CN118086076B - 核桃树皮内生真菌Coprinellus sp.YAFEF312分离及应用 - Google Patents
核桃树皮内生真菌Coprinellus sp.YAFEF312分离及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于植物病害防治技术领域，公开了一种核桃树皮内生真菌Coprinellus sp.YAFEF312分离及应用，具体的，本发明提供一种核桃树皮内生真菌，保藏名称：鬼伞属YAFEF312 Coprinellus sp.YAFEF312，保藏编号：CCTCC NO：M 2024288，通过本发明提供核桃树皮内生真菌制备获得的发酵液粗提物，对猕猴桃溃疡病致病细菌丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv.actinidiae）有抑制作用，为防治猕猴桃溃疡病提供了新的防治途径。
Description
技术领域
本发明属于植物病害防治技术领域，特别涉及一种核桃树皮内生真菌的分离及其液体发酵产生对猕猴桃溃疡病致病细菌丁香假单胞菌猕猴桃致病变种抑制作用的一种培养方法。
背景技术
核桃又被称为胡桃，系胡桃科胡桃属植物，是世界著名的“四大干果”之一。核桃坚果中含多种具有补肾温肺润肠功效的营养物质。在核桃叶和青皮中也发现，具有抗癌、杀虫、抑菌和抗病毒等作用的生物活性成分。核桃的分布和栽培遍及世界五大洲，是重要的栽培树种，在我国云贵川，华北和西北都有广泛栽培种植和野生分布。我国也是世界上最大的核桃生产国和消费国，在种植面积和坚果总产量等方面居世界首位。
植物内生菌是指存在于植物整个或部分生活史中，且寄居于其各个健康组织和器官的内部，但不会导致植物出现明显病害症状的真菌。无论是木本植物还是草本植物都含有丰富的内生真菌。目前研究表明，植物内生真菌中化合物结构新颖，有显著的生物活性，如抗炎、抗肿瘤、抗菌等。
猕猴桃富含维生素Ｃ、氨基酸、糖、挥发性风味物质等多种营养成分，被称为“水果之王”。我国猕猴桃种质资源丰富，栽培面积广泛，种植面积和产量稳定在世界第一。然而，随着猕猴桃种植面积不断增加，其溃疡病也开始大面积暴发。猕猴桃溃疡病是由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv.actinidiae）引起的一种世界性病害，因其可以借助风雨传播，所以广泛分布，发生普遍，对猕猴桃种植业危害严重，大幅降低了猕猴桃的产量和品质，是威胁猕猴桃生产最严重的病害之一。因此，探寻溃疡病的防治手段对猕猴桃产业十分重要。
丁香假单胞菌隶属于假单胞菌科假单胞菌属，是一种典型且传播广泛的革兰氏阴性细菌，广泛存在于自然界中，如大气、土壤、水体及植物叶面等，是一类生态适应性强、表型差异大的微生物群体。丁香假单胞菌是一类植物病原细菌，其引发植物病害的发生率居十大细菌性植物病害之首。其致病性严重影响农业的发展，给各国农业生产造成巨大的经济损失。开发针对丁香假单胞菌的绿色、高效的新型生物防治手段已经刻不容缓。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种核桃树皮内生真菌Coprinellus sp.YAFEF312的分离及其液体培养的方法，通过液体发酵产生抑制植物病害细菌的化合物。
为了实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：
一种核桃树皮内生真菌，保藏名称：鬼伞属YAFEF312 Coprinellus sp.YAFEF312，保藏编号：CCTCC NO：M 2024288，分类命名：鬼伞属YAFEF312 Coprinellus sp.YAFEF312。
进一步的，本发明提供了一种所述真菌发酵液粗提物的制备方法，包括以下步骤：
（1）Coprinellus sp. YAFEF312菌种活化；
（2）将活化好的Coprinellus sp. YAFEF312接种到KPGY液体培养基中培养，获得发酵液，KPGY液体培养基配置方法：分别称取1g 醋酸钾, 0.1g 思茅松锯末，2g葡萄糖和0.2g酵母粉,末加入到含有100ml水的三角瓶中，封口膜封好瓶口后高压灭菌，灭菌结束后待用；
（3）过滤发酵液中的菌丝体获得菌液，向菌液中加入乙酸乙酯，超声处理后，静置使其分层后萃取上清液；用旋转蒸发仪冷凝回流并干燥，获得所述真菌发酵液粗提物。
