BR112020023326A2 - composição fungicida estabilizada - Google Patents

Abstract

  COMPOSIÇÃO FUNGICIDA ESTABILIZADA. A presente invenção se refere a uma composição fungicida estabilizada que compreende: a) uma cepa de Paenibacillus sp. produtora de fusaricidina; e b) um agente estabilizador selecionado do grupo que consiste em uma amina, um composto de amônia quaternária, um sal de fosfato ou citrato, um poliol de cadeia curta que possui de 2 a 10 átomos de carbono, uma ureia e suas combinações. A presente invenção também fornece formulações aquosas agricolamente aceitáveis que compreendem uma cepa de Paenibacillus sp. produtora de fusaricidina e um agente estabilizador e métodos de controle de uma doença em plantas com as composições fungicidas e formulações aquosas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “COMPO- SIÇÃO FUNGICIDA ESTABILIZADA”.

REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica prioridade para o Pedido de Patente Provisório US No. 62/ 672.969, depositado em 17 de maio de 2018, cu- jos conteúdos estão aqui incorporados por referência em sua totalidade.

CAMPO TÉCNICO

[002] A presente invenção se refere a formulações de cepas bac- terianas e métodos para seu uso para controlar doenças de plantas. Em particular, a presente invenção é dirigida a composições fungicidas es- táveis e formulações de uma cepa de Paenibacillus sp produtora de fu- saricidina.

ANTECEDENTES

[003] Os fungicidas têm uma infinidade de usos, incluindo a prote- ção de culturas; como conservantes de alimentos, rações e cosméti- cos; e como agentes terapêuticos para aplicações humanas e veteriná- rias. A redução da produção agrícola, doenças transmitidas por alimen- tos e infecções fúngicas em humanos e animais são um problema em ambos os países desenvolvidos e em desenvolvimento.

[004] Inseticidas ou fungicidas sintéticos frequentemente são ines- pecíficos e, portanto, podem agir em organismos diferentes dos alvos, incluindo outros organismos benéficos que ocorrem naturalmente. De- vido à sua natureza química, eles também podem ser tóxicos e não bio- degradáveis. Os consumidores em todo o mundo estão cada vez mais conscientes dos potenciais problemas ambientais e de saúde associa- dos aos resíduos de produtos químicos, especialmente em produtos ali- mentícios. Isso resultou em uma pressão crescente do consumidor para reduzir o uso ou pelo menos a quantidade de pesticidas químicos (ou seja, sintéticos). Portanto, é necessário manusear os requisitos da ca- deia alimentar e, ao mesmo tempo, permitir o controle eficaz de pragas.

[005] Um outro problema que surge com o uso de inseticidas ou fungicidas sintéticos é que a aplicação repetida e exclusiva de um inse- ticida ou fungicida frequentemente leva à seleção de microrganismos patogênicos resistentes. Normalmente, tais cepas também apresentam resistência cruzada contra outros ingredientes ativos que possuem o mesmo modo de ação. Um controle eficaz dos patógenos com os refe- ridos compostos ativos então não é mais possível. No entanto, os ingre- dientes ativos que possuem novos mecanismos de ação são difíceis e caros para desenvolver.

[006] O risco de desenvolvimento de resistência em populações de patógenos, assim como questões ambientais e de saúde humana têm fomentado o interesse na identificação de alternativas aos insetici- das e fungicidas sintéticos para o manuseio de doenças de plantas. O uso de agentes de controle biológico é uma alternativa.

[007] Os agentes de controle biológico à base de Paenibacillus po- dem fornecer uma ferramenta valiosa para controlar um espectro de do- enças de plantas enquanto reduz o risco de resistência a patógenos. Fu- saricidinas e outros compostos antifúngicos são produzidos durante a fermentação de cepas de Paenibacillus sp. No entanto, esses compos- tos antifúngicos são suscetíveis à degradação durante o armazena- mento e transporte dos agentes de controle biológico à base de Paeni- bacillus. As temperaturas elevadas comuns durante as estações de cul- tivo contribuem para a degradação desses compostos antifúngicos. Há uma necessidade de identificar composições e formulações estabiliza- das de agentes de controle biológico à base de Paenibacillus que man- tenham sua atividade para controlar doenças de plantas por longos pe- ríodos de tempo e em temperaturas elevadas.

SUMÁRIO

[008] A presente invenção é baseada na identificação de agentes estabilizadores que inibem a degradação dos compostos antifúngicos produzidos por uma cepa de Paenibacillus sp. Esses agentes estabili- zadores preservam a atividade antifúngica da cepa de Paenibacillus sp. e reduzem a degradação de fusaricidinas e compostos semelhantes à fusaricidina.

[009] Em certas modalidades, a presente invenção é direcionada a uma composição fungicida estabilizada que compreende: a) uma cepa de Paenibacillus sp produtora de fusaricidina; e b) um agente estabiliza- dor selecionado do grupo que consiste em uma amina, um composto de amônia quaternária, um sal de fosfato ou citrato, um poliol de cadeia curta que possui 2 a 10 átomos de carbono, uma ureia e suas combina- ções.

[0010] Em outras modalidades, a presente invenção é dirigida a uma composição fungicida estabilizada que compreende: a) uma cepa de Paenibacillus sp. produtora de fusaricidina; e b) um agente estabili- zador selecionado a partir do grupo que consiste em uma amina, um composto de amônia quaternária, um sal de fosfato ou citrato, um poliol de cadeia curta com 2 a 10 átomos de carbono, uma ureia, uma alcano- lamina, uma amida e suas combinações.

[0011] Em algumas modalidades, a presente invenção é direcio- nada a uma composição fungicida estabilizada que compreende: a) uma cepa de Paenibacillus sp. produtora de fusaricidina; e b) um agente es- tabilizador selecionado do grupo que consiste em diamida carbônica (CO(NH2)2), cloridrato de guanidina, trietanolamina, cloridrato de beta- ína, fosfato de potássio (dibásico), citrato de potássio (tribásico) e suas combinações.

