CN1543801A - 一种辣椒疫病生防制剂及其生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于农作物病害生物防治技术领域。涉及一种防治辣椒真菌土传病害的微生物生防活菌制剂的生产及使用方法。本制剂的主要有效成分为放线菌：利用能产生抗生素、且能在辣椒根际土壤和根内定殖的拮抗性特殊放线菌在辣椒根际土壤及辣椒根系大量繁殖抑制辣椒疫霉生长，从根源上消除辣椒疫病发生条件，解决化学农药难以解决的辣椒疫病防治难题；采用固态培养法生产，原料主要为农副产品，来源广，价格低廉；本制剂的主要防治对象为辣椒疫霉(Phytophthora.capsici)。本制剂可通过施入辣椒苗床土、移栽时蘸根等方式接入辣椒根际土壤，用量少，用法简单。使用该制剂无化学农药残留，推广应用后社会及经济效益明显。

Description

一种辣椒疫病生防制剂及其生产方法
技术领域
本发明属于农作物病害生物防治技术领域。涉及一种防治辣椒真菌土传病害的微生物活菌制剂的生产方法。本辣椒疫病生防制剂的主要有效成分为具有特定功能的放线菌。
背景技术
辣椒是我国的特种农产品，也是人们日常生活中增味添色的蔬菜和调味品，更是重要的出口创汇优势经济作物。辣椒在我国种植范围广、面积大。据不完全统计，全国有27个省区有干制辣椒栽培，年种植500万亩以上，干椒年总产60～70万吨，年产值约50亿元。陕西省种植的“秦椒”，以角果细长、颜色鲜红、皱纹均匀、辣味佳美而久负盛名，出口远销港澳、新加坡、马来西亚、日韩和欧美等国家。陕西省辣椒年种植面积60～70万亩，约占全国种植面积的15％，年产值6～7亿元；青海省温室辣椒种植面积约1.5万亩，年产值高达1.5亿元。辣椒已成为我省及其他省份辣椒主产区广大农民脱贫致富的特色经济作物，种植效益较高，在调整农业产业结构和产业化开发中有重要意义。但由于辣椒疫病流行，严重阻碍了辣椒生产的发展。辣椒疫病防治已成了限制辣椒产业发展的主要因素之一。
辣椒疫病亦称辣椒枯萎病、辣椒疫霉病，是由辣椒疫霉(Phytophthora capsici)引起的一种土传病害，可称之为“辣椒癌症”，常造成辣椒减产，甚止绝收，已成为世界范围内辣椒的毁灭性病害。自80年代在我国发现以来已在陕西凤翔、岐山、扶风辣椒主产区造成了重大损失：辣椒疫病发病率高达50％～80％，一般减产30％～50％，严重时造成绝收；青海、新疆、甘肃、宁夏及其它省份辣椒疫病流行造成的损失更为严重：青海乐都、循化县的大棚辣椒亩产值在1万元以上，由于辣椒疫病绝收，有的农民已停止种植。青海人大代表已将辣椒疫病防治作为议案提交人大会议讨论，以寻求解决办法。辣椒疫病防治已成为陕西、新疆、青海等西北五省及全国辣椒生产面临的重大课题。
近十年来，人们已在查清辣椒疫病病原菌的基础上进行了一系列化学防治技术研究，取得了一定的结果，但仍未从根本上解决辣椒疫病防治难题。化学防治存在的主要问题：辣椒疫病为土传病，采用化学农药防治时农药必须施入土壤。而农药施入土壤后会发生物理、化学吸附、迁移及微生物降解转化等一系列复杂过程，严重影响了化学农药的防治效果；若过度加大用量，不仅会影响辣椒生长，增加辣椒果实中农药残留量，抑制土壤中有益微生物生长，而且会污染环境，增加生产成本。辣椒疫病一旦发生流行，则无法用化学农药控制。近20余年的化学防治研究表明，仅利用化学农药防治辣椒疫病并不能从根本上解决问题，在目前辣椒抗病育种尚无重大进展的情况下，探求新的突破途径是十分必要的。
本发明的研究结果表明：利用能产生抗生素、且能在辣椒根际土壤和根内定植的特殊拮抗性放线菌抑制辣椒疫霉生长，从根源上消除辣椒疫病发生的条件，可以从根本上解决化学农药不能解决的辣椒疫病的防治难题。这是一条重要且很有希望的途径：利用微生态原理中微生物间的竞争及拮抗理论，通过选育并向辣椒根圈施入拮抗性微生物，可从根本上抑制辣椒疫霉生长繁殖，防止辣椒疫病发生。
本发明研制出的辣椒疫病生物防治制剂以能抑制辣椒疫霉生长的拮抗性放线菌活菌为主要有效成分，主要用于辣椒疫病生物防治，同时对其他农作物的疫霉病害也有一定防效。
