CN118165842A - 保山茜内生真菌Veronaea sp.YAFEF256分离及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供保山茜内生真菌Veronaea sp.YAFEF256分离及应用，涉及植物微生物防治技术领域。本发明提供一种保山茜内生真菌，保藏名称为维朗那霉YAFEF256 Veronaea sp.YAFEF256，保藏编号为CCTCC NO：M 2024291，通过本发明提供保山茜内生真菌制备获得的发酵液粗提物，对大白菜软腐病致病细菌成团泛菌（Pantoea agglomerans）和柑橘溃疡病致病细菌柑橘黄单胞杆菌柑橘亚种（Xanthomonas citri subsp.citri）有抑制作用，为防治大白菜软腐病和柑橘溃疡病提供了新的防治途径。

Description

保山茜内生真菌Veronaea sp.YAFEF256分离及应用

技术领域

本发明涉及植物微生物防治技术领域，具体涉及保山茜内生真菌Veronaea sp.YAFEF256分离及应用。

背景技术

保山茜为茜草科大果茜属常绿小乔木，原名瑞丽茜树，为云南特有树种。保山茜主要分布于云南高黎贡山一带，生长于海拔1800-2000米。因其分布范围窄，数量少，被云南省极小种群物种拯救保护规划纲要列为极小种群物种。

植物内生真菌是指寄居在健康植物的组织内，同时对宿主植物无明显感染迹象的一类真菌。内生真菌广泛分布在健康植物各个组织、器官内，在与植物经历协同进化后，可形成与宿主植物相同或类似的活性产物，其种类丰富多样，具有抑制病原菌生长、杀死植食性昆虫以及促进宿主植物生长等作用。目前，对于内生真菌的研究主要包括植物内生真菌次生代谢产物的作用研究和植物内生真菌在与宿主共生时本身对宿主产生的影响。

农作物病虫害是我国的主要农业灾害之一，它具有种类多、影响大、并时常暴发成灾的特点，其发生范围和严重程度对我国国民经济、特别是农业生产常造成重大损失。大白菜是秋播蔬菜中种植面积最大，销量最广的一种蔬菜。近年来，由于白菜耕种时间延长，软腐病的发生呈多而重的趋势。大白菜软腐病又称腐烂病、烂疙瘩，是大白菜包心后期的主要病害，在白菜主产区均有发生，不但在田间发生，且在贮运、销售过程中也会发生腐烂，造成严重的经济损失。近几年，发现了一种具有类似软腐病症的新病，其腐烂斑点首先在外叶的叶柄基部观察到，逐渐发展和扩大、甚至整株植株腐烂。通过一系列生物学鉴定和分子鉴定，确定引起大白菜软腐病的病原菌为成团泛菌（Pantoea agglomerans）。成团泛菌作为大白菜软腐病新的病原菌为今后的育种和种植提出了新的挑战。

近年来中国柑橘产业发展迅速，栽培面积和年产量已超过美国和巴西，成为世界第一大柑橘生产国。在影响柑橘生产可持续发展的诸多因素中，检疫性病虫害是一个极其重要的制约因素。柑橘黄单胞柑橘亚种（Xanthomonas citri subsp. citri）是引起柑橘溃疡病的亚洲种，其菌系分化复杂、发病率高、传播快、致病力强，分布广泛，由此引起的溃疡病已成为我国柑橘生产上的一种重要病害。目前中国各主要柑橘产区几乎皆有柑橘溃疡病发生，对柑橘尤其是橙类产业造成了严重损失。迄今尚未发现能彻底防治柑橘溃疡病的药剂和方法，因此开发针对病原菌的新型防治手段已迫在眉睫。

发明内容

针对现有技术不足，本发明提供保山茜内生真菌Veronaea sp.YAFEF256分离及应用，通过Veronaea sp.YAFEF256的发酵液粗提物对植物病害致病细菌进行抑制。

