JPH07509605A - 遺伝子活性化要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２５、請求項２２の組換えＤＮＡ配列が導入されているトランスジェニック細菌 株であって、前記組換えＤＮＡ配列の細菌調製要素がトランスジェニック細菌株 に相同である遺伝子由来のものである、トランスジェニック細菌株。

２６、宿主株において少なくとも１つの遺伝子の発現を活性化する方法であって 、前記遺伝子は潜伏性であるかまたは生来低レベルで発現され、 前記宿主株に少なくとも１つの遺伝子活性化配列を導入することを含んで成る方 法。

２７、前記遺伝子活性化配列がＤＮＡ配列である、請求項２６の方法。

２８、前記ＤＮＡ配列が細菌調節要素に作用可能に連結される、請求項２７の方 法。

２９、前記調節要素が、シュードモナス（ム剋止圓■紐）属およびバシラス（Ｌ 旦且皿）属並びにＥ、コリ（Ｌ口）種から成る群より選択された細菌株から単離 された遺伝子由来のプロモーターである、請求項２８の方法。

３０、前記遺伝子活性化配列がｌぼＡ配列である、請求項２６の方法。

３１、前記且ａｆＡ配列が配列番号１の配列である、請求項３０の方法。

３２、前記遺伝子活性化配列がＬＬ［［ＬＡ配列である、請求項２６の方法。

３３、前記１ｅｍＡ配列がｐｃＩＩ３１６８中に含まれる］ｅｍＡである、請求 項３２の方法。

３４、真菌病原体に対して効果的な細菌株にする方法であって、該細菌株に請求 項１のＤＮＡ配列を導入することを含んで成る方法。

３５、真菌病原体に対して効果的な細菌株にする方法であって、該細菌株に請求 項１９のＤＮＡ配列を導入することを含んで成る方法。

明　細　書 止岨ｆ 股ユ 本発明は、菌株中の遺伝子の活性化に寄与する遺伝要素の同定、単離、クローニ ングおよび利用に関する。より詳しくは、細菌中の遺伝子の活性化において互い に相互作用する２クラスの遺伝要素の同定に関する。一方または両方の型の要素 の操作を利用して細菌の表現型を操作することができる。

欠盟皇翌五 成る土壌中で栽培された作物は、生まれつき成る種の真菌病原体に耐性であるこ とが知られている。更に、それらの病気の発達を助成する土壌は、抑制地帯から の少量の土壌の添加により、抑制または耐性にすることができる。５ｃｈｅｒら 、Ｐｈ　ｔｏ　ａｔｈｏｌｏ　７０：４２１（１９８０）。逆に、抑制土壌をオ ートクレーブ処理により真菌病を助成する土壌にすることができる。これは、病 気制御の原因となる因子が生物であることを示す。その後の研究により、根に集 落形成する細菌が生物学的病害防除（ＢＤＣ）として知られるこの現象の原因で あることが証明された。Ｂａｋｅｒら、Ｂｉｏｌｏ　１ｃａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ 　ｏｆ　１ａｎｔ胆止匹飢鉦（Ｆｒｅｅｍａｎ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｓａｎ　Ｆｒａ ｎｃｉｓｃｏ）　（１９７４）。

多くの場合、生物学的病害防除菌の最も有効な株は蛍光性シュードモナス菌（Ｐ ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）である。Ｗｅｌｌｅｒら、Ｐｈ　ｔｏ　ａｔｈｏｌ。

７３・４６３−４６９　（１９８３）。それらの細菌は、はとんどの土壌に存在 する有害な根圏微生物叢の抑制により、特定の真菌病原体の不在下での植物生育 を促進することも証明されている。Ｋｌｏｅｐｐｅｒら、庖■並配帥虹ルＬ７１ ：１０２０−１０２４　（１９８１）。それらの細菌での種子接種により効果的 に防除された重要な植物病原体としては、小麦の立枯病の原因物質ゲマノマイセ ス・グラミニス（堕堕飢胆肛並辷」ユ関側旦）ＣＣｏｏｋら、５ｏｉｌ　Ｂｉｏ ｌ、　Ｂｉｏｃｈｅ［［１，８：２６９−２７３　（１９７６））　、並びに綿 の立枯病に関係する病原体であるピチウム（医止皿Ｌ）およびリゾクトニア（Ｒ ｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ　）　ＣＨｏｗｅｌｌら、Ｐｈ　ｔｏ　ａｔｈｏｌｏ　６ ９：４８０−４８２（１９７９））が挙げられる。リゾクトニアは幾つかの理由 で特に問題となる植物病原体である。第一に、それは広範囲の作物を冒し得る。

第二に、この真菌を抑制するのに効果的な市販の化学殺真菌剤がない。これらの 状況のため、Ｒ，ソラニ（Ｒ，５ｏｌａｎｉ）に対する阻害剤がこの病原体に有 効な防除として相当な関心が持たれている。

多数の生物学的病害防除シュードモナス株は真菌病原体の増殖を阻害する抗体を 生産する。Ｈｏｗｅｌｌら、Ｐｈ　ｔｏ　ａｔｈｏｌｏ　６９：４８０−４８２ （１９７９）　；　Ｈｏｗｅｌｌ　ら、Ｐｈ　ｔｏ　ａｔｈｏｌｏ　７０ニア１ ２−７１５　（１９８０）　、それらは根圏中の真菌病原体の防除に関係してい る。幾つかの過去の研究は、病害防除菌がそれらの抗体を合成できなくなる突然 変異の効果に集中している。Ｋｌｏｅｐｐｅｒら、Ｐｈ　ｔｏ　ａｔｈｏｌｏ　 ７１：１０２０−１０２４（１９８１）　；　Ｈｏｗｅｌｌ　ら、Ｃａｎ、Ｊ、 　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２９：３２１−３２４　（１９８３）。それらの場合、 病原体を防除する生物の能力は減少されるが、完全に排除されない。特に、Ｈｏ ｗｅｌｌら、Ｐｈ　ｔｏ　ａｔｈｏｌｏ　６９：４８０−４８２（１９７９）は 、リゾクトニア・ソラー（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ　５ｏｌａｎｉ）に対して拮 抗作用する抗生物質を生産することが示されたシュードモナス・フルオレッセン ス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の株を開示している。

Ｂａｋｅｒ　ら、Ｂｉｏｌｏ　１ｃａｌ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　 Ｐａｔｈｏ　ｅｎｓ　（ＡｍｅｒｉｃａｎＰｈｙｊｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ 　５ｏｃｉｅｔｙ、　Ｓｔ、　Ｐａｕｌ、　Ｍｉｎｎ、）（１９８２）の第６１ −１０６頁において、生物学的防除の重要な要因は与えられた環境中で競争する 生物の能力であることが報告されている。よって、真菌病原体、例えばリゾクト ニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ　５ｏｌａｎｉ）　、今ルミントスポリ ウム・グラミネ（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓ　ｏｒｉｕｍ　ｒａｍｉｎｅａｅ）並び にピチウム（ｈ帥側Ｌ）属およびフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕ［［ｌ）属の種の 増殖を抑制するのに効果的であり、且つ植物の根圏中に存在する有害な細菌や微 生物叢と積極的に競争することができる生物防除剤の株を得ることが望ましい。

この目的を達成するために、真菌病原体の増殖を防除する能力と他の植物病原体 を防除する能力および／または根圏中で積極的に競争する能力とを合わせ持つ生 物防除剤の株を遺伝学的に工作するのに利用することができる、真菌病原体に対 する耐性を付与するのに有用なりＮＡ配列を得ることが更に望ましい。

細菌二成分調節系は広く概説されている〔例えば、Ａｌｂｒｉｇｈｔら、Ａｎｎ ｕ、Ｒｅｖ、ＧｅｎｅＬ、２３：３１１−３３６　（１９８９）　；　Ｂｏｕｒ ｒｅｔ　ら、Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　６０：４０１−４１１　（１９９１）　；　Ｍｅｋａｌａｎ ｏｓ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１７４：１−７　（１９９２））。はと んどの場合、環境シグナルはセンサータンパク質成分により受信される。該シグ ナルの受信は自己リン酸化現象とセンサータンパク質のコンホメーション変化を 引き起こす。この新しいコンホメーションになると、該センサーは活性化因子タ ンパク質成分のアミノ末端部分をリン酸化することができる。このリン酸化現象 は、カルボキシ末端のＤＮＡ結合モジュールがネットワーク内で調節遺伝子のプ ロモーター領域と相互作用することができるように、活性化因子タンパク質のコ ンホメーションを変えると考えられる。

Ｌａｖｉｌｌｅら、ＰＮＡＳ　ｔＪｓＡ　８９：１５６２−１５６６　（１９９ ２）は、シュードモナス１フルオレツセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕ ｏｒｅｓｃｅｎｓ）　ＣＨＡＯからの、抗真菌性二次代謝産物２．４−ジアセチ ルフロログルシノール、シアニドおよびビオルテオリンの合成に関与する遺伝子 の発現に必要とされる−と命名された活性化因子成分遺伝子の単離を開示してい る。この株は、真菌病原体チェラビオプシス・バシコーラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏ 　ｓｉｓ　ｂａｓｉｃｏｌａ）により引き起こされるタバコノ黒根腐れ病を抑制 することができると指摘された。膨遺伝子の破壊は、それらの二次代謝産物のい ずれも合成することができず且つ微粒菌核病を防除する能力が有意に減少された 変異体をもたらした。

Ｌａｖｉｌｌｅらは、筺妨遺伝子がＰ、フルオレッセンスの二次代謝の調節に関 与していると結論づけ、脛妨調節下で生産される細胞外二次代謝産物が微粒菌核 病の生物防除に重要であると推測した。彼らは、Ｅ、コリ中に鴎に相同の遺伝子 が存在することを記載し、シュードモナス・エルジノーサ（ｈ皿亜皿皿鉦組皿れ 匹鐸）中に匹Ｍに類似した配列が存在するというハイブリダイゼーション実験か らの予備証拠を引用した。

我々のデータは、抗真菌性二次代謝産物がおそらく、我々がシュードモナス・フ ルオレッセンス（ム皿包訓坦辷」包扛競別匹）からクローニングしたＯＲＦ　５ 遺伝子の調節下にある因子の部分集合のみであることを指摘している。というの は、我々はＯＲＦ　Ｓ　Ｑｌ巳）が高分子炭素源の異化に関係するキチナーゼや ゼラチナーゼといった加水分解酵素の生産にも影響を及ぼすことを発見したから である。

１、ａｖｉｌｌｅらは、■昌遺伝子が転写活性化因子による潜伏遺伝子の活性化 に関係することを開示または示唆しなかったし、また成る細菌株に由来する活性 化因子が異種細菌由来の遺伝子の発現を誘導するであろうことを示唆しなかった 。我々の知る限りでは、成る天然の細菌単離物が、異なる生物から誘導された細 菌転写活性化因子の導入（この場合、ＯＲＦ　５を含有するＰ、フルオレッセン ス９１５株ＤＮＡの２．Ｏｋｂ　Ｘｈｏｌ断片の導入またはＯＲＦ　５．−に相 同なりローン化Ｅ、コリ遺伝子の導入）により活性化させることができる未検出 の潜伏遺伝子を担持しているという発見を記載するのは本発明が最初である。

異なる微生物からの多数のセンサー成分遺伝子が特徴づけられている（概説につ いては、Ｂｏｕｒｒｅ　ｔら、　１９９１と５ｔａｃｋら、　１９９０を参照の こと）。−例として、シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ且亘 豚並）の病原性にはｌＡと称するセンサー成分遺伝子が必要であることが発見さ れた（Ｈｒａｂａｋら（１９９２）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１７虹３０ １１−３０２０）。しかしながら、本出願明細書中に与えられたデータと反対に 、ＨｒａｂａｋらはＩｅｍＡが単独でセンサー機能と調節機能を果たし得ること を提唱した。我々の実験は、シュードモナス・フルオレッセンスからクローニン グされた同一遺伝子ファミリーの構成員を特徴づけ、それが全体的調節要素釘旺 Ａと相互作用することによって遺伝子活性化の重要な役割を果たすことを明らか にする。

見肌塁斐稔 従って、本発明の１つの目的は、細菌株中の遺伝子を活性化するのに有用である ＤＮＡ配列を提供することである。

本発明の別の目的は、生物防除に有用な細菌株の生物防除能力を改善するのに利 用することができる遺伝子を提供することである。

本発明の１つの特徴は、細菌株中の遺伝子を活性するＤＮＡ配列および遺伝子が 提供されることである。

本発明の更なる特徴は、細菌株中の遺伝子の活性化を増強する、変更タンパク質 をコードする変更ＤＮＡ配列および遺伝子が提供されることである。そのような 変更は調節遺伝子の効能を改善することができる。

本発明の利点は、広域スペクトルの植物病原体を抑制することができる生物防除 剤が生産され得ることである。

本発明のもう１つの利点は、植物根圏中で積極的に競争することができる生物防 除剤が生産され得ることであり、この生物防除剤は細菌生物防除剤中に遺伝子を 活性化するＤＮＡ配列を含有する。

本発明によれば、上記目的は、細菌株中で通常は刺激されない遺伝子を活性化す ることができる遺伝要素または遺伝子活性化配列の単離と利用により達成するこ とができる。それらの遺伝子活性化配列の単離は幾つかの理由で重要である。第 一に、活性化された株は、植物病原体、特に真菌病原体、例えばリゾクトニア・ ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ　５ｏｌａｎｉ）　、ヘルミントスボリウム・ グラミネ（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓ　ｏｒｉｕｍ　ｒａｍｉｎｅａｅ）並びにピチ ウム（ｈ血判Ｌ）属およびフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属の種を抑制するこ とができる物質、例えばピロールニドリンやキチナーゼを生産する。従って、Ｏ ＲＦ　Ｓ型またはｌａＡ型遺伝要素により形質転換された細菌株の使用は、環境 上安全で且つ効果的なそれらの病原体の制御方法を提供する。

その上、そのままではＲ，ソラニに対する有効な生物防除剤でない他の菌株、特 にシュードモナス株にそれらの遺伝子活性化配列を伝達し、それによりそれらを 有効な生物防除株に形質転換せしめることができることが証明された。根圏生物 防除株の別の株の生物防除能力を改善するための遺伝子活性化配列の利用も本発 明の一部である。例えば、米国特許第４．４５６．６８４号（Ｗｅｌｌｅｒら） は、真菌ゲマノマイセス・グラミニス（Ｇａｅｍａｎｎｏｍ　ｃｅｓ　ｒａｍｍ ｊｎｉｓ）により引き起こされる小麦の立枯病が、この病原体に対して阻害性の 細菌を小麦種子に種まき前に施用することにより防除され得る場合があることを 開示している。しかしながら、Ｇ、グラミニスの増殖が効果的制御下にある場合 、Ｒ，ソラニが小麦の成長問題病原体となり得る（Ｊ、　Ｃｏｏｋ、私信）。Ｒ ，ソラニに対して効果的である遺伝子の活性化のための遺伝子活性化配列を、立 枯病から小麦を保護するのに目下使用している生物防除株に導入し、それらの有 効性の範囲をＲ。

ソラニを包含するように拡張することができる。

本発明は、ｐｃＩＢ　１３７として寄託された２　ｋｂ断片または配列番号ｌに 示されるＯＲＦ　５配列から本質的に成る単離されたＤＮＡ配列を包含する。そ れらのＤＮＡ配列は細菌株中の潜伏遺伝子活性を活性化することができる。よっ て、本発明は、宿主菌株のゲノム中に該ＤＮ″Ａ配列を導入することを含んで成 る、宿主菌株の潜伏遺伝子活性を活性化する方法にも関する。本発明の好ましい 態様では、宿主菌株はシュードモナス属菌、特にシュードモナス・フルオレッセ ンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）種の株であることが できる。

本発明は更に、細菌調節要素が配列番号１のＤＮＡ配列に作用可能に連結されて いる組換えＤＮＡ配列を含んで成る。細菌調節要素はシュードモナス菌、バシラ ス菌またはＥ、コリから単離された遺伝子からのプロモーターであることができ る。本発明の一態様では、細菌調節要素はＯＲＦ　５の生来のプロモーターであ る。細菌！１ｌｔｌｒＪ要素は、宿主菌株に相同または非相同である遺伝子から のものであることができる。

本発明はまた、本発明の組換えＤＮＡ配列を用いて宿主菌株を形質転換せしめる ことにより宿主菌株中の潜伏遺伝子活性を活性化する方法も包含する。本発明の 特定態様では、形質転換された宿主菌株は、真菌病原体、例えばリゾクトニア・ ソラニ（Ｒｈｊｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ）　、ヘルミントスポリウム・グ ラミネ（肚釦側帥匹皿亘叩幻１匹肋空頌−）並びにピチウム（ｈ帥江Ｌ）属およ びフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属の種に対して活性にされる。