[0012] Em certos aspectos, a composição ou formulação compre- ende uma cultura biologicamente pura da cepa de Paenibacillus sp. pro- dutora de fusaricidina.

[0013] Em uma modalidade, a cepa de Paenibacillus sp. produtora de fusaricidina é P. agarexedens, P. agaridevorans, P. alginolyticus, P.

alkaliterrae, P. alvei, P. amylolyticus, P. anaericanus, P. antarcticus, P. assamensis, P. azoreducens, P. azotofixans, P. barcinonensis, P. bore- alis, P. brasiliensis, P. brassicae, P. campinasensis, P. chinjuensis, P. chitinolyticus, P. chondroitinus, P. cineris, P. cookie, P. curdlanolyticus, P. daejeonensis, P. dendritiformis, P. durum, P. ehimensis, P. elgii, P. favisporus, P. glucanolyticus, P. glycanilyticus, P. gordonae, P. graminis, P. granivorans, P. hodogayensis, P. illinoisensis, P. jamilae, P. kobensis, P. koleovorans, P. koreensis, P. kribbensis, P. lactis, P. larvae, P. lautus, P. lentimorbus, P. macerans, P. macquariensis, P. massiliensis, P. men- delii, P. motobuensis, P. naphthalenovorans, P. nematophilus, P. nov. spec. epiphyticus, P. odorifer, P. pabuli, P. peoriae, P. phoenicis, P. phyl- losphaerae, P. polymyxa, P. polymyxa ssp. polymyxa, P. polymyxa ssp. plantarum, P. popilliae, P. pulvifaciens, P. rhizosphaerae, P. sanguinis, P. stellifer, P. taichungensis, P. terrae, P. thiaminolyticus, P. timonensis, P. tylopili, P. turicensis, P. validus, P. vortex, P. vulneris, P. wynnii ou P. xylanilyticus.

[0014] Em outra modalidade, a cepa de Paenibacillus sp. produtora de fusaricidina é Paenibacillus polymyxa, Paenibacillus polymyxa ssp. polymyxa, Paenibacillus polymyxa ssp. plantarum, Paenibacillus nov. spec. epiphyticus, Paenibacillus terrae, Paenibacillus macerans ou Pa- enibacillus alvei. Em outra modalidade, a cepa de Paenibacillus sp. pro- dutora de fusaricidina é Paenibacillus terrae.

[0015] A composição fungicida pode estar em qualquer forma de formulação, particularmente uma composição líquida, como um concen- trado que pode ser emulsionado, suspo-emulsão, concentrado de sus- pensão ou uma solução, tal como uma solução aquosa.

[0016] Em alguns aspectos, a proporção de peso para peso entre a cepa de Paenibacillus sp. produtora de fusaricidina e o agente estabili- zador é cerca de 500:1 a cerca de 1:500, cerca de 400:1 a cerca de 1:400, cerca de 300:1 a cerca de 1:300, cerca de 200:1 a cerca de 1:200,

cerca de 100:1 a cerca de 1:100, cerca de 75: 1 a cerca de 1:75, ou cerca de 50:1 a cerca de 1:50. Em uma modalidade, a proporção de peso para peso entre a cepa de Paenibacillus sp. produtora de fusarici- dina e o agente estabilizador é de cerca de 200:1 a cerca de 1:200. Em outra modalidade, a proporção de peso para peso entre a cepa de Pae- nibacillus sp. produtora de fusaricidina e o agente de estabilização é cerca de 50:1 a cerca de 1:50.

[0017] Em certos aspectos, a composição fungicida compreende ainda um solvente orgânico polar miscível em água. O solvente orgânico polar miscível em água pode ser qualquer um de 1,3 butileno glicol, 2- pirrolidona, acetona, acetonitrila, um álcool alifático, um éster alquílico de ácido carboxílico alifático, ciclohexanona, di- e triglicóis, álcool dia- cetona, dialquil cetona, dietileno glicol, diglima, DMF, DMSO, etanol, acetato de etila, formamida, álcool furfurílico, gama-butirolactona, glice- rol, glicofurol, um éter de glicol, glicol, hexametilenoglicol, isopropanol, metil etil cetona, N-metil pirrolidona, pentametilenoglicol, fosfórico éste- res de ácido, polietileno glicol, polietileno glicóis, alcanos poli-hidroxila- dos, propanol, carbonato de propileno, propileno glicol, pirrolidina, pirro- lidina, sulfolano, tetraidrofurano, tetrametileno glicol, tiodiglicol, trietileno glicol e/ou suas combinações.

[0018] Em certos aspectos, a presente invenção é direcionada a uma composição em que a cepa de Paenibacillus sp. produtora de fu- saricidina é cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972, cepa de Paeni- bacillus sp. NRRL B-67129, cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67304, cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67306, cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67615 ou uma cepa fungicida mutante destas.

[0019] Em algumas modalidades, a cepa fungicida mutante tem uma sequência genômica com mais do que cerca de 90% de identidade de sequência com a cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972, cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67129, cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-

67304, cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67306 ou cepa de Paeniba- cillus sp. NRRL B-67615. Em outras modalidades, a cepa mutante fun- gicida tem atividade fungicida e/ou níveis de uma fusaricidina que são comparáveis ou melhores do que os de Paenibacillus sp. NRRL B-

50972.

[0020] Em um aspecto, a presente invenção é direcionada a uma formulação aquosa estável aceitável em agricultura que compreende: (a) uma cepa de Paenibacillus sp. produtora de fusaricidina em uma quantidade de 3% p/p a 90% p/p; (b) um agente estabilizador selecio- nado a partir do grupo que consiste em uma amina, um composto de amônia quaternária, um sal de fosfato ou citrato, um poliol de cadeia curta que possui de 2 a 10 átomos de carbono, uma ureia e combina- ções dos mesmos em uma quantidade de 0,1% p/p a 10% p/p; (c) água; e (d) opcionalmente, um solvente orgânico polar miscível em água em uma quantidade de 2% p/p a 60% p/p.