为实现以上目的，本发明的技术方案通过以下技术方案予以实现：

保山茜内生真菌，所述保山茜内生真菌的保藏名称为维朗那霉 YAFEF256Veronaea sp. YAFEF256，保藏编号为CCTCC NO：M 2024291。

保山茜内生真菌的分离方法，包括以下步骤：

S1-1、获取保山茜树皮，表面除杂后采用30%次氯酸钠溶液浸泡再灭菌水冲洗，得组织块备用；

S1-2、将组织块混合钢珠、灭菌水进行破碎后稀释涂布在在KASMYF培养基平板上培养至长出菌落；

S1-3、将长出的菌落菌丝转接至MYF固体培养基上培养20d后，对菌株进行分子鉴定，得到Veronaea sp. YAFEF256菌株。

优选的，所述KASMYF培养基的组分为：20g/L麦芽糖+2g/L酵母粉+3g/L保山茜枝叶粉末+200μg/mL卡拉霉素+200μg/mL氨苄青霉素+200μg/mL链霉素+15g/L琼脂粉。

优选的，所述步骤S1-3中MYF固体培养基的组分为20g/L麦芽糖+2g/L酵母粉+3g/L保山茜枝叶粉末+15g/L琼脂粉。

保山茜内生真菌的发酵液粗提物的制备方法包括以下步骤：

S2-1、将Veronaea sp. YAFEF256菌种活化；

S2-2、将活化好的Veronaea sp. YAFEF256接种到SCMB液体培养基中培养，获得发酵液；

S2-3、将发酵液中的菌丝过滤后获得菌液，再向菌液中按照体积比为1∶1.5加入乙酸乙酯，超声处理后，静置使其分层后萃取上清液，用旋转蒸发仪冷凝回流并干燥，获得真菌发酵液粗提物。

优选的，所述SCMB液体培养基的制备方法为：分别称取0.5g丁酸钠，0.1g山核桃壳粉末，3g麦芽糖和0.4g牛肉粉末加入到含有100ml水的250ml三角瓶中，封口膜封好瓶口后高压灭菌。

采用上述发酵液粗提物制备防治成团泛菌或柑橘黄单胞杆菌柑橘亚种引起的农作物病害的产品。

优选的，所述农作物病害为大白菜软腐病或柑橘溃疡病。

且大白菜软腐病或柑橘溃疡病的防治方法为于大白菜或柑橘上施用上述产品对大白菜软腐病或柑橘溃疡病进行防治。

本发明提供保山茜内生真菌Veronaea sp. YAFEF256分离及应用，与现有技术相比优点在于：

本发明通过分离筛选保山茜内生真菌，得到一株具有抗菌活性的真菌，保藏名称为维朗那霉 YAFEF256 Veronaea sp. YAFEF256，保藏编号为 CCTCC NO：M 2024291，通过实验发现，真菌YAFEF256制备获得的发酵液粗提物，对大白菜软腐病致病细菌成团泛菌（Pantoea agglomerans）和柑橘溃疡病致病细菌柑橘黄单胞杆菌柑橘亚种（Xanthomonascitri subsp. citri）有极显著的抑制作用，为成团泛菌或柑橘黄单胞杆菌柑橘亚种引起的病害防治提供了新的防治途径。

附图说明

图1为本发明实施例1中保山茜内生真菌Veronaea sp. YAFEF256菌丝生长情况图；

图2为本发明实施例1中保山茜内生真菌Veronaea sp. YAFEF256菌丝显微图；

图3为本发明实施例3的内生真菌Veronaea sp. YAFEF256对柑橘黄单胞杆菌柑橘亚种的抑制作用图，其中1：Veronaea sp. YAFEF256发酵液粗提物；2：Veronaea sp.YAFEF256菌丝体粗提物；3：DSMO；4：SCMB液体培养基粗提物；

图4为本发明实施例3的保山茜内生真菌Veronaea sp. YAFEF256对成团泛菌的抑制作用图，其中1：Veronaea sp. YAFEF256发酵液粗提物；2：Veronaea sp. YAFEF256菌丝体粗提物；3：DSMO；4：SCMB液体培养基粗提物；