本発明は更に、］　ｅｍＡ遺伝子をコードする単離されたＤＮＡ配列を包含する 。それらの配列は、キチナーゼやゲラチナーゼといった加水分解酵素の生産並び にビロールニドリンやシアニドといった抗真菌性二次代謝産物の生産の機能を欠 く幾つかの変異体において、それらの機能を回復させることができる。本発明は 、細菌調節要素が…ΔのＤＮＡコード配列に作用可能に連結されている組換えＤ ＮＡ配列も更に包含する。細菌調節要素はシュードモナス菌、バシラス菌または Ｅ、コリから単離された遺伝子からのプロモーターであることができる。本発明 の一態様では、細菌調節要素は膠の生来のプロモーターである。細菌調節要素は 宿主菌株に相同または非相同である遺伝子からのものであってもよい。

本発明は、本発明の組換えＤＮＡ配列を用いて宿主菌株を形質転換せしめること により宿主菌株中の潜伏遺伝子活性を活性化する方法も包含する。本発明の特定 態様では、形質転換された宿主菌株は、真菌病原体、例えばリゾクトニア・ソラ ニ（Ｒｈｊｚｏｃｔｏｎｉａ　５ｏｌａｎｉ）、ヘルミントスポリウム・グラミ ネ（血旦罰帥匹皿ｄ町」口虹匣廷）並びにピチウム（ｈ仙且Ｌ）属およびフザリ ウム（ｈ且亘■）属の種に対して活性にされる。

本発明の遺伝子活性化配列の例は寄託されている。従って、遺伝子活性化配列は 寄託されたＤＮＡ配列並びにその断片を包含する。

断片とは、遺伝子活性化配列として機能することができるＤＮＡ配列を意味する 。

■ 本願明細書中で使用する時、次の用語はそのあとに述べられる意味を有する。

プロモーターまたは調節ＤＮＡ配列：タンパク質または他のＤＮＡ産物をコード する連合された構造ＤＮＡ配列の転写、翻訳または発現を助けるか、増強するか 、または他の方法で影響を及ぼす、非翻訳ＤＮＡ配列。プロモーターＤＮＡ配列 は通常は翻訳ＤＮＡ配列の５′末端に置かれ、典型的には翻訳開始部位の５′末 端までの２゜〜１００ヌクレオチドである。

造またはコードＤＮＡ配列・生物中で翻訳または転写されてＲＮＡ、タンパク質 または他のＤＮＡ産物を生成するＤＮＡ配列。

連４される　口　に　さ　る：　「連合された」または「作用可能に連結された 」２つのＤＮＡ配列は、物理的にまたは機能的に関連している。例えば、２配列 が作用可能に連結されているが、あるいは調節ＤＮＡ配列がコードＤＮＡ配列ま たは構造ＤＮＡ配列の発現レベルに影響を及ぼすように位置しているならば、プ ロモーターまたは調節ＤＮＡ配列がＲＮＡまたはタンパク質をコードするＤＮＡ 配列と「連合された」と言われる。

誘ｍ：第一のＤＮＡ配列または断片が第二のＤＮＡ配列または断片から物理的に 単離されるか、または前者が単離用プローブとして後者の一部もしくは全部を使 って単離される場合、前者が後者から「誘導される」と言われる。

１：あるＤＮＡ配列が宿主生物と同様な生物学的分類の生物のゲノムから最初に 単離されたか、または本来それに源を発するならば、そのＤＮＡ配列は宿主生物 （例えば細菌株）に「相同」であると言われる。例えば、形質転換させようとす る宿主生物がシュードモナス・フルオレッセンス種のものである場合、ＤＮＡ配 列がシュードモナス菌の株、特にシュードモナス属の株、特にシュードモナス・ フルオレッセンス種の株に由来するならば、該ＤＮＡ配列は相同である。「非相 同」なる用語は、プロモーターまたは調節ＤＮＡ配列および連合ＤＮＡ配列が異 なる生物学的分類の生物から単離される組換えＤＮＡ配列を指摘するのに用いら れる。

キメラ構　キメラＤＮＡ配　：調節ＤＮＡ配列が連合ＤＮＡ配列の転写または発 現を調節することができるように、調節ＤＮＡ配列またはプロモーターＤＮＡ配 列力＜ｒｎＲＮＡをコードするかまたはりンバク質として発現されるＤＮＡ配列 と連合されているかまたは作用可能に連結されている組換えＤＮＡ配列。キメラ 構成物の調節ＤＮＡ配列は天然に見つかるような連合ＤＮＡ配列には通常作用可 能に連結されない。

ゲノム、「ゲノムノなる用語は生物の生来の全遺伝子内容物を言う。細菌生物の ゲノムは生物の染色体ＤＮＡとプラスミドＤＮＡ内容物の両方を包含することが できる。

ａｆｆｉ　ｉ　（ｔ：ｉＥＭ・宿主中に形質転換されると、天然に存在する宿主 の状態では発現されない（即ち潜伏性）かまたは低レベルで発現される他の遺伝 子を刺激する能力を有する配列。それらの配列は典型的には遺伝子発現を調節す る過程において役割を果たすタンパク質をコードする。

Ｘ皿立血単笠脱肌 ｌＬ：この図面は、変異体２−１のＡＮＴ−表現型を補完することがわかった３ つのニスミドクローンｐＡＮＴ５．　ｐＡＮＴ９およびｐＡＮＴｌｏの制限地図 を示す。この図面中、「Ｂ」は抑１旧制限部位を、「ＥＪはＩ）ＡＮＴ５クロー ンから誘導されたＤＮＡ小断片が変異体２−１並びに野生型９１４および９２２ 株のＡＮＴ−表現型を補完できることを示す。

■ユニこの図面はＥｌｆ断片の構成を示す。この図は同定された５つの転写解読 枠（ＯＲＦ）と種々の酵素制限部位の位置を示す。

旦↓：この図面は、シュードモナス・フルオレッセンス９１５株のクローンｐｃ １８１４６から誘導されたＤＮＡ小断片が変異体ＣＧＰ　２１を補完できること を示す。

光朋！」Ｉセ【藍吸 テキサス棉畑で栽培した綿植物の根からシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐ ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）　９１５株を単離し、ピチウ ム・ウルチマム（Ｐ　ｔｈｉｕｍ　ｕｌｔｉｍｕｍ）とりジフトニア・ソラニ（ Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ　５ｏｌａｎｊ）により誘発される綿の立枯病の効果的 生物制御株として同定した。我々は、細菌生物学的制御株であるシュードモナス ・フルオレッセンス９１５株の成る種の変異誘導体は様々な機能が欠けているか または変更されていることを決定づけた。そのような多面的変異体は、当業者に 公知である突然変異誘発技術（例えばニトロソグアニジン突然変異誘発、トラン スポゾン突然変異誘発）後に単離することができ、または自然に発生することが できる。

化学的変異原ニトロソグアニジンを使った突然変異誘発後に得られる１つのその ような変異体を変異体２−１と命名した。９１５株中にトランスポゾンＴｎＣＩ Ｂ１１６を導入することにより、更に７つの変異体が同定された。それらの変異 体は、植物病原性真菌リゾクトニア・ソラニの増殖を試験管内で阻害できないこ とに基づいて同定することができる。それらは抗真菌性代謝産物ビロールニドリ ンを合成することもできず、そして各々が真菌の増殖を阻害する能力を有するシ アニドも酵素キチナーゼももはや生産することができないＣＶｏｉｓａｒｄ　ら 、ＥＭＢＯＪ、８：３５１−３５８　（１９８９）　；　Ｊｏｎｅｓら、ＥＩＪ ＢＯＪ、５：４６７−４７３　（１９８６））。該変異体のゼラチナーゼ活性を 有する酵素の生産は有意に減少し、それらは変更されたコロニー形態を有する。

多面的変異体の特徴を野生型Ｐ、フルオレッセンス９１５株の対応特徴と比較し た要約を表１に与える。

紅 ゼラチナーゼ　減少 ＋ コロニー形態　円形、完全、凸状　円形、波状、平坦および不透明　および半透 明 リゾクトニア・ソラニの　阻害十− 全部で８つの多面的変異体が同定された。それらは全て表１に記載の表現型を有 し、２つの異なる遺伝クラス、すなわちｍｌＡ遺伝子の導入により９１５表現塁 に回復され得るもの（下の八を参照のこと）と工１の導入により９１５表現型に 回復され得るもの（下のＢを参照のこと）に分かれる。

Ａ、ａｆＡ遺−によるパ・　の　６ 試験管内および温室内生物学的防除アッセイにおいて植物病原体リゾクトニア・ ソラニの増殖を阻害することができない２−１株と命名された変異体および更に ２つの変異体（挿入変異誘発から誘導された）に抗生作用を回復させる能力に基 づいて、Ｐ、フルオレッセンス９１５株の１１キロ塩基のｂＲＩ制限断片（断片 Ｅｌｆと称する）が同定された。Ｐ、フルオレッセンス９１５株の１１キロ塩基 ＥｃｏＲＩ制限断片（断片Ｅｌり、およびσＡ　（ＯＲＦ　５）を含有するこの 断片の２．０ｋｂ　Ｘｈｏｌサブクローンは、９１５株から誘導された１組の多 面的変異体中に接合により導入すると、各々表１に示されるような欠失または変 更機能の全てを回復させた。Ｐ、フルオレッセンス９１４および９２２株中への 断片Ｅｌｌまたは２．Ｏｋｂ　Ｘｈｏｌサブクローンの導入は、意外にも、ビロ ールニドリン、シアニドおよびキチナーゼの合成に関与する潜伏遺伝子の発現を 活性化し、そしてＰ、フルオレッセンス９１４株の場合には、大型、円形、平坦 、半透明、波形の縁を有するものから、小型、円形、凸状、白色不透明、完全な 縁を有するものへと、最少培地上でのコロニー形態に変化を引き起こした。断片 Ｅｌｌまたは２．　Ｏｋｂ　、１１ｇ１サブクローンの導入に関係するそれらの 表現型変化に伴って、植物病原体リゾクトニア・ソラニに対する活性を有する効 果的な生物防除株へのＰ、フルオレッセンス９１４および９２２株の変換が見ら れた。我々は、Ｐ、フルオレッセンス９１４株中へのＯＲＦ　５　（ｍｌＡ）に 相同なエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）遺伝子の導入 がシアニド、キチナーゼおよびビロールニドリンの合成に関与する遺伝子の発現 を活性化することも証明した。この結果は、ｇａｆＡクラスの遺伝子が非相同細 菌株中の潜伏遺伝子の活性化に十分であることを示す。

断片ＥｌｌのＤＮＡ配列分析は、現在まで、５つの転写解読枠並びに１つのｔＲ ＮＡ遺伝子（凹）の同定を可能にした。断片Ｅｌｌ中のそれらの転写解読枠の構 成を図３に描写する。我々が同定した最初の潜在的遺伝子調節要素はＯＲＦ　２ であり、これは細菌二成分調節系の多数のセンサー成分（Ａｌｂｒ４ｇｈｔら、 Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、　２３：３１１−３３６（１９８９）に概 説されている〕との相同性を有した。我々は、紅叩、０ＲＦ３（エシェリキア・ コリの匹■遺伝子に対する相同性を有する）および０ＲＦ４（Ｅ、コリの匡遺伝 子に対する相同性を有する）の構成が、Ｅ、コリゲノムの地図位置４２付近に見 つかる遺伝子構成と同一であることを決定づけた。Ｅ、コリでは、ＯＲＦ　５　 （Ｈ工Ｖと同等の位置に、未知の機能を有する推定上の転写活性化遺伝子が存在 する　ＣＭｏｏｌｅｎａａｒ　ら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１５：４２ ７３−４２８９　（１９８７））。

ＯＲＦ　５　（直）はこの推定上の活性化遺伝子に対して相同性を示す。

更に、断片Ｅｌｆ配列とＧｅｎｂａｎｋデータベースに入っているＤＮＡ配列と の比較は、ＯＲＦ　５がＩａｖｉｌｌｅら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８９：１５６２−１５６６　（１９９２）によってシュー ドモナス・フルオレッセンスＣＨＡＯから単離され提案された転写活性化因子に 対して相当な相同性を有することを明らかにした。よって、２つの転写解読枠Ｏ ＲＦ　２とＯＲＦ　５は、細菌二成分調節系の多数のセンサー成分および活性化 因子成分ＣＡｌｂｒｉｇｈｔら、Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、　２３： ３１１−３３６　（１９８９）に概説されている〕それぞれと有意な相同性を共 有する。

多面的変異体の欠失機能を回復させ且つ非相同のシュードモナス株中の潜伏活性 を活性化する原因となる遺伝子がより小さな制限断片上に単離できるかどうかを 決定する目的で、断片Ｅｌｆを使ってサブクローニング実験を実施する。ＯＲＦ 　５を含む２．　Ｏｋｂ　Ｘｈｃ＋１サブクローンを調製し、同じ＜０ＲＦＩ　 とＯＲＦ　２を含有する３、７ｋｂ瞼Ｒ１−Ｘｂａｌサブクローンも調製する。

２．　Ｇ　ｋｂ　ＸＩＬＱＩサブクローンは、当初断片Ｅｌｆにより補完された 多面的変異体のクラスにおいて欠失機能を回復させそしてＰ、フルオレッセンス ９１４および９２２株中の潜伏遺伝子の発現を活性化するのに十分である。３． ７　ｋｂ　Ｆ、ｗＲｌ　−Ｘｌａｌサブクローンは測定可能な効果がなかった。

更に、ＨｆＡ遺伝子を９１４株からクローニングし、プラスミドｐＬＡＦＲ３に 伝達し、９１４株中に再導入した時、潜伏遺伝子が活性化される。これは、９１ ４株は機能できるπＡ遺伝子を含むけれども、９１４株中での正Ａ遺伝子の発現 はおそらく潜伏遺伝子を活性化するほど十分に高いレベルではないことを示す。

ｍｌＡクラスの転写活性化因子が一般に非相同細菌株中の潜伏遺伝子の発現を活 性化することができるかどうかを決定するために、Ｍｏｏｌｅｎａｒらにより記 載された推定上の転写活性化因子をクローニングし、それをＰ、フルオレッセン ス９１４株中に導入した。幻ばＡによりコードされるものに約６０％相同である タンパク質をコードするＥ。

コリ遺伝子は、Ｐ、フルオレッセンス９１４株中のシアニド、キチナーゼおよび ピロールニドリンの生産に関与する遺伝子の発現を活性化した。

本発明の一観点は、様々な環境単離物中へのＥ３ｉＡクラスの転写活性化因子の 導入後に、改善された生物学的防除株が同定できることである。このアプローチ は、現在利用可能なスクリーニング法のいずれによっても他では選択されないで あろう潜在的に有効な生物防除株の同定方法を意味する。

当業者は、Ｅ３ＵＡクラスの転写活性化因子の調節下に追加の遺伝子を置くこと により、生物学的防除株を改善することができるだろうことにも気づくだろう。

これは、１げＡ応答性プロモーター要素を同定し、そして１または複数の所望の 遺伝子をそのような要素に作用可能に連結した後、そのような遺伝子を所望の株 に導入することにより達成することができる。

本発明の一態様では、ＦＡのＤＮＡ配列から本質的に成る約２ｋｂのＤＮＡ配列 を含んで成る組換えＤＮＡ配列が得られる。このＤＮＡ配列は、潜伏遺伝子活性 を活性化するかまたは他の遺伝子の効能を増強する多面的効果を表す。顔ＡＤＮ Ａ配列の多面的効果には、真菌病原体、例えばリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚ ｏｃｔｏｎｉａ　５ｏｌａｎｉ）、ヘルミントスボリウム・グラミネ（Ｈｅｌｍ ｉｎｔｈｏｓ　ｏｒｉｕｍ　ｒａｍｉｎｅａｅ）並びにピチウム（ｈ止包Ｌ）属 およびフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属の種の増殖を抑制する増加された能力 が含まれる。このＤＮＡ配列は、リゾクトニアに対する効果的な生物防除剤であ る菌株から誘導することができる。好ましくは、該ＤＮＡ配列はシュードモナス ・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の株 から単離されたクローンｐＡＮＴ５から誘導することができる。より好ましくは 、該ＤＮＡ配列はｐＡＮＴ５の約１１　ｋｂのＥｌｌ断片を含んで成ることがで きる。

本発明の特定態様では、該ＤＮＡ配列は約２ｋｂの断片または配列番号ｌのＤＮ Ａ配列から本質的に成る。クローンｐＡＮＴ５はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ 受託番号４０８６８を付与された。ｐＡＮＴ５の１１　ｋｂ　Ｅｌｆ断片を含有 するプラスミドはＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号４０８６９を付与され た。約２ｋｂの０ＲＦ５ＤＮＡ配列は、Ｘｈｏｌでの消化後に２ｋｂ断片として ｐＡＮＴ５のＥｌｌ断片から得ることができる。この断片はｐｃＴＢ１３７と命 名され、ＵＳＤＡ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５ｅｒｖｉ ｃｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、　Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏ ｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ　（ＮＲＲＬ）に寄託された。

