PT98705B - Processo para a preparacao de agentes de biocontrolo anti-patogenico a base de estirpes de pseudomonas fluorescens, agentes assim obtidos,genes codificadores da sintese de antibioticos e utilizacao dos referidos antibioticos - Google Patents

Description

O presente invento diz respeito ao isolamento de estirpes baeterianas purificadas que são eficazes na inibição de patogénios de plantas,, incluindo os fungos Rhisoctonia solaní e Pythium ultimum. Estas estirpes são úteis como agentes de biocontrolo e podem ser usadas para produzir metabolitos anti-fangicos, tais come compostos antibióticos, activos contra q fungo patogénico para plantas Rnizoçtonia_solani e PythjuiR_ul ti mu m. Ambas as estirpes baeterianas purificadas e os compostos antibióticos podem ser usados como agentes activos nas composições de biocontrolo» Genes que codificam uma ou mais enzimas úteis na produção cie um antibiótico activo contra o fungo patogênico para plantas rhizoçtonia solani e Fythium ultimum foram isolados e usados para transformar agentes de biocontrolo que normalmente não são eficazes contra os referidos fungos. Os agentes de biocontrolo transfarmados podem ser usados para controlar Rhizoctonia soIani ^e Pyfhium ultimum. ComposiçSes fungicidas compreendendo a combinação de uma estirpe de Rseudornonas__flurescens controladora de

bxológxcas θ uns fLingxcxoa controlo de fungoe.

csn para

Cs«|0o_dg._ínventci

presente invente está relacionado com a identificação e isolamento de novas estirpes hacteri-an-as qu.e são agentes de biocontrole eficazes,, Mais especif icaments,, o presente invento está relacionado com estirpes bacterianas que se encontrou inibirem o crescimento de fungos patogénicos para plantas» Mais especif icaments o presente invento está relacionado com estirpes de bactérias anteriormente desconhecidas» tais como membros do género Pseudomonas» incluindo membros da espécie P seu d omon a s fluorsecens, que se encontrou produzirem metabolítos anti-fúngicos, tais como compostos antibióticos,, que são eficazes contra fungos incluindo os fungos patogénicos para plantas Rhizoctonia solani e F'ythiunt ultimum. 0 presente invento está ainda relacionado com o isolamento,, identificação e clonagem de genes que codificam a produção das referidas substâncias antibióticas. Mais especificaments, o presente invento está relacionado com genes que codificam substâncias necessárias à biossíntese de uma substância antibiótica que è eficaz contra o fungo patogénico para plantas Rbizoçtonia._solani e Pythium_-.._ul timunu 0 presente inven to está ainda relacionado com uír composição fungicida compreendendo unia ou mais -estirpes de Pseudomonas f 1 urescens, controladores biológicos de doenças ou um agente de biocontrole -obtido a partir das referidas- estirpes e um ou mais fungicidas acilalarsina juntamente com um veiculo aceitável em agricultura»

Sabe-se que culturas crescidas nalguns solos são naturalmente resistentes a certos fungos patogénicos» Ainda, os solos que conduzem ao aparecimento destas doenças podem ser tornados supressores ou resistentes peia adição de pequenas quantidades·, de solo de um campo supressor» Scher et al», Pbxtaeâtoloa^, 7fe?s42'i C1930J» Pelo contrário solos supressores podem passar a condutores ds doenças fúngicas através da aufoclavagem, indicando que os factores responsáveis pelo controle da doença são biológicos» Investigação subsequente demonstrou que as bactérias cclonizadoras das raízes são responsáveis por esta fenómeno conhecido como controle biológico de doenças CBDC), Baker efc al,, Biplogical control of _ plant-..pat|-jogens, (Freeman Press, san FrancísoJ C1974).

Em muitos casos, as estirpes mais eficazes de bactérias controladoras biológicas de doenças são pseudomonas fluorescentes, Weller et a,, Phytopatoloqy, 73:463-469 (1983), Mostrou-se também que estas bactérias promovem o crescimento vegetal na ausência de um fungo patogénico específico através da supressão de microflora prejudicial da rizosfsra presente na maior parte dos solos, Kloepper et al,, Phytopatholoqy 71:1020-1024 (1981). Agentes patogénicos importantes das plantas que foram eficazments controlados pela inoculação de sementes com estas bactérias incluem ^^annçMyc^^j^mmá^is súbita do trigo, Cook et al,.

o agente causador Soil Biol, Biochem, de morte ____________________________________ 85269-273 (1976) e espécies de Pythium e Rhizoctonia, agentes patogénicos envolvidos no apodrecimento do algodoeiro, Howell et al,, Phytopatholoqy 69:480-482 (1979), Rhizoctonia é um agente patogénico para plantas particularmente problemático por vários motivos» Primeiro, ele é capaz de infectar uma larga gama de culturas» Segundo, não existem fungicidas químicos comerciais que sejam eficazes no controle do fungo. Devido a estas circunstâncias, um inibidor contra R, solani será de substancial interesse como potencial controle deste patogénio»

Muitas estirpes de Pseudomonas para o controle biológico de doenças produzem antibióticos que inibem o crescimento de fungos patogénicos, Howell et al,, Phytopatho1oqy 69:480-482 (1979)5 Howell et al „, Phytopatholoqy 70:712-715 (1980), Estas foram implicadas no controle de fungos patogénicos na rizosfera.

Vários estudos realizados anteriormente focaram o efeito de mutações que resultaram na incapacidade da bactéria ou fungo controlador da doença em sintetizar estes compostos antibióticos. Kloepper et aL, Phytopatho1oqy 71ϊ1020-1024 (1981>5 Howell et al., Can.__J. Microbiol. 29?321-324 Íi983>. Nestes casos, a capacidade do organismo para controlar o patogênio ê reduzida mas não eliminada. Em particular, Ho^ell et al., Phytopatho1 oqy 695480-482 (1978) descreve uma estirpe de Pseudomonas f1uorescens que se mostrou produzir ums substância antibiótica que é antagonista de Rhizoctonia solani.

Em Baker et ax

Bioloq ical Con tro 1. of_Plants

Pathooens, (American Phytopatological Socisty, St. Paul, Mirsn.) (1982), páginas 61-106, está descrito que um factor importante no controle biológico é a capacidade de um organismo para competir num determinado ambiente» Assim, ê desejável obter estirpes de agentes de bioeontrole que sejam eficazes no controle do crescimento de patogénios para plantas, particularmente fungos, tais como Rnizoctonia seIani e Pythium ultimum e que sejam capazes de competir agressivamente com bactérias endógenas e outra» micro-flora que exista na rizosfera da planta.

Para se conseguir este objectivo, é ainda desejável obter sequências de DNA qus sejam úteis para conferir resistência a Pbizoctoni-a so 1 ani que possam ser usados na manipulação qenética de estirpes de agentes de controle biológico que combinem a capacidade de controlar »0 crescimento de Rhizoctonia com a capacidade de controlar outros patogénios de plantas e/ou a capacidade de competir agressivamente na rizosfera.

Assim, constitui um objectivo do presente invento proporcionar tratamentos fungicidas eficazes para a protecção de culturas relatzvamente a agentes patogênicos, particularmente

fungos patogênicos, tais coara Oomyc Rbizoctonia s Pythium tais como Rh tes incluindo espécies de zcc tonia so1an í e Pythium

Constitui um outro objectivo do presente invento proporcionar estirpes de biocontrole de bactérias que possam ssr usadas para controlar o ataque patogénico de plantas principalmente de plantas de cultivo» novas é uma característica do presente invento estirpes de bactérias especialmente do género pr o po r c i on a r

Pseudomon as que sejam úteis na produção de metabolitos antifúngicos, tais como compostos antibióticos, inibidores de patogênios de plantas, de preferência fungos patogênicos, especialmente Oomycetes incluindo espécies de Rhizoctonla e de Pythium tais como

Rhízoctonia solani e Pythium__ultimum. Estas novas estirpes representam na forma purificada agentes de biocontrole eficazescontra fungos patogênicos para plantas» Eles produzem antibióticos que representam o principio activa» Estes antibióticos podem também ser usados para o controle de agentes patogênicos de

plantas» Assim, é um outro objectiv	o do presente invento propor- içados obtidos ou selecciona— tes estirões de Pseudomonas
c i on ar aoen tes dos a partir f1uorescens s	de de	biocontr uma da	ole purif s seguin
			ÍATCC	MS	da Acasso 55171);
	CGA	266447	CATCC	MS	de .Acesso 55170) ?
	CGA	♦- í / -c.w g	ÍATCC	MS	de Acesso 55169)s
	CGA	27Θ293	ÍATCC	N9	de Acesso 55175);
	CGA	270294	í ATCC	MS	de Acesso 55174); e
	cg A	'7^ 1	í ATCC	MS	de Acesso 55168)»

έ uma vantagem do presente invente que sejam proporcionados agentes de biocontrole e tratamento fungicida para a protecção eficaz de culturas contra os fungos patogênicos para plantas Rhizpctonia solani e Pythium ultimuffi.

Constitui um outro objectivo do presente invento propocionar sequências de DNA que sejam úteis como codificadoras da síntese de compostos antibióticos inibidores de agentes patogênicos para plantas.

Constitui ainda um outro objectivo do presente invento proporcionar genes que possam ser usados para melhorar as dades de biocontrole das estirpes de bactérias usadas no trole.

C&P&C 3. biocοπέ uma característica do presente invento que sejam proporcionados sequências de Dif A e genes que ajudem na produção de uma substancia antibiótica que é eficaz contra o fungo patogénico para plantas Rhizoefconia soIani.

é uma vantagem do presente invento que sejam proporcionados agentes de biocontrole e genes que sejam activos contra o funqo patoqénico para plantas Rhizocfconia so1 an i.

• - constituí uma outra vantagem do presente íiivsnto que possam ser produzidos agentes de biocontrole capazes de inibir um espectro largo de patogênios de plantas.

É ainda uma outra vantagem do presente invento que possam ser produzidos agentes de biocontrole os quais são capazes de competir agressivamente na. rizosfera de plantas, agentes de biocontrole esses que contêm uma sequência de DNA que ajuda na

produção de uma substância antibiótica que é eficaz contra o fungo patogénico Rhizoctonia solani»

De acordo com o presente invento, os objectivos acima □nssquiQQS através stirpes de nos que sejam eficazes contra utilização de novas da identificação s isolamento e agentes, de biocontrole bacteriao fungo patogénico de plantas

Rhizoctonia solani e/ou Py th ium u11 i mum e a identificação, isolamento — de preferência a partir dos referidos agentes- de biocontrole - e utilização dos genes que codificam a produção de um antibiótio activo contra o fungo patogénico de plantas Rhizoctonia solani e Pythiuai u 11imum, A identificação e isolamento de tais agentes e genes de biocontrole é importante por vários motivos» Primeiro, R. soIani & um patogéno de plantas particularmente pernicioso» As plantas afectadas incluem feijoeiro, trigo, tomateiro e batateira para além do algodoeiro» Segundo, não existem tratamentos fungicidas seguros e eficazes ambientalmente para a protecção de culturas contra R» solani» Portanto, a utilização de agentes de biocontrole incluindo o antibiótico para controlar ou prevenir infecçSes por R., solani em culturas através da aplicação de um metabolito vivo ou bactéria produtora de antibiótico ou o próprio composto antibiótico, podem proporcionar o primeiro método ambientalmente seguro e eficaz de controle deste patogénio. Em adição a bactéria pode ser usada para produzir Quantidades comerciais de compostos que sejam eficazes no controle de patogénios de plantas, tais como R. so1ani,

Ainda, os agentes de biocontrole podem ser usados em misturas coniuntamente do presente invento com outras estirpes bacterianas que de outra forma não seriam eficazes como agentes de biocontrole de R so 1 ani e P„ ultimam e portanto aumentam a gama de eficácia destas estirpes de biocontrole» A utilização de agentes de biocontrole do presente invento em misturas de forma a

aumentar as capacidades de biocontrals de outras estirpes des agentes de biocontrole da rizosfers é também uma parte de presente invento»

C We11«Γ c ausad s

Per ©Kemolo a Patente dos Estados Unidos h© 4,45ó,ó84, st al») descreve que a morte súbita, uma doença do trigo pelo fungo Gaeumannomyces qrammminis pode ser controlada

nalguns casas pela aplicação de bactérias inibidoras deste patogénio ás sementes de trigo antes da plantação, No entanto, sempre que o crescimento de G» qramminis está eficazmente sob controle, R, solani pode tornar-se um patogénio do trigo com cada vsz mais importância (d. Cook, comunicação pessoal)» Assim» os agentes de biocontrole do presente invento podem ser usados com agentes de biocontrole destinados a proteger o trigo ds morte súbita e prolongar a sua gama de eficácia para incluir R, solani e P uitimuiTi»

Os agentes de biocontrole bacterianos do presente inventa podem também ser usados em combinação com compostos químicos tais como fungicidas químicos, que sejam compatíveis com as estirpes bacterianas» Entre os fungicidas químicos preferidos encontra-se metalaxil, o qual é eficaz contra Pythium u 11 imum.