本发明研制出的辣椒疫病生物防治制剂可通过施入辣椒育苗苗床土、移栽时蘸根等方式接入辣椒根际土壤，利用拮抗菌在辣椒根际根内大量繁殖抑制辣椒疫霉生长，从根本上防治辣椒疫病大规模流行，减少或取消化学农药使用，降低辣椒中农药残留，提高辣椒质量，生产绿色无公害农产品，增加辣椒出口创汇，加快农村产业结构调整和农民增收。
发明内容
本发明的主要目的：提供一种利用微生态原理解决辣椒疫病问题的微生物产品及其生产方法。
发明的生物学原理：利用能产生抗生素、且能在辣椒根际土壤和根内定殖的特殊放线菌抑制辣椒根际土壤中辣椒疫霉生长及侵染辣椒根系，从根源上消除辣椒疫病发生的条件，从根本上解决辣椒疫病的防治问题。
发明内容：从4500余株分离自青海农田土壤放线菌中通过平皿拮抗性初筛、辣椒盆栽复筛、大田试验验证及拮抗菌在辣椒根系与土壤中的定殖能力测定等程序筛选出1株有实际应用价值的高效生防菌。
1.辣椒疫病生防菌的生物学特征：
入选防菌代号为28G14，保藏在中国专利菌种保藏中心(CCTCC)，保藏号：CCTCCNO：M203077
①28G14生防菌的分类地位：28G14，原核微生物，属于放线菌的链霉菌属，未定种(streptomeces.spp)。
②28G14号生防菌的形态与培养特征：
形态特征：在黄豆粉培养基上：基丝分枝、发达、均匀，气丝分枝、稀薄，分化出直状孢子丝，孢子柱形至球形；在高氏1号上基丝分枝、发达、均匀，气丝分枝、发达，孢子丝丰茂，钩状或顶端螺旋状，孢子球形。
培养特征：在黄豆粉培养基上无气丝，基丝棕褐色，产褐色素；在高氏1号上孢子丝灰色、粉状，基丝棕褐色，产褐色素。
生理生化特征：水解淀粉；不产生卵磷脂酶；在石蕊牛奶培养基中不产酸、不产碱、不凝乳，胨化牛奶；液化明胶；产生H2S；在酪氨酸琼脂上产生黑色素；不分解纤维素；对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、假丝酵母、青霉、西瓜枯萎病菌及黄瓜枯萎病菌均无拮抗作用。初步鉴定为链霉菌属中的灰褐类群。
③28G14号生防菌的鉴定特征(表1、2、3)：
A.28G14号生防菌的碳源利用(表1)：
                         表1  28G14对14种碳源的利用
鼠李糖* 核糖 D-甘露糖* 乙酸钠 D-山梨醇 D-半乳糖* 麦芽糖* 肌醇 D-密三糖 甜醇 马尿酸钠 D-果糖 葡萄糖* 淀粉
++ - ++ - ++ ++ ++ + + - - - ++ +
B.28G14号生防菌的氮源利用(表2)：
                            表2  28G14对14种氮源的利用
甘氨酸 天冬氨酸 丙氨酸 尿素 L-赖氨酸 酪氨酸 精氨酸 L-色氨酸 L-丝氨酸 L-胱氨酸 L-瓜氨酸 D-L酪氨酸 鸟氨酸 硫酸铵
- ++ + ++ + - -  -  -  -  - + - +
C.28G14号生防菌的抗药性标记(表3)：
表3  28G14对10种抗生素(mg/ml)及2种农药的抗药性特征
  环丙沙星(0.25)     诺氟沙星(5.0)   利福平(0.25)   红霉素(0.25)   链霉素(0.25)   氯霉素(0.2)   硫酸卡拉霉素(0.25) 硫酸庆大霉    素(0.25)   青霉素(5.0)   氨苄青霉素(5.0)     甲霜灵(稀释800倍)     代森锰森(稀释800倍)
  -     +     +    -   -   -    -  -   -   +     +     -
④28G14号生防菌的在平皿内对辣椒疫病病原菌的拮抗性：
28G14号生防菌对供试辣椒疫霉的拮抗圈直径达到19mm。
⑤28G14号生防菌在辣椒根系中的定殖作用(表4)：
单接拮抗菌及拮抗菌与辣椒疫霉同时接种时，辣椒根内的拮抗菌数量(104个/g根)分别为14.3及5.2，辣椒根内无疫霉，辣椒不发病；单接疫霉时辣椒根内的疫霉数量为27×104个/g根，辣椒发病死亡(表4)。
表4，28G14号生防菌在辣椒根系中的定殖作用(定殖密度：104个/g根)