本発明の組換えＤＮＡ配列はキメラであることができ、相同または非相同である ことができる。本発明の組換えＤＮＡ配列は、上記の構造ＤＮＡ配列に作用可能 に連結された１または複数の調節ＤＮＡ配列を更に含んでもよい。そのような調 節ＤＮＡ配列としては、プロモーター配列、リーダー配列、および調節ＤＮＡ配 列の発現に影響を及ぼし得る他のＤＮＡ配列、並びにそのような効果を伴って作 用することができる調節ＤＮＡ配列の断片が挙げられる。

Ｂ、　１ｅｍＡ遺−によるパ　体の　６単離された８つの多面的変異体のうち、 ５つはＦＡ遺伝子を有するプラスミドにより補完されない。これは、遺伝子活性 化に少なくとも１つの別の遺伝子座が必要とされることを示す。９１５株の全遺 伝子ライブラリーを接合によりそれらの変異体（例えばＣＧＰ　２１）中に導入 し、野生型形態を取り戻した接合完了体を得た。それらの接合完了体はピロール ニドリン、キチナーゼおよびシアニドも生産した。接合完了体から回復クローン を単離し、特徴づけた。ＩｅｍＡに対して高い相同性を有する遺伝子をコードす る６　ｋｂサブクローンＣＨｒａｂａｋら（１９９２）前掲〕が表現型回復能力 を保持していることが遺伝子は明らかにそれらの多面性変異体において生物防除 表現型をた。このことは、９１４株が不十分なＬＵ八へ現のためにキチナーゼ、 ゼラチナーゼ、ピロールニドリンおよびシアニドを生産しないという主張を裏付 ける。推論として、ｌｅｍＡ発現がキチナーゼ、ゼラチナーゼ、ピロールニドリ ンおよびシアニドの生産を妨げる律速因子であるシュードモナス株においてＩｅ ｍＡは予想通り潜伏遺伝子を活性化するであろう。１ｍＡと機能的に相同の他の 細菌遺伝子もｌｅｍＡと同じ経路で作用することができるだろう。そのような遺 伝子は、上述の頗へクラスの活性化因子をリン酸化することができ従ってそれら を活性化することができる１クラスのセンサー成分遺伝子を含んで成る。このク ラスの構成員は、本明細書中に記載されるような適当なりラスの多面的変異体の 補完により同定および単離することができる。例えば、ｌ■Ｙのリン酸化を招く 対応するＥ、コリ遺伝子がそのような遺伝子の一例である。

明らかに遺伝子活性化配列ｗｉＡおよびｌ　ｅｒｎＡは、シュードモナスの生物 防除表現型に重要な酵素および代謝産物の生産に関与する一連の遺伝子の活性化 において中心的役割を果たしている。

物　７、体　除への遺伝子活　と　列のＪ用本発明の別の態様では、真菌病原体 、例えばりジフトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ　５ｏｌａｎｉ）　、 ヘルミントスポリウム・グラミネ（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓ　ｏｒｉｕｍ　ｒａｍ ｉｎｅａｅ）並びにピチウム（ｈ仙側Ｌ）属およびフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕ ｍ）属の種の増殖を抑制することのできる生物防除剤が提供される。それらの生 物防除剤は、上記の組換えＤＮＡ配列により形質転換された細菌、植物細胞また は動物細胞であることができるが、好ましくは細菌株、より好ましくはグラム陰 性菌株、例えばシュードモナス菌株である。生物防除剤として最も好ましいのは 、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓ ｃｅｎｓ　）種の株である。

本発明の別の態様は、真菌病原体、例えばリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃ ｔｏｎｉａ　５ｏｌａｎｉ）　、ヘルミントスポリウム・グラミネ（Ｈｅｌｍｉ ｎｔｈｏｓ　ｏｒｉｕｍ　ｒａｍｉｎｅａｅ）並びにピチウム（医帥包Ｌ）属お よびフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属の種の増殖を阻害する方法を提供する。

本発明の方法では、真菌病原体の阻害剤として通常は効果的でないかもしれない 細菌株のゲノム中に遺伝子活性化ＤＮＡ配列を導入し、効果的な生物防除株をも たらすことができる。

プラスミドの形のＤＮＡは、接合と呼ばれる有性生殖過程により成る細菌から別 の細菌へ伝達させることができる。接合伝達を行うことのできるプラスミドは、 性腺毛の合成をコードする遺伝子を含有する。性線毛はプラスミド含有細菌（供 与体）を別の細菌（受容体）と連結する中空管であり、そこを通ってプラスミド の複製コピーが供与体から受容体へと運ばれる。この方法は本来自然界に存在し 、成る細菌から別の細菌に遺伝子を伝達する方法として研究室で使われている。

幾つかの細菌株、例えばシュードモナスには、ＤＮＡの接合伝達が好ましい方法 である。何故なら、それらの細菌は外来ＤＮＡにより容易に形質転換されないか らである。

本発明の更に別の態様では、真菌病原体、例えばリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉ ｚｏｃｔｏｎｉａ　５ｏｄａ旧）、ヘルミントスポリウム・グラミネ（Ｈｅｌｍ ｉｎｔｈｏｓ　ｏｒｉｕｍ　ｒａｍｉｎｅａｅ）並びにピチウム牝狙拍朋Ｌ）属 およびフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属の種の増殖を阻害するのに効果的であ る抗生物質の生産方法が提供される。この方法は、本発明の組換えＤＮＡ配列を 生物防除剤のゲノム中に導入して形質転換された生物制御剤を作製し、形質転換 された生物防除剤に抗生物質（例えばピロールニドリン）を生産させ、そして形 質転換された生物防除剤から抗生物質を抽出することを含んで成る。

本発明は、１または複数の形質転換された生物防除菌株を活性成分として使用す る抗真菌性組成物の調製も包含する。本発明は更に、活性成分が本発明の形質転 換された生物防除剤により生産された抗真菌性代謝産物または抗生化合物である 、抗真菌性組成物の調製も包含する。活性成分が生物防除菌株である場合、生物 防除用製剤は細菌株での種子および土壌処理について知られるいずれの方法で適 用してもよい。細菌株は本明細書に記載の１もしくは複数の化合物または化合物 の群と均一に混合することができるが、ただし、そのような化合物は細菌株と適 合性であることを前提とする。本発明はまた、植物の処理方法であって、細菌株 、または細菌株を含有する抗真菌性組成物を植物に施用することを含んで成る方 法にも関する。

本発明の活性成分は、本発明の生物防除剤により生産された抗真菌性代謝産物、 例えば抗生化合物であることもできる。本発明は、抗真菌性代謝産物、例えば抗 生化合物、または該代謝産物を含有する抗真菌性組成物を植物に施用することを 含んで成る、植物の処理方法にも関する。

本発明の活性成分は通常は組成物の形で施用され、処置すべき作物区域または植 物に、他の化合物と同時にまたは連続して、施用することができる。それらの化 合物は肥料もしくは微量栄養素供給物、または植物の生育に影響を与える他の製 剤であることができる。それらは、所望であれば更に製剤技術において常用され る担体、界面活性剤または適用促進助剤と一緒にした、選択的除草剤、殺虫剤、 殺真菌剤、殺菌剤、殺線虫剤、殺軟体動物剤またはそれらの製剤の数種類の混合 物であることもできる。適当な担体および補助剤は固体または液体であることが でき、そして製剤技術において汎用される物質、例えば天然もしくは再生無機質 、溶剤、分散剤、湿潤剤、粘着付与剤、結合剤または肥料に該当する。

本発明の活性成分または少なくとも１種の活性成分を含有する農薬組成物の好ま しい施用方法は葉面散布である。施用の回数および施用量は、対応する病原体（ 真菌の種類）による感染の強度に依存する。しかしながら、植物の病巣に液体組 成物を含浸させることによるかまたは該化合物を固体の形で、例えば顆粒形で土 壌に施用すること（土壌適用）により、活性成分が土壌を経て根から植物に浸透 することもできる（全身作用）。活性成分を含有する液体製剤を種子に含浸させ るか、または固体製剤をそれらに塗布することにより、活性成分を種子に施用（ 塗布）してもよい。特別な場合、他の施用形式が可能であり、例えば、植物の茎 または芽の選択的処理が可能である。

活性成分は未変性の形で使用されるか、または好ましくは製剤の技術分野で常用 される補助剤と一緒に使用され、従って既知の方法で乳化性濃縮物、塗布可能な ペースト、直接噴霧可能なまたは希釈可能な溶液、希釈乳液、湿潤性粉末、可溶 性粉末、微粉、顆粒、更には、例えば高分子物質中の封入物に製剤することでき る。組成物の性質と同様に、施用方法、例えば吹付け、噴霧、散粉、散布または 流し込みは、意図する目的と普及状況に従って選択される。有利な施用量は、通 常１ヘクタール（ｈａ、約２．４７１ニーカー）あたり５０ｇ〜５ｋｇの活性成 分（ａ、ｉ、）、好ましくは１００〜２　ｋｇ　ａ、　ｉ、　／ｈａ。

最も好ましくは２００　ｇ〜５００　ｇ　ａ、　ｉ、　／ｈａである。

活性成分および適当ならば固体または液体補助剤を含有する製剤、組成物または 調製物は、既知の方法で、例えば活性成分を増量剤、例えば溶剤、固形担体およ び適当ならば界面活性化合物（界面活性剤）と均一に混合しそして／または粉砕 することにより、調製される。

適当な溶剤としては、芳香族炭化水素、好ましくは８〜１２個の炭素原子を有す る留分、例えばキシレン混合物または置換ナフタレン、フタレート、例えばジブ チルフタレートもしくはジオクチルフタレート；脂肪族炭化水素、例えばシクロ ヘキサンまたはパラフィン；アルコールおよびグリコール並びにそれらのエーテ ルおよびエステル、例えばエタノール、エチレングリコールモノメチルまたはモ ノエチルエーテル；ケトン、例えばシクロヘキサノン；強極性溶剤、例えばＮ− メチル−２−ピロリドン、ジメチルスルホキシドまたはジメチルホルムアミド； 更にはエポキシ化植物油、例えばエポキシ化ヤシ油または大豆油；あるいは水が 挙げられる。

例えば微粉または分散性粉末に使われる固形担体は、通常、天然鉱物増量剤、例 えば方解石、タルク、カオリン、モンモリロナイトまたはアタパルジャイトであ る。物理的性質を改善するために、高分散性ケイ酸または高分散性吸収ポリマー を添加することも可能である。適当な粒状吸着性担体は多孔質型、例えば軽石、 れんが片、海泡石またはベントナイトであり；適当な非吸着性担体は方解石また は砂のような材料である。加えて、多数の無機または有機性質の粗砕材料、例え ば特にドロマイトまたは微粉砕した植物残渣を使用することができる。

製剤に使用する予定の活性成分の性質に依存して、適当な界面活性化合物は、優 れた乳化性、分散性および湿潤性を有する非イオン性、陽イオン性および／また は陰イオン性界面活性剤である。「界面活性剤」なる用語は界面活性剤の混合物 を包含するものとして解釈されるだろう。

適当な陰イオン性界面活性剤は水溶性石鹸と水溶性合成界面活性化合物の両方で あることができる。

適当な石鹸は、高級脂肪酸（１０〜２２個の炭素原子の鎖）のアルカリ金属塩、 アルカリ土類金属塩または非置換もしくは置換アンモニウム塩であり、例えばオ レイン酸もしくはステアリン酸のナトリウムもしくはカリウム塩、または例えば ヤシ油や獣脂油から得ることができる天然脂肪酸混合物のナトリウムもしくはカ リウム塩である。

脂肪酸のメチルタウリン塩を使用してもよい。

しかしながら、より頻繁には、いわゆる合成界面活性剤、特に脂肪酸スルホネー ト、脂肪酸スルフェート、スルホン化ベンズイミダゾール誘導体またはアルキル アリールスルホネートが使われる。

脂肪酸スルホネートまたはスルフェートは通常アルカリ金属塩、アルカリ土類金 属塩または非置換もしくは置換アンモニウム塩の形であり、そしてアルキル基の アルキル成分も包含する８〜２２個の炭素のアルキル基を有し、例えば、リグノ スルホン酸の、ドデシルスルフェートのまたは天然脂肪酸から得られる脂肪アル コールスルフェートの混合物のナトリウムまたはカルシウム塩である。それらの 化合物は、硫酸エステルの塩および脂肪アルコール／エチレンオキシド付加物の スルホン酸の塩も包含する。スルホン化ベンズイミダゾール誘導体は、好ましく はスルホン酸基２個と８〜２２個の炭素原子を含む脂肪酸基１個を含有する。ア ルキルアリールスルホネートの例は、ドデシルベンゼンスルホン酸、ジブチルナ フタレンスルホン酸、またはナフタレンスルホン酸／ホルムアルデヒド縮合生成 物のナトリウム、カルシウムまたはトリエタノールアミン塩である。

対応するホスフェート、例えば４〜１４モルのエチレンオキシドとｐ−ノニルフ ェノールの付加物のリン酸エステルの塩も適当である。

非イオン性界面活性剤は、好ましくは脂肪族もしくは脂環式アルコールまたは飽 和もしくは不飽和脂肪酸とアルキルフェノールのポリグリコールエーテル誘導体 である。前記誘導体は、３〜３０個のグリコールエーテル基、（脂肪族）炭化水 素成分中の８〜２０個の炭素原子およびアルキルフェノールのアルキル成分中の ６〜１８個の炭素原子を含有する。

更に適当な非イオン性界面活性剤は、ポリプロピレングリコール、エチレンジア ミンプロピレングリコールおよびアルキル鎖中に１〜１０個の炭素原子を含むア ルキルポリプロピレングリコールとポリエチレンオキシドとの水溶性付加物であ る。該付加物は２０〜２５０個のエチレングリコールエーテル基と１０〜１００ 個のプロピレングリコールエーテル基を含有する。それらの化合物は通常プロピ レングリコール単位あたり１〜５のエチレングリコール単位を含む。

非イオン性界面活性剤の代表例は、ノニルフェノールポリエトキシエタノール、 ヒマシ油ポリグリコールエーテル、ポリプロピレン／ポリエチレンオキシド付加 物、トリブチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリエチレングリコール、 およびオクチルフェノキシエトキシエタノールである。ポリオキシエチレンソル ビタンの脂肪酸エステルおよびポリオキシエチレンソルビタントリオレエートも 適当な非イオン性界面活性剤である。

陽イオン性界面活性剤は、好ましくはＮ−置換基として少なくとも１個のＣ１〜 Ｃ／２２アルキル基、および追加の置換基として低級の非置換もしくはハロゲン 化アルキル、ベンジルまたは低級ヒドロキシアルキル基を有する、第四級アンモ ニウム塩である。そのような塩は好ましくはハロゲン化物、メチルスルフェート またはエチルスルフェートの形であり、例えば塩化ステアリルトリメチルアンモ ニウム、または臭化ベンジルジ（２−クロロエチル）エチルアンモニウムである 。

製剤業界で常用される界面活性剤は、例えば、“ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ”　ｓＤ ｅｔｅｒｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ　Ｍａｎｎｕａｌ、”　 ＭＣＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｒｐ。

Ｒｊｎｇｗｏｏｄ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ、１９７９と５ｉｓｅｌｙおよびＷ ｏｏｄ、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａｏｆ　５ｕｒｆａｃｅ　Ａｃｔｉｖｅ　Ａｇ ｅｎｔｓ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、Ｉｎｃ、　Ｎｅ ｗＹｏｒｋ、１９８０中に記載されている。

農薬組成物は、通常約０．１〜約９９％、好ましくは約０．１〜約９５９６、最 も好ましくは約３〜約９０％の活性成分、約１〜約９９．９％、好ましくは約１ 〜約９９％、最も好ましくは約５〜約９５％の固体もしくは液体補助剤、および 約θ〜約２５％、好ましくは約０．１〜約２５％、最も好ましくは約０．１〜約 ２０％の界面活性剤を含有する。

商品は好ましくは濃縮物として製剤されるが、最終使用者は通常は希釈組成物を 使用するだろう。

遺−活　ヒ配列のその他の１１ 本発明の遺伝子活性化配列は、様々な微生物において遺伝子産物および二次代謝 産物の生産を誘導するのに利用することができると考えられる。該活性化配列は 、潜伏性であるかまたは本来低レベルで発現される遺伝子の発現を誘導または増 強することができる。

上述したように、該活性化要素は、生物防除の目的で微生物における抗生物質の 生産に利用される。そのような要素は製薬目的での抗生物質の生産にも有用であ り、特に生合成遺伝子を本来低レベルでしかまたは全く発現しない微生物の株に おける抗生物質の生産にも有用である。このような操作に適当な株の例としては 、テトラサイクリン、エリスロマイシン、クロロマイセチンおよびストレプトマ イシンの生産用のストレプトマイセス株：バシトラシンの生産用のパンラス株： 並びにペニシリン生産用のペニシリウム株が挙げられる。

活性化要素は更に、選択された微生物株中でのビタミン、成長因子およびホルモ ンの生産にも利用される。例として、それぞれアシュヤ（昼匝胆）およびスレブ トマイセス（江坦吐匡匹並）からのビタミンＢ２およびＢ１２の生産；フザリウ ム（Ｆｕｓａｒｊｕｍ）およびジベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）からのジベレ リンの生産；リゾプス（肚江並益）からの１１−α−ヒドロキシプロゲステロン の生産：並びにクルブラリア（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）からのコルチコステロン の生産が挙げられる。