Os agentes de biocontrole bacterianos do presente invento podem também ser úteis para produzir substâncias que possam -ser usadas como ingredientes activos em composições antifúngicas para aplicação no habitat© dos fungos fitopatogénicos, de preferência ás sementes, folhas ou no solo» As substâncias produzidas pelos agentes de biocontrole do presente invento podem ser produzidas de forma conhecida, incluindo revestimento das sementes com uma quantidade eficaz da substância ou aplicaçao em sulcos da substância directamente no solo» Também se considera que o agente de biocontrole possa ele próprio ser usado como

ingrediente activo nas composições preparadas de forma a não serem fatais biocontrole,

Demonstrámos -ainda que os genes que dirigem a biossíntese dos antibiótiocs podem ser transferidos para outras estirpes bacterianas, especialmente estirpes de pseudomonas, que de outra formai não são agentes eficazes de biocontrole para F:. sol anis e portanto transformam-nas em estirpes de biocontrole eficazes» A utilização dos genes para melhorar as capacidades de biocontrole de outras estirpes de biocontrole da rízosfera está também incluido no inventa» Por exemplo, a Patente dos Estados Unidos NS 4,456,,684, CWeller et al., > descreve que a morte súbita, uma. doença do trigo causada pelo fungo Gasmannomyces qramminis. pode ser controlada nalguns casos pela aplicação de bactérias inibidoras deste patogénio em sementes de trigo antes da sementeira. No entanto, sempre que o crescimento de G« qraminnis esta eficazmente sob controle, R. solani pode tornar-se um problema crescente para o trigo CJ» Cook, comunicação pessoal). Os genes para a introduzidos nas estirpes de biocontrole correntemente empregues para proteger o trigo de morte súbita para prolongar a sua gama de eficácia de forma a. incluir R. solani»

As sequências de DNA recombinante do presente invento podem ser usadas de forma a produzir uma substância, antibiótica que possa ser usada como ingrsoients activo em composições an ti fúngicas. para aplicação ruo solo» Os aqentes de biocontrole recombinantes do presente invento podem ser usados segundo formas conhecidas, incluindo revestimento de sementes com uma quantidade eficaz do agente de biocontrole ou aplicação em sulcos do agente de biocontrole direcLamente no solo.

agente de biocontrole pos

Também é considerado que o próprio ser usado como

ingrediente activo em composições preparadas de forma a não serem fatais para o agente de biocontrole.

DEFIN1C8ES

Conforme é usado no presente pedido, os termos que se seguem têm o significado descrito abaixos

Sequência promotora ou__reguladora do crescimentos Uma sequência de DNA não traduzida que aumenta ou de outra forma afecta a transcrição, tradução ou expressão de uma sequência de DNA estrutural associada que codifica uma proteína ou outro produto de DMA» A sequência de DMA promotora está, geralmente situada no extremo 5’ de uma sequência de DMA traduzida, tipicamente entre 20 e Í&& nucleótidos 5’ relativamente ao sítio de iniciação da tradução»

Sequência de DMA i-trutural ou codificadoras Uma sequência de DNA que é traduzida ou transcrita num organismo para produzir um RNA, uma proteína ou um outro produto de DNA»

Associado com/operacionalmente ligado; Duas sequências de DMA que estejam associadas ou “operacionalmente ligadas” estão relacionadas fisica ou funcionalmente» Por exemplo, uma sequência de DMA promotora ou reguladora é referida como estando associada com uma sequência de DMA que codifica um RNA ou uma proteína se as duas sequências estiverem operacionalmente ligadas ou situadas de forma a que a sequancxa de DNh reguladora afecte a o nível de expressão da sequência de DNA codificador ou estrutural »

Cons-crução guimer xcazsequênc xa_de_ uMh quimér zca.; Uma sequênc ia sequência de DNA recombinante em que uma de DMA

reguladora ou promotora está associada com, ou operacionalmsnte ligada a uma sequência de DNA que codifica um mRNA ou qus é expressa como uma proteína, de tal forma que uma sequência de DNA reguladora, é capaz de regular a transcrição ou expressão da sequência de DNA associada= A sequência de DNA reguladora da construção quimérica não está normalmente ligada operacionalmente à sequência de DNA associada como é encontrada, na natureza» 0 termo heterólogo é usado para indicar uma sequência de DNA recombinante em que o promotor ou sequência de DMA reguladora s a sequência de DNA associada são isolados a partir de organismos de espécies ou géneros diferentes»

Ac i1a1ani n ass Derivados fungicidas da fenilamída caracterizadas pelo modo de actuação idêntico nomeadamente pelas propriedades controladoras de Oomicetes CFicomicetes)« Representantes típicos estão descritos nas Patentes U«S« NS 4,742,079, 4,151,299, 4,046,911 e em Divulgação de Pesquisa (Agosto 1977) pp 40-41 e na Divulgação de Pesquisa (Nov. 1979) ppó32~633.

Metalaxils Nome comum de um representante típico de um fungicida acilalanina tendo o nome químico N-(2-metoxiacetil)-N~ juas marcas registadas são Ridom.il, • í2,6-xi1i1)—DL—a1an inato,

As ftpron e (Fubol = mistura com mancozeb), Metalaxil esta descrito rsa Patente US NS 4,151,299«

Furalaxils Nome comum de um representante típico de um fungicida acilalanina tendo o nome químico N-C2~furoil)~M-C2,6-xilil)-DL-alaninato» A sua marca registada é Fongarid. Furalaxil está descrito na Patente Britânica NS 1,44,810« Está também descrito em The Pesticide Manual Oitava Edição (1987) p,6840 publicada por The British Crop Protection Cou.ncil»

Qxadxxils Nome comum do um outro representante químico de um fúngicida acilalanina tendo o nome químico 2-metoxi~WC2-ΟΧΟ-Ί _?3~DKazDlidin~3~iI )-scst-2³ _s6’-xilidida. A sua marca registada é Sandofan. Gxadixil está. descrito ns Patente Britânica í*i™ 25w5í3j’<£ί5ν« Éz,s*ca também descrxoo em * i he Psssicxde Manual⁵· Oitava Edição (1987) p.?175 publicado pelo The British Crop Protection Council.

Benalaxils Nome comum de um outro representante típico de um fungicida acilalanina tendo o nome químico N-fenilacetil—N-2,ò-;:ilil — DL-alaninato de metilo. A sua marca registada é Galben. Benalaxil está descrita na Patente Alemã ÍM2 2,903,612» Está também descrito em The Pesticide Manual Oitava edição (1987) p»660 publicado por The British Crop Protection Council»

Ofurace. Nome comum de um outro representante típico de um fungicida acilalanina tendo o nome químico ±-«-2—Cloro-N-2_S6—xilil-gama-butiroiactona. Ofurace está descrito em The Psstici.de Manual” Oitava edição (1987) p,913@ publicado por The British Crop Protection Council.

Breve Descrição

Fiqura is	Esta fiqura mostra	os mapas	d f~ r © s t r à c ã o d e»
tr‘ê's clones de cosm	:idsos y ρκΝΤο 5 ρΑίΜΈΦ	e pANTie,	que comp1emen tam
o fenótxpo ANT do	mutante 2-1» Nesta	figura, 5B-’	indica um sítio
de restrição BamHIj	:Έ· um sítio de		eoRI; s ?H? um

sítio ds restrição HindIII,

Figura. 2;s Esta, figura, mostra a capacidade de subfragmentos de DNA derivados do clone pAMTS de Pseudomonas fluorescens estirpe 915 para complementar o fenótipo ANT do mutante 2-1 e as estirpes selvagens 914 e 922 „ 0 subfragmento marcado 3 é a região de aproximadamente 11 Kb que foi designada fragmento Eli»

A mais + ^1! indica produção de antibiótica»

A menos índica ausência de produção ds antibiótico,, “WD” significa não determinado,

Figura 3s Esta Figura indica os resultados das inssi— ções do transposão Tno no fragmento Eli da região do gene do antibiótico. Cada uma das inserções Tn5 está representado como uma linha vertical na sua posição aproximada no mapa genético. Os números acima de cada inserção indicam o número de identificação da inserção, 0 efeito de cada inserção na produção de antibiótico nas estirpes não produtoras tipo selvagem de Pseudomonas flurescens está indicado acima do mapa genético no caso dos testados. Um menos indica a ausência de produção de antibiótico, um mais + ” indica produção ds antibiótico e um ma is /'menos ±” indica resultados variáveis,

SESmSML DETALHADA- DQ -JÍNVEhiTO

I

Numa realização do presente invento são proporcionados agentes de biocontrole purificados que são capazes de inibir o crescimento de fungos patogênicos tais como Rhizoctonla solani e Pythium u1timum» Estes agentes de biocontrole são preferencialmente estirpes bacterianas purificadas e mais preferencialmente estirpes bacterianas gram negativas_? tais como pseudomonas» Os mais preferidos como agentes de biocontrole são estirpes das espécies Pseudomonas f1uorescens. 0 presente invento pode também compreender uma mistura de estirpes bacterianas, em que pelo

menos uma das estirpes bacterianas é um agente de biocontrole purificado. Os agentes de biocontrole purificados do presente invento podem também ser conjugados com outras estirpes bactérianas para a transferência da sua actividade antibiótica.