[0021] Em outro aspecto, a presente invenção é direcionada a uma formulação aquosa estável aceitável em agricultura que compreende: (a) uma cepa de Paenibacillus sp. produtora de fusaricidina em uma quantidade de 3% 90% p/p; (b) um agente estabilizador selecionado a partir do grupo que consiste em diamida carbônica (CO(NH2)2), clori- drato de guanidina, trietanolamina, cloridrato de betaína, fosfato de po- tássio (dibásico), citrato de potássio (tribásico) e suas combinações em uma quantidade de 0,1% p/p a 10% p/p; (c) água; e (d) opcionalmente, um solvente orgânico polar miscível em água em uma quantidade de 2% p/p a 60% p/p.

[0022] A quantidade da cepa de Paenibacillus sp. produtora de fu- saricidina empregada é preferivelmente cerca de 3% p/p a cerca de 90% p/p de toda a formulação. Mais preferivelmente, a cepa de Paenibacillus sp. produtora de fusaricidina está presente em uma quantidade entre cerca de 4% a 80% p/p, mais preferivelmente 5% p/p a cerca de 75%

p/p e, em algumas modalidades, entre cerca de 10% p/p a cerca de 70% p/p ou até cerca de 20% p/p a cerca de 70% p/p.

[0023] A quantidade de agente estabilizante usada é preferivel- mente cerca de 0,1% p/p a cerca de 20% p/p de toda a formulação. Mais preferivelmente, o agente estabilizante está presente em uma quanti- dade de cerca de 0,5% a 10% p/p, mais preferivelmente 0,5% p/p a cerca de 5% p/p e, em algumas modalidades, entre cerca de 0,5% p/p a cerca de 2% p/p.

[0024] A quantidade de solvente orgânico polar miscível em água empregada é opcionalmente cerca de 2% p/p a cerca de 60% p/p de toda a formulação. Alternativamente, o solvente orgânico polar miscível em água está opcionalmente presente em uma quantidade de cerca de 5% a 50% p/p, mais preferivelmente 10% p/p a cerca de 40% p/p e, em algumas modalidades, de cerca de 20% p/p a cerca de 40% p/p.

[0025] Em certos aspectos, a presente invenção é direcionada a for- mulações secas estáveis que compreendem (a) uma cepa de Paeniba- cillus sp. produtora de fusaricidina; e (b) um agente estabilizador seleci- onado a partir do grupo que consiste em uma amina, um composto de amônia quaternária, um sal de fosfato ou citrato, um poliol de cadeia curta que possui 2 a 10 átomos de carbono, uma ureia e combinações desses.

[0026] Em outros aspectos, a presente invenção é direcionada a for- mulações secas estáveis compreendem (a) uma cepa de Paenibacillus sp. produtora de fusaricidina; e (b) um agente estabilizador selecionado a partir do grupo que consiste em uma amina, um composto de amônia quaternária, um sal de fosfato ou citrato, um poliol de cadeia curta tendo de 2 a 10 átomos de carbono, uma ureia, uma alcanolamina, uma amida e combinações desses.

[0027] A formulação seca pode ser qualquer uma de um pó molhá- vel, um pó solúvel, uma névoa, um grânulo, um comprimido, um grânulo solúvel em água e que pode ser disperso em água, um comprimido so- lúvel em água e que pode ser disperso em água e um pó solúvel em água e que pode ser disperso em água.

[0028] Em uma modalidade, a presente invenção é direcionada a uma formulação estável aceitável na agricultura que compreende: (a) uma cepa de Paenibacillus sp. produtora de fusaricidina em uma quan- tidade de 3% p/p a 90% p/p; (b) um agente estabilizador selecionado a partir do grupo que consiste em uma amina, um composto de amônia quaternária, um sal de fosfato ou citrato, um poliol de cadeia curta que possui de 2 a 10 átomos de carbono, uma ureia e combinações desses em uma quantidade de 0,1 % p/p a 10% p/p; e (c) outras substâncias inertes para a formulação.

[0029] Em outra modalidade ainda, a presente invenção se refere a um método de tratamento de uma planta para controlar uma doença, em que o método compreende a aplicação de uma quantidade eficaz de uma composição ou formulação aqui descrita à planta, a uma parte da planta e/ou no local da planta. Em certos aspectos, a composição com- preende um produto da fermentação da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972, cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67129, cepa de Paenibaci- llus sp. NRRL B-67304, cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67306, cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67615, ou uma cepa fungicida mutante deste. Em outros aspectos, o método compreende a aplicação da com- posição às partes foliares da planta. Em outros aspectos ainda, a com- posição é aplicada em cerca de 1 x 1010 a cerca de 1 x 1012 unidades formadoras de colônia (CFU) da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B- 50972, cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67129, cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67304, cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67306, cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67615 ou uma cepa fungicida mutante destas por hectare. Em uma modalidade, a composição é aplicada entre cerca de 0,5 kg a cera de 5 kg de sólidos de fermentação por hectare.

[0030] Em alguns aspectos, a doença da planta é causada por um fungo. Em outros aspectos, a doença da planta é um míldio ou ferru- gem. Em uma modalidade, o míldio é um míldio pulverulento ou míldio penugento. Em outra modalidade, a doença da ferrugem é selecionada a partir do grupo que consiste em ferrugem da folha do trigo, ferrugem da folha da cevada, ferrugem da folha do centeio, ferrugem marrom da folha, ferrugem da coroa e ferrugem do caule.

[0031] Em algumas modalidades, o fungo é selecionado a partir do grupo que consiste em Alternaria alternata, Alternaria solani, Botrytis ci- nerea, Colletotrichum lagenarium, Fusarium culmorum, Phaeosphaeria nodorum, Zymoseptoria tritici, Phytophthora crtogea, Phytophthora in- festans, Pythatephthora infestans, Pythatephthora infestans, Pytha- tephthora e cucumeris, Ustilago segetum var. avenae, Uromyces ap- pendiculatus e Puccinia triticina.

