CN106367375B - 一株抑制刺五加立枯病的内生生防菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株抑制刺五加立枯病的内生生防菌株及其应用，所述内生生防菌株为芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC‑JW‑14，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.12921。本发明的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC‑JW‑14可用于刺五加立枯病的生物防治，对立枯丝核菌的抑菌率可达69.6％，防治效果可达59.4％。本发明以立枯病病原菌为防治对象，对健康植株刺五加中存在的拮抗内生菌株进行分离筛选，为刺五加立枯病的生物防治奠定基础，同时它的合理应用可以减少化学药剂造成的环境污染，有利于保护生态平衡，对刺五加人工栽培和增收增产都能够起到很大的提高和促进作用，具有一定的研究意义。

Description

一株抑制刺五加立枯病的内生生防菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一株抑制刺五加立枯病的菌株及其应用。
背景技术
五加科植物刺五加Acanthopanax.sentieosus Harm.主要产于我国东北地区，是五加属植物中最重要的药材，具有益气健脾、补肾安神、扶正固本的功效，对亚健康人群具有良好的医疗保健作用。目前，刺五加不但国内畅销，还远销日本、韩国、欧洲和北美洲等国家，为我国出口创汇的主要中药材之一，年需求量约5000t。
由于市场需求量的增加，价格上扬，药农大量破坏性地挖掘刺五加根茎，毁灭性的采挖，使之在相当长的时期内无法更新形成群落，从而导致刺五加野生种群大面积急剧减少，甚至消失。所以，人工栽培刺五加是满足需求和发展的必由之路。随着人工栽培面积的不断扩大，刺五加病害日益严重。目前刺五加栽培中主要病害为苗期的立枯病，刺五加苗木立枯病的致病菌主要是立枯丝核菌(Acanthopanax senticosus)。它是植物在幼苗阶段真菌引起的土传病害，发生范围广，危害严重，防治困难，多年的化学防治使病原菌对多种杀菌剂产生抗药性，且抗性发展速度惊人，导致施用化学农药的剂量不断增加，造成农药残留量的增大、土壤生物结构破坏。而且近两年，黑龙江地区由于春季低温多雨，刺五加立枯病呈加重发生的趋势。
大量研究表明，由于内生菌存在于植物体内，可在植物体内长期定殖并传导，不易受外界环境条件的影响，所以不仅可以给植物提供所需营养物质及一些激素，对植物的生长发育、抵抗病虫侵袭及不良环境等具有广泛的生物学作用，增强了植物抗逆境、抗病虫害的能力。有研究显示，51％的从植物内生菌分离的生物活性物质是以前没有发现的化合物，这对抗菌活性物质来源的新领域的开发将具有十分重大的经济意义。
发明内容
本发明的目的是提供一株抑制刺五加立枯病的内生生防菌株及其应用，对立枯丝核菌(Acanthopanax senticosus)的抑菌率可达69.6％，防治效果可达59.4％。
本发明的抑制刺五加立枯病的内生生防菌株为芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC-JW-14，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2016年9月1日，保藏编号为CGMCC No.12921。
本发明的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC-JW-14的菌落表面平滑，粘稠，为白色，革兰氏阳性菌。
本发明的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC-JW-14的生理生化特性：革兰氏染色、接触酶、明胶液化、V.P、淀粉水解和葡萄糖氧化均为阳性，氧化酶和M.R阴性，石蕊牛奶产酸胨化。
本发明的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC-JW-14经16SrDNA序列比对(NCBI数据库)与芽孢杆菌(Bacillus sp.)的同源性为100％。
本发明的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC-JW-14可用于刺五加立枯病的生物防治。芽孢杆菌(Bacillus sp.)对立枯丝核菌(Acanthopanax senticosus)的抑菌率可达69.6％，对立枯丝核菌(Acanthopanax senticosus)的防治效果可达59.4％。
本发明以立枯病病原菌为防治对象，对健康植株刺五加中存在的拮抗内生菌株进行分离筛选，为刺五加立枯病的生物防治奠定基础，同时它的合理应用可以减少化学药剂造成的环境污染，有利于保护生态平衡，对刺五加人工栽培和增收增产都能够起到很大的提高和促进作用，具有一定的研究意义。