Os agentes de biocontrole podem ser aplicados em qualquer método conhecido para o tratamento de sementes ou solo com estirpes bacterianas. Por exemplo, ver Patentes dos Estados Unidos NQ 4,8ó3,Sõó. Estes métodos podem incluir inoculação do solo, inoculação de plantas derivadas de semente e revestimento de sementes. As estirpes são eficazes no caso de biocontrole mesmo se a bactéria não estiver viva. ÍMo entanto, prefere-se a aplicação da bactéria viva»

Uma outra realização do presente invento proporciona métodos de inibição do crescimento de fungos patogênicos incluindo Qomicetes tais como Rhizoctonia solani e Pythium u1timum. Nos métodos do presente invento, os agentes de biocontrole purificados podem ser aplicados de forma conhecida parai serem eficazes na inibição de fungos patogênicos, tais como Rhizoctonia solani e Pythium uItimum, resultando numa estirpe de biocontrole eficaz» presente invento engloba composições anti-fúngicas e a sua preparação em que o igrsdiente activo é uma substância antibiótica produzida pelo agente de bicontrole recombinante do presente invento (detalhes, ver abaixo) ou é a própria estirpe bacteriana de biocontrole purificada» 0 presente invento inclui composições antifúngicas e a sua preparação em que o ingrediente activo é o metabolito antifúngico ou composto antibiótico produzido pela estirpe bacteriana de biocontrole purificada do presen— t e i n ven to»

activo é uma estirpe bactéria— na de biocontrole, a preparação de biocontrole pode ser ap de forma conhecida para o tratamento de sementes e de

Sempre que o ingrediente estirpes bacterianas.

ft estirpe olo com homogeneamente grupos de compostos aqui compat .1 ve 1 com estirpes fungicidas acilalanina e presente invento também

DdCtBf iãsiâ pooe misturada, com um ou mais compostos ou descritos₅ desde que tal composto seja hacterianas. Compostos preferidos são los aceitáveis em agricultura, ~cí1 nn odn mm /«ώ $“/·*/·!/·

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aplicação da estirpe bacteriana ou da substância .antibiótica produzida pela estirpe ou composições fúngicidas contendo a estirpe bacteriana ou a substância antibiótica produzida pela, estirpej, às plantas.

ingrediente activo do presente invento pode também ser um metabolito antifúngico, como seja um composto antibiótico, produzido pelos agentes de biocontrole do presente invento. 0 presente invento também está relacionada com métodos para o tratamento de plantas, o qual compreende a aplicação às plantas de um metabolito antiíUngico, coma seja um composto antibiótico ou composições antifúngicas contendo o metabolito.

ÍVOS do	prca-tí! i tw ii ivento	incluindo
normalm	ente aplicados na	forma de
ados à	área de cultura ou	planta a
ou em s	ucessão, com outro-	s compos-

tos. Estias compostos podem ser ambos fertilizantes ou dadores de micronutrienf.es ou outras preparações que influenciem o crescimento das plantas. Podem ser também herbicidas selectivos, insecticidas, fungicidas (de preferencia fungicidas acilalanina), í~*i=ictericxdcA'», nemal.xcxdas^ moiusicxuas ou misturas de várza.s oestas preparações, caso se pretenda junt-amente com veículos.

aceitáveis em agricultura, tensioactívos ou adjuvantes promotores da aplicação normalments empregues nas formulações. Veículos e adjuvantes adequados podem ser sólidos ou líquidos e correspondem às substâncias normalaiente empregues na tecnologia de •formulações, e.g. substâncias naturais ou minerais regeneradas-, solventes, dispersantes, agentes moidantes, ligantes ou fertilizantes.

Os métodos preferidos de aplicação de um ingrediente activo do presente invento ou de uma composição agroquímica do presente ivento que contenha pelo menos um dos metabolitos antifõngicos produzidos pelas estirpes bacterianas do presente invento são de aplicação foliar, revestimento de sementes e aplicação no solo. 0 número de aplicações e a frequância de aplicações depende da intensidade da infestação pelo correspondente patogénio (tipo de fungos). No entanto, os ingredientes activos podem também penetrar na planta através das raízes via solo (acção sistémica) impregnando o locus da planta com uma composição líquida ou aplicando os compostos na fornia sólida no solo, e.g, na forma granular (aplicação no solo),, Os ingredientes activos podem também ser aplicados a sementes (revestimento) por impregnação das sementes com uma formulação líquida contendo ingredientes activos ou revestindo-as com uma formulação sólida. Em casos especiais, são também possíveis outros tipos de aplicação, por exemplo, tratamento selectivo dos ramos ou gomos.

Ainda, surprsendsntemente encontrou-se que a aplicação combinada de uma ou mais estirpes de controle biológico de EseuáPfflonas fluorescens ou de um agente de biocontrole purificado obtido a partir de estirpes de Pseudomonas flurescens juntamente com um ou mais fungicidas acilalanina apresenta uma actividade significativamente aumentada contra patogénios vegetais da ordem Oomicetes (Ficomicetss) incluindo espécies de Phytium e Rh i zoe torci a.

A. actividade conseguida pelas referidas combinações é decididamente superior á actividade que se espera da adição das actividades dos componentes individuais Csinergismo).

Assim, o presente invento está ainda relacionado com uma composição fúngicida compreendendo uma ou mais estirpes de controle biológico de Pseudomonas flurescens ou um agente de biocontrole obtido a partir das referidas estirpes e um ou mais fungicidas acilalanina juntamente com um veiculo aceitável em agricultura.

J

Proporções de misturas favoráveis dos dois princípios activos estirpe de Pseudomonas flurescens (=1) e o fungicida acilalanina ( = ΙΪ) sãos IsII = de 10©sl a ΙϊίΟΘ, de preferência de 10si a IslO. Um aumento de actividade έ já conseguido guando o fungicida químico ê usado em concentrações normais e a estirpe bacteriana é adicionada em quantidades que vão de 5€> g a 5Kg a.i. por hectare.

Assim, o termo “agente de biocontrole usado ao longo da presente especificação s das reivindicações engloba estirpes purificadas de Pseudomonas__flurescens de controle biológico de doenças sósinhas ou em combinação com um ou mais fungicidas acilalanina. 0 termo ainda engloba o principio activo incluindo metabolitos antifúngicos, tais como compostos antibióticos sózinhos ou em combinação com um ou mais fúngicidas

Neste contexto são preferidas a.s estirpes de flurescens CGA 266446, CBA 266447, CGA 267356, CGA 270293, CGA 270294 e CGA 281Θ36. Os fungicidas acilalanina preferidos são metalaxil, furalaxil, oxadixil s ofurace. é especialmente preferida a combinação com metalaxil.

acilalanina„ Ess/omonas

Os ingredientes activos são usados na forma não modificada ou de preferência juntamente com um veiculo aceitável em agricultura» Tais veículos são adjuvantes convencionalmente empregues nas formulações agrícolas e são portanto formulados de forma conhecida em concentrados emulsionáveis, pastas de revestimento, soluções que ρο-dem ser vaporizadas directamente ou ainda diluidas, emulsões diluídas, pós molháveis, poeiras, granulados e também encapsulaçSes, por exemplo, em polímeros» Tal como a natureza das composições, os métodos de aplicação, como seja vaporização, atomização, pulverização, dispersão ou rega, são escolhidos de acorda com o abjectivo pretendido e circunstâncias prevalecentes» As proporções de aplicação vantajosas são normalmente entre 50 s 5 -rg de ingrediente activo Ca«i») por hectare <ⁿhaⁿ, aproximadamente 2,471 acres), de preferência entre 100 g e 2Kg a»i»/ha, preferencialmente entre 2®0 g e 500 g a«i«/ha«

As formulações, composições ou preparações contendo osingredientes activos e, sempre que adequado, um adjuvante sólido ou líquido, são preparadas de forma conhecida, por exemplo através da mistura homogénea e/ou trituração dos igredientes activos com aditivos, por exemplo solventes, veículos sólidos e, sempre que adequado, compostos tsnsioeetivos»

Os solventes adequados para composições incluindo as que contêm os metaholitos anti-fungicos produzidos pelas estirpes bacterianas de biocontrole do presente invento incluem hidrocar— bonetos aromáticos, de preferência as fracções tendo S a 12 átomos de carbono, por exemplo, misturas de xilenos ou naftalenos substituídos, ftaiatos tais como dibutilftalato ou dioctilftalato, hidrocarbonetos aromáticos tais como ciclo—hexano ou pe.ra.fi~ aiuoois e glxcõxs e seus éteres e ésteres, taxs como etanol, etilenog1icol éter monometílico ou monoetilico, cetonas tais como . xo .ι o—: fòfíí an una, vsn l.ms for uMioMnce poxares taxs como

N~me til -2~ρ i rro 1 i d on a, d i me t i 1 su 1 f ó x ido ou d i me t, i I f or mam 1 d a, assim como óles vegetais epoxidados tais como óleo de coco epoxidado ou óleo de sojas ou água.

r«« veículos sólidos usados dispersáveis são normalmente ,q« cara ooe.iras e p©s d e en c h i roen to mine r a i s naturais tais como calcite, talco, caulino, montemoriIonite ou atapulgite. para melhorar as propriedades físicas é também possível adicionar ácido silícico altamente disperso ou polímeros absorventes al tamente disper·:

persos;

Veículos adsorventes granulados adequados são do tipo poroso, por exemplo p-umice, tijolo partido, sepiolite ou bentonite; e veículos não adsorventes adequados são materiais tais como calcite ou areia» Em adição pode usar-se um grande número de materiais pré-granulados ds natureza inorgânica ou orgânica, e.g. especialmente dolomite ou resíduos vegetais pu1veri 2ados»

Dependendo da natureza do ingrediente activo a ser usado na formulação, compostos tensioactivos adequados são tensioac ti vos catiónicos e/ou. aniónicos tendo boas propriedades emulsionantes, dispersantes e molhantes. O termo “tensioactivos também será entendido como compreendendo misturas de tensioactivos .

Tensioactivos aniónicos adequados podem ser sabões solúveis em água e compostos tensioactivos sintéticos solúveis em água.São sabões adequados os sais- de metais alcalinos, sais de metais alcalinos terrosos ou sais de amónio não substituídos ou substituídos de ácidos gordos superiores (cadeias de 10 a 22 átomos de carbono), por exemplo sais de sódio ou potássio de ácido oleico ou ácido esteárico, ou de misturas de ácidos gordos obtidos por exemplo a partir de óleo de naturais que podem ser amendoim ou de me tiltaur i η o ·

sebo. Podem ser usados sais de ácido gordo vos sintéticos, especialmente sulfonatos gordos, sulfatos gordos, derivados sultonados de bsnzimidazole ou alquilarilsulfonatos»

Os sulfonatos ou sulfatos formei de sais de metais alcalinos.

gordos são geralmente na sais de metais alcalinos terrosos ou sais de amónio não substituídos ou substituídos e têm um radical alquilo de 8 a 22 átomos de carbono que também incluem partes alquilo de radicais alquilo, por exemplo, o sal de cálcio ou sódico do ácido 1inho-sulfónico, ds dodecilsul fato ou de uma mistura de sulfatos de alcoóis gordos obtidos a partir de ácidos gordos naturais» Estes compostos também compreendem os sais de ésteres do ácido sulfúrico e ácidos sul fónicos ds álcool gordo/óxido de etileno» Qs derivados sulfonados ds benzimidasols de preferência contêm 2 grupos de ácido sulfónico e um radical de ácido gordo contendo 8 a 22 átomos de carbono» São exemplos de alquilarilsulfonatos os sais de sódio, cálcio ou trietanolamin-a do ácido dodecilbenzeno-sulfónico, ácido dibutiInafta.leno-sulfónico ou do produto de condensação ácido anaftaleno-sulfónico/for~ maldeído» Também são adequados os correspondentes fosfatos, e»g» os sais são preferencialmente na forma de haletos, metilsulfatos ou stilsulfatos, s„g» cloreto de estearí1trimetilamónio ou brometo de henzildi<2—cloroehilCehilamónio ou sais do éster de ácido fosfórico de um aditivo de ρ-nonilíenol com 4 a 14 moles de óxido de etileno» □s t en s i o ac t i voí derivados de éteres de c i c1oa1i f áti c os ou ác idos alquilfenóis, os referidos :· nãO icliqlic qorous iónicos são preferencialmente óis de alcoóis alifáticos ou saturados ou insaturados e derivados contendo a 30 grupos éter

de qlicol e 8 a. 20 átomos de carbono na parte hidrocarboneto Califático) e a 18 átomos ds carbono na parte alquilo dos alquilfenóis»