图5为本发明实施例1基于ITS构建的内生真菌系统发育树展示图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供的保山茜内生真菌，保藏名称：维朗那霉 YAFEF256 Veronaea sp.YAFEF256；保藏编号：CCTCC NO：M 2024291；保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；该培养物于2024年01月29日由保藏中心收到，并登记入册，根据请求，由该日起保藏三十年，该培养物的存活性由保藏中心于2024年02月05日检测完毕，结果为存活。

实施例1：

保山茜内生真菌的分离和鉴定：

1、保山茜内生真菌的分离

用刀将离地1米的保山茜树皮切割下来后，立即放入自封袋中，并将样品放入干冰保存一直到下一步处理，然后将样品用自来水清洗表面杂物后，用解剖刀到将样品切成2cm小块,用1L蒸馏水冲洗，然后，用30%次氯酸钠溶液浸泡1min，倒掉次氯酸钠溶液，用50mL的灭菌水，冲洗6次。

将2cm的小块切成长度与宽度均为0.5cm的组织块，放入2ml离心管，加入2颗钢珠，0.7mL的灭菌水，破碎2分钟（180rpm)。再稀释1000倍涂板10个在KASMYF培养基平板上（KASMYF：20g/L麦芽糖+2g/L酵母粉+3g/L保山茜枝叶粉末+200μg/mL卡拉霉素+200μg/mL氨苄青霉素+200μg/mL链霉素+15g/L琼脂粉）平板上，培养10d，长出菌落，挑选菌落，对单菌落进行鉴定。

将长出的菌丝转接到MYF固体培养基上培养20d后，对菌株进行分子鉴定，得到Veronaea sp. YAFEF256菌株。所述MYF固体培养基包括以下组分：20g/L麦芽糖+2g/L酵母粉+3g/L 保山茜枝叶粉末+15g/L琼脂粉。

2、保山茜内生真菌的鉴定

（1）形态的鉴定

该菌株形态如图1所示，真菌在PDA固体培养基上生长良好，菌落表面呈绒毛状向外生长，有大量气生白色菌丝。

（2）DNA提取

①实验前先将CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）放在65℃水浴锅中加热30min；

②取50mg新鲜的Veronaea sp. YAFEF256菌丝体于2mL的离心管中，加入3颗小钢珠，将该离心管放入液氮中3min，并立即用破碎机破碎2min，加入1mL预热的CTAB溶液，用移液枪吹打混匀后全部移入装有200μL PVP(聚乙烯基吡咯烷酮)的离心管中，在通风橱中悬空添加20μLβ-巯基乙醇，震荡15s以充分研磨，然后放到65℃水浴锅水浴1.5h，每10min上下翻转5-6次，水浴结束后以12000r/min，4℃离心10min；

③取1mL上清液到新的离心管中，加入DNA酚试剂、氯仿-异戊醇混合液各500μL，上下翻转10min，离心（4℃，12000r/min）10min（③步骤重复两次）；

④取上清液900μL放入一个新的离心管中，加入50μL 3mol醋酸钠溶液和900μL95%无水冰乙醇（-20℃），摇匀放入-20℃冰箱沉淀3h；

⑤沉淀完离心（4℃·12000r/min）10min，弃上清液，加入500μL 75％酒精上下翻转2-3次，静置3min，弃上清液；

⑥加入500μL 95%酒精上下翻转2-3次，静置3min，常温离心（13000rpm）3min，弃乙醇，放置干；

⑦加入40μL洗脱缓冲液EB，常温离心（13000rpm）1.5min，得到真菌Veronaea sp.YAFEF256的基因组DNA。

（3）ITS分析鉴定

用真菌通用引物ITS1（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）扩增真菌rDNA的间隔序列(含ITS1区、5.8S区、ITS4区)序列，所得的ITS测序序列如SEQ ID No.1所示。