           抑菌圈处理    直径(mm) 单接28G14(545×104个/ml)      28G14拮抗菌+疫霉同时接种
    7d后根内定殖密度(104个/g根) 接种菌悬液浓度 7d后根内定殖密度
拮抗菌  疫霉   拮抗菌  疫霉
CK1(未接疫霉)    -CK2(接疫霉)      -28G14接种        19     0014.3   0      00      630545    545     0      00      275.2    0
2.辣椒疫病生防制剂在盆栽实验中对辣椒疫病的防效(表5)：
表5 28G14号拮抗菌在不同生育期对辣椒疫霉的盆栽试验抗病性(未灭菌土壤)
                处理            试验辣椒株数       辣椒发病率(％)
                试验时间(d)                      3      4        5
辣椒幼苗期盆    CK1(未接疫霉)        40         0      0        0
栽试验          CK2(接疫霉)          40         52.9   100      100
                28G14+疫霉            40         0      0        0
                试验时间(d)                      7      14       30
开花-结椒期     CK1(未接疫霉)        40         0      0        0
辣椒盆栽试验    CK2(接疫霉)          40         0      100      100
                28G14+疫霉            40         0      0        14
3.辣椒疫病生防制剂在田间实验中对辣椒疫病的防效(表6)：
表6 28G14蘸根接种处理对辣椒疫病的田间防效(2003年，陕西省岐山青化乡)
                          调查时间(日/月)   干辣椒产量(kg/ha)
  26/7   1/8   7/8  16/8   27/8   9/9
发病率(％)   CK(不接生防菌)   10.7   11.1   16  18   20   28     3210
  28G14接种   2.0   0.55   3.9  8   8   12     5616
 28G14接种发病率降幅(％)   81.3   95.0   75.6  55.6   60.0   57.1
病情指数   CK(不接生防菌)   0.14   0.10   0.12  0.18   0.189   0.28
  28G14接种   0.02   0.06   0.036  0.072   0.072   0.12
 28G14接种病情指数降幅(％)   85.7   40.0   70.0  60.0   61.9   57.1
4.辣椒疫病生防制剂的发酵工艺：采用固态发酵工艺，发酵培养基成分如下：
固体发酵基质原料：包括有机和无机原料。有机原料(大米粉、玉米粉、黄豆饼粉麸皮等)主要为微生物提供碳源、能源及部分氮源：将大米、玉米及黄豆饼粉碎至粒径1mm左右。无机配料：土壤、黄沙，除了提供少量无机养分离子外，主要用作填充料，增加固态培养基的疏松度和通气性。土壤，系普通黄土母质发育土壤，在中国北方广泛分布；黄沙，普通建筑用，过1mm筛。
生防制剂固态发酵培养基：
1号配方：大米粉∶砂∶土＝30∶35∶35，培养物的活菌数(1.6×1016cfu/g)；
2号配方：玉米粉∶砂∶土＝20∶40∶40，培养物的活菌数(2.0×1016cfu/g)：；
生防制剂固态发酵培养方法：按上述配方比例配料，再按干料∶营养液＝1∶0.30～0.45的比例加入高氏1号液体培养基，搅拌均匀，121℃×30min灭菌，冷却，按5％～10％用量接种生防菌菌悬液，拌匀，在灭菌培养盘中28℃培养，4～5d即可。