Outros tensioactivos não tónicos adequados são os aditivos solúveis em água cie óxido de polietileno com polipropilenoglicol, etilenodiaminapropilenoglicol e alquilpolipropilsnoçlicol contendo 1 -a 10 átomos de carbono na cadeia alquilo.

aditivos esses que contêm

250 grupe 'ti 1 enog 1 ico 1 e

O a 100 grupos éter de propilenog1icol» Estes compostos geralmente contêm la 5 unidades ds etilenoglicol por unidade de propi1enoç1ico1«

Exemplos representativos ds tensioactivos não iónicos são nonilfenolpolietoxietanóis, éteres de poliglicóis de óleo de castor, óxido de polipropileno/polietileno, tributilfenoxipolietoxietanol, polietile-noglicol e octilfenoxietexietanol» Também são adequados como tensioactivos não iónicos os ésteres de ácidos gordos de polioxietilenossorbita.no e trioleato de polioxisti1enossorbi tano»

Os tensioactivos catiónicos são preferencialmente sais de amónio quaternários que têm como M—substituiute, pelo menos um radical alquilo C_o—Cl-,.-, s ainda outros substituintes tais como

W X. X.

radicais alquilo inferior não substituído ou alquilo halogenado, oenzuo ou bioroxia 1 qui 1 o inferior» us sais te na forma de haletos, metiIsulfatos ou cloreto de esteariltrimetilamónio ou brometo de benzildií2—cloroe t i1)etilamónio„ ião prefsrencia1men— etilsu1fatos, e»q»

Os tensioactivos normalmente empregues no campo das formulações estão descritas por exemplo em “Mc CutcheorPs Detergente and Emulsifiers ftnnual, MC Publishinq Corp» Rinqwood,

New Jersey, 1979, ε bxsely ε Wood, “Encyclopedia of Surface Active ftaents, Chemical Publishinq Co., Inc» New York, 1980.

As composições agroquímicas qeralmente contêm entre

C & L» fef ’<? a í © L.	pi f r* λ rl as	Γ5Γ5®/ ~S.~ VWsj Life*	|»í i v-f t feí K* tf I 1L. Jt. cá.	L. td í L. ã D hf V rj jL cá	cerca
95% e mais pr	ef er^nc	ialmente	enfcrs? cfe?rc	a de 3 e cerca	de 90%
ingrediente	sc.’ Lxvo 5	entre i	cerca de 1	cerca de 99,	9% de
íferência entr	’£? C&rCe.	de 1 e :	cerca de 99%	e mais prefer	eneial-
ite entre cerc	cá U feí O	e cerca	•J... fSC7“/ Lí fcd 7 Zn Ϊ J fcf U<	m adjuvante sói	ido ou

liquido s entre cerca de o e cerca de 25%, de preferência entre cerca de 0,1 e cerca de 25% e mais preferencialmente entre cerca de O,í e cerca de 2®% de um tensioactivo.

Se bem que os produtos com? mente formulados como concentrados, o te emprega formulações diluídas» ? ·» a& ϊ«· mZ ut.il is sejam preferencialdor final normalmen-

carac que Rhz zc

Um fragmento de DNA contendo genes c terísiticas necessárias para a biossintese seja eficaz contra os fungo patogénic cfonia solani foi clonado e caracterizado» odificadores das de um antibiótico o para plantas 0 fragmento de

DNA foi derivado de Pseudomonas flurescens estirpe foi isolada a partir de raízes de unta ro e foi identificada como unja estirpe eficaz apodrecimento do algoodoeiro induzido por estirpe 915. Esta planta do algodoeide biocontrole do Pythíum ultimum e

R h i z oc ton i a so 1 an i» fragmento de uNh con para duas estirpes diferentes de produzirem um antibiótico eficaz agentes de biocontrole eficazes tendo estes genes foi transferido P» f1uorescens que se sabe não contra R. solani e que não são para o apodrecimento do algodoeiro induzido por R._solani» Em cada um dos casos estirpes de P» f1uorescens portadoras do fragmento do gene antibiótico

demonstraram produção de antibiótico in vitro com base na inibisoa ani sm pla»_as ne agar» Hinda, as estirpes foram testadas na estufa e demonstrou—se serem eficazes ção do crescimento de R, como agentes de biocorh induzido por R. solani» do apodrecimento do algodoeiro

Numa realização do presente invento, obtiveram-se sequências de DNA recombinante que compreendem uma sequência de DÍMA estrutural que codifica a produção de uma substância antibiótica que inibe o crescimento do fungo Rhizoctonia sola.ni. Esta sequência de DNA pode derivar de agentes de bioeontrole que sejam eficazes na inibição do crescimento de Rhizoctonia. De preferência a sequência de DMA pode derivar do clone pANTS, o qual foi isolado a partir de uma estirpe de Pseudomonas f 1 uorescens. íiais preferencialmente a sequência de DNA pode compreender o fragmento Eli de aproximadamente 11 Kb do pANTS. 0 clone pANTS foi depositado na AlCC e foz designado A) número de acesso 40868.

Um plasmídeo contendo o fraqmento Eli de 11 Kb do pANTS foi depositado na A-TCC e foi desianado ATCC número de íso 408&V r.

As sequências de DMA recombinante do presente invento podem ser quiméricas e podem ser heterólogas ou homólogas» As sequências de DNA recombinante do presente invento podem ainda compreender uma ou mais sequências de DNA reguladoras operacionalmente ligadas a sequência de DMA estrutural atrás» Tais sequências de DNA reguladoras incluem sequências de promotor, sequências líder e outras sequências de DNA que possam afectar a expressão das sequências de DNA reguladoras, assim como os fragmentos de uma sequência de DNA regulador -que seja capaz de actuar com tal efeito»

Numa realização do presente invento, são proporcionadosagentes de bioeontrole que são capazes de inibir o crescimento de

Rhizoe ton ia so1ani» Os agentes de biocontrole podem ser bactérias, células vegetais ou células animais, mas preferencialmente estirpes bacterianas e mais preferencialmente estirpes de bactérias qram negativas tais como Pseudomonas» São especialmente preferidos como agentes de biocontrole as Pseudomonas f1uorescens.

estirpes do género

Uma outra realização do presente invento proporciona .métodos de inibição do crescimento do fungo Rhi zoe ton la__so 1 an 1»

Nos métodos do presente invento as sequências de DNA recombinante codificadoras da inibição do patogénio são introduzidas no genoma de um agente de biocontrole, como seja uma estirpe bacteriana que habitualmente não é eficaz como inibidor do patogénio Rhizoctonia so 1 ani» resultando numa estirpe de biocontrole eficaz»

DNA na forma de plasmideo pode ser transferido de uma bactéria para outra por um processo ssxuado designado conjugação» Os plasmídeos capazes de serem transferidos por conjugação contêm genes que codificam a síntese de pili sexuais» Os pili sexuais são tubos ocos que ligam a bactéria contendo o plasmideo (dadora) com uma outra bactéria Ca recipiente) e através do qual cópias replicadas do plasmideo passam do dador para o recipiente» Este processo ocorre naturalmente na natureza e é utilizado no laboratório como um método de transfsrência de genes de urna bactéria Para algumas estirpes de bactérias, tais como transferência por conjugação do DNA é o método preferido uma vez que estas bactérias não são facilmente transformadas coro DNA estranho» para duu a Pseudomonas

Ainda numa outra realização do presente invento, são proporcionados métodos para obtenção de uma substância antibió— eja eficaz na inibição do crescimento do fungo Este método compreende a introdução das tica que Rhizoctonia solani

sequãncias de um agente de transformado, produza uina antibiótica a

DNA recombinante do presente inventa na genoma de biocontrole para formar um agente de biocontrole pe r íki h i n d o substância partir da

Se bem gue referência a realiz, ρ o s s i v e i s n u me r o s a s portanto, todas essaser encaradas como e gue o agente de biocontrole transformado antibiótica e extracção da substância agente de biocontrole transformado.

o presente inventa seja descrito abaixo com çSes específicas, será apreciado que são variações, modificações e realizações e ; variações, modificações e realizações devem ítando dentro do âmbito do presente invento.

EXEMPLOS

Exemolo ís Colheita de amostras de plantas e do solo

As amostras de plantas s do solo foram colhidas a partir de áreas de crescimefo activo do algodoeiro no Texas. As amostras ds plantas foram retiradas directamente do campo aproximadamente 3 a 4 semanas após a plantação. As amostras de plantas foram colocadas em sacos de plástico e guardadas numa caixa de gelo até voltarem para o laboratório. As amostras de solo foram colocadas em contentores de plástico de cinco galões com tampas e guardadas a. 25‘-'C. Sempre gue não foi possível obter amostras frescas de plantas, solo dos campos foi semeado com sementes do algodoeiro e incubado na câmara de crescimento para se obter plantas para amostras.

Exemplo Ss Restreio preliminar de amostr etc civioads de ancxbiotxco r e 1 a t. i vamen te á

Fizeram—se diluições seriadas dos sistemas radiculares do solo aderente de piantulas do algodoeiro até 1@ ⁷ e amostras ml foram misturadas com 9 ml ds aqar fundido do meio; agar de tripticsse-soja, agar nutriente, agar de seguinte batata-dextrose, agar do meio de King B a agar de extracto de solo» Segmentos lavados dos sistemas radiculares das prãntulas foram la.mbem semeados directamente nas placas de agi

Após um per iode? placas foram inoculadas infestado coo? Rhizoetonia ultimum, As placas foram à presença de zonas clara colónias ba c t e ri an as» ds incubação de três a quatro dias as com farelo de trigo triturado seco e __so1an i ou pedaços de agar de Pythium observadas periodicamente relativamente s no crescimento de fungos ã volta das

As ojl o* í x as apresentan do ac tividade inibidora ou antibiótica foram semeadas e isolada cultura com os fungos patogénicos para confirmar e colocadas em sua actividade antibiótica.

Os antagonistas putativos assim identificados foram foram classifiçados numa escala de acordo com a sua actividade antibiótica contra. R. solanie P» ultimam em agar nutriente (altamente nutritiva) e agar de extracto de solo (pouco nutritivo) » As estirpes que apresentaram boa actividade inibidora num ou mais meios foram guardadas em soro fisiológica a 5°C e em culturas de solo estéries para manter a sua pureza qenética.

Exemplo 5: Estudo dos novos isolados

As estirpes inibidoras foram examinadas com base nas características morfológicas, fisiológicas e antibióticas. As estirpes· que se encontrou não serem duplicados de outros isolados foram semeadas a partir da solução de soro fisiológico em placas, de agar nutritivo e incubadas durante tr’ã's dias» As bactérias foram então retiradas das trãs placas por lavagem com 30 ml de •áqua estéril»

□ inóculo fungo ens farelo de aproximadamente uma de R» solani foi preparado trigo estéril humedecido a duas semanas. seco ao por crescimento do ou painço durante ar durante vários dias, depois triturado o inóculo até :0 mesh coaí um moinho Wiley» fungo era semana. Q indivídua cultivado inóculo de P» ult sementes de painço material foi então s. Como alternativa em culturas líquid.

durante aproximadamente 10 dias.

imum foi preparado fazendo crescer o humedecidas estéreis durante uma seco ao ar e dividido em sementes , o inóculo de P,_ultimum pode serás de meio de colesterol-sumo V8 tapetes de micélio foram

retirados e macerados num misturador manual para se

QO'p:-pOrO;çi r.

obter apenas

Uma suspensão de propágulos pode ser misturada no -solo na proporção de 2000 oósporos por grama de solo e o solo incubado durante aproximadamente è semanas antes de usar, para ultrapassar o factor de dormência associado aos oósporos frescos.

solo usado nos testes para a. eficácia, de biocontrole foi Lufkin Fine Sandy Loam com um pH de 3,7. 0 solo foi passado através de um filtro com um quarto de polegada, e ajustado a 157. de humidade. 0 solo foi infestada com os patogénios misturando o inóculo e o solo num misturadior de cimento durante 2© minutos a numa proporção de aproximadamente 0,15 a 0,4 g de inóculo/13,6 Kg de solo para R. solani e 20,4 g de inóculo/13,6 Kg de solo para P„ ultimum. Este material pode ser facultafivamente usado durante aproximadamente 3 semanas antes de preparar o material fresco.

solo infestado foi colocado em canecas de plástica de 20 os. contendo mechas de gase em alqodão de 2 x 10“ passadas através de um furo de 5/8“ no fundo. A mecha estende-se até è superfície do solo. Cinco buracos de 2 cm de profundidade foram feitos na superfície do solo em cada chávena à volta da mecha s colocada uma semente de algodoeiro da variedade -Stoneville 213 em cada buraco.