[0032] A presente invenção também se refere ao uso das composi- ções e formulações descritas para controlar um organismo fitopatogê- nico em plantas úteis. Em certos aspectos, o organismo fitopatogênico é selecionado a partir do grupo que consiste em Alternaria alternata, Alternaria solani, Botrytis cinerea, Colletotrichum lagenarium, Fusarium culmorum, Phaeosphaeria nodorum, Zymoseptoria tritici, Phytophthora cryptogea, Phytophthora infestans, Pythium ultimum, Magnaporthe ory- zae, Thanatephorus cucumeris, Ustilago segetum var. avenae, Uromyces appendiculatus, e Puccinia triticina. Em outros aspectos, o organismo fitopatogênico é selecionado do grupo que consiste em Xan- thomonas campestris, Pseudomonas syringae e Erwinia carotovora.

[0033] Ainda em outros aspectos, as plantas úteis são selecionadas do grupo que consiste em maçãs, bananas, frutas cítricas, kiwi, melões, pêssegos, peras, abacaxi, pomáceas, romã, repolho, couve-flor, pepino, cucurbitáceas, tomate, batata , trigo, arroz e soja.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DAS FIGURAS

[0034] A FIG. 1 ilustra os níveis relativos de fusaricidina em formu- lações líquidas do caldo concentrado (BC) da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 sem qualquer agente estabilizador ou misturado com ureia, cloridrato de guanidina, trietanolamina ou oxalato de etil glicerol antes e após armazenamento a 54°C por duas semanas.

[0035] A FIG. 2 representa os níveis relativos de fusaricidina em for- mulações líquidas da cepa de Paenibacillus NRRL B-50972 BC sem qualquer agente estabilizador ou misturada com ureia, cloridrato de gua- nidina, trietanolamina ou oxalato de etil glicerol antes e após armazena- mento a 40°C por duas, quatro e oito semanas.

[0036] A FIG. 3 representa os níveis relativos de fusaricidina em for- mulações líquidas da cepa de Paenibacillus NRRL B-50972 BC sem qualquer agente estabilizador ou misturada com ureia, cloridrato de be- taína ou fosfato de potássio dibásico antes e após armazenamento a 54°C durante duas semanas. As barras de erro representam os interva- los de confiança de 95% para os valores mostrados.

[0037] A FIG. 4 representa os níveis relativos de fusaricidina em for- mulações líquidas da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC sem qualquer agente estabilizador ou misturada com ureia, cloridrato de be- taína ou fosfato de potássio dibásico antes e após armazenamento a 40°C durante oito semanas. As barras de erro representam os intervalos de confiança de 95% para os valores mostrados.

[0038] A FIG. 5 mostra os níveis relativos de fusaricidina em formu- lações líquidas da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC em uma diluição de 50:50 com água ou propilenoglicol antes e depois do arma- zenamento a 54°C por duas semanas.

[0039] A FIG. 6 mostra os níveis relativos de fusaricidina em formu- lações líquidas da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC em uma diluição de 50:50 com água ou propilenoglicol antes e depois do arma- zenamento a 40°C por duas, quatro ou oito semanas.

[0040] A FIG. 7 mostra uma foto de uma amostra da cepa de Pae- nibacillus sp. NRRL B-50972 BC sem uréia (“BC - Ureia”) e uma amostra da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC com ureia (“BC + Ureia”) depois do armazenamento a 54°C durante duas semanas.

[0041] A FIG. 8 ilustra os níveis relativos de fusaricidina em formu- lações líquidas da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC sem qualquer agente estabilizador ou misturada com ureia antes e depois do armazenamento a 23°C durante duas, quatro, oito, vinte e seis, cin- quenta e duas e cento e quatro semanas.

[0042] A FIG. 9 ilustra os níveis relativos de fusaricidina em formu- lações líquidas da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC sem qualquer agente estabilizador ou misturada com uréia junto com a cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67304 BC e a cepa de Paenibacillus sp. NRRL B- 67306 BC, cada uma misturada com ureia antes e depois do armazenamento a 40°C durante quatro e oito semanas.

[0043] A FIG. 10 representa os níveis relativos de fusaricidina em formulações líquidas da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC sem qualquer agente estabilizador ou misturada com uréia junto com a cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67304 BC e a cepa de Paenibacillus sp. NRRL B- 67306 BC, cada uma misturada com uréia antes e após armazenamento a 23°C por duas, quatro, oito, vinte e seis e cinquenta e duas semanas.

[0044] A FIG. 11 ilustra os níveis relativos de fusaricidina em for- mulações líquidas das cepas de Paenibacillus sp. NRRL B-67304, NRRL B-67306 e NRRL B-67615 durante o armazenamento a 40°C por oito semanas. As formulações líquidas eram caldo integral sem uréia (“WB-Ureia”) e caldo concentrado com uréia (“BC+Ureia”).

[0045] A FIG. 12 descreve os níveis relativos de fusaricidina em for- mulações líquidas das cepas de Paenibacillus sp. NRRL B-67304, NRRL B-67306 e NRRL B-67615 durante o armazenamento a 4°C ou a

23°C durante cinquenta e duas semanas. As formulações líquidas eram caldo integral sem uréia (“WB - Ureia”) e caldo concentrado com uréia (“BC + Ureia”).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0046] Foi descoberto que determinados agentes estabilizadores preservam a atividade antifúngica das cepas de Paenibacillus sp., per- mitindo o armazenamento e o transporte em temperaturas elevadas e/ou por longos períodos de tempo. As cepas de Paenibacillus sp. in- cluem a cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972, a cepa de Paeniba- cillus sp. NRRL B-67129, a cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67304, a cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67306, a cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67615 e mutantes fungicidas derivados destas.