具体实施方式
1.二级菌种的扩大培养∶将生防菌28G14斜面菌种接入加有250ml黄豆粉液体培养基〔可溶淀粉5.0，蔗糖10.0，蛋白胨2.0，酵母膏2.0，NaCl 2.0，K2HPO4，MgSO4.7H2O 0.5，CaCO31.0，黄豆粉浸汁(1L水加50g黄豆粉煮沸30分钟，过滤取汁)1L，pH7.2～7.4，121℃灭菌30min。〕500ml三角瓶中，在摇床上28℃恒温振荡培养3d即可用作菌剂制备的接种剂。
2.菌剂制备：按1号或2号配方比例配料，再按干料∶营养液＝1∶0.30～0.45的比例加入高氏1号液体培养基，搅拌均匀，121℃×30min灭菌，冷却，按5％～10％用量接种生防菌菌悬液，拌匀，在灭菌培养盘中28℃培养4～5d；发酵产物自然风干、低温减压干燥或低温通风烘干(40～45℃)，粉碎即可。
3.生防活菌制剂的用量与用法：
①蘸根：2～3kg/亩；按固态菌剂∶水＝1∶4～5的比例将菌剂与清水混合均匀呈糊状，移栽前将辣椒根系浸入生防制剂糊状物中8～10小时或直接蘸根，使根系表面充分粘附生防菌接种材料，然后按常规3株1穴的方法栽植即可。
②苗床土处理：将固态发酵产物按5％～10％的用量加入苗床土中并充分混匀，其余措施同常规辣椒育苗方法。辣椒移栽时根系所带的营养土中有大量生防菌，移栽后继续在辣椒根际土壤中生存、繁殖，可以有效抑制辣椒疫霉生长及对辣椒的侵染，从而达到防病的结果。
与现有的辣椒疫病化学防治方法相比，本发明具有以下主要优点：
1.能有效解决辣椒疫霉的流行难题：辣椒连茬种植导致辣椒根际土壤中辣椒疫霉数量大幅度增加，引起辣椒疫病发生。辣椒育苗或移栽时接种辣椒疫病生防菌，生防菌可在辣椒根际土壤中繁殖并侵染辣椒根系，可以从根本上抑制辣椒疫霉在辣椒根际土壤中大量繁殖及侵染辣椒根系，进而达到防治辣椒疫病流行的目的。
2.无化学农药残留，无毒副作用：本发明的理论基础是微生物生态学，用于辣椒疫病防治的生防菌来源于农田土壤，经过工业发酵扩大培养后再施入农田，对人及其它动物无毒副作用，使用后无任何化学农药残留，对生产绿色食品有重要意义。
3.推广应用后社会及经济效益明显：本发明产品的生产原料主要为农产品或农副产品，原料来源广，价格低廉，生产成本低；辣椒预防接种时辣椒生防制剂用量少，用法简单，田间使用时不增加作业难度；企业生产及农民施用该制剂均有明显的社会、经济及生态效益。
4.本制剂可采用固态法发酵生产：设备投入少，管理较为简单，易于中小企业使用。

Claims (7)

1.一种用于辣椒疫病防治的生物活菌制剂。其特征在于：放线菌为活菌制剂的主要有效成分；制剂主要用固态培养法生产；该制剂的主要防治对象为辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)。
2.根据权利要求1所述的辣椒疫病生物防治活菌制剂，其特征在于：活菌制剂的有效放线菌为链霉菌属(streptomeces.spp)。
该生防菌的形态与培养特征如下：
形态特征：①在黄豆粉培养基(成分公知)上基丝分枝、发达、均匀；气丝分枝、稀薄，分化出直状孢子丝，孢子柱形至球形；②在高氏1号上基丝分枝、发达、均匀，气丝分枝、发达，孢子丝丰茂，钩状或顶端螺旋状，孢子球形。
培养特征：①在黄豆粉培养基上无气丝，基丝棕褐色，产棕褐色素；②在高氏1号(成分公知)上孢子丝灰色、粉状，基丝棕褐色，产棕褐色素。
生理生化特征：水解淀粉；不产生卵磷脂酶；在石蕊牛奶培养基中不产酸、不产碱、不凝乳，胨化牛奶；液化明胶；产生H2S；在酪氨酸琼脂上产生黑色素；不分解纤维素；对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、假丝酵母、青霉、西瓜枯萎病菌及黄瓜枯萎病菌均无拮抗作用。
该生防菌的碳源、氮源利用其抗药性标记特征(表1、2、3)如下：
                    表1  28G14对14种碳源的利用 鼠李糖* 核糖 D-甘露糖* 乙酸钠 D-山梨醇 D-半乳糖* 麦芽糖* 肌醇 D-密三糖 甜醇 马尿酸钠 D-果糖 葡萄糖* 淀粉 ++ - ++ - ++ ++ ++ + + - - - ++ +