Como alternativa o solo infestado com R. so1ani foi colocado em tabuleiros contendo cerca de 13,6 Kg de solo e estes divididos em quatro secções. Em cada secção foram feitas e semeadas quatro filas de dez sementes, cada semente foi tratada com cerca de 0,5 ml de suspensão de bactérias na semente e cerca de 0,5 ml na superfície do solo e os tabuleiros foram incubados a 25'--‘U com um fotoperíodo de 12 horas durante aproximadamente 14

secções foi regada com aproximadamente 250 ml dia sim dia não» No final daquele periodo s das plantas que surgiram e que sobreviveram.

diss» Cada uma das de égua desíonizada f i zeram-se con taqen solo infestado com oósporos de P.. ultimum pode ser colocado em lotes de 5 g em tubos de ensaio contendo cerca, de 0,75 ml de água ou suspensão bacteriana e e semeada no centro de cada tubo uma semente de algodoeiro» Dez tubos foram tratados com cada uma das estirpes bacterianas e os tubos foram incubados a cerca de 15°C no escuro durante cerca de 7 dias» Os tubos foram então passados para 25*C e um fotoperiodo ds 12 horas durante cerca de 3 a 5 dias. Fizeram-se contagens das plantas que surgiram e sobreviveram» As estirpes bacterianas cujo tratamento resulta em 50’Z ou mais de sobrevivência das plantulas como média de três testes foram guardadas em 0,375 ml ds caldo nutritivo e 0,125 ml de glicsrol a. ~70'^:’C = As culturas destas estirpes, identificadas até à espécie, foram sujeitas a outros testes» isi X dí:

u tratamento da semente uspensão de bactérias das e solo consiste em colocar 0,5 estirpes ssleccion-adas em cada

semente, cobrindo a semente com do 3 ml da suspensão bacteriana na chávena» A superfície do solo solo infestado, depois dispers sobre toda a superfície do s foi então ligeiramsnte vapori anda com água e a chavenplástico de 0,5 ml pre: tratadas com água» . foi coberta •a com um elés com uma única envoltura de tico, as testemunhas foram

As chávenas tratadas e câmara de crescimento com 20 °C e periodo no escuto a 16°C. Após água sup1ementar, retirou—se ο ρϊ colocada num reservatóriuo de ág fundo da chávena. Após mais testemunha foram colocadas numa um fotoperiodo de 12 horas e um aproximadamente quatro dias sem ãscxco envolvente e a mecha fox. ua de 2,5 polegadas abaixo do uma incubação de seis dias»

fizeram-se contagens das plantulas que surgiram e sobreviveram.. Os sobreviventes foram retirados do solo e examinados relativamente ao aparecimento da doença ou efeitos de fitotoxicidade no sistema hipocótilo e radicular» fts estirpes cujo tratamento resulta em 65’/. ou mais de plantas saudáveis foram guardadas e identificadas sempre que possível pela espécie de acordo com descrições morfológicas e fisiológicas proporcionadas em Berqey^? rianua 1 of__De te r m i n a t i ve

Bacterioloqv assim como com a utilização de testes de identificação, tais como Rapid NFT ída API Analytab Products). Este teste mede uma série de caracteristicas bioquímicas chave que são usadas para classificar as bactérias» Este kit particular destina-se a distinguir bactérias Gram negativas oxidase—positivas entre as quais se encontra Pseudomonas»

Exemplo

Identi de estirões eficazes no bioconirole

ã) Retiraram-se amostras numa determinada área com base nos diferentes tipos de solo, diferentes variedades de alqodoeiro cultivadas e variações na história de colheitas anteriores» Idealmente as amostras foram retiradas quando a planta do algodoeiro estava na fase de plantula, mas pode ser retirada numa fase mais tardia»

No primeiro despiste tras de solo de cinco áreas de de ensaio com diluições feitas com o Exemplo 2» Isolou-se um micetes que produziam compost foram obtidas 22 plantas e crescimento diferentes» Das a partir destas amostras de total de 114 bactérias e 20 os activos contra R. solan amosρ 1 ac a.s acordo actinoi e P.

u1tirnum-

Dos números totais de bactérias.

activas contra R, solani em aqar estirpes eram

103 enquanto 59 estirpes Do último qrupo oito eram activas em agar de extracto de solo são também activas contra R» solani em agar de extracto de solo., mas mas não em agar nutriente. Isto indica que aproximadamente 50% do número total de estirpes bacterianas isoladas são activas apenas em agar nutriente, enquanto os outros 50% são activos em ambos os meios»

De entre os isolados que apresentaram actividade contra P. ultimum, 79 eram aotivos em agar nutriente e 53 em agar de extracto de solo, dentro destes dois grupos 39 são activos apenas em agar nutriente, nove são activos apenas em agar de extracto de solo e 84 são activos em ambos os meios»

Num segundo despiste, um total de 135 isolados foi retirado das placas de diluição de amostras e testados in vitro relativamente â actividade contra R» so1an i e P» ultimum» Destes 35 são activos contra ambos os patogéníos»

Um total de 2 crescimento reiativamente da podridão de plantas induzida por Pythium ou mais de 65% de plantas qu ult imum» Uma série destas de uma outra com base nos estirpes foi testado na câmara de à eficácia como agentes de biocontrole do algodoeiro derivadas de sementes

Phi zoetonia» Destes isolados, 29 deram e sobreviveram em solo infestado com Pj»_ estirpes suspeita—se serem duplicados testes de actividade antibiótica e de biocontrole e noutras caracterizações fisiológicas» Seis estirpes de pseudomonas seleccionadas foram tomadas para estudos- posteriores juntamente com 10 actinomicefes produtores de antibióticos» Todas as estirpes de pseudomonas foram identificadas como pertencentes a. Pseudomonas fluoresrens.

c) Num terceiro rastreio, um total de isolados guardados e estabilizados crescimento para a eficás foram testados relativaolani ou Pythium ultimum.

detestados em placas de diluição foram geneticamente para ensaio na Câmara de cia ds biocontrole. 158 destes isolado mente ao biocontrole de Rhízoctonia s

Destes, 13 demonstraram bom biocontrole da doença das plantulas induzida por R, solani ou F*« ul timum ou ambos, Estes isolados•foram identifiçados até à espécie, guardados em glicerol a -70*C para estudos posteriores.

emplo 5¾ Cultura de bactérias e fungos para ensaios de rastreio

a) Cultura de bactérias

As culturas bacterianas foram guardadas em 50% glicerol a ~80°C antes de usar» Uma ansa da cultura guardada foi ressuspensa em 5 ml de Caldo Luria CLB; 10 g Bacto—Tryptone, Difco, 5 g e 1 } e agitado a 150 rpm e 25’^:>C durante a de extracto de levedura, Oxoid; 0,25 g MgSQ_AH_oQ; 8 g de NaCl de água destilada; pH noite. 100 ml de meio LB foram inoculados com í ml da pré-cultura e incubado nas mesmas condições, 10 ml da última cultura foram centrifugados <10 min» a 10000 rpm) e o sedimento ressuspenso em

200 ml de soro fisiológico <0,Q% NaCl) dando uma concentração de s aproximadamente 10 cfu/ml.

	Para a	determinação exacta prepar	OU—Se	uma série	de
diluições	e gotas	de 10 μΐ foram colocadas	sobre	Agar de Lu	ria
CLB com 1	,5% de	Bacto-Agar, Difco) com uma	pon ta	Eppsndorf.	As

cfu foram contadas após 24 boras de incubação a 28*C,

b) Cultura de Rhizoctonia solam

Rhizoctonia solani foi cultivada em Potato Dsxtrose Agar (PDA, Difco), pH 3,6 numa placa de petri. Um frasco Erlenmeyr de 300 ml com 25 g de painço e 50 ml de água destilada foi autoclavado e incubado com um pedaço de agar (5 mm de diâmetro) de uma cultura PDA de R. solani. Após incubação a 20°C no escuro durante 3 semanas o painço com a cultura crescida foi seco ao ar e triturado num moinho Culatti (crivo 1 mm, 60Ô0 rpm),.

c) Cultura de Pythium ultimum

Pythium ultimum foi cultivado em Ralt Agar (Oxoid), pH 5,& numa placa de Petri. Um pedaço de agar (6 mm de diâmetro) desta cultura foi transferido para uma placa de petri com 8 ml de de agar de farinha da aveia i150 g de farinha de aveia, 3 ml 1,5% de cloesterina e 11 de água destilada) com uma superfície inclinada» Duas horas mais tarde adicionou-se 13 ml de água destilada estéril e as placas foram incubadas durante 10 a 14 dias no escuro» 0 micèlio que cresceu da superfície de agar para a água foi transferido para um misturador e cortado em pedaços pequenos» A concentração dos oósporos foi contada numa câmara, de ho.ma e ajustada com áoua destilada a 2 x W/ml»

Exemplo ós Realização de ensaios de rastreio

a) Pato—sistema R» so1ani-a1oodoei ro

Potes de plástico uma camada de fundo espessa mistura (7:3 v/v) de solo St» ípassado por crivo de 3 mm) com a superfície previamente (280 ml) foram cheios primeiro com (1 cm) de Vemex F e depois com uma Aubin autoclavado mas recolonizado e Vermex F» Sementes de alqodoeiro esteri1izada CCossypium hir sutum„ cv. Delta Pine/ foram incubadas 30 minutos © semeadas no solo a

em água aquecida na mão durante uma. profundidade de 1 a 1,5 cm,

No centro do pote a um cm abaixo da superfície colocou-ss 5 mg de pó milho painço infestado com R. solani (ver 2,1,2/. Todos os potes foram regados com 60 ml de água, cada um.

Duas horas mais tarde cada um dos potes foi ensopado S com 20 ml de uma suspensão de bactérias ÍW' cfu/ml, ver 2,1,1) de 2@ ml Monceren Clmg WP25/ml) resp, resultando em aproximadaò mente 7 x 10 cfu/ml de solo ou 20 ppm de Monceren resp. Os potes foram dispostos ao acaso e incubados numa câmara de crescimento marcada para 23 '-'C à. luz do dia (14 horas) s 18*C durante a noite (10 horas) e 507» de humidade relativa, O solo foi mantido húmido, sgistado apôs 5,

V e 13 dias dias -a incidência da doença foi avaliada classificando a planta em saudável <“!”> ou não germinada ou doente (ambas 0^B5, se a raís ou hipocotilo aparecer castanha e podre. Para cada pote com 5 sementes as avaliações foram resumidas resultando num número de ‘'0 (todas as plantas doentes ou não germinadas), 1”, ^!!2^!i ₅ 3, 4 ou 5” (as 5 plantas saudáveis), Os números dos cinco potes por tratamento são a média. A eficácia, do biocontrole de cada tratamento numa experiência está dado em % em comparação com a testemunha sem tratamento e sem patogénio ÍMT.MP, definido como 100% do biocontrole) s o controle com (NT.P, definido como 0X biocontrole).

