CN113493755A - 盖氏假单胞菌gt03、其应用及所得防治剂 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种盖氏假单胞菌(Pseudomonas gessardii)GT03、其应用及所得防治剂，属于微生物技术领域。该盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardiiGT03，其特征在于，保藏编号为CGMCC No.22836，于2021年07月06日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。本发明提出的盖氏假单胞菌具有良好的溶解有机磷的活性以及较强的产生长素能力，在将该盖氏假单胞菌用于烟草黑胫病的防治中时，可对烟草疫霉菌引起的黑胫病进行有效抑制。

Description

盖氏假单胞菌GT03、其应用及所得防治剂

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种盖氏假单胞菌(Pseudomonasgessardii)GT03、其应用及所得防治剂。

背景技术

由烟草疫霉菌(Phytophthora nicotianae)引起的黑胫病是最具破坏性的植物土传病害之一。随着生态农业需求的增加，防治土传病害不应完全依赖于化学肥料和农药的使用。目前已有大量研究表明植物根际微生物可以作为生防菌和促生菌用来防治植物病害和促进植物生长。以其为原料制备的微生物制剂具有环境友好、无农药残留的特点，为农业绿色发展带来积极作用，是提升植物产量和防控植物病害的有效途径。

近年来，微生物菌剂已被应用于烟草黑胫病的防治中，并且取得了一定的成效。但目前使用的微生物菌剂大多为芽孢杆菌，同质化严重。事实上烟草根际存在着除芽孢杆菌外的许多种具有生防效果的细菌。因此，亟待寻找新的生防菌以丰富微生物菌剂的种类。假单胞菌广泛存在于植物根际中，多种假单胞菌被证实具有促生植物生长、防治植物病害的效果，其促生作用主要表现在具有溶磷活性、ACC脱氨酶活性、产生长素以及铁载体的能力。然而，目前并未有研究报道过盖氏假单胞菌(Pseudomonas gessardii)在防治烟草黑胫病上的应用。

发明内容

本发明提供了一种盖氏假单胞菌(Pseudomonas gessardii)GT03、其应用及所得防治剂，通过对获得的盖氏假单胞菌进行促生防病能力测定，发现其具有良好的溶解有机磷的活性以及较强的产生长素能力，在将该盖氏假单胞菌用于烟草黑胫病的防治中时，可对烟草疫霉菌引起的黑胫病进行有效抑制。

为了达到上述目的，本发明提供了一种盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardiiGT03，其特征在于，保藏编号为CGMCC No.22836，于2021年07月06日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。

作为优选，所述盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii GT03具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。

本发明提供了一种根据上述技术方案所述的盖氏假单胞菌Pseudomonasgessardii GT03的PCR扩增方法，包括以下步骤：

1)提取分离自土壤悬浊液中细菌菌株的基因组DNA；

2)以细菌菌株的基因组DNA为模板，使用上游引物和下游引物，采用rTaq酶进行PCR扩增；

其中：PCR反应体系为：2×Taq Master Mix 12.5μL、正反向引物(10μM)各1μL、DNA模板2μL、ddH₂O 8.5μL，总体系25μL。

作为优选，扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸1.5min，循环30次；最后72℃延伸10min。

作为优选，所述引物对为：

正向引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；

反向引物：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。

本发明还提供了一种根据上述技术方案所述的盖氏假单胞菌Pseudomonasgessardii GT03在拮抗烟草疫霉Phytophthora nicotianae引起的黑胫病中的应用。

作为优选，OD₆₀₀＝0.6浓度下，接种50μL菌液，GT03产生的抑菌圈直径为3.21±0.14cm。

作为优选，OD₆₀₀＝0.6浓度下，接种500μL菌液至50mL含有0.01％色氨酸的LB培养基中，28℃，180r/min振荡培养3d，GT03产生170.31μg/mL的生长素。

作为优选，所述盖氏假单胞菌GT03在每盆接种浓度为10⁷CFU/g时，对烟草疫霉菌引起的黑胫病防治效果达到79.87％。

本发明还提供了一种烟草黑胫病防治剂，以上述技术方案所述的盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii GT03为主要有效成分。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