               表2  28G14对14种氮源的利用 甘氨酸 天冬氨酸 丙氨酸 尿素 L-赖氨酸 酪氨酸 精氨酸 L-色氨酸 L-丝氨酸 L-胱氨酸 L-瓜氨酸 D-L酪氨酸 鸟氨酸 硫酸铵 - ++ + ++ + - - - - - - + - +
             表3  28G14对10种抗生素(mg/ml)及2种农药的抗药性特征 环丙沙星(0.25)  诺氟沙星(5.0)  利福平(0.25)  红霉素(0.25)  链霉素(0.25) 氯霉素(0.25)      -      +      +      -      -     - 硫酸卡拉霉素(0.25)  硫酸庆大霉素(0.25)  青霉素(5.0)  氨苄青霉素(5.0) 甲霜灵(稀释800倍) 代森锰森(稀释800倍)      -      -      +      +     -
3.根据权利要求1所述的辣椒疫病生物防治活菌制剂，其特征在于：该发明的基本原理是：从农田及辣椒根际土壤中筛选具有双重功能的特殊放线菌：①能产生拮抗辣椒疫霉的抗生素，②能在辣椒根际土壤和辣椒根内定植；利用所选特殊放线菌制成活菌制剂，通过蘸根或施入苗床土的方法给辣椒根系接种，进而使辣椒根系及根际土壤中辣椒疫霉拮抗菌的数量达到一定水平，实现抑制辣椒根际土壤中辣椒疫霉生长及侵染辣椒根系的目的，从根源上消除辣椒疫病发生的条件，从根本上解决辣椒疫病流行难题。
4.根据权利要求1所述的辣椒疫病生物防治活菌制剂，其特征在于：该活菌制剂用固态发酵法培养，培养温度28～30℃，培养时间3～5d；
5.根据权利要求1所述的辣椒疫病生物防治活菌制剂，其特征在于：该活菌制剂的固态发酵培养基成分包括有机和无机原料两部分：有机原料，主要为微生物提供碳源、能源及部分氮源，包括大米粉、玉米粉、黄豆饼粉及麸皮等；无机配料：土壤、黄沙等。配料前需将大米、玉米及黄豆饼粉碎至粒径1mm左右。土壤，系普通黄土母质发育土壤，在中国北方广泛分布；黄沙，普通建筑用。黄沙：过1mm筛。生防制剂固态发酵培养基成分(质量比)：1号配方：大米粉∶砂∶土＝30∶35∶35；2号配方：玉米粉∶砂∶土＝20∶40∶40。
6.根据权利要求1所述的辣椒疫病生物防治活菌制剂，其特征在于：生防制剂固态发酵培养方法如下：
①二级菌种的扩大培养：将生防菌28G14斜面菌种接入加有250ml黄豆粉液体培养基(可溶淀粉5.0，蔗糖10.0，蛋白胨2.0，酵母膏2.0，NaCl2.0，K2HPO4，MgSO4.7H2O0.5，CaCO31.0，黄豆粉浸汁(1L水加50g黄豆粉煮沸30分钟，过滤取汁)1L，pH7.2～7.4，121℃灭菌30min。)的500ml三角瓶中，在摇床上28℃恒温振荡培养3～4d，即可用作菌剂制备的接种剂。
②菌剂制备：按1号配方或2号配方配料，再按干料∶营养液＝1∶0.30～0.45的比例加入高氏1号液体培养基(成分公知)，搅拌均匀，121℃×30min灭菌，冷却，按5％～10％用量接种生防菌菌悬液，拌匀，在灭菌培养盘中28℃培养4～5d；发酵产物自然风干、低温减压干燥或低温烘干(40～45℃)，粉碎即可。
7.根据权利要求1所述的辣椒疫病生物防治活菌制剂，其特征在于：生防活菌制剂的用量与用法如下：
①蘸根：30～40kg/公顷；按固态菌剂∶水＝1∶4～5的比例将菌剂与清水混合均匀呈糊状，移栽前将辣椒根系浸入生防制剂糊状物中8～10小时或直接蘸根，使根系表面充分粘附生防菌接种材料，然后按常规3株1穴的方法栽植即可。
②苗床土处理：将固态发酵产物按5％～10％的用量加入苗床土中并充分混匀，其余育苗措施同常规辣椒育苗。辣椒移栽时根系所带的营养土中有大量生防菌，移栽后继续在辣椒根际土壤中生存、繁殖，可有效抑制辣椒疫霉生长及其对辣椒的侵染，从而达到防病的目的。
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