□gemo apenas

b) Pato-sistema P«_ ultimum-aíqodaeiro solo e as sementes forma preparados como descrito na parte a) acima, e os potes foram regados com 50 ml de água cada um. Após í hora 20 ml de uma suspensão de oósporos (2xl0^/ml, ver 2,1,3) foram usados para ensopar o solo (aproximadamente 1400

cfu/rnl). Após mais duas horas adicionou-se 2© ml de uma suspensão bacteriana (i©^d cfu/ml, ver 2.Í.1) ou 2© ml de Ridomil <WP 25, í .4.

mq/ml) resp. a cada pote resultando em aproximadamente 7X1©“ cfu/ml de solo ou 2© ppm Ridomil resp. Os potes foram incubados nas mesmas condições como descrito atrás e a aparecimento de plantulas e incidência da doença foram registados como mencionado atrás (ver parte a) atrás).

mostra a eficácia de biocontrole das mesmas estirpes contra P„___ultimum. A estirpe CGA 266446 mostrou-se a mais e f i c az (56% de b i ocontro1 e)»

c) Pato-sistema R» solani-tomateiro

Adicionou-se bactérias (12© ml/6 Kg) a Pro-mix BX autoclavado num tambor mecânico e misturou-se durante S minutos.

A Pro-mix com bactérias foi deixada em repouso em cestos ma λ fechados durante três dias antes do inóculo do patogénio C©,©2% de grãos de aveia colonizados) ser adicionado» A mistura foi então bem misturada durante mais cinco minutos e colocada em potes» 5 potes foram semeados com 1© sementes de tomateiro (cv. Bonny Best) para cada tratamento. Terraclor íwp 75, í©,3 K ai/ha) foi adicionado como tratamento testemunha sem tratamento bacte— riano e adicionou-se por ensopamento imediatamente antes da plantação» Cada tratamento foi repetido 4 vezes» Os potes foram .mantidos no escuro durante os 4 primeiros dias após sementeira ík23*C> s depois passados para a estufa durante o resto do ensaio» Após 15 dias o número de plantas saudáveis foi contado» Um tratamento com patogénio mas sem tratamento testemunha com bactérias foi preparado como um tratamento para testar o patogénxo»

A Tabela 3 mostra os resultados dos ensaios de quatro estirpes de rizobactérias. CBA 266446 © CBA 267356 reduziram significativamente a doença» CGA 266447 e CGA 270294 são menos eficazes mas também apresentaram efeitos benéficos»

d) Pato-sistema R. so1ani-oeoineiro solo foi preparado misturando células bacterianas com terra comercial para vasos na proporção de 1 ml de células numa densidade de aproximadamente 10' células/ml por 10 g de solo» Ao mesmo tempo sementes infestadas com Rhi zoo ton í a so1an i © reduzidas a pé foi misturado com o solo numa proporção de 10 ml/10 g de solo» D solo foi aplicado em tabuleiros comerciais para sementeira, cada um consistindo em 12 potes pequenos de 3 cm quadrados que levam aproximadamente 1® g de solo» Em cada um dos 12 potes do tabuleiro foi colocada uma única semente de pepineiro e três tabuleiros foram preparados para cada tratamento» As testemunhas não infestadas sem patogenias ou bactérias adicionadas ao solo e testemunhas infestadas tendo patogénio mas não tendo bactérias foram incluídas em cada experiência. Os tabuleiros foram colocados numa câmara de crescimento em que foi mantida uma temperatura constante de 28’‘C e mantidos húmidos regando duas vezes por dia COffl um aspersor suspenso» Doze dias após plantação registou—se o número de plantas sobreviventes em cada tratamento.

A Tabela 4 mostra os resultados de ensaios de 3 estirpes de rizobactérias. CGA 267356 e CGA 270293 reduziram signifi.·· cativamente a doença. CBA 266447 é menos eficaz»

Exemplo 7; Isolamento e eficácia de estirpes antipatoqénieas

a) Pseudomonas fluorescens estirpe 266446

A estirpe CGA 266446 foi identificada como pertencendo à espécie Pseudomonas fluorescens» Esta estirpe foi isolada a partir da rizosfera de uma planta do algodoeiro madura em greda, arenosa em Burleson Co. Texas. A colheita anterior tinha sido milho. A estirpe é activa contra Rhicoctonia so1ani e Pythium ultimum em agar nutriente mas tem pouca actividade em agar com extracto de solo. 0 tratamento do algodoeiro no solo infestado com P» solani resulta em 7Í% do controle da doença (Tabela 1). 0 tratamento de algodoeiro em solo infestado com P. ultimum resulta em 56a de controle da doença (Tabela 2). 0 tratamento do tomateiro em solo infestado com R» solani resulta em 123% de controle da doença (Tabela 3>.

b) Pseudomonas fluorescens estirpe CGA 266447

A estirpe (CGA 266447 foi identificada como pertencendo à espécie de Pseudomonas f1uorescens. Esta estirpe foi isolada a partir da mesma área da estirpe CGA 266446 e tem actividade semelhante» 0 tratamento do algodoeiro em solo infestado com Fb so1ani resulta em 70% de controle da doença (Tabela í). Tratamento de algodoeiro no solo infestado com F'„ ul_timum resulta em 30% de controle da doença (Tabela 2). 0 tratamento do tomateiro em solo infestado com R. solaní resulta em 54% de controle da doença \rabela 35. 0 tratamento de pepineiro em solo infestado com R» so1ani resulta em 10% de controle da doenra (Tabela 45»

c) Pseudomonas f 1 ud r esc en s estirpe CSA 267356

A estirpe CSA 267356 foi identificada como pertencendo á espécie Pseudomonas f1uorescens. Esta estirpe foi isolada a partir da rizosfera de uma variedade de algodoeiro “SP3774 em solo de terra preta de uma quinta perto de Aqui11a, Hill Sounty, Texas» A colheita anterior foi trigo» A estirpe é activa contra Rh i zoct on ia so 1 ani em agar nutriente e em agar de extracto de solo» Ela é activa contra Pythium ultimum apenas em agar nutriente» 0 tratamento do algodoeiro em solo infestado com R. solani resulta em 80% de controle da doença (Tabela 1)« 0 tratamento do algodoeiro em solo infestado com P» ultimum resulta em 44% de controle da doença (Tabela 2)0 tratamento do tomateiro em solo infestado com R» solani resulta em 131% de controle da doença (Tabela 3)» A estirpe produz um antibiótico que é eficaz para tratar R» so3.ani e P. ultimum, que está descrito no pedido de patente número de série 570,184, entregue em 2© de Agosto, 1990, a. especif icação da qual está aqui incluído como referência» □ tratamento de pepineíro em solo infestado com R» solani resulta em 67% de con tro1e da doença (Tabe1a 4 >»

d) Pseudomonas fluorescens estirpe CSA 270293

A estirpe CSA 270293 foi identificada como pertencendo à espécie Pseudomonas fluorescens. Esta estirpe foi isolada a partir da rizosfera de uma variedade de algodoeiro Stoneville 213^i! em greda lodosa Norwood da Texas A&M Research Farm, em tóras

County ΐ exas, de em

A cultura anterior foi alqodoeiro» A estirpe é activa contra Rhizoctonia solani em agar e em agar extracto de solo» Ela é eficaz contra Pythium u1t imum apenas agar nutriente» 0 tratamento de algodoeiro em solo infestado com R» solani resulta em 68% de controle da doença (Tabela 1)» tratamento do algodoeiro em solo infestado com P» ultimum result em 33% de controle da doença (Tabela 25« □ tratamento do pepineiro em solo infestado com R, solani resulta em 53% de controle dâ doença (Tabela 4).

e) Pseudomonas__f 1 uorescsns estirpe CGA 2‘7©2'?4

A estirpe CGA 270294 foi identificada como pertencendo a Ps-eu.domonas f 1 uorsscens. Esta estirpe foi isolada a partir da rizosfera de uma variedade de algodoeiro Stoneville 213 em greda arenosa fina de Miles derivada de Chilicothe, Texas» A colheita anterior foi a. variedadePayme.ster 145“« Esta estirpe era activa contra foi activa contra R» solani em agar nutriente e em agar de extracto de solo e contra P» ultimam em agar nutriente» A estirpe ê activa contra R. solani e P» ultimum em solo infestado com R. solani (Tabela 1) e 34% de controle da doença em solo infestado com P. ultimum (Tabela 2). 0 tratamento de tomateiro em solo infestado com R» so1ani resulta em 46% de controle da doença (sabeia o/»

f) Pseudomonas fluorescens estirpe CGA 2S1S36

Quando da cultura de uma amostra da estirpe CGA 266447, encontrou—se que estavam presentes duas estirpes distintas de bactérias» A segunda bactéria, designada estirpe CGA 281636, é morfologicamente distinta da CGA 266447 e apresenta boa actividade de biocontrole» CGA 281836 foi identificada como pertencente Λ espéc i e Pseudomonas f1uorescens» tratamento do algodoeiro em solo infestado com R.__so1ani resulta em 76% de controle da doença (Tabela 1). □ tratamento do algodoeiro em solo infestado com P» ultimum resulta em 37% de controle da doença (Tabela 2)»

□ metabolito antifúngico activo pode ser extraído do meio de crescimento das estirpes bacterianas que produzem -antibióticos inibidoras. Por exemplo, usando a estirpe CSA 267356, isto é conseguido por extracção do meio de crescimento com acetona a 807. seguido de remoção da acetona por evaporação e uma segunda extracção com éter dietílico» 0 éter dietílico foi removido por evaporação s o extracto seco foi ressuspenso num pequeno volume de água» Pequenas quantidades do extracto de antibiótico aplicadas a discos de papel de filtro estéreispequenos colocados numa placa de agar inibirão o crescimento de R. solani, indicando a presença do composto antibiótico activo» Uma vez que o antibiótica é facilmente extraído com solventes orgânicos, é provável que tenha grupos cíclicos ou aromáticos na. sua estrutura como é comum a muitos antibióticos que se sabe serem produzidos por outras pseudomonas» £xomplo_9j_ÇombUnar^o.___sinergístiga de P. fluorescens com____o íyDSÍ^da_^cilal^ijia_jn^âia^lo_£^a__j^onixol^.^^odjiidãD___do algafeiroegi____solo......infestado ..com Rhizoctonia___solani e Pythium ultimum

As estirpes CSA 281S36, CSA 267356 e CSA 276293 foram aplicadas indívidualmente a solo não estéril como um chuveiro a 2

B x 10 cfu/ml de solo, enquanto que o fungicida metalaxilo é espalhado como uma chuveiro CRidomil, a 0,02, 0,5 ou 2 ppm) ou usado para revestir sementes (Aproo, a 35 g a«i. CÍ00 Kg de semente.}» P»_____ultimum foi introduzido como uma suspensão de □esporos (1400 esporos/ml de solo), R„ so1ani foi introduzido como um pó sedimentado í5 mg no centro de cada pote) Após incubação durante 19 dias na estufa os hipocótilos das plantulas de algodoeiro foram avaliados relativamente â doença numa escala de

observação» Conseguiu-se controle quase completo da. podridão quando a estirpe CGA 267356 foi aplicada com Ridomil a 2 ppm» Usando Apron em vez de Ridomil resulta no mesmo nível de controle» A estirpe CGA 267356 sózinha ainda dá supressão significativa de ambos os patogériios. 0 fungicida Metalaxil sózinha não consegue controlar o complexo de doenças»

0,02 ppm Ridomil sózinho dá 40% de supressão de P» ultimum. A combinação de 0,02 ppm de Ridomil com a estirpe CGA 267356 aumenta o nível de controle para mais de 60%. A estirpe CGA 281836 dá resultados essencialmente tão bons quanto a estirpe CGA 267356. A estirpe CGA 270293 não suprime significativamente o complexo de doenças das planfulas.

que foi dito demonstra que a aplicação combinada de estirpes bacterianas de biocontrole com uma proporção reduzida ds fungicida metalaxil consegue o controle quase completo do complexo de doenças das plantas em algodoeiro provocado por R» solani s P. ultimum.