SEQ ID No.1：

CGGGGCGTCTACCTGATTTGAGGTCAAATTGTCAAAGGTATTGTCCTTACGGACGGTTAGAAGCGAGTCTAAACCAAGTCCACGGCGTAGATAATTATCACACCAATAGACGGAGGTTCAGTATGAACTCGCTAATGCATTTCAGGGGAGCAGACCGCGCTGAGGCAGCCTGCACAAACCCCCACATCCAAGCCTCAGCAGGTTAATAAAAACGGGTGAGGTTGAGAATTTAATGACACTCAAACAGGCATGCTCCTCGGAATACCAAGGAGCGCAAGGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCAAGAGATCCGTTGCTGAAAGTTGTATAGTGTTTTTATAGGCTGTGAAGCCCATTGACTACATTCTATATCATACATTTGGGGTGTGTAAAAAGACGTAGAGCCTGGAAATTCGAGGAGAGACCCGCTCGCACGGGCAATCCTCGCATCCGCCCAGAGGCGAGAGTTATCCAGACCTACAGTCGGTGCACAGGTGGAAAGATAAAAATGGCGGGCGTGCACAATGCTCCGAGGAGCCAGCGACAACCAAGACACCATAGTTATTCGTTAATGATCCTTCCGCAGGCCCCCCAAAGGGAAAGG；

（4）构建发育树

基于ITS利用MEGA软件构建植物内生真菌的系统发育树（图4），综合菌株形态学鉴定和分子生物学鉴定结果，将YAFEF256菌株鉴定为Veronaea sp.。

实施例2：

保山茜内生真菌液体发酵粗提物的制备：

1、液体培养

将保山茜内生真菌Veronaea sp. YAFEF256的菌丝体接种到装有100ml SCMB液体培养基的250mL锥形瓶中，置于26℃，170rpm的恒温摇床中，培养20d。

2、液体培养发酵液粗提物的制备

将液体培养的菌丝体用纱布滤走，得到菌液。向菌液中1：1.5加入乙酸乙酯，后超声45min。随即倒入分液漏斗中，静置12h使其分层后萃取上清液。萃取溶液用旋转蒸发仪冷凝回流干燥，制得保山茜内生真菌Veronaea sp. YAFEF256液体发酵粗提物。

3、菌丝体粗提物的制备

用纱布将液体发酵的菌丝体过滤后，获得液体发酵菌丝体。将菌丝体放入三角瓶中，加入95%乙醇，淹没菌丝体。静置12h后，纱布过滤获得菌丝体浸提液，菌丝体浸提液用旋转蒸发仪冷凝回流干燥，制得保山茜内生真菌Veronaea sp. YAFEF256菌丝体粗提物。

4、SCMB液体培养基粗提物制备：

将装有100ml SCMB液体培养基的250mL锥形瓶，置于26℃，170rpm的恒温摇床中20d。向液体培养基中1∶1.5加入乙酸乙酯，后超声45min。随即倒入分液漏斗中，静置12h使其分层后萃取上清液。萃取溶液用旋转蒸发仪冷凝回流干燥，制得SCMB液体培养基粗提物。

实施例3：

Veronaea sp. YAFEF256液体发酵粗提物的抗菌活性检测：

1、致病菌的活化

将成团泛菌和柑橘黄单胞杆菌柑橘亚种，分别取5μL加入2mL离心管中，再加入750μL的LB液体培养基（胰蛋白胨10g/L+氯化钠10g/L+酵母提取物5g/L），然后将离心管放入37℃，转速为180r/min恒温摇床中培养12h，得到致病菌菌液，置于4℃冰箱备用，使用前取出，将活化好的细菌稀释为1/10。

2、滤纸片法检测抗菌活性

将活化得到的致病菌液分别均匀涂布在LB固体培养基（胰蛋白胨10g/L+氯化钠10g/L+琼脂15g/L+酵母提取物5g/L）上，静置待用。

分别取25 mg Veronaea sp. YAFEF256发酵液粗提物、菌丝体粗提物以及SCMB液体培养基粗提物于1.5 mL离心管，加入500μL DMSO（二甲亚砜）溶液，得到50mg/mL粗提物溶液。