优选的，步骤（2）中，培养条件为：26℃，170rpm的恒温摇床中，培养20d，获得发酵液。
优选的，步骤（3）中，菌液中按照体积比1:1.5加入乙酸乙酯。
本发明还提供了一种产品，所述产品含所述制备方法制备获得的真菌发酵液粗提物。
进一步的，所述的产品在防治丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae)引起的农作物病害中的应用。
进一步的，所述农作物病害为猕猴桃溃疡病。
最后，本发明还提供了一种猕猴桃溃疡病的防治方法，具体方法为于猕猴桃上施用所述的产品。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过分离筛选核桃树皮内生真菌，得到一株具有抗菌活性的真菌，保藏名称：鬼伞属YAFEF312 Coprinellus sp. YAFEF312，保藏编号：CCTCC NO：M 2024288，分类命名：鬼伞属YAFEF312 Coprinellus sp. YAFEF312，通过实验发现，真菌YAFEF312制备获得的发酵液粗提物，对猕猴桃溃疡病致病细菌丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv.actinidiae）有极显著的抑制作用，为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv.actinidiae）引起的病害防治，特别是猕猴桃溃疡病的防治提供了新的防治途径。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明所述的核桃树皮内生真菌Coprinellus sp.YAFEF312菌丝生长情况图；
图2为本发明所述的核桃树皮内生真菌Coprinellussp.YAFEF312菌丝显微图；
图3为本发明的内生真菌Coprinellus sp.YAFEF312对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的抑制作用图（其中1：Coprinellus sp.YAFEF312发酵液粗提物；2：Coprinellussp.YAFEF312菌丝体粗提物；3： KPGY液体培养基粗提物；4：DSMO）；
图4本发明基于ITS构建的内生真菌系统发育树展示图。
具体实施方案
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供的核桃树皮内生真菌，保藏名称：鬼伞属YAFEF312 Coprinellus sp.YAFEF312，保藏编号：CCTCC NO：M 2024288，分类命名：鬼伞属YAFEF312 Coprinellus sp.YAFEF312；保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；该培养物于2024年01月29日由保藏中心收到，并登记入册，根据请求，由该日起保藏三十年，该培养物的存活性由保藏中心于2024年02月05日检测完毕，结果为存活。
实施例1 核桃树皮内生真菌的分离和鉴定
1、核桃树皮内生真菌的分离
用刀将离地1米的核桃树皮切割下来后，立即放入自封袋中，并将样品放入干冰保存一直到下一步处理，然后将样品用自来水清洗表面杂物后，用解剖到将样品切成2cm小块,用1L蒸馏水冲洗，然后，用30%次氯酸钠溶液浸泡1min，倒掉次氯酸钠溶液，用50mL的灭菌水，冲洗6次。
将2cm的小块切成长度与宽度均为0.5cm的组织块，放入2ml离心管，加入2颗钢珠，0.7mL的灭菌水，破碎2分钟（180rpm)。再稀释1000倍涂板10个在KASGYJ固体培养基平板上（KASGYJ：20g/L葡萄糖+2g/L酵母粉+3g/L核桃枝粉末+200μg/mL卡拉霉素+200μg/mL氨苄青霉素+200μg/mL链霉素+15g/L琼脂粉）平板上，培养10d，长出菌落，挑选菌落，对单菌落进行鉴定。
将长出的菌丝转接到GYJ固体培养基上培养20d后，对菌株进行分子鉴定，得到Coprinellus sp.YAFEF312菌株。所述GYJ固体培养基包括以下组分：20g/L葡萄糖+2g/L酵母粉+3g/L 核桃枝粉末+15g/L琼脂粉。
2、核桃树皮内生真菌的鉴定
（1）形态的鉴定
该菌株形态如图1、2所示，真菌在GYJ固体培养基上生长良好，菌落表面绒毛状，有大量气生白色菌丝。
（2）DNA提取