他の用途として、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　）からのブタノ ール、アセトンおよびエタノールの増強生産；サツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒ ｏｍ　ｃｅｓ　）からのグリセロールの生産；ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａ ｃｉｌｌｕｓ　）からの乳酸の生産；リューコノストク（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏ ｃ　）および他の生物からのアルギン酸塩、キサンタン、デキストランといった 多糖の生産；バシラス（国吐旦匹）　、アスベ／ｌ／　−４（ルス（ｂ匹匡■旦 辷）および他の生物からのアミラーゼ、プロテアーゼ、ペクチナーゼ、キチナー ゼ、セルラーゼ、ゼラチナーゼ、コラ−ゲナーゼ、エラスターゼ等といった酵素 および分泌タンパク質の生産；並びにサツカロミセス（抑速■復曳則旦邸−）か らのインベルターゼの生産が挙げられる。

次の実施例は例示目的で与えられ、限定目的ではない。

塞蓋拠 流側１：パ　体の　離および　１補８ 野生型シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕ。

ｅｓｃｅｎｓ）　１ｌｃ−１−３８株（９１５株）を変異原Ｎ−メチル−Ｎ’　 −ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンへの暴露により変異せしめた。栄養寒天上で のＰ、ウルチマムとＲ，ソラニの増殖を阻害する能力について個々の変異体をス クリーニングすることにより、およそ２ダースの抗生作用性変異体が同定された 。それらの大部分は、上記２つの植物病原性真菌のうちの１つに対する抗生物質 活性が減少されているかまたは全く有さないことを示したが、もう１つの真菌の 阻害には影響がなかった。しかしながら、変異体２−１と命名した１つの変異体 は試験真菌の両方に対して抗生物質活性を欠くことがわかった。

それらの結果は、Ｐ、フルオレッセンスｌ１ｃ−１−３８株が、両真菌に対して 効果的である１つの抗生物質を生産するというよりも、１つはＰ、ウルチマムに 対して効果的であり、もう１つはＲ，ソラニに対して効果的である、２つの異な る抗生物質を生産することを強く示した。

親株から単離した全ＤＮＡを部分的５ａｌｌ制限消化し、サイズ分画して２０〜 ３０キロ塩基の断片を得、そして珈Ｉで制限されたベクターｐＶＫ１００　（Ｋ ｎａｕｆら、Ｐｌａｓｍｉｄ　８：４５−５４　（１９８２）　）中に連結せし めることにより、全ＤＮＡの遺伝子ライブラリーを作製した。この遺伝子ライブ ラリーを、　ｔｒａ″″プラスミドｐＲＫ２０１３　（Ｄｉｔｔａら、Ｐｒｏｃ 。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７７：７３４７−７３５１　（１ ９８０）　）を含有するＥ、コリとの三親株接合により抗生作用性変異体２−１ に伝達した。Ｐ、ウルチマムとＲ，ソラニの増殖阻害を測定することにより、ト ランスジェニック接合完了体を抗生物質の生産について試験した。Ｒ，ソラニに 対する抗生物質活性を変異体２−１に回復させたがＰ、ウルチマムに対する抗生 物質活性を回復させなかった３つの重複クローンが同定された。それらのクロー ンの制限地図を決定し、それを図１に示す。

一施Ｊ２・Ｅｌ＋遺伝　弔域の特　づけ変異体２−１における抗生物質生合成の 機能補完に必要な遺伝子領域を、より大きな領域の部分をサブクローニングしそ して抗生作用について変異体２−１を補完するそれらの能力を評価することによ り、限定した（図２）。上記変異を補完することが証明された最小断片は４．９ 　ｋｂ　ｔｔｉｎｄｌｌｒ／１ＥｃｏＲＩ断片であった。これは図２では小断片 ６として示され、小断片Ｈ／Ｅ４．９と命名された。抗生物質代謝産物クローン （ｐＡＮＴ−５と命名）から誘導されサブクローニングされた幾つかのＤＮＡ断 片を、普通はＲ，ソラニに対する抗生物質を生産することができない２つの野生 型Ｐ、フルオレッセンス株１１ｃｍ１−３３（９１４株）と１１−１−６　（９ ２２株）に伝達した。

図２に示される結果は、ｌ１ｋｂのＦｗＲＩ小断片（これは図２に小断片３とし て示され、小断片Ｅｌｌと命名された）が両株にＲ，ソラニ活性抗生作用を付与 することを示した。

３：リゾクトニア・ソラニの 活性な抗生物質化合物は、この抗生物質を生産する形質転換されたＰ、フルオレ ッセンス株の増殖培地から抽出することができる。

これは、培地を８０％アセトンで抽出した後、蒸発によりアセトンを除去し、そ してジエチルエーテルで第二の抽出を行うことにより達成された。ジエチルエー テルを蒸発により除去し、乾燥した抽出物を少量の水に再懸濁した。寒天平板上 に置いた小さい無菌の濾紙ディスクに適用した抗生物質抽出物の少量のアリコー トは、Ｒ，ソラニの増殖を阻害するであろう。これは活性な抗生物質化合物の存 在を示す。該抗生物質はＮＭＲと質量分析によりビロールニドリンであると決定 された。

”　４：　Ｅｌｌおよび２．Ｏｋｂ　Ｘｈｏｌ小　によ　回′される面的　「： 他の細　株　の゛　遺−活　化　るそれらの　の熊万座脱肌 変異体２−１と命名されたＰ、フルオレッセンス９１５株の変異誘導体は、最初 は真菌リゾクトニア・ソラニの増殖を試験管内で阻害する能力の減少に基づいて 単離された。その後ピロールニドリンと同定された抗生物質代謝産物の生産は、 変異体２−１に欠けていた。ピロールニドリン生産の欠失は変異体２−１におい て観察された最初の欠損であったが、追加の実験（詳細については後述する）は 変異体２−１が表１に要約される特徴を有する１クラスの多面性的異体の一員で あることを明らかにする。

ａ　ビロールニドリン生　の Ｐ、フルオレッセンス９１５株と変異体２−１を、Ａ１１ｌＢＥＲＬＩＴＥ　Ｘ ＡＤ−４樹脂（Ｒｏｈｍ　ａｎｄ　Ｈａａｓ）（５％ｖ／ｖ）を含む５０ｒＩＬ ｌの栄養ブロス中で各々の培養物を２８°Ｃで３日間増殖させることにより、ピ ロールニドリン生産について試験した。上記樹脂を篩上で収集し、水で十分に洗 浄した。イソプロパツール（０，５容）での２回の連続抽出により樹脂からピロ ールニドリンを溶出させた。２つの抽出液を合わせ、ロータリーエバポレーター 中で４０°Ｃで真空乾燥した。乾燥材料を２−のイソプロパツールに溶かし、Ｏ ／１００％の出発組成を有し徐々に１００１０９６の最終組成に変化する水／メ タノール混合物から成る移動相を用いて、Ｈｙｐｅｒｓｊｌ　ＯＤＳカラム（直 径２．１　ＥｍＸ　１０ｃｍ）を使ったＨＰＬＣクロマトグラフィーにより更に 分析した。ＨＰＬＣへの注入前に、各抽出物１００μｌを真空乾燥し、同容量の 水／メタノール（５０１５０）中に再懸濁した。カラムから溶出する材料を２１ ２　ｎｍと２５２　ｎｍでの吸光度によりモニタリングし、溶出時間により分画 した。Ｐ、フルオレッセンス９１５株抽出物は、ピロールニドリン標準と同時に 移動しそしてＮＭＲ分光法と質量分析法によりビロールニドリンであると決定さ れたピークを含んだ。変異体２−１および他の同定された多面的変異体はこのピ ークを欠いた。

ｂ　シアニド生産の Ｐ、フルオレッセンス９１５株、変異体２−１および追加の多面的変異体をシア ニド生産について試験した。Ｗｈａｔｍａｎ濾紙片に５■／ｍｌ。

の銅エチルアセトアセテート／クロロホルムと５■／１ｒｄ！の４，４′−メチ レンビス（Ｎ、　Ｎ−ジメチルアニリン）／クロロホルムを含浸させ、次いでク ロロホルムを蒸発させた。次いで、ウェルに９１５株と様々な多面的変異体の培 養物を接種しておいたマイクロタイタープレートのカバーの下に上記濾紙を置い た。プレートをアルミホイルで包み、２８℃で一部インキユベートした。シアニ ドを生産する各培養物のウェルの上では濾紙が青色に変わった。その結果は、９ １５株がシアニドを生産する一方、多面的変異体がシアニドを生産できないこと を示した。

Ｃキチナーゼ化　の Ｐ、フルオレッセンス９１５株と様々な多面的変異体を、２つの方法のいずれか によりキチナーゼ活性の存在について試験した。第一の方法では、各株のＬ−ブ ロス培養物３００ｒＩｄ！を２８℃で１２時間インキュベートした。遠心により 細胞を収集し、２０ｍＭリン酸塩緩衝液（１０ｍＭ　ＮａＪＰＯ＜／１０ｍＭ　 ＫＨ２ＰＯ４）中で１回洗浄した。遠心後、細胞ベレットを５ｒｎＩ！の２００ １Ｍリン酸塩緩衝液中に再懸濁した。Ｂｒａｎｓｏｎ　５ｏｎｉｆｉｅｒのマイ クロチップを使って６０秒間の超音波処理により細胞を溶解させ、そして遠心に より細胞抽出物から細胞砕片を除去した。１ｏＯμｌの細胞抽出物を総容量２５ ０μｌの０．０３Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６，５中で１００μｆの三重水素化 キチン（０，５％ｖ／ｖ　；約０．１　ｍｃｉ／−）と共に３７℃にて１時間イ ンキュベートすることにより、キチナーゼ活性をアッセイした。同容量の２Ｍ　 ＴＣＡの添加により反応を停止させ、次いで遠心した。２００μ！アリコートを 液体シンチレーションカウンター中でカウントし、キチナーゼ活性の結果として 不溶性キチン分子から遊離された可溶性カウントを測定した。表２に与えられる ような典型的な結果は、＃７３６と命名したトランスポゾン変異体（これは多面 的変異体の１クラスの一員であることが証明された）がＰ、フルオレッセンス９ １５株に見られるキチナーゼ活性を欠いていることを示す。

衷Ｉ 抽出物　−々３≦乙上ｌ仝ｔ Ｐ、フルオレッセンス９１５　３２２０５トランスポゾン変異体＃７３６　４３ ６６抽出物なし　４９９３ 第二の方法では、各株の２００μｌ培養物を９６ウエルのマイクロタイタープレ ートのウェル中のＬ−ブロス中で２８℃にて一晩インキユベートした。−晩培養 物を凍結させ、次いで解凍した後、細胞結合であったかもしれない何らかの酵素 を遊離させるために更に使用した。各々の一晩細菌培養物１０μｌと、５０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７，０，１１００Ｉ　ＥＤＴＡ、　０．１％Ｔｒｉｔｏ ｎ　Ｘ−１００，０，１％５ａｒｃｏｓｙｌおよび１０ｍＭβ−メルカプトエタ ノールから成る溶液８０μｌとが入った不透明の黒色マイクロタイタープレート のウェルに、１０１ｔｌｌの０．５ｍＭ４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−Ｎ 、Ｎ’−ジアセチルキトパイオシドを添加した。インキュベーションを３７°Ｃ で３時間行った。マイクロタイタープレートをＴｉｔｅｒｔｅｋ　Ｆｌｕｏｒｏ ｓｃａｎ　ＩＩ蛍光分光光度計上で３５５　ｎｍの励起と４６０　ｎｍの発光で 読むことにより、キチナーゼ活性による蛍光性メチルウンベリフェリル基の遊離 をモニタリングした。

表３に与えられる典型的な結果は、多面的変異体がＰ、フルオレッセンス９１５ 株に見られるキチナーゼ活性を欠いていることを示す。

Ｐ、フルオレッセンス９１５　１３．２多面的変異体　０．６８７ ｄ　ゼラチナーゼ活　の減小 ３％Ｗ／Ｖバクトーゼラチン（Ｄｉｒｃｏ）が補足された栄養寒天平板上で細菌 をインキュベートすることにより、Ｐ、フルオレッセンス９１５株と様々な多面 的変異体誘導体のゼラチナーゼ活性をアッセイした。ゼラチンを加水分解するこ とのできるプロテアーゼを合成し放出するコロニーの周りの寒天中に曇った輪が 形成する。２８°Ｃで２４時間のインキュベーション後の９１５株のコロニーの 周りに優勢な輪が出現した。そのような輪は２４時間の期間内には多面的変異体 のコロニーの周りに出現しなかったが、約４８時間後には出現した。よって、多 面的変異体は完全にはゼラチナーゼ活性を失っておらず、それらは９１５株にお いて２４時間以内に出現するプロテアーゼ種を合成できないか、でなければその ような種の合成および／または放出が遅れる。

ｅ　コロニーン態のヒ 最少増殖培地上で、Ｐ、フルオレッセンス９１５株は、完全な縁を有する小さい 円形の凸状の白色不透明のコロニーを形成した。調べた全ての多面的変異体は、 波状の縁を有する大きい円形の平坦な半透明のコロニーを形成した。

ｊ５：１１キロ　基　Ｅｌｆ　の 図３は、ＤＮＡ配列分析から現在までに決定されたＩＩキロ塩基断片Ｅｌｌの遺 伝子構成を描写する。断片Ｅｌｆを様々な制限エンドヌクレアーゼで単独でまた は組み合わせて消化し、次いで適当なりローニングベクター、例えばｐＢＳ　Ｓ Ｋ”　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と連結せしめることにより、ジデオキシ配列決 定反応用の二本鎖鋳型として、断片Ｅｌｌの様々なサブクローンを調製した。連 続ＤＮＡ配列の領域が生じた時、それらを既知の細菌遺伝子コード領域との相同 性についてＧｅｎＢａｎｋデータベース中に入っている配列と比較した。この分 析は、今までのところ図３に描写されるような断片Ｅｌｌの遺伝子構成の割り当 てに至った。ＯＲＦ　Ｉは、Ｅ、コリのｃｈｅＲ遺伝子およびミクソコツカス・ サンサス（Ｍ　ｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ）のｆｒｚＦ遺伝子との相当 な相同性を有する。Ｅ、コリ中のニは走化性応答の媒介に関与するメチルトラン スフェラーゼ活性を有しくＳｐｒｉｎｇｅｒおよびＫｏｓｈｌａｎｄ。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４：５３３−５３７ 　）　、そして丘」はＭ、サンサス（Ｍ、　ｚａｎｔｈｕｓ）中で同様な機能を 有すると思われる（ＭｃＣｌｅａｒｙら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１７２：４ ８７７−４８８７　（１９９０））　、　ＯＲＦ　２は、いわゆる細菌二成分調 節配列（Ａｌｂｒｉｇｈｔら、１９８９　；　Ｂｏｕｒｒｅ、ｔら、１９９１　 ；およびＭｅｋａｌａｎｏｓ、　１９９２）のセンサー成分をコードする多数の 遺伝子との相当な相同性を有する。その他の細菌センサー成分遺伝子の例として は、Ｅ、コリのｃｈｅＡ、Ｅ、コリのｒｃｓＣ、ミクソコツカス°ザンサスＯＪ 　ｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ）　ｑ匡ｄおよびボルデテラ・ベルツッシ ス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｅｒｔｕｓｓｉｓ）の城■が挙げられる。Ｐ。

フルオレッセンス９１５株の血ｔＲＮＡ遺伝子は、Ｅ、コリの血ｔＲＮＡ遺伝子 座と１００９６相同である。ＯＲＦ　３は、ホスファチジルグリセロホスフェー ト（リン脂質の代謝に関係する酵素である）をコードすケ筺仏遺伝子ＣＧｏｐａ ｌａｋｒｉｓｈｎａｎら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、’　Ｃｈｅｍ、２６１：１３２９−１ ３３８　（１９８６）　）との相同な相同性を有する。ＯＲＦ　４は、紫外光損 傷修復エクシヌクレアーゼの一成分をコードするＥ、コリのｕｖｒＣ遺伝子Ｃ３ ｈａｒｍａら、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１４：２３０１−２３１８　 （１９８６））とのかなりの相同性を有する。

断片Ｅｌｌの遺伝子活性化２．Ｏｋｂχｈｏｌサブクローン上に存在するＯＲＦ 　５は、細菌二成分調節配列の転写活性化因子成分をコードする多数の遺伝子と の相当な相同性を有する。特に、ＯＲＦ　５はシュードモナス・フルオレッセン スＣ１１ＡＯの註妨遺伝子（Ｌａｖｉｌｌｅら、１９９２）およびＥ、コリのｕ ｖｒ−２３遺伝子（Ｍｏｏｌｅｎｅａｒら、１９８７）と非常に類似している。