吸取10 ul上述粗提物溶液添加到5mm的灭菌滤纸圆片中，当滤纸圆片充分吸收粗提物溶液后，分别放在培养基的对应标记处，将培养基正放置于37℃的恒温培养箱中培养12h，观察是否出现抑菌圈并用十字交叉法量出抑菌圈的直径大小。

粗提物的抑菌活性结果表明Veronaea sp. YAFEF256发酵液的粗提物的抑菌圈为15.2±0.3 mm（图3），说明Veronaea sp. YAFEF256发酵液的粗提物对柑橘黄单胞杆菌柑橘亚种有显著的抗菌活性，菌丝体粗提物和SCMB液体培养基粗提物没有明显的抑菌圈，因此无抗菌活性。

粗提物的抑菌活性结果表明Veronaea sp. YAFEF256发酵液的粗提物的抑菌圈为11.2±0.2 mm（图4），说明Veronaea sp. YAFEF256发酵液的粗提物对成团泛菌有显著的抗菌活性，菌丝体粗提物和SCMB液体培养基粗提物没有明显的抑菌圈，因此无抗菌活性。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.保山茜内生真菌，其特征在于，所述保山茜内生真菌的保藏名称为维朗那霉YAFEF256 Veronaea sp. YAFEF256，保藏编号为CCTCC NO：M 2024291。

2.一种如权利要求1所述的保山茜内生真菌的分离方法，其特征在于，所述分离方法包括以下步骤：

S1-1、获取保山茜树皮，表面除杂后采用30%次氯酸钠溶液浸泡再灭菌水冲洗，得组织块备用；

S1-2、将组织块混合钢珠、灭菌水进行破碎后稀释涂布在在KASMYF培养基平板上培养至长出菌落；

S1-3、将长出的菌落菌丝转接至MYF固体培养基上培养20d后，对菌株进行分子鉴定，得到Veronaea sp. YAFEF256菌株。

3.根据权利要求2所述的分离方法，其特征在于：所述KASMYF培养基的组分为：20g/L麦芽糖+2g/L酵母粉+3g/L保山茜枝叶粉末+200μg/mL卡拉霉素+200μg/mL氨苄青霉素+200μg/mL链霉素+15g/L琼脂粉。

4.根据权利要求2所述的分离方法，其特征在于：所述步骤S1-3中的MYF固体培养基的组分为20g/L麦芽糖+2g/L酵母粉+3g/L 保山茜枝叶粉末+15g/L琼脂粉。

5.一种如权利要求1所述的保山茜内生真菌的发酵液粗提物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

S2-1、将Veronaea sp. YAFEF256菌种活化；

S2-2、将活化好的Veronaea sp. YAFEF256接种到SCMB液体培养基中培养，获得发酵液；

S2-3、将发酵液中的菌丝过滤后获得菌液，再向菌液中按照体积比为1∶1.5加入乙酸乙酯，超声处理后，静置使其分层后萃取上清液，用旋转蒸发仪冷凝回流并干燥，获得真菌发酵液粗提物。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述SCMB液体培养基的制备方法为：分别称取0.5g丁酸钠，0.1g山核桃壳粉末，3g麦芽糖和0.4g牛肉粉末加入到含有100ml水的250ml三角瓶中，封口膜封好瓶口后高压灭菌。

7.一种产品，其特征在于：所述产品含有权利要求5-6任一所述制备方法获得的发酵液粗提物。

8.一种如权利要求7所述的产品在防治成团泛菌或柑橘黄单胞杆菌柑橘亚种引起的农作物病害中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述农作物病害为大白菜软腐病或柑橘溃疡病。

10.一种大白菜软腐病或柑橘溃疡病的防治方法，其特征在于，于大白菜或柑橘上施用权利要求7所述的产品。