[0047] A cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 e a cepa de Pa- enibacillus sp. NRRL B-67129 foram previamente identificadas como produtoras de um grupo único de fusaricidinas e compostos do tipo fu- saricidina com atividade antifúngica de amplo espectro (WO 2016/154297). A cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 está relacio- nada à cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67304 e a cepa de Paeniba- cillus sp. NRRL B-67306 como descrito no pedido de patente US No. 62/671.067. Os compostos do tipo fusaricidina incluem as Paeniserinas e Paeniprolixinas descritas em WO 2016/154297. Compostos do tipo fu- saricidina adicionais incluem os compostos do tipo fusaricidina (por exemplo, compostos 1A, 1B, 2A, 2B, 4A, 4B, 5 A e 5B) descritos em WO 2016/020371.

[0048] Como usado aqui, o verbo "compreender" como é usado nesta descrição e nas reivindicações e suas conjugações, é usado em seu sentido não limitante para significar que os itens que acompanham a palavra estão incluídos, mas os itens não mencionados especifica- mente não são excluídos. Além disso, a referência a um elemento pelo artigo indefinido "um" ou "uma" não exclui a possibilidade de que mais do que um dos elementos esteja presente, a menos que o contexto exija claramente que haja um e apenas um dos elementos. O artigo indefinido “um” ou “uma”, portanto, geralmente significa “pelo menos um”.

[0049] Em certas modalidades, a presente invenção é direcionada a uma composição fungicida estabilizada que compreende: a) uma fu- saricidina e/ou um composto do tipo fusaricidina; e b) um agente esta- bilizador selecionado do grupo que consiste em uma amina, um com- posto de amônia quaternária, um sal de fosfato ou citrato, um poliol de cadeia curta que possui de 2 a 10 átomos de carbono, uma ureia e com- binações dos mesmos.

[0050] Em outras modalidades, a presente invenção é direcionada a uma composição fungicida estabilizada que compreende: a) uma fu- saricidina e/ou um composto do tipo fusaricidina; e b) um agente esta- bilizador selecionado a partir do grupo que consiste em uma amina, um composto de amônia quaternária, um sal de fosfato ou citrato, um poliol de cadeia curta que possui de 2 a 10 átomos de carbono, uma ureia, uma alcanolamina, uma amida e combinações desses.

[0051] Em algumas modalidades, a presente invenção é direcio- nada a uma composição fungicida estabilizada que compreende: a) uma fusaricidina e/ou um composto semelhante a fusaricidina; e b) um agente estabilizador selecionado do grupo que consiste em uma dia- mida carbônica (CO(NH2)2), cloridrato de guanidina, trietanolamina, clo- ridrato de betaína, fosfato de potássio (dibásico), citrato de potássio (tri- básico) e uma combinação dos mesmos.

[0052] Em certas modalidades, a composição estabilizada compre- ende uma preparação livre de células de caldo de fermentação de uma cepa de Paenibacillus sp. Em um aspecto, a preparação livre de células compreende uma fusaricidina e/ou um composto semelhante a fusarici- dina.

[0053] Deve ser entendido que qualquer intervalo numérico citado aqui se destina a incluir todos os subintervalos. Por exemplo, uma faixa de 1 a 10 se destina a incluir todas as subfaixas entre e incluindo o valor mínimo citado de 1 e o valor máximo citado de 10, isto é, que possui um valor mínimo igual ou maior que 1 e um valor máximo valor ou inferior a

10.

[0054] A expressão "alquila", como usada aqui, a menos que defi- nido de outra forma, se refere a um grupo saturado linear, ramificado ou cíclico derivado da remoção de um átomo de hidrogênio de um al- cano. Grupos alquila de cadeia linear representativos incluem -metila, - etila, -n-propila, -n-butila, -n-pentila e n-heptila. Grupos alquila ramifica- dos representativos incluem -isopropila, -sec-butila, -isobutila, - terc-bu- tila, -isopentila, -neopentila, l-metilbutila, 2-metilbutila, 3-metilbutila, 1,1- dimetilpropila e 1,2-dimetilpropila. Grupos alquila cíclicos representati- vos incluem ciclohexila, ciclopentila e ciclopropila.

[0055] Em uma modalidade, o agente estabilizador é uma "ureia". Como usada aqui, a expressão "ureia" se refere a um composto químico com um grupo funcional constituído por um grupo carbonila li- gado a dois resíduos de amina, em que cada resíduo de amina é, inde- pendentemente, uma amina primária, uma amina secundária ou uma amina terciária. A ureia mais simples é a diamida carbônica (CO(NH2)2), em que ambos os resíduos de amina são aminas primárias.

[0056] Em certos aspectos, a ureia é uma ureia substituída de fór- mula (I) (I) em que R1, R2, e R3 são independentemente -H, -OH, C1-C6 alquila ou -R5OH; R4 é -R5OH; e R5 é C1-C6 alquila.

[0057] Espécies ilustrativas de ureia substituída são hidroximetil ureia, hidroxietil ureia, hidroxipropil ureia; bis (hidroximetil) ureia; bis (hi- droxietil) ureia; bis (hidroxipropil) ureia; N, N'-di-hidroximetil ureia; N, N'- di-hidroxietil ureia; N, N'-di-hidroxipropil ureia; N, N, N'-tri-hidroxietil ureia; tetra (hidroximetil) ureia; tetra (hidroxietil) ureia; tetra (hidroxipro- pil) ureia; N-metil-N'-hidroxietil ureia; N-etil-N'-hidroxietil ureia; N-hidro- xipropil-N'-hidroxietil ureia e N,N'-dimetil-N-hidroxietil ureia. Onde a ex- pressão hidroxipropil aparece, o significado é genérico para qualquer um dos radicais 3-hidróxi-n-propila, 2- hidróxi-n-propila, 3-hidróxi-i-propil or 2-hidróxi-i-propila.

[0058] Em algumas modalidades, o agente estabilizador é a dia- mida carbônica (CO(NH2)2) ou uma ureia substituída. Em outras moda- lidades, o agente estabilizador é uma diamida carbônica (CO(NH2)2).

[0059] Em certos aspectos, o agente estabilizador na composição ou formulação fungicida descrita compreende uma ureia e um sal de fosfato ou citrato. Em um aspecto, o sal de fosfato ou citrato é selecio- nado do grupo que consiste em fosfato de potássio monobásico, fosfato de potássio dibásico, citrato de potássio monobásico, citrato de potássio dibásico e combinações dos mesmos.