保藏信息：
分类命名：芽孢杆菌Bacillus sp.；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
保藏日期：2016年9月1日；
保藏编号：CGMCC No.12921。
附图说明
图1为芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC-JW-14在LB培养基上纯培养菌落图片；
图2为立枯丝核菌(Acanthopanax senticosus)对照组培养基观察图；
图3为芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC-JW-14对立枯丝核菌(Acanthopanaxsenticosus)的抑菌效果图；
图4为芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC-JW-14革兰氏染色结果图；
图5为芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC-JW-14基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
具体实施方式一：本实施方式提供的抑制刺五加立枯病的内生生防菌株芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC-JW-14保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2016年9月1日，保藏编号为CGMCCNo.12921。
本实施方式的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC-JW-14来源于牡丹江林副特产研究所刺五加试验田，通过对健康植株的组织材料进行内生细菌分离获得，具体方法如下：
一、内生细菌的分离
采回的植株用水冲洗干净后，选取适量的根、茎、叶组织，分别称量后，剪成5mm×5mm的组织块，在95％乙醇中浸泡1min，然后在1％NaClO溶液中浸泡5min，再放入75％乙醇浸泡30s，取出后用无菌水冲洗3次。在无菌研钵内加入10ml的无菌水和少许灭过菌的石英砂研磨成匀浆，加盖静置30min，将匀浆10倍系列稀释后，用移液枪分别吸取0.1ml至准备好的LB平板上，涂抹均匀后放入培养箱培养，48h后记录菌量，并根据菌落形态、颜色和大小选取，在平板上进行纯化保存，共分离5个批次。以组织消毒后用无菌水冲洗的第3次冲洗液为CK，涂皿3d后如有菌落生成，表明表面消毒不彻底，弃去；若CK中无菌落，研磨液中长出的菌落可能是内生菌，进行纯化培养，于4℃冰箱中保存备用。
二、内生拮抗细菌的初步筛选
采用对峙培养法对内生菌拮抗病原真菌进行初筛。在PDA培养基平板上划十字线分出4个区域，每个区域中心分别接入直径为8mm的靶标病原菌菌饼，同时在平板十字线上划入分离出的刺五加内生细菌，放于培养箱中28℃黑暗培养，4d后观察记录抑菌菌带的有无及大小，共重复3次。选出抑菌带宽度最大的8株进行复筛。
三、内生拮抗细菌的复筛
采用对峙培养法对内生菌拮抗病原真菌进行复筛。在PDA培养基平板上划十字线分出4个区域，每个区域中心分别接入直径为8mm的靶标病原菌菌饼，同时在平板十字线上划入初步筛选后有拮抗作用的刺五加内生细菌的培养液(浓度为0.6×107～1×109cfu/L)，设无菌水为对照，重复3次。至于28℃条件下培养，当对照真菌长至十字线位置时观察处理组抑菌效果，测量抑菌菌带宽。抑菌率(％)＝(对照菌丝直径－处理菌丝直径)/对照菌丝直径×100％选出效果最好的一株菌，保存备用。
图2为立枯丝核菌(Acanthopanax senticosus)对照组培养基观察图；图3为芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC-JW-14对立枯丝核菌(Acanthopanax senticosus)的抑菌效果图。芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC-JW-14对立枯丝核菌(Acanthopanax senticosus)的抑菌率可达69.6％。
将筛选的拮抗细菌在LB平板上活化，然后进行革兰氏染色，并在镜下对菌体形态进行观察。菌体形态如表1所示，芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC-JW-14的菌落(图1)表面平滑，粘稠，为白色，革兰氏阳性菌(图4)。
表1芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC-JW-14的菌体形态
芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC-JW-14的生理生化鉴定结果如表2所示。
