包括71种碳源、24种氮源和1个对照。碳源可细分为糖类化合物、醇类化合物、酸类化合物、酯类化合物和其他。氮源可细分为氨基酸、二肽、核苷酸、胺类物质和其他。非洲哈茨木霉ACCC 33109、MU153均可代谢FF板中所有物质。MU153对FF板中46种物质的代谢能力高于非洲哈茨木霉ACCC 33109，达到显著水平的有2种，分别为甘油和麦芽糖。
表2、非洲哈茨木霉ACCC 33109代谢能力低于MU153的物质
Figure BDA0002387148970000101
表2中，*表示显著差异，P≤0.05。
进一步可以得到如下可以用于培养MU153的优化培养基：
合成培养基1：α-D-葡萄糖20g，琼脂20g，酵母膏3g，苏氨酸3g，磷酸氢二钾1g，四水硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，七水硫酸锌0.1g，硫酸铁0.01g，以蒸馏水定容至1L。
合成培养基2：吐温-80 20g，琼脂20g，酵母膏3g，苏氨酸3g，磷酸氢二钾1g，四水硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，七水硫酸锌0.1g，硫酸铁0.01g，以蒸馏水定容至1L。
合成培养基3：糊精20g，琼脂20g，酵母膏3g，苏氨酸3g，磷酸氢二钾1g，四水硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，七水硫酸锌0.1g，硫酸铁0.01g，以蒸馏水定容至1L。
合成培养基4：麦芽糖20g，琼脂20g，酵母膏3g，苏氨酸3g，磷酸氢二钾1g，四水硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，七水硫酸锌0.1g，硫酸铁0.01g，以蒸馏水定容至1L。
合成培养基5：α-D-半乳糖20g，琼脂20g，酵母膏3g，苏氨酸3g，磷酸氢二钾1g，四水硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，七水硫酸锌0.1g，硫酸铁0.01g，以蒸馏水定容至1L。
优化培养基的抑菌效率：依据Biolog表型芯片分析结果，分别将合成培养基中的碳源果糖换为MU153利用率高且非洲哈茨木霉ACCC 33109利用率低的底物—α-D-半乳糖、糊精、麦芽糖、α-D-葡萄糖和Tween-80进行非洲哈茨木霉野生株ACCC 33109和突变株MU153与尖孢镰刀菌ACCC 38875的对扣试验，即所用培养基为上文的合成培养基1-5。每个处理设置3个重复，连续5天计算抑菌率。
以α-D-半乳糖、糊精、麦芽糖、α-D-葡萄糖和吐温-80(Tween-80)为碳源时的合成培养基中的碳源浓度均为20g/L。
对扣试验步骤按照步骤3的方法进行，将步骤3所用的PDA替换为相应碳源的合成培养基。
结果发现MU153基于5种底物产生的挥发性有机化合物对尖孢镰刀菌的抑菌率均明显高于野生株非洲哈茨木霉ACCC 33109，与Biolog试验结果符合。以α-D-葡萄糖为底物时，非洲哈茨木霉ACCC 33109和MU153产生的挥发性有机化合物对尖孢镰刀菌的抑制率均高于其他四种碳源，并且MU153抑菌率达到了最高为56.17％(图4)。
6、基因组测序和泛基因组比较分析
菌丝制备：以打孔器(Φ＝6mm)获得野生株非洲哈茨木霉ACCC 33109、突变株MU153菌饼，接种到PDB培养基，5d后用6层纱布过滤获得菌丝，用无菌滤纸吸干菌丝表面液体，液氮速冻15min后装入无菌离心管。
基因组测序：委托南京派森诺基因科技有限公司在IlluminaNovaSeq平台上进行三株菌基因组的片段文库构建和组装分析。采用AdapterRemoval去除3'端的接头污染，以SOAPec软件基于Kmer频率对所有reads进行质量校正，获取高质量测序数据，通过A5-miseq和SPAdes对高质量的二代测序数据进行从头拼装，构建contig和scaffold，使用pilon软件对结果进行校正，得到最终基因组序列数据。
基因注释和泛基因组分析：分别采用diamond、InterPro、eggNOG-mapper、KAAS和BLAST软件对蛋白编码基因进行NR、KOG、KEGG、SwissPort和GO注释，并以PGAP软件进行泛基因组差异基因分析。
经Hiseq平台测序，非洲哈茨木霉ACCC 33109和MU153的基因组大小分别为38746116mb和41018310mb，预测的基因数目均在8000以上，平均基因长度大于1500bp。