[0060] Como usada aqui, a expressão "concentração combinada" se refere à soma das concentrações dos componentes individuais refe- renciados em uma composição ou formulação. Em algumas modalida- des, a ureia e o sal de fosfato ou citrato estão presentes na composição ou formulação fungicida em uma concentração combinada entre cerca de 2% e cerca de 3%. Em outras modalidades, a ureia e o sal de fosfato ou citrato estão presentes na composição ou formulação fungicida em uma concentração combinada entre cerca de 0,1% e cerca de 3%, entre cerca de 0,5% e cerca de 3%, entre cerca de 1% e cerca de 3%, ou entre cerca de 1,5% e cerca de 3%. Em ainda outras modalidades, a ureia e o sal de fosfato ou citrato estão presentes na composição ou formulação fungicida em uma concentração combinada entre cerca de 0,1% e cerca de 2%, entre cerca de 0. 25% e cerca de 2%, entre cerca de 0,5% e cerca de 2%, ou entre cerca de 1% e cerca de 2%. Exemplos não limitantes de tais misturas de ureia e o sal de fosfato ou citrato são apresentados na Tabela 1.

[0061] Certas vantagens surgem da combinação da ureia com o sal de fosfato ou citrato na composição ou formulação. Múltiplos agentes estabilizadores aumentam a estabilidade das fusaricidinas e compostos semelhantes a fusaricidina, e no caso de um dos agentes estabilizado- res falhar em condições adversas, outro agente estabilizador pode ainda estar ativo e exercer um efeito protetor. Além disso, os sais dos ácidos polipróticos (isto é, os sais de fosfato e citrato) fornecem um efeito de tamponamento do pH na composição ou formulação, o que estabiliza ainda mais o sistema. Tabela 1. Exemplos não limitantes de agentes estabilizadores com efeito melhorado de inibição da degradação de fusaricidinas e com- postos semelhantes a fusaricidinas Agente estabili- Mistura 1 Mistura Mistura Mistura 4 Mistura 5 Mistura 6 Mistura 7 Mistura 8 zador 2 3 Ureia 2% a 1% 2% a 1% 2% a 1% 2% a 1% 2% a 1% 2% a 1% 2% a 1% 2% a 1% Fosfato de Potás- sio Monobásico 1% a 2% -- -- -- 0% a 1% -- -- -- (KH2PO4) Fosfato de Potás- sio Dibásico -- 1% a 2% -- -- -- 0% a 1% -- -- (K2HPO4) Citrato de Potás- sio Monobásico -- -- 1% a 2% -- -- -- 0% a 1% -- (C6H7KO7) Citrato de Potás- sio Dibásico -- -- -- 1% a 2% -- -- -- 0% a 1% (C6H6K2O7) Concentração Total do Estabili- 3% 3% 3% 3% 2% 2% 2% 2% zador

[0062] Em alguns aspectos, o agente estabilizador é uma alcanola- mina. Como usada aqui, uma "alcanolamina" é um composto químico eu contém grupos funcionais hidroxila (-OH) e amina (isto é, uma amina primária, secundária ou terciária) em um arcabouço de alcano.

[0063] Em um aspecto, a alcanolamina é um aminoálcool. Em outro aspecto, o aminoálcool é etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, isopropanolamina, diisopropanolamina (DIPA), triisopropanolamina (TIP A), metanolamina, aminometil propanol, heptaminol, dimetiletanolamina ou N-metiletanolamina. Em ainda outro aspecto, o aminoálcool é etano- lamina, dietanolamina, trietanolamina, isopropanolamina, diisopropano- lamina (DIPA), triisopropanolamina (TIPA) ou metanolamina. Em algu- mas modalidades, o aminoálcool é etanolamina, dietanolamina ou trie- tanolamina. Em uma determinada modalidade, o aminoálcool é trietano- lamina.

[0064] Em ainda outras modalidades, o agente estabilizador é uma amida. Em algumas modalidades, a amida é uma amida orgânica, uma sulfonamida ou uma fosforamida.

[0065] Em um aspecto, a amida orgânica é uma carboxamida. Em algumas modalidades, a carboxamida é acetamida ou benzamida.

[0066] Em algumas modalidades, a composição ou formulação fun- gicida descrita compreende ainda um inibidor de protease. Em certos aspectos, o inibidor de protease é um inibidor de protease aspártica, inibidor de cisteína protease, inibidor de metaloprotease, inibidor de se- rina protease, inibidor de treonina protease ou inibidor de tripsina. Em um aspecto, o inibidor de tripsina é um inibidor de tripsina de soja Kunitz, também conhecido como um inibidor de protease Kunitz STI. Em outros aspectos, o inibidor de protease é um inibidor suicida, inibidor do estado de transição, inibidor da proteína protease ou agente quelante. Em um aspecto, o inibidor da proteína protease é uma serpina.

[0067] Os microrganismos e cepas particulares aqui descritas, a menos que especificamente indicado de outra forma, são todos separa- dos da natureza e cultivados sob condições artificiais, tal como em cul- turas em frasco de agitação ou por meio de processos de fabricação em escala, tal como em biorreatores para maximizar a produção de meta- bolitos bioativos, por exemplo. O crescimento sob tais condições leva à

"domesticação" da cepa. Geralmente, tal cepa "domesticada" difere de suas contrapartes encontradas na natureza pelo fato de ser cultivada como uma população homogênea que não está sujeita às pressões de seleção encontradas no ambiente natural, mas sim a pressões de sele- ção artificial.

[0068] Os microrganismos da invenção ou culturas ou isolados dos mesmos, podem ser descritos como estando em uma forma "isolada" ou "biologicamente pura". Estas expressões pretendem significar que os microrganismos foram separados de um ambiente ou um ou mais constituintes, celulares ou outros, aos quais eles podem estar associa- dos se encontrados na natureza ou de outra forma. As expressões "iso- lado" ou "biologicamente puro" não devem ser consideradas para indi- car a extensão na qual os microrganismos foram purificados. No en- tanto, em uma modalidade, os isolados ou culturas dos microrganismos contêm uma predominância dos microrganismos da invenção.