ＯＲＦ　５との配列相同性を有する幾つかの他の細菌の転写活性化因子遺伝子の 例として、バシラス・サブチリス（ＢａｃｉｌｌｕｓＳｕｂｔｉｌｉｓ）の旦」 、ボルデテラ・ベルツツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ匹且益旦Ｌ）の戚Ｃ１およ びシュードモナス・エルジノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕ　１ｎｏ ｓａ）の紅鱈が挙げられる。ＯＲＦ　５の全コード領域は配列番号１として与え られる。図３に描写された最も左側のＥｃｏＲ１部位と内部のＨｉｎｄＩＩＩ部 位により括られた断片Ｅｌｆの５．６キロ塩基部分の全配列は配列番号２として 与えられる。配列番号２に含まれる転写解読枠の座標は次の通りである：ＯＲＦ 　１　：　２１０−１６８８　、左から右に転写されるＯＲＦ　２　：　１９０ ６−３６３３　；左から右に転写される７　：　４６１６−４６９１　；右から 左に転写されるＯＲＦ　３　：　４７３１−５３１８　、右から左に転写される ＯＲＦ　５を含有する断片Ｅｌｆの２．Ｏｋｂ　Ｘｈｏｌサブクローンがシュー ドモナス株中の潜伏遺伝子発現を活性化するという結果と、ＯＲＦ　５に相同で あるＥ、コリのｕｒｖ−２３遺伝子が潜伏シュードモナス遺伝子発現を活性化で きるという結果を合わせると、ＯＲＦ　Ｓクラスの転写活性化因子が潜伏細菌遺 伝子の発現を活性化する意外な能力を有することが示される。

、施ｌＪ６：２ｋｂ　のクローニング 生物制御シュードモナス株９１５からＮ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−二トロソ グアニジン処理後に変異株２−１を誘導した。それは最初に真菌リゾクトニア・ ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ　５ｏｌａｎｉ）とピチウム・ウルチマム（Ｐ 　ｔｈｉｕｍ　ｕｌｔｉｍｕｍ）の増殖を試験管内で阻害できないことに基づい て同定された。更なる特徴づけは、この株がピロールニドリン、キチナーゼおよ びシアニド生産を含む多数の活性の発現にも欠損があることを明らかにした。加 えて、変異体２−１は形悪学的にも９１５株から識別可能であった。合成培地Ｌ ＭＧ（０，１％ＫＨ。

ＰＯ，、０，１％　ＮａｚＨＰＯ，、０，１χＮａＣ］、　０．４％（ＮＨＪ） ２Ｓ０４．０．０２％グルコース、０．６６％ＭｇＳＯ４および１．６％寒天） を含む寒天平板上で、野生型親株（９１５株）は完全な縁を有する小さい円形の 凸状の白色不透明のコロニーを形成した。変異体２−１は波状の縁を有する大き い円形の平坦な半透明のコロニーを形成した。

ＯＲＦ　５を含む約２ｋｂのＸｈｏｌ断片を広域宿主プラスミドｐＶＫ１００（ Ｋｎａｕｆ　ら（１９８２）、　Ｐｌａｓｍｉｄ　８：４５−５４）中にクロー ニングしてプラスミドｐｃＩＢ１３７を得た。

７　：　２　ｋｂ　Ｘｈｏｌ断の ＯＲＦ　５配列とＧｅｎＢａｎｋデータベース中のＤＮＡ配列との比較は、既知 の細菌二成分調節系中の多数の転写活性化因子遺伝子との相当な相同性を明らか にした。特に、ＯＲＦ　５はシュードモナス・フルオレッセンスＣＨＡＯの肢薊 遺伝子およびＥ、コリのｕｖｒ−２３遺伝子に非常に類似している。ＯＲＦ　５ は、Ｘｈｏｌ制限部位により限定された約２ｋｂの領域の中に完全に位置する。

この約２　ｋｂ　珈１断片を広域宿主プラスミドｐＶＫＩｏＯＣＫｎａｕｆら（ １９８２）、　Ｐｌａｓｍｉｄ　８：４５−５４）中にクローニングしてプラス ミドｐＣＩ１１１３７を得た。ｐｃＩＢ１３７は、１９９２年６月２４日に６１ ６０４イリノイ州ベオリア市のノースユニノく−シテイ通り１８１５番にあるＵ ＳＤＡ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５ｅｒｖｉｃｅ　Ｃｕ １ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ　（ＮＲＲＬ）　ｌこ寄託され、受託番号　を付与 された。

ｐｃＩＢ１３７を形質転換によりＥ、−１り宿主株５１７−１　ＣＳｉｍｏｎら 、（１９８３）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｌニア８４−７９１）中に導入 した。次いでそれを接合により２−１株中に伝達した。５１７−１（１）Ｃ］８ １３７）と２−１株の新鮮な一晩培養物をＬ寒天平板上で混合しく各５０μｍ） 、２８°Ｃで一晩インキユベートした。次いで接合混合物からのループ状細菌を 、１５μｇ／ＴＬＩテトラサイクリンを含むＬＭＧ寒天寒天液線し、更に２８° Ｃでインキュベートした。テトラサイクリン耐性コロニーを精製し、ｐｃｉ８１ ３７の存在について調べた。１）ＣＩＢＩ３７を含む２−１株の接合完了体は、 ビロールニドリン、キチナーゼおよびシアニドを生産することが証明された。そ れらは９１５株の形態も示した。

天然のシュードモナス単離体９１４株および９２２株は検出可能なレベルのピロ ールニドリン、キチナーゼまたはシアニドを生産しない。

それらはＬＭＧ寒天寒天液形の縁を有する大きな円形の平坦な半透明のコロニー を形成した。実施例２に記載したような接合によりそれらの株にｐｃＩＢ１３７ を導入した。ｐｃＩＢ１３７を含む９１４株の接合完了体は、ピロールニドリン 、キチナーゼおよびシアニドを生産することが示された。それらはシュードモナ ス９１５株の形態を示した。

１）ＣＩＢ１３７を含む９２２株の接合完了体も、ピロールニドリン、キチナー ゼおよびシアニドを生産することが示されたが、形態の変化は示さなかった。よ って、リゾクトニア・ソラニの試験管内または生体内阻害において効果がないシ ュードモナス・フルオレッセンス株（例えば９１４株と９２２株）中へのｐｃＩ Ｂ１３７の導入は、意外にも、以前は不活性で検出されなかったキチナーゼ、シ アニドおよびビロールニドリン遺伝子の発現を活性化することがわかった。また 、９１４株の場合には、断片Ｅｌｌの導入が、意外にもＰ、フルオレッセンス９ １５株について表１に列挙したものと非常に類似した形態へのコロニー形態の変 化を引き起こした。

８：遣−−ヒには８全なＯＲＦ　５が八　であるＤＮＡ配列分析は、ＯＲＦ　５ の中に７２　ｂｐ離れて２つのＮａｅ　Ｉ認識部位が存在することを示した。介 在ＤＮＡの除去は推定遺伝子産物を２４アミノ酸縮小させ、これは該遺伝子産物 を非機能的にするであろう。２　ｋｂ　１ｊＩＨＩ断片をプラスミドｐＳＰ７２ 　（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＸｈｕ１部位中にクローニングした。ｐｃ］Ｂ１３８と 命名された生成構成物は、ＯＲＦ　５の中の２個を除いて他のＮａｅ１部位を１ つも含まない。ｍｌでｐｃｉ８１３８ＤＮＡを消化した後、３０　ｎｇ／μｌの 濃度で連結し、そしてＥ、コリ５１７−１株中に形質転換せしめ、所望の７２　 ｂｐ欠失を含むｐｃＩＢ１５０を作製した。この欠失の存在をＤＮＡ配列分析に より確認した。

ｐｃｌＢ１５０からのＯＲＦ　５含有側１断片を１）ＶＫ１００中にクローニン グしてｐｃＩＢ１４９を作製した。Ｉ）ＣＩＢ１４９は、７２　ｂｐのＤＮＡの 欠失の他は１）ＣＩ８１３７と同じである。ｐｃｉ８１４９を実施例５に記載し たような接合により９１４株と９２２株に導入した時、ピロールニドリン、キチ ナーゼまたはシアニド生産は検出されなかった。よって、菌株中での遺伝子活性 化には完全なＯＲＦ　５が必要である。

９・遺−置 次の遺伝子置換実験により、９１５株中での遺伝子調節に対するＯＲＦ　５の効 果を証明した。断片Ｅｌｌの右６．８ｋｂ（最も右側のＥｍＲ１部位とｆｌａｘ 旧により挟まれた部分、図３参照）をｐＢＲ３２２（ＢｃｏＲＩ　とＢａｍＨｌ で消化したもの）中にクローニングしてｐＢＲＢ８６．８を作製した。

飾Ｉでの消化によりｐＢＲＥ８６．８からＯＲＦ　５を含む２ｋｂ縛Ｗ１断片を 除去し、次いで自己連結せしめてＩ）ＣＩＢＩ３９を作製した。ｐｃＩＢ１３９ 中のＨｉｎｄＩ［［と顆Ｉにより挟まれたテトラサイクリン耐性領域をＴｎ５か らのＨｉｎｄｌｌＩ−３ａｌｌ力ナマイシン耐性断片で置換することにより、カ ナマイシン耐性マーカーをｐｃＩＢ１３９に導入した。得られたプラスミドｐｃ ＩＢＩ５４の中にｐｃ１８１５０からの２　ｋｂ珈■断片（７２ｂｐぬＣ欠失を 有する）を導入してｐｃＩＢ１５６を作製した。このプラスミドをエシェリキア ・コリ５１７−１株Ｃ３ｉｍｏｎら（１９８１）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 　ｌニア８４−７９１）中に形質転換せしめ、次いで接合により９１５株中に導 入し、カナマイシン耐性について選択した。ｐｃＩ８１５６は９１５株中で自律 的に維持することができないので、該プラスミドおよびそれのカナマイシン耐性 決定因子を含んだカナマイシン耐性接合完了体は染色体中に組み込まれた。最も 頻繁な組み込み現象は、２　ｋｂ　Ｘｈｏｌ断片とその周囲の配列により提供さ れる相同性領域の所での相同組換えにより起こった。そのような接合完了体は、 ２コピーの２ｋｂ　Ｘｈｏｌ領域（１つは野生型のものでもう１つは７２　ｂｐ 　Ｎａｅｌ欠失を有するもの）を含んだ。そのような重複は堪能な相同組換え系 を有する細菌中では不安定であり、それらの形成に好ましい選択的条件を取り除 くと検出可能な頻度で自然に消失する。１つのそのような接合完了体をカナマイ シン選択なしで液体培地中で培養し、次いで再びカナマイシン選択なしで固形寒 天培地上に筒布して個々のコロニーを得た。個々のコロニーをカナマイシン感受 性について試験した。そのようなコロニーは全体の約２％で得られた。それらの カナマイシン感受性コロニーは２つの形態クラス、すなわち一方は野生型に似て いるもので他方は多面的変異体に似ているもの、に分かれる。サザンハイプリダ イゼーション結果は、両方のクラスのコロニーが組み込み型プラスミドを失って おり、そして野生型形態を有するクラスが完全な２ｋｂ　Ｘｈｏｌ領域を含み、 他方のクラスが７２　ｂｐ　Ｎａｅｌ欠失を有するものに相当する小さい伽１領 域を含むことを確証した。前者のクラスのコロニーは９１５株と同一であった。

後者のクラスのコロニーは、ＯＲＦ　Ｓ中の７２　ｂｐ　Ｎａｅｌ欠失を除いて ９１５株と同一であった。それらの９１５株の誘導体はもはやピロールニドリン 、キチナーゼまたはシアニドを生産しない。よって、９１５株中での遺伝子活性 化には完全なＯＲＦ　５が必要である。

次の証拠は、２　ｋｂ　飾１断片中にＯＲＦ　５の転写を指令するプロモーター 要素が見つかるらしいことを示す。ｐｃ１８１３７中に見られるものとは反対の 方向で２ｋｂ挿入断片を有する、２　ｋｂ　飾１断片を含有する広域宿主プラス ミドｐＶＫ１００の変形を単離した。このプラスミドをｐｃ］ＢＩ５］　と命名 した。多面的変異体中およびＰ、フル才レツセンス９１４株中へのｐｃＩＢ１５ １の導入は遺伝子発現を活性化した。各方向において遺伝子発現を活性化する２ 　ｋｂ　Ｘｈａｌ断片の能力、および上述したような遺伝子活性化への機能的Ｏ ＲＦ　５遺伝子産物の必要条件から、おそら＜０ＲＦ５の転写が２ｋｂ挿入断片 中に置かれたプロモーターの存在に頼っているらしいと考えられる。更に、Ｍｏ ｏｌｅｎａｒら（１９８７）は、ＯＲＦ　５に関連するＥ、コリのｕｒｖ−２３ 遺伝子の転、写を指令するプロモーターを同定している。このプロモーターはｕ ｒｖ−２３構造遺伝子の上流の最初の１００塩基対の中に含まれていた。ＯＲＦ 　５の上流のほとんど同じ位置に、我々はＲｏｓｅｎｂｅｒｇおよびＣｏｕｒｔ 、　Ａｎｎｕ。

Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、　１３：３１９−３５３　（１９７９）により記載され たシグマ−７０プロモ一ター共通配列に似ている配列ＴＴＧＴＣＡ−１７ｂｐ− ＴＴＴＴＴＴを同定した。

ＯＲＦ　５構造遺伝子、上記の可能なプロモーター領域、およびＯＲＦ　４（こ れはＥ、コリの■匹に相同である）の５′末端を含む９８３塩基対領域の配列を 配列番号３に与える。配列番号３の中のそれらの要素の座標は次の通りである： プロモーター相同性を有する配列二２３−５１０ＲＦ　５構造遺伝子：　９９− ７４００ＲＦ４（皿匹）の５′末端：　７４３−９８３０ＲＦ　５をＰ、フルオ レッセンスの多面的変異体誘導体中またはＰ。

フルオレッセンス９１４株と９２２株中に導入した時、２　ｋｂ　４１断片にと って生来であるプロモーターがＯＲＦ　５の転写を指令したらしい。

しかしながら、成る種の菌株中でＯＲＦ　Ｓクラスの転写活性化因子を発現させ るためには、ＯＲＦ　Ｓクラス構造遺伝子を、所望の宿主菌属においてより一層 効率的に潜伏遺伝子を活性化する機能をするプロモーターおよび／またはリポソ ーム結合部位と作用可能に連結させることが有益かもしれないと当業者は考える だろう。例えば、０ＲＦＳクラスの遺伝子を使ってバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ）種において潜伏遺伝子を活性化するために、ＯＲＦ　Ｓクラスの遺伝子をバシ ラス調節領域に作用可能に連結せしめることができる。そのような調節領域は当 業者に容易に入手可能である。細菌調節配列とＯＲＦ　Ｓクラスの構造遺伝子と の融合を達成するための１つの可能な方法は、重複伸長ポリメラーゼ連鎖反応法 （Ｈｏｒｔｏｎら、Ｇｅｎｅ　７７：６１）の利用を包含する。

施１１　：　ＯＲＦ　５遺−の ａ、　０ＲＦ５コード領域は、細菌転写活性化因子の特徴を有する２１３アミノ 酸タンパク質をコードすることができる。例えば、Ａｌｂｒｉｇｈｔら（１９８ ９）により概説された転写調節因子のドメインｌおよび２とＯＲＦ　５の中の同 等領域との間には強い相同性がある。該タンパク質の５４位の推定アスパラギン 酸残基は、このクラスの他の転写活性化因子の保存されたアスパラギン酸残基と 一列に並ぶ。センサー成分タンパク質との相互作用により典型的にリン酸化され るのは、この位置のアスパラギン酸である。ＯＲＦ　５とＥ、コリのｕｒｖ−２ ３およびＰ。

フルオレッセンスＣＨＡＯの肢已との整列は、ＯＲＦ　５がＡＴＧやＧＴＧ開始 コドンよりも効率的でない稀な翻訳開始コドンＴＴＧを含むという結論を導く。

ＯＲＦ　５のアミノ酸位置４９のところにアスパラギン酸残基が存在し、一方で …ａの同等位置にはチロシン残基が存在することは全く価値がない。アグロバク テリウム・ツメファシェンス（Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉ ｅｎｓ）転写活性化因子である虱では、保存されたリン酸化部位の近くのアスパ ラギンからアスパラギン酸への置換が、ｖｉｒＧをおそらくセンサー成分による リン酸化をもはや必要としない構成的転写活性化因子に変換した。我々のＯＲＦ 　５はチロシンからアスパラギン酸への置換から見てそのような構成的活性化因 子であるかもしれない。

ｂ、上述したように、ＯＲＦ　５の転写を指令するプロモーターはお１７２：５ ５９３−５６０１　（１９９０）が別のシュードモナスプロモーターについて行 ったように、例えばＳ１ヌクレアーゼマツピング（Ａｉｂａら、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５６：１１９０５−１１９１０　（１９８１））と プライマー伸長マツピング（ＤｅｂａｒｂｏｕｉｌｌｅおよびＲａ１ｂａｕｄ、 　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５３：１２２１−１２２７（１９８３））の組 合せにより、このプロモーターの位置をマツピングすることが可能である。−変 位置決定されれば、所望であればこのプロモーターを含むＤＮＡ断片を、適当な りＮＡ制限断片の連結かまたはＨｏｒｔｏｎらの重複伸長プライマー伸長法のい ずれかにより、０ＲＦＳクラスの活性化因子に作用可能に連結することができる 。