本发明提供了一种盖氏假单胞菌(Pseudomonas gessardii)GT03，通过对获得的盖氏假单胞菌进行促生防病能力测定，发现其具有良好的溶解有机磷的活性以及较强的产生长素能力，并且首次提出了可将该盖氏假单胞菌用于烟草黑胫病的防治中，且具有良好的抗病性，在每盆接种浓度为10⁷CFU/g时，对烟草疫霉菌引起的黑胫病防治效果达到79.87％。该盖氏假单胞菌的获得能够丰富现有微生物制剂的种类，既解决了长期使用化学药品对环境的污染以及对对病原菌产生的抗药性，又克服了目前的微生物菌剂同质化比较严重的问题。

附图说明

图1为本发明实施例提供的盖氏假单胞菌GT03与其他模式菌株的系统进化关系示意图；

图2为本发明实施例提供的盖氏假单胞菌GT03在NA培养基上菌落形态示意图；

图3为本发明实施例提供的盖氏假单胞菌GT03细菌对烟草疫霉菌JM1的抑制效果示意图；

图4为本发明实施例提供的接种黑胫病菌15d后发病情况及病情指数示意图，***表示P<0.001。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1土壤样品采集

2020年7月从贵州遵义烟区发病烟田中采集了健康烟草根际土，将整株烟株带根挖出，抖落非根际土，将根及附着的根际土壤放入无菌自封袋，低温运回实验室进行菌株分离培养。

实施例2盖氏假单胞菌的筛选

2.1试剂：

LB固体培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，氯化钠10.0，琼脂粉20.0。

NB培养基(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉膏3.0，氯化钠5.0，琼脂粉20.0。

PKO无机磷培养基(g/L)：葡萄糖10.0，(NH₄)₂SO₄ 0.5，MgSO₄·7H₂O 0.1，NaCl 0.2，KCl 0.2，FeSO₄·7H₂O 0.003，MnSO₄·4H₂O 0.03，Ca₃(PO₄)₂ 5.0，酵母粉0.5，琼脂20.0。

蒙金娜有机磷培养基(g/L)：：葡萄糖10.0，MnSO₄·4H₂O 0.03，FeSO₄·7H₂O0.03，CaCO₃ 5.0，(NH₄)₂SO₄ 0.5，NaCl 0.3，KCl 0.3，蛋黄卵磷脂0.2，酵母粉0.4，琼脂20.0。

改良CAS琼脂培养基：购自北京酷来搏科技有限公司。

燕麦培养基(g/L)：燕麦30，琼脂20.0。

谷子培养基：谷子100g，煮至2/3开花，滤干水份。

其它生化试剂及普通化学试剂均为进口或国产分析纯。

2.2细菌的分离培养：

在无菌环境中称取采集到的1.0g烟草根际土加入9mL无菌生理盐水中，震荡混匀，吸取100μL上清液加入到900μL生理盐水中，梯度稀释至10^-4。分别吸取10^-2-10^-4浓度的稀释液100μL涂布于LB固体培养基上。在28℃下恒温培养3d，根据菌落颜色、形态、表面光滑度等挑取不同的单菌落，经2-3次划线纯化，接种于LB液体培养基摇培24h至菌液浑浊，吸取菌液与50％甘油1:1混匀，于-80℃冰箱冷冻保存。

2.3盖氏假单胞菌的筛选及分子鉴定：

采用菌落PCR技术，使用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)对细菌16S rRNA基因序列进行扩增。具体采用的扩增体系为：2×Taq Master Mix 12.5μL、正反向引物(10μM)各1μL、DNA模板2μL、ddH₂O 8.5μL，总体系25μL；扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸1.5min，循环30次；最后72℃延伸10min。

将PCR产物送往青岛睿博生物技术有限公司进行测序，所得细菌序列经校对后上传至EzBioCloud数据库(https://www.ezbiocloud.net/)进行比对。比对完成后分别下载同源性最高的模式菌株序列，使用MEGA5.0进行CLUSTALX多重比对，采用邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树，自举值(Bootstrap)为1000。