[0069] A cultura da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 dá ori- gem a uma cepa variante espontânea com uma morfologia de colônia estável, designada aqui como cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-

67129. A cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67129 está intimamente relacionada à cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972, exceto que a cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67129 expressa Spo0A com uma única substituição de aminoácido em comparação com o Spo0A ex- pressa pela cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972.

[0070] Em uma modalidade, uma cepa mutante da cepa de Paeni- bacillus sp. NRRL B- 50972, cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67129, cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67304, cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67306 ou cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67615 é forne- cida. A expressão "mutante" se refere a uma variante genética derivada de uma cepa de Paenibacillus sp. Em uma modalidade, o mutante tem uma ou mais ou todas as características de identificação (funcionais) da cepa de Paenibacillus sp. Em um caso particular, o mutante ou um pro- duto de fermentação do mesmo controla (como uma característica fun- cional de identificação) fungos e/ou bactérias, pelo menos tão bem quanto a cepa parental de Paenibacillus sp. Tais mutantes podem ser variantes genéticas que possuem uma sequência genômica que tem mais do que cerca de 85%, mais do que cerca de 90%, mais do que cerca de 95%, mais do que cerca de 98%, ou mais do que cerca de 99% de identidade de sequência com a cepa parental de Paenibacillus sp. Os mutantes podem ser obtidos pelo tratamento das células da cepa de Paenibacillus sp. com produtos químicos ou irradiação ou pela seleção de mutantes espontâneos de uma população de células da cepa de Pa- enibacillus sp. (tais como mutantes resistentes a fagos ou resistentes a antibióticos), pelo embaralhamento do genoma, como descrito abaixo, ou por outros meios bem conhecidos por aqueles versados na técnica.

[0071] O embaralhamento do genoma entre as cepas de Paeniba- cillus pode ser facilitado através do uso de um processo denominado fusão de protoplasto. O processo começa com a formação de protoplas- tos a partir de células bacilares vegetativas. A remoção da parede celu- lar do peptideoglicano, tipicamente usando lisozima e um estabilizador osmótico, resulta na formação de um protoplasto. Este processo é visí- vel ao microscópio óptico com a aparência de células esféricas. A adi- ção de PEG, polietileno glicol, induz a fusão entre os protoplastos, per- mitindo que os conteúdos genéticos de duas ou mais células entrem em contato, facilitando a recombinação e o embaralhamento do ge- noma. As células fundidas, então, são repartidas e recuperadas em um meio de crescimento sólido. Durante a recuperação, os protoplastos re- constroem as paredes celulares do peptideoglicano, fazendo a transição de volta à forma bacilar. Veja Schaeffer, et. al., (1976) PNAS USA, vol. 73, 6:

[0072] A cepa de Paenibacilus sp. NRRL B-50972, cepa de Paeni- bacilus sp. NRRL B-67129, cepa de Paenibacilus sp. NRRL B-67304, cepa de Paenibacilus sp. NRRL B-67306, cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67615 e seus mutantes têm atividade contra uma ampla gama de patógenos de plantas. Em um aspecto, as cepas têm atividade contra fungos, tais como antracnose do pepino, míldio pulverulento do pepino, ferrugem da folha do trigo, míldio pulverulento da cevada, Alternaria e Botrytis; Oomicetos, como a ferrugem tardia do tomate, míldio penu- gento do pepino e míldio penugento da brassica; e/ou bactérias, como Pseudomonas, Xanthomonas e Erwinia.

[0073] A presente invenção também abrange métodos de trata- mento de uma planta para controlar doenças de planta pela administra- ção a uma planta ou a uma parte da planta, tal como uma folha, caule, flores, fruto, raiz ou semente ou pela aplicação a um local no qual planta ou partes de planta crescem, tal como solo, formulações aquosas ou composições fungicidas que compreendem uma cepa de Paenibacillus sp. produtora de fusaricidina e um agente estabilizador selecionado do grupo que consiste em ureia, cloridrato de guanidina, trietanolamina, cloridrato de betaína, fosfato de potássio (dibásico), citrato de potássio (tribásico) e uma combinação dos mesmos.

[0074] Em um método de acordo com a invenção, a composição ou formulação pode ser aplicada a qualquer planta ou qualquer parte de qualquer planta cultivada em qualquer tipo de meio usado para cultivar plantas (por exemplo, solo, vermiculita, papelão picado e água) ou apli- cada a plantas ou partes de plantas aéreas cultivadas, tais como orquí- deas ou samambaias chifre de veado. A composição ou formulação po- dem, por exemplo, ser aplicadas por pulverização, atomização, vapori- zação, dispersão, rega, esguicho, aspersão, derramamento ou fumiga- ção. Como já indicado acima, a aplicação pode ser realizada em qual- quer local desejado onde a planta de interesse está posicionada, tal como agricultura, horticultura, floresta, plantação, pomar, viveiro, cultu- ras cultivadas organicamente, grama e ambientes urbanos.

[0075] As composições da presente invenção podem ser obtidas pela cultura de uma cepa de Paenibacillus sp. produtora de fusaricidina de acordo com métodos bem conhecidos na técnica, incluindo o uso de meios e outros métodos descritos nos exemplos abaixo. Os processos convencionais de cultura microbiana em grande escala incluem fermen- tação submersa, fermentação em estado sólido ou cultura de superfície líquida. Perto do final da fermentação, os nutrientes se esgotam, as cé- lulas começam a transição da fase de crescimento para a fase de espo- rulação, de modo que o produto final da fermentação é em grande parte esporos, metabolitos e meio de fermentação residual. A esporulação faz parte do ciclo de vida natural do Paenibacillus e geralmente é iniciada pela célula em resposta à limitação de nutrientes. A fermentação é con- figurada para obter altos níveis de unidades formadoras de colônias e para promover a esporulação. As células bacterianas, esporos e meta- bolitos em meios de cultura resultantes da fermentação podem ser usa- dos diretamente ou concentrados por métodos industriais convencio- nais, como centrifugação, filtração de fluxo tangencial, filtração em pro- fundidade e evaporação.