①实验前先将CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）放在65℃水浴锅中加热30min；②取50mg新鲜的Coprinellus sp.YAFEF312菌丝体于2mL的离心管中，加入3颗小钢珠，将该离心管放入液氮中3min，并立即用破碎机破碎2min，加入1mL预热的CTAB溶液，用移液枪吹打混匀后全部移入装有200μL PVP(聚乙烯基吡咯烷酮)的离心管中，在通风橱中悬空添加20μLβ-巯基乙醇，震荡15s以充分研磨，然后放到65°C水浴锅水浴1.5h，每10min上下翻转5-6次，水浴结束后以12000r/min，4°C离心10min；③取1mL上清液到新的离心管中，加入DNA酚试剂、氯仿-异戊醇混合液各500μL，上下翻转10min，离心（4℃，12000r/min）10min（③步骤重复两次）；④取上清液900μL放入一个新的离心管中，加入50μL 3mol醋酸钠溶液和900μL95%无水冰乙醇（-20℃），摇匀放入-20℃冰箱沉淀3h；⑤沉淀完离心（4℃·12000r/min）10min，弃上清液，加入500μL 75％酒精上下翻转2-3次，静置3min，弃上清液；⑥加入500μL95%酒精上下翻转2-3次，静置3min，常温离心（13000rpm）3min，弃乙醇，放置干；⑦加入40μL洗脱缓冲液EB，常温离心（13000rpm）1.5min，得到真菌Coprinellus sp.YAFEF312的基因组DNA。
（3）ITS分析鉴定
用真菌通用引物ITS1（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）扩增真菌rDNA的间隔序列(含ITS1区、5.8S区、ITS4区)序列，所得的ITS测序序列如SEQ ID No.1所示。
SEQ ID No.1
CGGGGCGTCTACCTGATTTGAGGTCAAATTGTCAAAGGTATTGTCCTTACGGACGGTTAGAAGCGAGTCTAAACCAAGTCCACGGCGTAGATAATTATCACACCAATAGACGGAGGTTCAGTATGAACTCGCTAATGCATTTCAGGGGAGCAGACCGCGCTGAGGCAGCCTGCACAAACCCCCACATCCAAGCCTCAGCAGGTTAATAAAAACGGGTGAGGTTGAGAATTTAATGACACTCAAACAGGCATGCTCCTCGGAATACCAAGGAGCGCAAGGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCAAGAGATCCGTTGCTGAAAGTTGTATAGTGTTTTTATAGGCTGTGAAGCCCATTGACTACATTCTATATCATACATTTGGGGTGTGTAAAAAGACGTAGAGCCTGGAAATTCGAGGAGAGACCCGCTCGCACGGGCAATCCTCGCATCCGCCCAGAGGCGAGAGTTATCCAGACCTACAGTCGGTGCACAGGTGGAAAGATAAAAATGGCGGGCGTGCACAATGCTCCGAGGAGCCAGCGACAACCAAGACACCATAGTTATTCGTTAATGATCCTTCCGCAGGCCCCCCAAAGGGAAAGG
（4）构建发育树
基于ITS利用MEGA软件构建植物内生真菌的系统发育树（图4），综合菌株形态学鉴定和分子生物学鉴定结果，将YAFEF312菌株鉴定为鬼伞属真菌，然后进行保藏，保藏编号：CCTCC NO：M 2024288。
实施例2 核桃树皮内生真菌液体发酵粗提物
1、液体培养
将核桃树皮内生真菌Coprinellus sp.YAFEF312的菌丝体接种到装有100ml KPGY液体培养基的250mL锥形瓶中，置于26℃，170rpm的恒温摇床中，培养20d，100ml KPGY液体培养基配置方法为：分别称取1g 醋酸钾, 0.1g 思茅松锯末，2g葡萄糖和0.2g酵母粉末加入到含有100ml水的250ml三角瓶中，封口膜封好瓶口后高压灭菌，灭菌结束后待用。
2、液体培养发酵液粗提物的制备及抑菌测试
将液体培养的菌丝体用纱布滤走，得到菌液。按照体积比1:1.5向菌液中加入乙酸乙酯，混合均匀后超声45min。随即倒入分液漏斗中，静置12h使其分层后萃取上清液。萃取溶液用旋转蒸发仪冷凝回流干燥，制得核桃树皮内生真菌Coprinellus sp.YAFEF312液体发酵粗提物。