Exemplo ΊΟϊ Isolamentr o ao gene do antibiótico

Pseudomonas fluorescens tipo selvagem estirpe ilc-í-38 (estirpe 9Í5) foi mutagenizada por exposição ao mutagénio N-metil-hP-nitro-N-nitrosoguanidina» Aproximadamente duas dúzias de mutantes afectados no antibiótico foram identificados por rastreio de mutantes individuais relativamente à sua capacidade para inibir o crescimento de P.__ultimum e R. solani em aqar nutriente»

A maior parte destes apresentou actividade reduzida ou nenhuma actividade antibiótica contra um dos dois funqos fitopatoqénícos, mas na.o são afectados na; sua inibição de outros funqos»

No entanto, um mutante, que designámos 2-1, não possui actividade antibiótica contra ambos os fungos testados. Estes resultado sugerem fortemente que P. fluorescens estirpe ííc-1-38 produz dois antibióticos distintos, um eficaz contra P» ultimum e o out.ro eficaz contra ambos os fungos.

Uma biblioteca de genes de DNA total isolado a partir da estirpe parental foi construída por digestão parcial com Sall do DNA, fraccionamento por tamanho para dar fragmentos de

Kilobases e ligação do vector pVKÍOO cortado com Xhol. Knauf et al. , Plasmid 8; 45-54 (1982). A biblioteca de genes foi transferida para o mutante de antibiótico 2-1 por conjugação triparental com E. coli portadora do plasmideo tra+ pRK2Ô13. Ditta et al., Proc. IMatl Acad. Sei. USA 77s7347-7351 (1980). Os exconjugantes transgénicos foram testados relativamente ã produção de antibiótico medindo a inibição dp crescimento de P. ultimum e de R. so1ani. Três clones sobreponiveis foram identificados os quais ____s gl_a n i_ ? mas não

1. Os mapas de restrição destes restauraram a actividade antibiótica contra R contra P. ultimum. ao mutante hufiiíb foram determinados cuídq se mostra na Fiuura 1

Exemplo 11 s Caracterização da região do gene do antibiótico

A região genética necessária ã compieffien tação» funciunal da biossíntese de antibiótico no mutante 2-1 foi definida por suoclonagem de porçóes da. região maior e trestsndo a sua capacidade para complementar o mutante 2-1 relativamente ã actividade de antibiótico (Figura 2) . Q fragmento mais pequeno que aprsentou complementação d-a mutação é o fragmento HindIII/EcoRI de 4,9 Kb, o qual está indicado como subfragmsnto 6 na Figura 2 e foi designado subfragmsnto H/E4.9» Alguns dos subfraqmentos de DNA clonados derivados do clone parental do gene do antibiótico, o qual foi designado pANT—5», foram transferidos para duas estirões

tipo selvagem de P, f Iuorescens, llc-33 (estirpe 914) e 11-1-6 (estirpe 922)₅ que normalmente não são capazes de produzir antibiótico contra R, solani,

Os resultados apresentados na Figura 2, indicaram que um subfragmento EcoRI de 11 Kb, o qual está indicado como sub— fragmento 5 na Figura 2 e foi designado subfragmento Eli, confere ambas as estirpes— Para melhor definir as fronteiras genéticas deste fenómeno, usou-se mapeamento de transposões para se obter um mapa funcional da região do gene antibiótico.

Vinte cinco inserções independentes do transposão Tn5 foram geradas no fragmento EcoRI de 11 Kb (Figura 3), A capacidade da maior parte destes para conferir antibiose activa. contra Rj_ duas estirpes dos testes determinada © os resultados estão descritos na Figurai 3, Gs resultados indicam que a maior parte do fragmento Hindi 11/EcoRI de 4,9 Kb no lado direito do fragmento EcoRI de 11 Kb está envolvido na síntese de antibiótico tal como estão as regiões para a esquerda do sítio Hindlli, No entanto, duas inserções Tn5 numa pequena região imediatamente para s direita do sítio Hindi II não tem qualquer efeito na. síntese do antibiótico. Isto indica que esta reqião contem DNA que não é necessário para a antibiose,

Exemplo 12;; Inibição de Rh.izgçtonia solani composto antibiótico activo pode ser extraído a partir do meio de crescimento da estirpe -de P» fluore_scens transformada que produz este antibiótico. Isto foi conseguido por extracção do meio com acetona a 8@“4 seguido da remoção da acetona por evaporação e uma segunda extracção com éter dietíiico, 0 éter dietílico foi removido por evaporação e o extracto seco foi

ressuspenso num pequeno volume de á extracto de antibiótico aplicadas a filtro estéreis colocados numa placa mento de R, solaní indicando a pres activo» Uma vez que o antibiótico gua. Pequenas quantidades do pequenos discos de papel de de agar inibirão o cresciença do composto antibiótico é facilmente extraído com solventes orgânicos, é provável tina sua estrutura tal como é comum dos produzidos ou cr nc ? ri nni r*n .λ c grupos cíclicos ou aromáticos muitos antibióticos conheciExemplo_15s Formulações de composições antifúnqicas empregando composições líquidas

Mos exemplos que se seguem, as percentagens da composição são dadas por peso e o ingrediente activoS é

a) uma bactéria Pseudomonas f 1 uorescens transformada produtora da substância antibiótica inibidora do patogenia alvo ou

b) um metabolito antifúngico produzido pela bactéria f1uorescens que é inibidor para o patogenia alvo ou

Rseud omon as

c) uma combinação í ? í das UGA266446, CSA 266447, CGA 26 281836 e me ta1a x i1.

es t i r pss Pseudomonas f1uorescens bõ, CGA 2/0293, CSA 270294 ou L'Ga

1, Concentrados emulsionáveis

Tr π q red lente a c f i ν o $

Dorieci1benzenossulfonato cálcio

Éter de óleo de castor polietilenoglicol (36 moles de óxido de eti1eno) éter de tributilfenol polietilenoglicol (3© moles de óxido de etile.no)

12%

4%

Cic 1o-hexanona

2©/

H i stu ra de x i1enos

Emulsões de qualquer concentração necessária podem ses produzidas por diluição com áqua.

2. Soluções;

Ingrediente activo*

S@5i

107

Éter monometílico de etilenoglxcol

Polietxlenoglicol 40Θ

N-raeti12-pirrolidona óleo de coco epoxidado

Destilado de petróleo (gama de ebulição íóD-iPô^C)

20)

947

-jA

Estas soluções são adequadas para aplicação na forma de ííiicraqotas.

Ingrediente activo*

107 cau λ mo

Ãcido silicico altamente disperso

93·:

Atapulgite

V07 ingrediente activo foi dissolvido em cloreto de metileno,, a solução foi espalhada sobre o veiculo e o solvente foi subsequentemente evaporado sob vácuo»

4« Poeirass a b

Ingrediente activo* 2% 5%

Ãido silicico altamente 1% 5“/.

disperso

Talco 97%

Caulino - 90%

As poeiras prontas para usar são obtidas misturando bem os veículos com o ingrediente activo,,

Formulasão de. composições......antifúngicas empregando

CõmposiiSes_sóLidas

Nos exemplos que se seguem, as- percentagens das composições -são por peso e o ingrediente activo# pode ser uma ou. mais das bactérias Pseudomonas fluorsscens transformadas produtoras da substância antibiótica inibidora do patogénio alvo ou um mais dos metabólicos anti-fúngicos produzidos por bactérias Pseudomonas fluorescens que são inibidoras para o patogénio alvos

1» Pés molháveiss ingrediente activa:!.

207,

60X

Linhossu1tate de sód io ta

Laurilsulfato de sódio

W iit 'Di isobuti lnaftalenossulfonatc de sódio

67.

ے%

Éter de octilfeno1 ρο 1 i.e t i 1 enog 1 i c o 1 (7-8 mo 1 es de óxido de etileno)

Acido silicico altamente disperso jÍ. f /«

Í0Z, laulino □ ingrediente activo foi bem misturada com os adjuvar? tes e a mistura foi bem triturada num moinho adequado, dando pó molháveis que podem ser diluídos cora água para dar suspensões da concentragõss pretendidas»

2., Concentrado emulsionáveis

Ingrediente activo®

10% éter de octilfenol polietilenoglicol <4-5 moles de óxido de etileno)

Dodecilbensenossulfonato de cálcio éter de poliglicol óleo de castor & ^af i V i Ί — _4 — *!*/« v««D ίΤϊΟΐ ΐζ’ ζ:· O te* óxido de etileno)

C ic1o-hexanona

Mistura de xilenos

3ΘΧ .50% fcjnulsões de qualquer concentração necessária podem ser obtidas a partir deste concentrado por diluição com água»

3» Poeirass

Inqrediente activo®

Talco

Caulino

3, Granulado extrudidos

Ingrediente aotivo# 107«

Linhossulfonata de sódio 2%

Ca r faox i me t i1ce1u1ose 1X

Caulina 87% ingrediente activo foi adjuvantes e a mistura foi subsequer A mistura foi extrudida e depois sec misturado e triturado com os temente humedecida com ãgua« a numa corrente de ar«

Granu1ado revestidos

Ingrediente activo# 3% r’o 1 is ti 1 enog 1 ico 1 200 3X

Caulino 94% ingrediente ac ti uniformemente num misturador noglicol. Os granulados não obtidos vo finamente triturado foi aplicado ao caulino humedecido com polietile— pulverulentos revestidos foram assim

ó. concentrado em suspensão:

Ingrediente ac t i vo$

Etilenoq1icol

Nonilfenol polietilenoglicol C15 moles de óxido de etileno)

Linhossulfonato de sódio >

Carboximeti1ce1uIose »4.

10%

10%

1%

Solução aquosa de formaldeído a 37% óleo de silicone e/n emulsão aquosa a. 755 ingrediente activo misturado com os adjuvantes dando partir do qual podem ser obtidas tração pretendida por diluição com água

Exempla 15 s Ensaio :âinuo py /e finamente triturado foi bem um concentrado em suspensão a suspensões de qualquer concenda biuuuntro1e

As estirpes de biocontrole foram guardadas em 50% de glicerol a -80°C» Uma ansada da cultura guardada foi ressuspensa em 5 ml de Caldo de Luria CLBs 10g de Bacto—Tryptone, Difco; 5 q de extracto de levedura, Oxold; 0,-,25 g de MgSO^^xH^O; S g de NaCls e 1 1 de água destilada; ρΗ7) e agitada a 15Θ rpm & 25°C durante 24 horas» 100 ml de LB foi inoculado com 1 ml da pré—cultura e incubado nas mesmas condições» Após 16 horas a cultura foi

cfu/ml (D02)« Assim, 100 ml 200-300 ml de suspensão de DOS.

a 1	0000	rpm	m 0 sedimento res-
!, 8%	iMaCl)		ajustado a 3 x l©7
C3 51	cultu	Γ-3.	d ã.o apr 0 x i mad amen te

Usou-se um hemocitómetro e/ou espectrofotómetro para ajustar a concentração de bactérias no suspensão para ensopar.. Como alternativa uma solução salina padrão de DO conhecida (e.g.