Ｃ０細菌調節要素は、市販のベクター、当業界で既知の細菌調節要素、無プロモ ーターマーカー含有トランスポゾンを使って同定された細菌調節要素、またはｐ ＫＫ１７５−６やｐＫＫ２３２−８　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ。

Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）のようなプロモーター選択ベクターなどの様々 な源から得ることができる。商業的に入手可能な細菌調節要素は、多数の源、例 えばプラスミド発現ベクターｐＫＫ２３３−２．　ｐＤＲ５４０，ｐＤＲ７２０ ゜ｐＹＥＪＯＯｌ、　ｐＰＬ−ｉａｍｂｄａ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）またはｐ ＧＥＭＥＸ発現ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ、　Ｍａｄｉｓｏｎ、 　Ｗりから入手可能である。当業界で既知の細菌調節要素としては、プロモータ ー、エンハンサー、リポソーム結合部位および／または連合したコードＤＮＡ配 列の他の調節割面機構として機能することが知られている任意の細菌調節要素が 挙げられる。連合コードＤＮＡ配列は該調節要素に隣接しているかまたは３′に 連結しており、且つ転写および翻訳されるとタンパク質をコードするＤＮＡ配列 である。適当な細菌要素としては、Ｄｅｒｅｔｉｃ　ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ ｌｏｇｙ　７：１２４９−１２５４　（１９８９）　；　Ｄｅｕｓｃｈｌｅら、 ＥＭＢＯＪ、　５：２９８７−２９９４　（１９８６）　；　Ｈａｗｌｅｙおよ びＭｃＣｌｕｒｅ、　ＮｕｃｌｅｊｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、ＩＩ：２２３７−２ ２５５　（１９８３）　；　ＲｏｓｅｎｂｅｒｇおよびＣ０Ｕｒｔ、　Ａｎｎｕ 。

Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、１３：３１９−３５３　（１９７９）並びにそれらの中 に引用された参考文献のものが挙げられる。同様に、グラム陽性微生物、例えば バシラス種に使用されるプロモーターも、当業者に容易に入手可能である。上記 のいずれも標準ＤＮＡ合成技術を使って合成することができる。細菌調節要素は 、異なる種からの調節要素の一部分の混合物を含んで成るハイブリッド調節領域 も包含する。例えば、Ｅ、コリのトリプトファンオペロンプロモーターの一３５ 領域とＥ、コリの脆オペロンプロモーターの一１０領域とを組み合わせたｐＫＫ ２３２−２（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ）の江νｌａｃ　（ｔｒ旦）プロモーターは 、′シュードモナス中で効率的に機能するＣＢａｇｄａｓａｒｉａｎら、Ｇｅｎ ｅ　２６：２７３−２８２　（１９８３））。

成る種の細菌プロモーターは様々な菌属において効率的に機能する能力を有する 。例えば、広域宿主プラスミドＲＳＦＩＯＩＯ上の選択マーカー用プロモーター は、少なくとも次の菌属において機能することが知られている：アセトバクター （紅担回瓜ハ虹）　、アクチッパシラスＱ信ｊ切耶ユ■旺）、エロバクター（妬 皿匣は扛）、エロモナス（加■旦阻ｕ）、アグロバクテリウム（舷匹崩以」ユ照 ）、アルカリゲネス（Ｍｊ上戊江邸）、アゾトバクタ−（ｂ似函凍Ｊ虹）、アゾ スピリルム（７旦叩）、カラロバフタ−（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）、デスルホ ビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）　、エルウィニア（打栢且組）、エシ ェリキア（詠仙肛■±組）、グルコノバクタ−（叶匹邸函凍Ｊ江）、ハイポミク ロビウム（逝卯４μｍｏｂｉｕｎ＋）　、クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ）　、メチロフィルス（Ｍｅｔｈ　ｌｏ　ｈｉｌｕｓ）　、モラクセラ（Ｍｏｒ ａｘｅｌｌａ）　、パラコツカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）　、プロテウス（Ｐ ｒｏｔｅｕｓ）　、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）　、リゾビウム （Ｒｈｉｚｏｂｉｕｔｎ）　、ｏトバクタ−（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅ　、セラチ ア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）　、ザントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）　、ビブ リオ（■−リ、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）およびザイモモナス（釘厘旦■ 封）ＣＭｏｒａｌｅｓ　ら、１９９０　：　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ：　Ｂｉｏ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ、Ｐａｔｈｏ−ｇｅｎｅｓｉｓ、　ａｎｄ　Ｅ ｖｏｌｖｉｎｇ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、（Ｓｉｌｖｅｒ、　Ｃｈａｋｒ ａｂａｒｔｙ。

ＩｇｌｅｗｓｋｉおよびＫａｐｌａｎ編）第２２９〜２４１頁〕。

施　１２トランスジエニ・・り　の化 ９１４株および９２２株のｐＣＩＢ１３７含有接合完了体の生物防除力をそれら の天然の親と比較した。細菌培養物をルリアブロス中で２８℃にて一晩増殖させ た。遠心により細胞をベレット化し、次いで６００　ｎｍで２．５の光学濃度（ 約２×１０１コロニー形成単位／ｍｌ）になるように無菌蒸留水に再懸濁した。

リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ）をオートクレー ブ処理したキビ上で培養し、次いで乾燥し、粉末に粉砕した。等置部の鉢植え用 土（Ｍｅｔｒｏ−ｍｉｘ　３６０　）　、砂およびバーミキュライトを混合する ことにより土壌を調製した。これを使って直径１５ｃｍの鉢を満たした。各錘の 周辺に全長３０ａｎの長さを有する深さ２−の円形の溝を掘った。各溝に１０粒 の綿実（Ｓｔｏｎｅｖｉｌｌｅ５０６）を入れた。Ｒ，ソラニに感染したキビ粉 末を１００■／鉢の割合でこの溝の中の綿実の上に平等にふりかけ、次いで各錘 につき２〇−の細菌懸濁液を散布した。無菌の対照には細菌懸濁液の代わりに水 を加えた。各処理は、Ｉ処理あたり合計４０種子に対して４つの複製鉢から成っ た。２６／２１°Ｃの昼／夜温度設定で環境制御された室内において植物を成育 させた。１０日後に病気の重さについて植物を観察した。その結果（表４）は、 ９１４株と９２２株は全く病害防除を提供しないが、それらのｐｃｉ８３１７含 有接合完了体は綿においてＲ，ソラニの良好な防除を提供したことを明らかに示 す。

紅 （１０ＤＡＰ’作物） ’ＩｊＪＬ　Ｒ１医ルＲｇ４Ｒｇ４　王曵麗土盗肱除１ＮＰ、ＮＴ’　９　１０ 　９　９　９．２５　１００．０Ｐ、ＮＴｃ０　２　１　１　１．００　０．０ ９１４　３　０　３　１　１．７５　９．ス９１４（ｌｌｃＩＢＩ４９）　０　 １　０　２　０．７５　−３．０９１４（＋）ＣＩＢ１３７）　５　４　５　７ 　５．２５　５１．５９２２　１　１　１　Ｌｌ、５０　６．１９２２（１）Ｃ ＩＢ１３７）　８　１０　７　６　７．７５　８１．８１＝未感染対照を１００ ％生物防除と指定し：感染対照を０％生物防除　御と指定する ａ＝種まき後の日数 ｂ＝病原体なし、処理なしく未感染対照）Ｃ＝病原体あり、処理なしく感染対照 ）Ｊ１３：シュードモナス・フルオレ・・センス９１４　か゛　さたａｆＡ遣− の　重コピーは９１４　の′　遺−の　活　ヒ断片を標識し、そしてＸｈｏｌで 消化されたＰ、フルオレッセンス９１４株からの全ゲノムＤＮＡとハイブリダイ ズせしめた。該プローブにハイブリダイズした９１４株からの２．０　ｋｂ　Ｍ 匿１断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ“中にクロニングし、ＤＮＡ配列決定を 行って該クローンが肢■同族体を含むことを確認した。９１４株中の眩皿同族体 のＤＮＡ配列を表５に与える。９１４株の一同族体は９つのヌクレオチド位置で ９１５株の口と異なるが、それらのヌクレオチド相違のうちの１っだけが両タン パク質中のアミノ酸の相違を生むと推定される（アミノ酸残基１８２は９１５株 のＧａｆＡタンパク質ではスレオニンであり、９１４株のＧａｆＡタンパク質で はイソロイシンである）。９１４株の肢皿遺伝子を広域宿主プラスミドｐＶＫ１ ００中にサブクローニングし、得られた組換えプラスミドを接合により９１４株 に導入した。９１４株中の単一の染色体計り遺伝子の発現はピロールニドリン、 キチナーゼおよびシアニドの合成に必要な遺伝子の発現を活性化することができ なかったが、９１４株の胆ｕ遺伝子の多重プラスミドコピーを含有する９１４株 誘導体はピロールニドリン、キチナーゼおよびシアニドを合成した。

表呈 ｐｃＩＩ１３３４１からの凹転写解読枠６０１７刀ＣｘＯχｆτに３ニスα石ａ ロ０刀０ンσ０ズンｉＧｒ＋ズ工テＧＡ−１４：　Ｅ、コリのｕｖｒ−２３遺− った゛　−の囮 Ｅ、コリにおいてはまだそれに既知の機能が当てられていないけれども、Ｅ、コ リの藍二益遺伝子（ｕｔｘｉとも称する）は細菌転写活性化因子の１クラスの一 員であるらしい。ポリメラーゼ連鎖反応（ＭｕｌｌｉｓおよびＦａｌｏｏｎａ、 　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１５５：　３３５−３５０（ １９８７））により広く利用可能なＥ、コリに１２株のＡＢ１１５７ゲノムの約 １．１ｋｂ部分を増幅させることにより、ｕｖｒ−２３遺伝子を含むＤＮＡ断片 を得た。このポリメラーゼ連鎖反応用のプライマーは発表されたｕｖｒ−２３配 列（Ｓｈａｒｍａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１４：２３０１ −２３１８　（１９８６））に基づいて調製した。ＰＣＲキット製造業者（Ｐｅ ｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）により提供された反応緩衝液中に４種のデ オキシリボヌクレオチド（ｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ　 、各々について２００μＭ）、約１０００ｇのＥ、コリに１２株ＡＢＩＩ５７ゲ ノムＤＮＡおよび１単位のＴｐＤＮＡポリメラーゼを含有する５０μｌの反応混 合物中、２つのＰＣＲプライマーオリゴヌクレオチド５’　−ＧＧＣＧＧＡＧＴ ＡＴＡＣＣＡＴＡＡＧ−３°　と５°−ＡＴＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡ ＴＣＧＴＡＣ−３’を各々ＩμＭの濃度で、約１．１ｋｂ断片の増幅に使用した 。典型的な増幅サイクル時間および温度は９４°Ｃで１分、４５°Ｃで１分、次 いで７２°Ｃで１分（全部で３０サイクル）であった。増幅されたＤＮＡ断片を 制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄｌＩ［で消化し、シュードモナス中で複製する ことのできる広域宿主プラスミドｐＬＡＦＲ３（Ｓｔａｓｋａｗｉｃｚら、Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６９：５７８９−５７９４　（１９８７））をｆｉｉｎ ｄ　ｍで消化したものと連結せしめ、Ｅ、コリを形質転換せしめるのに使った。

Ｅ、コ’）　ｕｖｒ−２３遺伝子を含有するｐＬＡＦＲ３誘導体を接合によりシ ュードモナス・フルオレッセンス９１４株中へ移行させると、皿益遺伝子はシア ニド、キチナーゼおよびピロールニドリンの生産に関与する遺伝子の発現を活性 化した。Ｐ、フルオレッセンス９１４株中での最適活性化はｐＬＡＦＲ３の石プ ロモーターからのｕｖｒ−２３の発現に明らかに依存する。

１５：　・である“小の６　サブユニート　ロ　るための２、Ｏｋｂ　Ｘｈｏｌ 　の　なる限　決定Ｅ、コリのＯＲＦ　Ｓ様転写活性化因子がＰ、フルオレッセ ンス９１４株中の潜伏遺伝子を活性化することができるという事実（実施例１２ ）は、２．　Ｏｋｂ　Ｘｈｏｌ断片中のＯＲＦ　５の破壊がこの断片の遺伝子活 性化能力を廃止するという事実と結び付けると、ＯＲＦ　５が完全であり且つ発 現されるという前提のもとで、遺伝子活性化能力を有する２ｋｂ断片よりも小さ いＤＮＡ断片を限定することが可能であろうことを示す。ＯＲＦ　５の発現は、 それの生来のプロモーターから、ベクターのプロモーターから、またはＯＲＦ　 ５コード領域に作用可能に連結された非相同のプロモーターから指令することが できる。小さいＤＮＡ断片は、本質的には実施例５においてＥ、コリから■Ｌｕ 遺伝子を単離するのに記載した手順により、クローン化２　ｋｂ　Ｘｈｏｌ断片 から成る鋳型から調製する。ポリメラーゼ連鎖反応増幅反応用に対をなすオリゴ ヌクレオチドブライマーを調製する。各プライマー対の中にはＯＲＦ　５の下流 で鋳型にアニールする共通のプライマーが存在し、各対の残りのプライマーはＯ ＲＦ　５の上流の異なる距離のところで配列にアニールする。増幅反応からのＤ ＮＡ断片を、キチナーゼ、シアニドおよびピロールニドリンの生産をアッセイす ることにより潜伏遺伝子活性の活性化について試験する。潜伏遺伝子を活性化す る最小断片が同定される。

一流側１６・Ｒ，ソラニの増　に対して且圭性の抗生　生　するン　されたＰ、 フルオし・・センス　の　′　として　用する抗盲菌性組成物の処Ｊ 次の例において、組成の％は重量で与えられる：上−五Ｍ二　ａ　ｂ　主 活性成分　２０％　４０％　５０％ ドデシルベンゼンスルホン酸カルシウム　５％　８％　６％ヒマシ油ポリエチレ ングリコール　５％　−−エーテル（エチレンオキシド３６モル）トリブチルフ ェノールポリエチレン　１２％　４％グリコールエーテル（エチレンオキ シド３０モル） シクロへキサノン　−１５％　２０％ キシレン混合物　７０％　２５％　２０％このような乳剤から水での希釈により 任意の所望濃度の乳液を製造することができる。

ｌ一層液上　立　ｉ　工　１ 活性成分　８０％　１０％　５％　９５％エチレングリコールモノメチル　２０ ％　−−−エーテル ポリエチレングリコール４００　−　７０％　−−Ｎ−メチル−２−ピロリドン 　−２０％−−エポキシ化ヤシ油　−−１％　５９６ 石油留出物　−−９４％− （沸点範囲１６０〜１９０°） これらの溶液は微小滴の形での適用に適する。

３、　粒剤：　立　−す− 活性成分　５％　１０％ カオリン　９４％　− 高分散性珪酸　１％　− アタパルジャイト　９０％ 活性成分を塩化メチレンに溶解し、該溶液を担体上に噴霧し、その後で溶剤を真 空蒸発させる。

±−投剋二　ｉ　上 舌性成分　２％　５％ 高分散性珪酸　１％　５％ タルク　９７％　− カオリン　−９０％ 担体を活性成分と十分に混合することにより、すぐ使用できる粉剤が得られる。

施ｊ１７：Ｒ，ソラニの　に対して　の　生　生　る〉　されたＰ、フルオレ・ ・センス　の　として　る　組　の 次の例において、組成の％は重量で与えられる：上−水胆亙二　ａ　ｂ　主 活性成分　２０％　６０％　７５％ リグノスルホン酸ナトリウム　５％　５％　−ラウリル硫酸ナトリウム　３％　 −５９６ジイソブチルナフタレンスルホン酸　６％　１０９６ナトリウム オクチルフェノールポリエチレン　−２％　−グリコールエーテル （エチレンオキシド７〜８モル） 高分散性珪酸　５％　２７％　１０％ カオリン　６７％　−− 活性成分を補助剤と混合し、その混合物を適当なミル中で徹底的に粉砕すると、 水で希釈して所望の濃度の懸濁液を与えることができる水和剤が得られる。

Ｚ　乳剤： 活性成分　１０％ オクチルフェノールポリエチレン　３％グリコールエーテル （エチレンオキシド４〜５モル） ドデシルベンゼンスルホン酸カルシウム　３％ヒマシ油ポリグリコールエーテル 　４９６（エチレンオキシド３６モル） シクロへキサノン　３０％ キシレン混合物　５０％ このような乳剤から水での希釈により任意の必要濃度の乳液を製造することがで きる。

ｌ−投五二　ｉ　笠 活性成分　５％　８％ タルク　９５％　− カオリン　−９２％ 活性成分と担体を十分に混合し、該混合物を適当なミル中で粉砕することにより 、すぐ使用できる粉剤が得られる。