3、菌丝体粗提物的制备
用纱布将液体发酵的菌丝体过滤后，获得液体发酵菌丝体。将菌丝体放入三角瓶中，加入95%乙醇，淹没菌丝体。静置12h后，纱布过滤获得菌丝体浸提液，菌丝体浸提液用旋转蒸发仪冷凝回流干燥，制得核桃树皮内生真菌Coprinellus sp.YAFEF312菌丝体粗提物。
4、KPGY液体培养基粗提物制备
将装有100ml KPGY液体培养基的250mL锥形瓶，置于26℃，170rpm的恒温摇床中20d。向液体培养基中按照体积比1:1.5加入乙酸乙酯，混合均匀后超声45min。随即倒入分液漏斗中，静置12h使其分层后萃取上清液。萃取溶液用旋转蒸发仪冷凝回流干燥，制得KPGY液体培养基粗提物。
5、致病菌的活化
将丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv.actinidiae），取5μL加入2mL离心管中，再加入750μL的LB液体培养基（胰蛋白胨10g/L+氯化钠10g/L+酵母提取物5g/L），然后将离心管放入37℃，转速为180r/min恒温摇床中培养12h，得到致病菌菌液，置于4℃冰箱备用，使用前取出，将活化好的细菌稀释为1/10。
6、滤纸片法检测抗菌活性
将活化得到的致病菌液均匀涂布在LB固体培养基（胰蛋白胨10g/L+氯化钠10g/L+琼脂15g/L+酵母提取物5g/L）上，静置待用。分别取25 mgCoprinellus sp.YAFEF312发酵液粗提物、菌丝体粗提物以及KPGY液体培养基粗提物于1.5 mL离心管，加入500μL DMSO（二甲亚砜）溶液，得到50mg/mL粗提物溶液。吸取10 ul上述粗提物溶液添加到5mm的灭菌滤纸圆片中，当滤纸圆片充分吸收粗提物溶液后，分别放在培养基的对应标记处，将培养基正放置于37℃的恒温培养箱中培养12h，观察是否出现抑菌圈并用十字交叉法量出抑菌圈的直径大小。粗提物的抑菌活性结果表明Coprinellus sp.YAFEF312发酵液的粗提物的抑菌圈为14.5±0.4 mm（图3），说明Coprinellus sp.YAFEF312发酵液的粗提物对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种有显著的抗菌活性，菌丝体粗提物和KPGY液体培养基粗提物没有明显的抑菌圈，因此无抗菌活性。
Claims (8)
1.一种核桃树皮内生真菌，其特征在于，保藏名称：鬼伞属（Coprinellus sp.）YAFEF312，保藏编号：CCTCC NO：M 2024288。
2.一种权利要求1所述真菌发酵液粗提物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）Coprinellus sp. YAFEF312菌种活化；
（2）将活化好的Coprinellus sp. YAFEF312接种到KPGY液体培养基中培养，获得发酵液；所述KPGY液体培养基配置方法：分别称取1g 醋酸钾, 0.1g 思茅松锯末，2g葡萄糖和0.2g酵母粉末加入到含有100ml水的三角瓶中，封口膜封好瓶口后高压灭菌，灭菌结束后待用；
（3）过滤发酵液中的菌丝体获得菌液，向菌液中加入乙酸乙酯，超声处理后，静置使其分层后萃取上清液；用旋转蒸发仪冷凝回流并干燥，获得所述真菌发酵液粗提物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，培养条件为：26℃，170rpm的恒温摇床中，培养20d，获得发酵液。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，菌液中按照体积比1:1.5加入乙酸乙酯。
5.权利要求2-4任一所述制备方法制备获得的真菌发酵液粗提物。
6.权利要求5所述的真菌发酵液粗提物在防治丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae)引起的农作物病害中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述农作物病害为猕猴桃溃疡病。
8.一种丁香假单胞菌猕猴桃致病变种引起的猕猴桃溃疡病的防治方法，其特征在于，于猕猴桃上施用权利要求5所述的真菌发酵液粗提物。
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