表2芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC-JW-14生理生化鉴定结果
项目 结果
革兰氏染色 +
接触酶 +
氧化酶 －
明胶液化 +
石蕊牛奶 产酸胨化
MR －
V.P +
淀粉水解 +
葡萄糖氧化 +
挑取拮抗细菌接种于LB液体培养基中，37℃、200r/min摇床培养18h，离心收集菌体，采用DNA提取试剂盒，提取菌株基因组DNA。以基因组DNA为模板，应用细菌16SrDNA通用引物：上游引物5’-AGAGTTTGATC-CTGGCTCAG-3’和下游引物5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’进行PCR扩增。PCR反应体系：10×PCR buffer 2.5μL，dNTP 2.0μL，上下游引物各0.5μL，DNA模板1.0μL，Taq DNA聚合酶0.2μL，补双蒸水至25μL。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1.5min，循环扩增30次：最后72℃延伸10min。由图5可知，芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC-JW-14基因组DNA通过凝胶电泳扩增到单一条带，条带清晰，大小约为1600bp。
将16SrDNA扩增产物回收纯化后，委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC-JW-14经16SrDNA序列比对(NCBI数据库)与芽孢杆菌(Bacillus sp.)的同源性为100％。结合微生物形态和生理生化指标鉴定，确认抑制刺五加立枯病的生防菌株为芽孢杆菌。
本实施方式中，各培养基成分如下：
PDA培养基：马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂20克，无菌水1000毫升，自然pH。
LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，无菌水1000毫升，pH＝7.0。
明胶培养基：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl 0.5g，可溶性淀粉1g，琼脂1.8g，pH＝7.2，100mL无菌水。
石蕊牛奶培养基：加石蕊的酒精饱和溶液于新鲜脱脂牛奶中，使其显浅紫色，分装于小试管。
葡萄糖蛋白胨培养基：蛋白胨0.5g，葡萄糖0.5g，K2HPO4 0.5g，H2O 100mL，pH＝7.2。
吲哚培养基：蛋白胨0.5g，NaCl 0.25g，H2O 50mL，pH＝7.6。
淀粉水解培养基：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl 0.5g，可溶性淀粉1g，H2O 100mL，pH＝7.0。
葡萄糖氧化培养基：蛋白胨2.7g，NaCl5.0g，0.2％溴麝香酚兰0.03g，琼脂3g，K2HPO4 0.3g，葡萄糖10g，无菌水1000毫升，pH＝7.0。
本实施方式中，病原菌为从刺五加感病植株的茎基部分离得到的立枯丝核菌(Acanthopanax senticosus)。
具体实施方式二：本实施方式中芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC-JW-14 可用于刺五加立枯病的生物防治，防治效果实验如下：
设置三个实验组进行盆栽实验，分别为健康对照组，感病对照组和防治组，每组20株刺五加植株。用立枯丝核菌(Acanthopanax senticosus)配置成浓度为1×105个/mL的孢子悬浮液。将刺五加苗进行表面消毒后，用针刺法对健康对照组注入20μL无菌水，感病对照组和防治组各注入20μL立枯丝核菌孢子悬浮液后接种于花盆中。并将防治组植株根部浇灌3mL刺五加生防菌培养液(浓度为0.6×107～1×109cfu/L)。保证每个实验组的刺五加在阴凉通风处生长，每天进行浇灌，15d后观察并记录刺五加发病情况。
防治效果＝(感病对照组感病植株数-防治组感病植株数)/接种植株数×100％。
根据实验结果可知：芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC-JW-14对立枯丝核菌(Acanthopanax senticosus)的防治效果可达59.4％。

Claims (2)

1.一株抑制刺五加立枯病的内生生防芽孢杆菌（ Bacillus sp.） 菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12921。
2.根据权利要求1所述菌株用于刺五加立枯病生物防治的应用。
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