经比对，如图1所示，菌株GT03的16S rRNA基因序列与盖氏假单胞菌(Pseudomonasgessardii)相似度最高，为98.84％；系统发育树显示菌株GT03独立成枝，并与P.gessardiiDSM 17152T聚为一簇，因此，初步认定菌株GT03为盖氏假单胞菌，具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。该盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii GT03的保藏编号为CGMCC No.22836，于2021年07月06日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。

实施例3盖氏假单胞菌GT03的促生指标

3.1盖氏假单胞菌GT03的菌落形态

在营养琼脂培养基上培养48h，菌落直径达到1-2mm；形态为浅黄色、表面光滑并且规则的圆形菌落，如图2所示。

3.2盖氏假单胞菌GT03的促生指标

利用不同的指示培养基测定了盖氏假单胞菌GT03的溶磷活性、ACC脱氨酶活性、产生长素以及铁载体的能力。

3.2.1溶磷活性测定：取5μL GT03菌液(OD₆₀₀＝0.6)分别点种到PKO琼脂培养基和蒙金娜有机磷培养基上，28℃培养3天，观察菌落周围具有一个清晰的光环，用增溶指数(SI)评估菌株的增溶作用，计算公式如下：溶解指数(SI)＝(晕+菌落直径)/菌落直径。

3.2.2ACC脱氨酶活性测定：以产物α-丁酮酸作为指标进行检测，以分析菌株的ACC脱氨酶活力。

3.2.3生长素产生能力评价：将20μL细菌悬浮液(～10⁶CFU/mL)接种到20mL LB培养基(5mM L-色氨酸)，于28℃150r/min振荡培养72h，测定生长素产生量。

3.2.4铁载体产生能力评价：将GT03菌株在28℃180r/min下振荡培养到OD₆₀₀＝0.6接种到CAS琼脂培养基，30℃培养7d，观察细菌菌落周围的颜色变化，颜色从蓝色变为橙色或者深黄色，表明菌株可以产生铁载体。

结果发现：菌株GT03不具有溶解无机磷、ACC脱氨酶活性和产铁载体能力，但具有溶解有机磷的活性，溶磷指数为3.0；且具有较强的产生长素能力(170.31μg/mL)。

实施例4盖氏假单胞菌GT03的抑菌能力

打取烟草疫霉菌JM1 6mm菌饼，接种到燕麦培养基培养3d。将菌株GT03接种至NB培养基，28℃，180r/min下摇床培养24h。在烟草疫霉菌菌落边缘打取6mm菌饼，接种到NA平板中央，在平板边缘2.5cm处打6mm孔4个，加入50μL GT03菌液，以加无菌水为对照，培养3d后，观察是否有抑菌圈并量取直径，计算抑菌率。

结果发现，接种GT03后的烟草疫霉菌落直径为2.4cm，以加无菌水为对照的烟草疫霉菌落直径为8cm(图3)，抑菌率达到70％。

实施例5盖氏假单胞菌GT03的防病效果

5.1制备烟草疫霉菌谷

将谷子清洗后用蒸馏水煮至2/3谷粒开花，捞出沥干水分，装入1000mL锥形瓶中灭菌(装样量在20％左右)；将烟草黑胫病菌转接到燕麦培养基，28℃培养4d；6mm打孔器打取菌落边缘菌饼接入灭菌的谷子培养基中，每瓶3枚菌饼；25℃培养14d，至菌丝长满培养基。

5.2盖氏假单胞菌GT03的生防盆栽试验

将盖氏假单胞菌GT03接种到NB培养基中，28℃，180rmp/min振荡培养24h，4℃，6000r/min离心5min，用无菌水重悬至OD₆₀₀＝0.5；烟草种子(小黄金)播入育苗盘，出苗后进行假植，培养30d，选取生长一致的烟苗；称取100g基质土，每盆加入2g菌谷，搅拌均匀后置于9×9×8cm塑料盆中；取出烟苗，小心抖落根部土，保留约5cm长的根，清洗根部基质，移植；沿烟苗根部浇灌20mL GT03菌液，设置3个重复，每个重复10盆。以不浇灌GT03菌液为对照组；移栽后的烟苗置于28℃，湿度70条件下培养，于第5d、10d、15d统计发病等级和发病率，计算病情指数和防病效果。