经PGAP软件分析，2株菌共有和特有的基因簇共有9232个，MU153特有的基因簇有1234个。经GO(Gene Ontology)数据库注释分析，差异表达基因主要集中在生物学过程和分子功能方面，其次是细胞、胞内、细胞组分、细胞器、细胞内氮化合物代谢过程和生物合成过程。经eggNOG(evolutionary genealogy of genes:Non-supervised OrthologousGroups)数据库注释分析，未知功能的基因占36.38％及以上，其次是碳水化合物的运输及代谢、翻译后修饰、蛋白质转换、分子伴侣、核糖体结构和胞内运输等。经KEGG(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes)数据库注释分析，差异表达基因主要集中在遗传信息加工方面，其次是信号和细胞过程、信号传导和新陈代谢等。
非洲哈茨木霉ACCC 33109的突变株MU153已于2019年12月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC NO.19036，该突变株下文称为非洲哈茨木霉MU153。
实施例2、非洲哈茨木霉MU153的抑菌作用的测定
检测野生株非洲哈茨木霉ACCC 33109与实施例1的非洲哈茨木霉MU153产生的挥发性有机化合物对黄瓜枯萎病菌(尖孢镰刀菌)、烟草黑胫病(致病疫霉)和烟草赤星病(长柄链格孢)的抑菌效果。
1、待测菌株
非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)ACCC 33109，下文简称为ACCC33109；
实施例1的非洲哈茨木霉MU153，下文简称为MU153。
2、供试病原菌
尖镰孢黄瓜专化型(黄瓜枯萎病菌)(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)ACCC 37438，下文简称为ACCC 37438；
长柄链格孢(烟草赤星病菌)(Alternaria longipes)ACCC 30002，下文简称为ACCC 30002；
疫霉(Phytophthora nicotianae)ACCC 38636，为烟草黑胫病菌，下文简称为ACCC38636。
3、操作步骤
将ACCC 33109、MU153、ACCC 37438、ACCC 30002和ACCC 38636分别在PDA上活化，7d后以打孔器(Φ＝6mm)分别在菌落边缘分别打取ACCC 33109和MU153菌饼并接种到PDA中央，分别与ACCC 37438、ACCC 30002和ACCC 38636对扣，中间以无菌玻璃纸隔开，用两层封口膜密封，28℃恒温培养。以只接种ACCC 37438、ACCC 30002和ACCC 38636菌饼的培养皿为对照(CK)，每个处理设置3个重复，连续5天测量菌落半径，并计算抑菌率。抑菌率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)×100％/对照菌落直径。
结果见表3和图5，结果显示，ACCC 33109和MU153均能抑制尖孢镰刀菌(尖镰孢黄瓜专化型)、疫霉和长柄链格孢菌的生长，MU153的抑制效果明显高于ACCC 33109。
表3、非洲哈茨木霉ACCC 33109和MU153产生的挥发性气体对尖孢镰刀菌、疫霉和长柄链格孢菌的抑菌率
菌株名称 尖镰孢黄瓜专化型 疫霉 长柄链格孢菌
非洲哈茨木霉ACCC 33109(％) 37.18±0.0167A 56.08±0.0061A 70.65±0.0279A
非洲哈茨木霉MU153(％) 53.86±0.0164B 78.97±0.0180B 80.44±0.0057B
注：同列不同字母表示非洲哈茨木霉ACCC 33109和MU153的抑菌率间有显著差异，P≤0.01。
实施例3、实施例1的非洲哈茨木霉MU153对黄瓜枯萎病防治效果的测定
供试病原菌：尖镰孢黄瓜专化型(黄瓜枯萎病菌)(Fusarium oxysporumf.sp.cucumerinum)ACCC 37438，下文简称为尖孢镰刀菌ACCC 37438。
待测菌株：非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)ACCC 33109，下文简称为ACCC 33109；实施例1的非洲哈茨木霉MU153，下文简称为MU153。