±−狸班拉五二 活性成分　１０％ リグノスルホン酸ナトリウム　２％ カルボキシメチルセルロース　１％ カオリン　８７％ 活性成分を補助剤と混合・粉砕し、その混合物を次いで水で湿らせる。それを押 し出し、次いで適当な空気流の中で乾燥させる。

ｌ−被覆蚊Ｍ− 活性成分　３％ ポリエチレングリコール２００３％ カオリン　９４９６ 細砕した活性成分を、ミキサー中のポリエチレングリコールで湿らせたカオリン に均一に適用する。こうして無粉塵性の被覆粒剤が得られる。

旦−１１■０１劃に 活性成分　４０％ エチレングリコール　１０９６ ノニルフエノールポリエチレングリコール　６％（エチレンオキシド１５モル） リグノスルホン酸ナトリウム　１０％ カルボキシメチルセルロース　１９６ ３７％水性ホルムアルデヒド溶液　０．２％７５％水性乳液中のシリコーン油　 ０．８％水　３２％ 細砕した活性成分を補助剤と十分に混合し、懸濁液濃縮物を与える。この懸濁液 濃縮物から、水での希釈により任意の所望濃度の懸濁液が得られる。

施Ｊ１８　：他の　面的パ・体の゛ 接合により９５１株中にトランスポゾンＴｎＣＩＢ１１６を導入する（Ｌａｍら （１９９０）　Ｐｌａｎｔ　５ｏｉｌ　１２９：　１１−１８３　。９１５株の トランスポゾン挿入変異体の集団を得、それを実施例４に記載したようにピロー ルニドリンとキチナーゼ生産の欠失についてスクリーニングする。

１０、０００個のトランスポゾン変異体をスクリーニングした後、ピロールニド リン、キチナーゼまたはシアニドをもはや生産しない７つの多面的変異体が得ら れた。

施Ｊ１９：　９１５株　の遺伝　活　とには２つの遺−が必　で五旦。

上記７つの多面的変異体は２つの遺伝子クラスに分かれる。ｐｃｌＢ１３７は７ つのトランスポゾン誘発変異体のうちの２つと変異体２−１を野生型に回復させ た。これは、それらの変異体の遺伝的欠損がＯＲＦ　５にあったことを示唆する 。５つの変異体は回復されず、９１５株中の遺伝子活性化には少なくとも１つの 別の遺伝子座が必要であることを示す。９１５株の全遺伝子ライブラリーを接合 によりそれらの変異体に導入し、野生型形態を取り戻した接合完了体を得た。そ れらの接合完了体はピロールニドリン、キチナーゼおよびシアニドも生産する。

それらの接合完了体から回復クローンを単離した。制限分析は、該クローンが遺 伝子断片の重複ファミリーを形成することを示した。試験したクローンは、第二 クラスの計５つの変異体を野生型に回復させ、第一クラスの２つの変異体には全 く影響を与えなかった。それらのクローンは、９１５株中の遺伝子活性化に必要 な第二の遺伝子領域を限定する。その群の中で最小のクローンであるｐｃＩＢ１ ４６を更に分析する。

２０・　二の遺−の ｐｃｉ８１４６中のクローンはＥｃｏＲＩ部位により隣接された（図４）。

該クローンの中には１つの内部ｆｗＲ１部位が存在する。２つの−Ｒ１サブクロ ーンを得、回復能力について試験した。どちらのサブクローンも、５つのクラス ■変異体のうちの１つである変異体ＣＧＰ　２１を野生童表現型に回復させるこ とができなかった。このことは、内部ＥｍＲ１部位が第二の遺伝子座の機能達成 に重要な部位であることを限定する。該クローン中には２つのＢａｍＨＩ断片が ある。それらの内部断片を除去した時（ｐｃＩＢ１９１）　、回復能力は影響を 受けなかった。

最後に、内部石ｄ■部位から最も左の内部−旧部位までの領域のみを含有する６ 　ｋｂサブクローン（ｐｃｉ８１６８）は回復能力を保持していた。変異体を補 完することができる２つのクローンを寄託した。

ｐｃＩＢ１４６　（約２５ｋｂ）およびｐｃＩ８１６８　（約６’ｋｂ）。

２１：　二の遺−−は１ｅｍＡに　口の′　−るｐｃＩ８１４６中の内部ｔＥｍ Ｒ１部位を取り囲むＤＮＡ配列を得た。

ＧｅｎＢａｎｋデータベースに入っている配列に対する比較は、シュードモナス ・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓ　ｒｉｎ　ａｅ）のｐＶ、シリンゲＢ ７２８ａ株の膠遺伝子（二成分調節系のセンサー成分の遺伝子）　（Ｈｒａｂａ ｋおよびＷｉｌｌｓ、　１９９２　）との有意な相同性を示した。表６を参照の こと。

７８８−１０６３　７２％ １１０１−１８８６　７７％ ＋６１６−１８８６　８７％ ２１８２−２３０８　７８％ ２５２８−２８４３　７２％ 実施例２２・生物制御機能の回復のためのシュードモナス株　への江臥二伝ヱ■ 五ム １ｇＡ遺伝子の不在のために生物防除機能を欠いている変異体シュードモナス株 中にクローンｐｃｉＢＩ４６を導入する。ｐｃＩ８１４６を接合によりＥ、コリ からシュードモナス株中に導入すると、キチナーゼ、ゼラチナーゼ、ピロールニ ドリンおよびシアニド生産を包含する生物防除機能を回復させることがわかった 。

生来の］ｅ＋ｎＡまたは瓜Ａ遺伝子のいずれにも見かけ上欠損がないシュードモ ナス株中にもｐｃｉ８１４６を導入する。πＡタンパク質をリン酸化する能力の 制限を克服するそれらの株中でのＬＩＩＬＩＩＩＡの増加生産のおかげで、形質 転換された株においてキチナーゼ、ゼラチナーゼ、ピロールニドリンおよびシア ニド生産を包含する生物防除機能の増強が見られる。

実施例１３に記載の手順により既にｍｌＡが導入されたシュードモナス株中にも １ｍＡ遺伝子を導入する。この場合、両遺伝子構成物をシュードモナス中で適合 可能にするためにｐＬＡＦＲ３とは異なる複製開始点を使用するプラスミド上で １ｍＡを導入する。ｍｌＡタンパク質をリン酸化する能力の制限を克服するそれ らの株中でのｌｅｍＡの増加生産のおかげで、引いてはシュードモナス菌細胞中 の多量の田ｎのおかげで、両トランスジエンを発現する株においてキチナーゼ、 ゼラチナーゼ、ピロールニドリンおよびシアニド生産を包含する生物防除機能の 増強が見られる。

上述の実験アプローチのいずれにおいても、自身のプロモーターからの発現の代 わりに、非相同のブローモーターから匣遺伝子を発現させることができる。その ようなプロモーターはシュードモナス細胞中で発現可能であることが要求され、 構成的にまたは誘導形式のいずれかで発現させることができる。

他のセンサー成分からの推論によると、■皿Ａタンパク質のアミノ末端部分と未 知のシグナルとの相互作用により、１ｅｍＡは該タンパク質のカルボキシ末端近 くに置かれたヒスチジンの自己リン酸化という機能を果たし、よってπＡタンパ ク質のリン酸化を可能にすると思われる。次の２つの実験アプローチを使ってｗ ＬＡに対するキナーゼ活性を増加させる。

第−に、ヒスチジン自己リン酸化標的に隣接するアミノ酸環境を、当業界で公知 のＰＣＲとクローニング技術を使って変更する。遺伝子置換技術を使ってシュー ドモナス中への変更ＩＢＡ遺伝子の導入を行い（実施例９参照）、こうして変更 されたシュードモナス株を、キチナーゼ、ゼラチナーゼ、ピロールニドリンおよ びシアニド生産について未変更株に対して評価する。標的ヒスチジンの近隣に該 ヒスチジンを自己リン酸化に良い標的にする変更されたアミノ酸環境を有する構 成物は、圧Ａをより効率的にリン酸化し、従って増加されたレベルのキチナーゼ 、ゼラチナーゼ、ピロールニドリンおよびシアニドを生産する。

第二に、当業界で公知のＰＣＲおよびクローニング技術を使って―Ａ遺伝子のア ミノ末端センサー部分をアミノ酸の削除／置換により変更する。こうして調製さ れた一連の変更構成物を、遺伝子置換技術を使ってシュードモナス株中に導入し く実施例９参照）、こうして変更されたシュードモナス株を、キチナーゼ、ゼラ チナーゼ、ピロールニドリンおよびシアニド生産について未変更株に対して評価 する。変更されたセンサー領域を有する構成物は、必要なシグナルの相互作用を 使わずに標的ヒスチジンをリン酸化することができ、従ってｍｌＡをより効率的 にリン酸化することができ、かくして増加されたレベルのキチナーゼ、ゼラチナ ーゼ、ピロールニドリンおよびシアニドを生産することができる。

；雄側２４：タンパク　のリン酸化効・−加させるためのａｆＡ遺−±皇支丈 ｇＡＬＡタンパク質の推定受容領域（残基５４の周り）に隣接するアミノ酸環境 を、ＰＣＲおよびクローニング技術を使って変更する。こうして調製された一連 の変更構成物を、遺伝子置換技術を使ってシュードモナス株中に導入しく実施例 ８ｂ参照）、こうして変更されたシュードモナス株を、キチナーゼ、ゼラチナー ゼ、ピロールニドリンおよびシアニド生産について未変更株に対して評価する。

変更された受容領域を有し一層容易にリン酸化される構成物は、増加されたレベ ルのキチナーゼ、ゼラチナーゼ、ピロールニドリンおよびシアニドを生産する。

施ｊ２５：　された１ｅｍＡおよびａｃＡ遺−るシュードモナスを 改良されたｍｌＡ構成物を使って遺伝子置換実験を繰り返すことによって改良さ れたＩＭＪＡ含有株含有度更することにより、シュードモナス株中に導入すると キチナーゼ、ゼラチナーゼ、ピロールニドリンおよびシアニドの増加生産の表現 壓を引き起こす実施例１９と２０に記載の匝１変更とｍＡ変更とを同一シュード モナス株中に組み合わせる。

流側２６：タンパク　リン酸ヒに、　係に　るためのａｆＡの１タンパク質をリ ン酸化に無関係にするよ引こＢＩＡ遺伝子を変更する。細菌二成分調節系の活性 化因子成分のリン酸化は該活性化因子のＤＮＡ結合領域のコンホメーション変化 をもたらすので、同等なコンホメ・−ジョン変化をもたらすいずれかの特定のア ミノ酸置換、挿入または削除は該活性化因子をリン酸化に無関係にする。細菌株 中の潜伏遺伝子の活性化においてリン酸化に無関係なｊＬｆＡの変形を使用する と、細菌株がＬｅｍＡまたは同等のキナーゼの活性形を含有するという必要条件 が除去される。

当業界で公知のＰＣＲおよびクローニング技術を使ってπＡのＮ末端半分の中の アミノ酸環境を変更する。そのようなｍｌＡ遺伝子の変異形を広域宿主プラスミ ド中にクローニングし、そして９１５株の］ｅｍＡ−変異体誘導体中に導入する 。―へ−変異体中への未変更形πＡの導入はキチナーゼ、ピロールニドリン、シ アニドおよびゼラチナーゼの合成を回復させることができない（実施例１５参照 ）ので、ｌｅｍＡ−株においてそれらの化合物の合成を成るレベル回復させるＧ ａｆＡタンパク質の任意の変更形は、構成的に活性なコンホメーションに固定さ れる（即ち、リン酸化に無関係）。

本発明をそれの特定態様に関して記載してきたが、多数の変形、改良および態様 が可能であり、従ってそのような変形、改良および態様は全て本発明の精神およ び範囲内であると見なすことができることは明らかであろう。

配列表 （１）一般的情報： （ｉ）　出願人：チバーガイギー　ＡＣスイス国、４００２　バーシル、クリペ ックストラーセ　１４１ （ｉｆ）　発明の名称：遺伝子活性化要素（ｉｉｉ）　配列の数ニア （ｉｖ）　連絡先： （Ａ）あて先：チバーガイギー　コーポレーション（Ｂ）通りニスカイラインド ライブ７ （Ｃ）市：ハウトルン市 （Ｄ）州：ニューヨーク州 （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）　Ｚ　Ｉ　Ｐ　：　１０５３２ （Ｖ）　コンピューター読み取り形式。

（Ａ）媒体型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：　ＩＢＭ　ＰＣ互換盟（Ｃ）駆動システム：　ＰＣ−Ｄ ＯＳ／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）ソフトウェア：　Ｐａｔｅｎｔｌｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ 　＃１．０、バージョン＃１．２５ （ｖｉ）　本願データ・ （Ａ）出願番号：　ＰＣＴ／ＵＳ９３１０６３００（Ｂ）出願日・１９９３年７ 月２日 （Ａ）出願番号：　ＬＩＳ　０７／９０８．２８４（Ｂ）出願日・１９９２年７ 月２日 （ｖｉｉｉ）代理人情報： （Ａ）氏名：５ｐｒｕｉｌｌ、　ｗ、　Ｍｕｒｒａｙ（Ｂ）登録番号：　３２． ９４３ （Ｃ）整理番号：　Ｓ−１８２１０／Ａ／ＣＧＣ１５０６／ＰＣ（ｘｉ）　電気 通信情報 （Ａ）電話：　（９１９）５４１−８６１５（Ｂ）テレックス：　（９１９）５ ４１−８６８９（２）配列番号１： （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）配列の長さ・６４２塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｌ］）配列の種類ニゲツムＤＮＡ （ｉｉｉ）　ハイボセテイカル：Ｎ０ （ｉｖ）　アンチセンス・Ｎｏ （ｖｌ）起源： （Ａ）生物名：シュードモナス・フルオレッセンス（Ｂ）株名：　ＣＧＡ２６７ ３５６ （Ｃ）単離個体名：０ＲＦ５ （ｖｉ　ｉ）　直接の起源： （Ｂ）クローン塩　ｆｌｃＩＢ１３７ （ｉｘ）　特徴： （Ａ）特徴を表す記号：　ＣＤ５ （Ｂ）存在位置・１．　、６３９ （Ｄ）他の情報　（位置：１．．３、ａａ：Ｍｅｔ）を除き翻訳（ｘｉ）　配列 ：配列番号１ ＴＴＧ　ＡＴｒ　Ｘ；Ｇ　ＧＩＧ　ＣｒＡ　ＧＴＡ　ＧＩＩＩＣＧＡＴ　ＧＡＣ ＣＡＴ　ＧＡＴ　ＣＴＣＧｒｒ　ＣＧｒ　ＡＣＡ　ＧＧＴ　S８ Ｍｅｔ　工１ｅ　Ａｘｑ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　 Ｈｉｓ　Ａｓｐ　Ｉａｕ　Ｖａｎ　ｋ１宿ＧａｙＡＴＴＡＣＡαａ　ｘ　ＣＴＧ 　ｃｍ　ＧＡＣｍ　ＧＡＴαｚ　ｃ’ｔ’ｃ　ｃｕ、ｃ’ｒｃｃ’ｃα；ＣＣＸ ；　９６エ１ｅ　′ｒｈｒ　Ａｒｇ　ｌ−ｍｅ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｓｐ工ｌｅ 　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇ１■ αｌ：ｃ　ＧＡＧ　ＴＣＡ　ＣＸＸ；　ＧＡＧ　ＧＭ　ＴＣＣＣＩ’Ｇ　ＣＴＣ ＡＡＧα℃α石ＧＡＧ　’ＩＴＧ　ＭＡα℃１４４Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇ ｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｉａｕ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇ ｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒ。