烟草黑胫病病害分级标准：0级，全株无病；1级，茎部病斑不超过茎围的1/3，或1/3以下叶片凋萎；3级，茎部病斑环绕茎围的1/2～2/3，或1/3～1/2叶片轻度凋萎；5级：茎部病斑超过茎围的1/2，但未完全环绕茎围，或1/2～2/3叶片凋萎；7级，茎部病斑完全环绕茎围，或2/3以上叶片凋萎；9级：病株基本枯死。

发病率＝(发病株数/总接种株数)×100％；

病情指数＝[(各病级株数×代表级值)/(总株数×发病最高级的代表级值)]×100

防治效果＝[(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数]×100％。

结果发现，使用GT03菌液后，烟苗病情指数从55.19下降至11.11，发病率从56％下降到10％，能显著降低黑胫病菌对烟草的侵染(P<0.001)，防治效果达到79.87％，如图4和表1所示。

表1接种GT03后发病率和病情指数

注：数值后的不同小写字母代表处理间有显著性差异

序列表

<110> 贵州省烟草公司遵义市公司

中国农业科学院烟草研究所

<120> 盖氏假单胞菌GT03、其应用及所得防治剂

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1379

<212> DNA

<213> 盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii GT03

<400> 1

CGAGCGGTAGAGAGGTGCTTGCACCTCTTGAGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGG 60

AATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTTCGGAAACGAACGCTAATACCGCATACGTCCTA 120

CGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGC 180

TAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATC 240

AGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATT 300

GGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTG 360

TAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGTTGTAGATTAATACTCTGCAATTTTGACGTTAC 420

CGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAG 480

CGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAA 540

AGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCAAAACTGTCGAGCTAGAGTATGGTAGAGGG 600

TGGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCG 660

AAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGA 720

TTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGAGCCTTGAGC 780

TCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAA 840

AACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGC 900

AACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATCCAATGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGC 960

CTTCGGGAGCATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTG 1020

GGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCA 1080

CTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATG 1140

GCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCG 1200

CGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACT 1260

GCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGG 1320

GCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCT 1379

Claims (10)

1.盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii GT03，其特征在于，保藏编号为CGMCCNo.22836，于2021年07月06日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。

2.根据权利要求1所述的盖氏假单胞菌GT03，其特征在于，所述盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii GT03具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii GT03的PCR扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取分离自土壤悬浊液中细菌菌株的基因组DNA；

2)以细菌菌株的基因组DNA为模板，使用上游引物和下游引物，采用rTaq酶进行PCR扩增；

其中：PCR反应体系为：2×Taq Master Mix 12.5μL、正反向引物(10μM)各1μL、DNA模板2μL、ddH₂O 8.5μL，总体系25μL。

4.根据权利要求3所述的PCR扩增方法，其特征在于，扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸1.5min，循环30次；最后72℃延伸10min。

5.根据权利要求3所述的PCR扩增方法，其特征在于，所述引物对为：

正向引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；

反向引物：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。

6.如权利要求1或2所述的盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii GT03在拮抗烟草疫霉菌Phytophthora nicotianae引起的黑胫病中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，OD₆₀₀＝0.6浓度下，接种50μL菌液，GT03产生的抑菌圈直径为3.21±0.14cm。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，OD₆₀₀＝0.6浓度下，接种500μL菌液至50mL含有0.01％色氨酸的LB培养基中，28℃，180r/min振荡培养3d，GT03产生170.31μg/mL的生长素。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述盖氏假单胞菌GT03在每盆接种浓度为10⁷CFU/g时，对烟草疫霉菌引起的黑胫病防治效果达到79.87％。

10.烟草黑胫病防治剂，其特征在于，以权利要求1或2所述的盖氏假单胞菌Pseudomonas gessardii GT03为主要有效成分。

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