实验步骤：以打孔器(Φ＝6mm)获得活化好的野生株非洲哈茨木霉ACCC 33109、突变株MU153和尖孢镰刀菌ACCC 37438菌饼，接种到PDB培养基，7d后分别用6层纱布和2层擦镜纸过滤获得孢子，调整孢子浓度均为1.0×10 7conidia/ml备用。将非洲哈茨木霉ACCC33109和MU153的孢子悬浮液分别与尖孢镰刀菌ACCC 37438孢子悬浮液等体积混合，得到两种孢子混合液。将每种孢子混合液分别与土拌匀，每克土拌的总孢子数为2.0×107conidia，每个处理10个重复，每个重复1.5kg土，然后移栽黄瓜中农春秋(中蔬种业科技(北京)有限公司)幼苗，6周后统计黄瓜枯萎病发病级数，并计算病情指数和发病率。利用清水拌土作为清水对照，利用等量病原菌拌土作为病原菌对照，利用等量待测菌株拌土作为对照。
黄瓜枯萎病发病级数：
0级：黄瓜不发病；
1级：叶片轻微黄化萎蔫；
2级：叶片轻度黄化萎蔫，植株矮化；
3级：叶片重度黄化萎蔫，植株明显矮化；
4级：植株死亡。
病情指数(％)＝100×∑(病情级值×该级病情株数)/(病情最高级值×总株数)。
发病率(％)＝100×(发病植株数/调查总株数)。
结果见表3和图6，结果显示，非洲哈茨木霉ACCC 33109和MU153均能防治黄瓜枯萎病，并且MU153的防治效果明显好于ACCC 33109，发病率和病情指数均显著下降。
表4、不同菌株处理下黄瓜发病情况
清水对照 病原菌 ACCC 33109 MU153 ACCC 33109+病原菌 MU153+病原菌
病情指数(％) 0 60 0 0 15 10
发病率(％) 0 90 0 0 30 20

Claims (10)

1.非洲哈茨木霉（Trichoderma afroharzianum）MU153，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO.19036。
2.一种菌剂，含有权利要求1所述非洲哈茨木霉（Trichoderma afroharzianum）MU153。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂为具有如下任一用途的菌剂：
A1、防治尖孢镰刀菌所致疾病；
A2、防治致病疫霉所致疾病；所述致病疫霉为烟草黑胫病菌（Phytophthoranicotianae）；
A3、防治长柄链格孢所致疾病；
A4、抑制尖孢镰刀菌；
A5、抑制致病疫霉；所述致病疫霉为烟草黑胫病菌（Phytophthora nicotianae）；
A6、抑制长柄链格孢。
4.权利要求1所述非洲哈茨木霉（Trichoderma afroharzianum）MU153的培养物，为在微生物培养基中培养权利要求1所述非洲哈茨木霉（Trichoderma afroharzianum）MU153得到的含菌混合物。
5.权利要求1所述非洲哈茨木霉（Trichoderma afroharzianum）MU153在制备具有下述至少一种功能的产品中的应用：
A1、防治尖孢镰刀菌所致疾病；
A2、防治致病疫霉所致疾病；所述致病疫霉为烟草黑胫病菌（Phytophthoranicotianae）；
A3、防治长柄链格孢所致疾病；
A4、抑制尖孢镰刀菌；
A5、抑制致病疫霉；所述致病疫霉为烟草黑胫病菌（Phytophthora nicotianae）；
A6、抑制长柄链格孢。
6.权利要求1所述非洲哈茨木霉（Trichoderma afroharzianum）MU153或权利要求2或3所述菌剂的下述任一种应用：
A1、防治尖孢镰刀菌所致疾病；
A2、防治致病疫霉所致疾病；所述致病疫霉为烟草黑胫病菌（Phytophthoranicotianae）；
A3、防治长柄链格孢所致疾病；
A4、抑制尖孢镰刀菌；
A5、抑制致病疫霉；所述致病疫霉为烟草黑胫病菌（Phytophthora nicotianae）；
A6、抑制长柄链格孢。
7.培养权利要求1所述非洲哈茨木霉（Trichoderma afroharzianum）MU153的方法，包括：将所述非洲哈茨木霉（Trichoderma afroharzianum）MU153在用于培养非洲哈茨木霉的培养基中进行培养，完成所述非洲哈茨木霉（Trichoderma afroharzianum）MU153的培养。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述培养基为以α-D-半乳糖、糊精、麦芽糖、α-D-葡萄糖或吐温-80为碳源的培养基。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述培养基为PDA、SNA或CMA。
10.制备权利要求2或3所述菌剂的方法，包括将权利要求1所述非洲哈茨木霉（Trichoderma afroharzianum）MU153作为菌剂的成分，得到所述菌剂。
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