Phillips⁵ Milk of Maqnesia

TM

Mg(OH)^) pode ser usada pa.ra ajustar a 00 da suspensão. Se não houver uma centrífuga todo caldo de cultura pode ser aplicado; um hemocitómetro é então usado para determinar as cfu/ml.

Para determinação exacta, preparou—se uma série de ft ~Pi diluições (10' a 10 20 μΐ em 1S0 μΐ) numa placa de microtitulação e gotas de 10 pl são colocadas sobre agar de Luria CLB com 1,5% de Bacto-Agar, Difco) com uma pipeta Eppendorf. Aís cfu são contadas após 24 horas de incubação a 2o°C.

25© ml da suspensão de bactérias por 10⁵ ( = í rep) foram espalhadas como um chuveiro sobre as sementes cobertas (200 sementes por rep). Um vaporizador manual ou regador sem resíduos de pesticidas foi usado para aplicar a suspensão numa banda estreita ou com 1,5 polegadas.

Preparou-se Rhizoctonia solani e Pythium u11imum para inoculação como no Exemplo 5 atrás.

aparecimento de novas piancas ιοί registado sd· 10 dias após plantação para avaliar podridão antes da germinação. Fizs. am—Sfe registos aos z.i oia.s e 2tí oias apos plantação para avaliar a podridão após o aparecimento das plantas.

Actividade de biocontrole em % das contra Rhitoctonia solani em plantas

estirpes usadas do a1godoeiro=

1D r“.Z> Ϊ3

JL t·/

Es t i rpe

Percentagem média da actxvioade de taiocontrole

USA 266446 CGA 266447 CGA 267356 CGA 270293 CGA 270294 CGA 281836

7©

R0

401~^: Testemunha nao infestada designada 100% de biocontrole

Testemunha infestada designada '3% de biocontrole»

Tabela

Actividade de biocontrole contra F'ythium u111 »)um em em % das estirpes usadas no despiste lantas do alqodoeiro.

>tiΓμΒ

CSA	j£Óo44fe	56
CSA	266447
CSA	Ο ξ. *’ Z.O / JJQ	Λ ?ϊ *4*4.
CSA	270293
CSA	270294	•*e i»
CSA	281836	39

Percentagem média da actividade de biocontrole¹

1- Testemunha não infestada desianada 100% de b i oc on1 role

Testemunha infestada desianada 0% de biocontrole.

Actividade de bioeontrole em % das estirpes usadas ne desp; contra Rhizoctonia solani em tomateiros»

Tratamento

Valores r-;sp3 Rep4

P?«=

DAP’'

Média % Actividade

B i oc on t r o 1 e ~

K

MP.MT

... ,.,,.c

P ii O! í

T errac1or

CkiH 26o44o CGA 266447 CínA 26/--.56 CGA 27ô29' 4

9	10	ti	10	O SZ7 Z* w π ,Jv
5	4		£?	cr ΟΕΓ
10	10	9	10	9,75
9	5?	10	9	Q ->s
7	5	6	10	7,00
9	10	10	q	9,50
*7	6	6	7	6,75

138

Í31

4,4 a —· - após plantauao b = Sem patogénios, sem tratamento (testemunha não infestada) ^satogénio, sem tratamento (Testemunha infestai;

~ Testemunha não infestada designada 100% de bioeontrole Testemunha infestada desiqnada 0% de bioeontrole

Actividade de biocontrole em % das estirpes usadas no despistes contra Rhisoçtonia^oiâQi ^sffl tomateiros.

Valores 12 DAP^â

't ratamento	Repl	Rep2	Rep3	Média	% Actividade Biocontrole x
NP«iMTb	12	11	12	11,67	100
P.NTC	7	1©	9	8,67	©
CSA 266447	9	9	9	9,0©	10
CSA 267356	1©	11	11	10,67	67
CGA 27Ô293	9	11	í í	10,33	53

a - Dias após plantação b ·- Sem patogénios, sem tratamento (testemunha não infestada) c = Patogénio, sem tratamento (Testemunha infestada) = Testemunha não infestada designada !©©% de biocontrole

Testemunha infestada designada ©% de biocontrole

BÊZ^n^J^_a£Srdâ^o2LJl__JÍâtMíLJÍe_jlydafieste.^„Am^ican....J>ee

Culture^CplJectipn

J clone pftNTS foi depositado em 1/ de Agosto ds 199© na ATCC e foi-lhe dado o número de acesso ATCC 4©Q68. Um plasmídeo contendo o fragmento Eli ds 11 Kfa do pftNTS foi depositado na mesma data e foi designado ATCC número de acesso 4©869.

As estirpes de Pseudomonas fluorescens que se seguem foram depositadas pelo requerente em 24 de Abril, 1991 na American Type Culture Collsction, 123©í Parklawn Drive, Rockvilie, Md 2©852_s de acordo com o Tratado de Budapestes

ΟθΑ	266446-	(ATCC	N-2	de	AC -—'hz- ζΞΌ	551	71
w C?H	26â<44 /	K f'6í CL	NS	de	Acesso	551	70
CGA	267356	(ATCC	N2	C3S?	HC SÍLI	551	69
CuA	2 / 02”? 3	< ATCC	MS	tá *3	Acbbso	w*_í ζ	75
CSA	270294	(ATCC	N2	de	j—í 55 C*	551	74
CSA	qq -i οτ.ύ Λ-W - Wm‘W	(ATCC	N9	rfs	Λ Hl. cf ϊς-χΌ	551	όβ

€?

Claims (8)

1. lã. - Agente de biocontrole. purificado eficaz contra patogénios fúngicos, caracterizado por compreender uma quan tidade fungicida eficaz de um agente de biocontrole purificado obtido ou seleccionado a partir de uma das seguintes estirpes de PseudomoΙ kl o r escens s

   CGA 266446 (ATCC N2 ds Acesso 55171), CSA 266447 CATCC NS de Acesso 55170); CGA 267356 CATCC NS de Acesso 55169)? CGA 270293 (ATCC NS de Acesso 55175)₅ CGA 270294 (ATCC NS de Acesso 55174)s e CGA 281836 (ATCC NS de Acesso 55168)„
2. 2ã„ -· Agente ds biocontrolo purificado eficaz contra patogénios fúngicos de acordo com a reivindicação 1» caracterizado por os patogénios fúngicos serem selsccionados a partir do grupo constituído por Rhizoctonia solani e Pvthium ultimum.
3. 3ã» - Processo para a preparação ds uma composição fungicida, caracterizado por se incluir na referida composição (I) uma ou mais estirpes ds Pseudomonas flurescsns controladoras de doenças biológicas ou um agente de biocontrolo obtido a partir das referidas estirpes e (II) um ou mais fungicidas acilalanina juntamente com um veículo aceitável em aqricultura; sendo as proporções de mistura dos dois princípios activos Isll de desde 100sí a 15Í00, de preferência desde 10; 1 a
4. 4â» - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a estirpe de Pseudomonas flurescsns ser selecciona™ da a partir do grupo constituído pelas estirpes de Pseudomonas
5. 5a.

   cações 3 ou. 4 seleccioriado a

   CGA 266446 CATCC N2 de Acesso 551 71); CGA . * / Z¹ Z⁵ 2Ú Í5 CJ ”»* t’ / CATCC we Acesso 551 70); CGA 267356 í ATCC N2 de Acesso 551 69); cGa 27029-7 CATCC we de Acesso 531 -ycr \ _w / t-r / tt CGA 270294 ÍATCC we de Acesso 551 74); e CGA •“’»O ·» O7· / rfl»W Ã í ATCC j\!O de Acesso 551 éS) .. - Pfi □cesso d e aco rdo com qualquer uma das reivindi- 5 u aracteri K'. CÍ w Ό nnr w t □ fungicida ac i lalanina ser

   partir do grupo constituído por metalaxilo, furalaxilo, oxadixilOr, banaiaxiio e ofurace»
6. 6â» - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado por o agente de biocontrole ser o da reivindicação 1 ou da reivindicação 2=
7. 7â» - Método para controlar um fungos f ítopatogénico,, caracterizado por compreender a introdução de uma. quantidade fungicida eficaz de um agente de biocontrole de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2 ou de uma composição fungicida de qualquer uma das reivindicações 3 a 6 no ambiente onde se pretende inibir o fungo fítopatogénico, sendo a taxa de aplicação da estirpe bacteriana de 5© g a 5 kg por hectare»

   Sã» - Método para a obtenção de uma substância antibiótica que inibe eficazmente o crescimento de um patogénio fúngico., caracterizado por compreender a cultura de um aqente de biocontrolo purificado de acordo com a reivindicação 1, em condições suficientes para produzir uma substância antibiótica; e a extracçáo da substância antibiótica por meios convencionais„

   Si

   DNA

   92» - Processo para a obtenção de uma sequência de recombinante que codifica uma ou mais enzimas necessárias è. síntese de uma substância antibiótica, em que a referida substância antibiótica inibe o crescimento do fungo Rhizoctonia solani, caracterizado por a referida sequência ser derivada a partir de agentes de biocontrole da reivindicação 1»
8. 10â» - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a referida sequência de DNA ser obtida a partir do clone pAWT5« líâ. — Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por a referida sequência de DMA compreender o fragmento Eli de aproximadamente 11 kb»

   Í2ã. ~ Agente de biocontrole, caracterizado por compreender uma sequência de DNA recombinante seleccionada a partir do grupo constituído por sequências de DNA obtidas de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11»

   Í3â. - Agente de biocontrol de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por ser uma estirpe bacteriana»

   ÍTUJÍl-dAS i

   Í4ã.

   is acordo com a reivindipor a estirpe bacteriana ser uma pseudo-·· íbâ. — Agente de biocontrole de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a estirpe bacteriana pertencer ao gênero Pseudomonas fluorescens» lóã. - Método para inibir o crescimento do fungo Rh1zoctPPia so 1 an 1. caracterizado por compreender:

   de de a> a introdução da sequência de DNA’ recombinante qualquer uma das reivindicações 9 a 11 no genoma de um agente biocontrolo para formar um agente de biocontrolo transformados b> a aplicação do agente? de biocontrolo transformado no ambiente onde se pretende inibir o fungo Rhizoctonia solani»

   17ã» - Método para a obtenção de uma substancia antibiótica que é eficaz para inibir o crescimento do fungo Rhizoctonia solani caracterizada por compreender;

   a) a introdução da sequência de DNA recombinante obtida de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11 no genoma ds um agente de biocontrolo para formar u.m agente de biocontrolo?

   b) o permitir que o agente de Biocontrolo produza uma substância antibiótica; e

   -anstormado

   c) a extracção da substância antibiótica do agente de biocontrolo transformado por meios convencionais, í8é,

   Pseudomonas f 1 nrescsns,, caracterizado por ser sei ecc ion-ads seieccionadí partir do grupo constituído pelas

   -oss

   CGA 266446 (ATCC IMS de Acesso 5517Í)5 CBA 266447 (ATCC NS de Acesso 5317®)$ CGA 267356 (ATCC NQ de Acesso 55169)5 CGA 270293 (ATCC NS de Acesso 55175)5 CGA 270294 (ATCC NQ de Acesso 55174)5 e CGA 281836 (ATCC NS de Acesso 55168).

   Lisboa5 19 de Agosto ds 1991