ＧＡＴＣ：ｒＧｃ’ｒｃ　Ｃ１℃ｍ　ＧＡＣＧＫ：　ＭＧ　ＡＴＧ　ＣＯ：αに に℃α℃α；ｉｒ　ｅｒｒ　ｃｕ、　１９２ＡＳＴ）Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　 Ｍｅし　ＡＳＴ）Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　 Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕα：ＣＡＣＧＣＧＣＡＡＡＴＩＧＴＩＧＱＥＣＡＧｒＣ ）’ＣＣＣＧＧＡＴＡＴＣＡＭＧＴＣＣ％ＧＱｌ：　２４０Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａ ｒｇ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　均Ｓｅｒ　石ｓ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｌ ｙｓ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｌａｃ’ｒｃ　ＡＯ：　ｃ’ｒｃ　ＴＧＴ　ＧＡＡ　 ＧＡＡ　ＣＡＴ　ＣＣＧ　’ｒｒｃα刀Ｎ℃α；ＣＴＴＧ　Ｃ１℃ＣＡＡα℃　 ２８８Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｐ ｈｅ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　ＭａαＥＧＣＧ■α ππＩＣＣＴＧに℃ＮＣぼるα刀α℃口℃Ｎσ罎に石ω℃　３３６Ｇｌｙ　Ａｌ ａ　７ｕａ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌ ｙ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　ｔｍｔ　Ｖａｌｌｏｏ　１０５　１１０ α頁江ＡＴＴの頁−頷Ｉπ（３）＝Ｃ■互Ｈに凪傾瞑ｘＫ品　３８４Ｇｉｎ　７ １ａａ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｆ’ｈｅ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ 　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　、f１ｎ ｍ　ｃａ：　ＣＡＧ　％　７１℃ｃ’ｒｃ　ｒｒｃ　ＡＡＧ　ＴＣＡ　ＴＴＣＣ ＡＧα：ＴＴＣＣＸ；ＴＧＡＴＴＣＡ　４３２１１ｅ　Ａｌａ　ＧＬｎＧｉｎ　 Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓシｒ　Ｐｈｅ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏシｒ　Ｓｅｒ　 Ａｓｐ　５ｅｒα刀−℃Ｇ７σαπて店−℃ＱＣα刀Ｑ込ｍ％ｍｏ：凋０℃にぢ にズ　４８０Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｒ ｇ　Ｇｌｕ　工１ｅ　Ｇｉｎ　Ｉｌｅ　ＡＬａ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ｘ１ｅＧＴＣ ＧＧＣＴＧｃＣＡＧ　ＭＡσｒｃ　０ＩＩＧ　ＡＴＣＡＴＣπｒ：　ｃｚ　ＭＧ 　ＣＴＧπＣＣｒＧＴＣＴ　５２８Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　 Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｉｌｅ　工１ｅ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　Ｃｙｓ　 ｔａｕ　５ｅｒＣＣＧ　ＡＡＡ　ＡＱ：　ＧＴｒ　ＡＡＴ　ＡＱ：　ＴＡＣαπ χαｚ　ＡＴＣ？１℃ＧＡＡ　ＭＧ　ａ℃π５７６Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｖ ａｌ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ工１ｅ　Ｐｈｅ　Ｇｌ ｕ　Ｌｙ５　Ｌａｕ　５ｅｒＡＴＣＡＧＣＡＧＣｔ：ａｒ　ＧＩＴ　ＧＡＡσ［ ０ＡＣＡ　７％　Ｃ１℃ＧＣＧ　ＧＩＴ　ＣＧＣＣＡＣαＺＡＴＧ　６２４工ｌ ｅ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　シｕ　Ｌａｕ 　Ａｈａ　Ｖａｌ　Ａｌｌ’９　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　冷しω℃ωσα℃にπＧａ： πλ　６４２ Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ａｌａ（２）配列番号２・ （ｉ）　配列の特徴 （Ａ）配列の長さ、２１３アミノ酸 （Ｂ）配列の型、アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （１１）配列の種類　タンノ々り質 （Ｘｌ）配列　配列番号２ 陥を工ｌｅ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　！Ｊｅｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　） Ｌｉｓ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙｌ　５　１０　１５ 工ｌｅ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｈｉｔ　Ｉａｕ　Ａｌａ　Ａｓｐ　工１ｅ　Ａｓｐ　 Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇ１ｎＡｌａ　Ｇｌｕ　Ｆ Ａｔ　Ｇｌ’／　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　）ｌｌａ 　ｋｌＧｌｕ　ＩＪｕ　Ｌｙｓ　Ｉ’ｒB ｐｓｐ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　ＭＪ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｍｅセ　Ｐ ｒｏ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　ＧｌｕＡｌａ　ＴｈＸ　Ａｒ ｇＬＹＳ　Ｌａｕ　Ｉｊｕ　ｋＳＳｅｒ　）ｕｓ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｌ ｙｓ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　ＡｌａＶａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌ ｕ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｉ ｎに２Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　ＴｈＸ　Ｌｙｓ　Ｇ ｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｍｅセ　Ｖａｌｌｏｏ　１０ ５　１１０ Ｇｉｎ　Ａｌａｌｌａ　Ａｒｇ　Ｉａｕ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇ ｉｎ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ工ｌｅ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇ１ｎ工ｌｅ　Ａｌａ　Ｇｉｎ 　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓシｒ　Ｐｈｅ　Ｇｉｎ　ｐｒｏ　Ｓ ｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　５ｅｒＰｒｏ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｓｅ ｒ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　Ｉｌｅ　ＡＬａ　Ｌｅｕ　Ｍｅ ｔ　Ｘ１ｅＶａｌ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｉｌｅ 　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　５ｅｒＰｒｏ　 Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　 Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　５ｅｒ１Ｂ０　１８５　１９０ エｌｅ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　 Ｌａｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　ｋｉｔ１９５　２００　２ ０５　、 ｖａｌ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ａｌａ（２）配列番号３： （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）配列の長さ・５５５９塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）　配列のＮｔ頚ニゲツムＤＮＡ（ｉｉｉ）　ハイポセティカル：Ｎ。

（ｉｖ）　アンチセンス＝Ｎ。

（ｖｉ）　起源： （Ａ）生物名・シュードモナス・フルオレッセンス（Ｂ）株名：　ＣＧＡ２６７ ３５６ （Ｃ）単離個体名：　５．６　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩ［Ｉ制限断片（ｖ ｉｉ）　直接の起源： （Ｂ）クローン名　ｐｃ１８１３７ （１ｘ）特徴。

（Ａ）特徴を表す記号　ｍ１ｓｃ　ｆｅａｔｕｒｅ（Ｂ）存在位置：２］０．　 、１６８８（Ｄ）他の情報　“ＯＲＦ　Ｉ　、左から右に転写”（１ｘ）特？ｊ ｉ： （Ａ）特徴を表す記号　ｍ１ｓｃ　ｆｅａｔｕｒｅ（Ｂ）存在位置：　１９０６ ．　、３６３３（Ｄ）他の情報二　“ＯＲＦ　２　、左から右に転写”（ｉｘ） 　特徴： （Ａ）特徴を表す記号：　ｍ１ｓｃ　ｆｅａｔｕｒｅ（Ｂ）存在位置：　４６１ ６．　、４６９１（Ｄ）他の情報：　“ｇｔｙｗ、右から左に転写”（ｉｘ）　 特徴： （Ａ）特徴を表す記号：　ｍ１ｓｃ　ｆｅａｔｕｒｅ（Ｂ）存在位置：　４７３ １．　、５３１８（Ｄ）他の情報：　“ＯＲＦ　３　、右から左に転写“（ｘｉ ）　配列：配列番号３ Ｎ（ａ工ｒズ込α工こυＪ潰℃に百αコつχ℃ｉ美バマＡ工℃０ゴαンＧマＣ） ＝１℃ＣＭＣα℃４８０χ工ぢ■λＮ込α刀Ｃズ℃に℃−刀丁工３χ刀α＝Ｃコ ℃Ｑ℃α℃丁マＡフロα℃フυλズ℃５４０σご工に２σζ百σλ℃αＷ工Ｍλ ゴまλ℃πＬ鳩ひ２スπ刀ＫＬ咳πｎ詰　１５６０に℃にひ工ω工にロクｄα迫 π工隨工Ｍ品品に０鎚エロひＪα！　１６２００λ刀０工℃ｇ！℃α囚ｎ仄λ℃ Ｇごり潰了刀σλ℃Ｍロロαコ刀に刃１．Ｃ２１６０υαスＧ人工にλ℃ローぜ αＡ請σロ６ＫＤフａＧ工にで工ｍスπλπｎ丁１’Ｃ２５２０α２訂Ｃぶ学σ Ｃ■■λゴ０λ℃Ｍ０刀ロー砧α■込πシ℃ロロ端αＤ刀にπ墓　２５８０ロー 刀χＳ工πＤ刀に−℃Ｇλ℃ゴＧ工αｎ刀πＤ工χ刃℃αΩπＯＩＡＴＡａｌｌ ＡｒＴ２６４０πｍα２篤πフ工ＭＤスゲα迫ＩＸ℃Ｍ（２）詰αλ工πｒコシ ごπσ草℃Ｇ丁に　２７００３２　ａｌ；ＣＣＡＴ′ｒＣｃｃ２　ＣＩ’Ａｆｌ 　＄Ｔｌ　３７２０πｎ刀αコ刀σＤ工にＤ℃口＝π仄篤σ了にロウＣに２工ま ２ゴα２−α！　３７８０ＡＧＧＴ；１１０ＧＯ！　２α！　２　ＧＧＣＡＴＡ ）０℃４８６０（２）配列番号１１ （］）配列の特徴 （△）配列の長さ・９８３塩基対 （Ｂ）配列の型　核酸 （Ｃ）ｂｌの数・−末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類　ゲノムＤＮＡ （ｉｉｉ）　ハイボセティカル、Ｎ０ （ｉｖ）　アンチセンス：Ｎ。

（Ａ）生物名：シュードモナス・フルオレッセンス（Ｂ）株名：　ＣＧＡ２６７ ３５６ （ｖｉｉ）　直接の起源： （Ｂ）クローン塩：　ｐｃＩＢ１３７ （ｉｘ）　特徴： （Ａ）特徴を表す記号：　ｍ１ｓｃ　ｆｅａｔｕｒｅ（Ｂ）存在位置：２３．． ５１ （Ｄ）他の情報：　“プロモーター相同性を有する配列”（ｉｘ）　特徴： （Ａ）特徴を表す記号：ｍ１ｓｃ　ｆｅａｔｕｒｅ（Ｂ）存在位置：９９１．７ ４０ （Ｄ）他の情報・　“ＯＲＦ　５構造遺伝子”（１ｘ）特徴： （Ａ）特徴を表す記号：　ｍ１ｓｃ　ｆｅａｔｕｒｅ（Ｂ）存在位置：　７４３ ．　、９８３（Ｄ）他の情報：　”ＯＲＦ　４　（ｕｖｒＣ）の５′末端”（Ｘ ｌ）配列：配列番号４ ＡＴＱＡＣＣＡＴＧＡ丁ＣＴＣ３Ｔ丁０１；ＴＡＣＡＧＧｒＡＴｒＡ　ＣへＣＧ ＡＡＴＧＣｒｆｌＣＡＴＧＧＣＣＴＧＣ１８０Ｍ口θπなバシＣ℃工鳩π旭刀Ｒ 工Ｍ冗αフ℃１ス闇ヱσ号■λ羽ワ込Ｋ　２４０ＴＣＡＡπ込Ｎσαπ工に蕊℃ に了刀αコ刀π嘗ロχｎ刀α１χ「ｎにロ０シα工α℃４８０ππ℃ａσ℃ａ６ 罠α了スａα罠ＡＣＣ（込σαπ＝ウロσＬ圏πＣコπａｒに口’Ｃ７ＥＩＯ口 α：ＡＧＴＧＧＣα云工πａ刀ＴＧｒＡｆｆαシ四ａπ刀にλ℃ωσ閣ぽπにπ ににｎαπ　８４０ＣｘＸ：ｒ、ｗα：ＣＭＧＡＡα：ＴＧＡＡＧＡＧＣα意コ αＣ）α？ｒＡＣ３σ：ＧＧＣＣＴＧＧ：９００σ２スｇλ℃便フエαコ刀πＣ 刀αＤロα口６に（２）スＭＯユαλにＡＣＣＧＯフに刀　９６０Ｘλ℃Ｑλ℃ σコ℃亘ＣにＧＡＧ　９８３（２）配列番号５・ （１）配列の特徴。

（Ａ）配列の長さ：６４２塩基対 （Ｂ）配列の型　核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）　配列の種類ニゲツムＤＮＡ（ｉｉｉ）　ハイボセティカル二Ｎ。

（ｉｖ）　アンチセンス二Ｎ。

（ｘｉ）　配列：配列番号５ π道菖ωｉπのＸ葛ＣＡπ口菖尼にχ℃コい　６４２（２）配列番号６゜ （１）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ、１８塩基対 （Ｂ）配列の型、核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）　配列の種類ニゲツムＤＮＡ（ｉｉｉ）　ハイポセティカル：Ｎ。

（ｉｖ）　アンチセンス、Ｎ。

（ｘｌ）配列：配列番号６： ＧＧＣＧＧＡＧＴＡＴ　ＡＣＣＡＴＡＡＧ　１８（２）配列番号７・ （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２４塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （１１）配列の種類、ゲノムＤＮＡ （ｉｉｉ）　ハイボセティカル、Ｎ。

（１ｖ）　アンチセンス：Ｎ。

（Ｘｌ）配列：配列番号７： ＡＴＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡＴＣＧＴＡＣ２４ＦＩＧ、　２ 特表平７−５０９６０５　（２１） 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成６年！２−月２７日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．少なくとも１つの遺伝子の発現を誘導することができる遺伝子活性化配列で あって、前記遺伝子が標的生物中で潜伏性であるかまたは低レベルで発現される 、前記遺伝子活性化配列。 ２．前記標的生物が、前記遺伝子活性化配列が誘導された株以外の株である、請 求項１の遺伝子活性化配列。 ３．前記配列がｇａｆＡ配列である、請求項１の遺伝子活性化配列。 ４．前記配列がｌｅｍＡ配列である、請求項１の遺伝子活性化配列。 ５．前記ｇａｆＡ配列がｐＣＩＢ１３７として寄託された２ｋｂ断片から本質的 に成る、請求項３の遺伝子活性化配列。 ６．請求項５のＤＮＡ配列から誘導される単離されたＤＮＡ配列。 ７．前記ｌｅｍＡ配列がｐＣＩｂ１６８として寄託された６ｋｂ断片から本質的 に成る、請求項４の遺伝子活性化配列。 ８．請求項７のＤＮＡ配列から誘導される単離されたＤＮＡ配列。 ９．前記ＤＮＡ配列がｌｅｍＡをコードする、請求項８のＤＮＡ配列。 １０．宿主株において潜伏性であるかまたは生来低レベルで発現される遺伝子を 活性化する方法であって、少なくとも１つの請求項１の遺伝子活性化配列を前記 宿主株に導入することを含んで成る方法。 １１．前記宿主株が、前記遺伝子活性化配列が誘導された株以外の株である、請 求項１０の方法。 １２．前記遺伝子活性化配列がｌｅｍＡまたはｇａｆＡ配列である、請求項１０ の方法。 １３．前記ｇａｆＡ配列がｐＣＩＢ１３７として寄託された２ｋｂ断片またはそ の断片から本質的に成る、請求項１２の方法。 １４．前記ｌｅｍＡ配列がｐＣＩＢ１６８として寄託された６ｋｂ断片から本質 的に成る、請求項１２の方法。 １５．前記宿主株が細菌株である、請求項１０の方法。 １６、前記宿主株がシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の株である、 請求項１５の方法。 １７．配列番号１に示されるｇａｆＡ配列から本質的に成る単離されたＤＮＡ配 列。 １８．請求項１７のＤＮＡ配列から誘導される単離されたＤＮＡ配列。 １９．請求項１の遺伝子活性化配列に作用可能に連結された細菌調節要素を含ん で成る組換えＤＮＡ配列。 ２０．請求項３のＤＮＡ配列に作用可能に連結された細菌調節要素を含んで成る 組換えＤＮＡ配列。 ２１．請求項４のＤＮＡ配列に作用可能に連結された細菌調節要素を含んで成る 組換えＤＮＡ配列。 ２２．前記細菌調節要素が、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属およ びバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属並びにＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）種から成る 群より選択された細菌株から単離された遺伝子由来のプロモーターである、請求 項２０の組換えＤＮＡ配列。 ２３．前記細菌調節要素が宿主細菌株に相同である、請求項２２の組換えＤＮＡ 配列。 ２４．請求項２０の組換えＤＮＡ配列が導入されているトランスジェニック細菌 株。 ２５．請求項２２の組換えＤＮＡ配列が導入されているトランスジェニック細菌 株であって、前記組換えＤＮＡ配列の細菌調製要素がトランスジェニック細菌株 に相同である遺伝子由来のものである、トランスジェニック細菌株。 ２６．宿主株において少なくとも１つの遺伝子の発現を活性化する方法であって 、前記遺伝子は潜伏性であるかまたは生来低レベルで発現され、 前記宿主株に少なくとも１つの遺伝子活性化配列を導入することを含んで成る方 法。 ２７．前記遺伝子活性化配列がＤＮＡ配列である、請求項２６の方法。 ２８．前記ＤＮＡ配列が細菌調節要素に作用可能に連結される、請求項２７の方 法。 ２９．前記調節要素が、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属およびバ シラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属並びにＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）種から成る群よ り選択された細菌株から単離された遺伝子由来のプロモーターである、請求項２ ８の方法。 ３０．前記遺伝子活性化配列がｇａｆＡ配列である、請求項２６の方法。 ３１．前記ｇａｆＡ配列が配列番号１の配列である、請求項３０の方法。 ３２．前記遺伝子活性化配列がｌｅｍＡ配列である、請求項２６の方法。 ３３．前記ｌｅｎＡ配列がｐＣＩＢ１６８中に含まれるｌｅｍＡである、請求項 ３２の方法。 ３４．真菌病原体に対して効果的な細菌株にする方法であって、該細菌株に請求 項１のＤＮＡ配列を導入することを含んで成る方法。 ３５．真菌病原体に対して効果的な細菌株にする方法であって、該細菌株に請求 項１９のＤＮＡ配列を導入することを含んで成る方法。