[0076] As composições da presente invenção incluem produtos de fermentação. Em algumas modalidades, o caldo de fermentação con- centrado é lavado, por exemplo, através de um processo de diafiltração, para remover o caldo de fermentação residual e metabolitos. A expres- são "concentrado de caldo", como aqui utilizada, se refere a um caldo integral (caldo de fermentação) que foi concentrado por métodos indus- triais convencionais, conforme descrito acima, mas permanece na forma líquida. A expressão "sólido de fermentação", tal como aqui utilizada, se refere ao material sólido que permanece após a secagem do caldo de fermentação. A expressão "produto de fermentação", tal como aqui uti- lizada, se refere ao caldo integral, concentrado de caldo e/ou sólidos de fermentação. As composições da presente invenção incluem produtos de fermentação.

[0077] As preparações livres de células de caldo de fermentação das cepas da presente invenção podem ser obtidas por qualquer meio conhecido na técnica, tal como extração, centrifugação e/ou filtração de caldo de fermentação. Aqueles versados na técnica apreciarão que as chamadas preparações livres de células podem não ser desprovidas de células, mas sim amplamente livres de células ou essencialmente livres de células, dependendo da técnica utilizada (por exemplo, velocidade de centrifugação) para remover o células. A preparação livre de células resultante pode ser formulada com componentes que auxiliam na sua aplicação em plantas ou em meios de crescimento de plantas. Os mé- todos de concentração e as técnicas de secagem descritos acima para o caldo de fermentação também são aplicáveis a preparações sem cé- lulas.

[0078] Em uma modalidade, o produto de fermentação compreende pelo menos cerca de 1 x 104 unidades formadoras de colônia (CFU) do microrganismo (por exemplo, cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 ou uma cepa fungicida mutante da mesma)/mL de caldo. Em outra mo- dalidade, o produto de fermentação compreende pelo menos cerca de 1 x 105 unidades formadoras de colônia (CFU) do microrganismo (por exemplo, cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 ou uma cepa fungi- cida mutante da mesma)/mL de caldo. Em outra modalidade, o produto de fermentação compreende pelo menos cerca de 1 x 106 CFU do mi- crorganismo (por exemplo, cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 ou uma cepa fungicida mutante da mesma)/mL de caldo. Em ainda outra modalidade, o produto de fermentação compreende pelo menos cerca de 1 x 107 CFU do microrganismo (por exemplo, cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 ou uma cepa fungicida mutante da mesma)/mL de caldo Em outra modalidade, o produto de fermentação compreende pelo menos cerca de 1 x 108 CFU do microrganismo (por exemplo, cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 ou uma cepa fungicida mutante da mesma)/mL de caldo. Em outra modalidade, o produto de fermentação compreende pelo menos cerca de 1 x 109 CFU do microrganismo (por exemplo, cepa de Paenibacilus sp. NRRL B-50972 ou uma cepa fungi- cida mutante da mesma)/mL de caldo. Em outra modalidade, o produto de fermentação compreende pelo menos cerca de 1 x 1010 CFU do mi- crorganismo (por exemplo, o produto de fermentação compreende pelo menos cerca de 1 x 1011 CFU do microrganismo (por exemplo, cepa de Paenibacilus sp. NRRL B-50972 ou uma cepa fungicida mutante da mesma)/mL de caldo.

[0079] As composições da invenção podem ser utilizadas como ou dependendo de suas propriedades físicas e/ou químicas particulares, na forma de suas formulações ou formas de uso preparadas a partir das mesmas, tais como aerossóis, suspensões, cápsulas, concentrados de nebulização a frio, concentrados de nebulização a quente, grânulos en- capsulados, grânulos finos, concentrados fluxíveis para o tratamento de sementes, soluções prontas para uso, pós pulverizáveis, concentrados emulsionáveis, emulsões óleo em água, emulsões água em óleo, ma- crogrânulos, microgrânulos, pós dispersáveis em óleo, concentrados fluxíveis miscíveis em óleo, líquidos miscíveis em óleo, gás (sob pres- são), produtos que geram gás, espumas, pastas, semente revestida por pesticida, concentrados em suspensão, dispersão em óleo, suspo-emul- sões concentradas, concentrados solúveis, suspensões, pós molháveis, pós solúveis, névoas e grânulos, grânulos ou comprimidos solúveis em água e dispersáveis em água, pós solúveis em água e dispersáveis em água para o tratamento de sementes, produtos naturais e substancias sintéticas impregnadas com o ingrediente ativo e também microencap- sulação em substancias poliméricas e em materiais de revestimento para semente e também formulações ULV para vaporização a frio e va- porização a quente.

[0080] Em algumas modalidades, as composições inventivas são formulações líquidas. Exemplos não limitantes de formulações líquidas incluem concentrações de suspensão e dispersões de óleo.

[0081] As composições da presente invenção podem incluir subs- tâncias inertes para formulação adicionadas às composições que com- preendem células, preparações livres de células ou metabolitos para melhorar a eficácia, estabilidade e usabilidade e/ou para facilitar o pro- cessamento, embalagem e aplicação de uso final. Tais substâncias inertes e ingredientes para formulação podem incluir veículos, agentes de estabilização, nutrientes ou agentes modificadores de propriedades físicas, que podem ser adicionados individualmente ou em combina- ção. Em algumas modalidades, os veículos podem incluir materiais lí- quidos, tais como água, óleo e outros solventes orgânicos ou inorgâni- cos e materiais sólidos, tais como minerais, polímeros ou complexos de polímeros derivados biologicamente ou por síntese química. Em algu- mas modalidades, o veículo é um aglutinante ou adesivo que facilita a aderência da composição a uma parte da planta, tal como uma semente ou raiz. Veja, por exemplo, Taylor, AG, et al., "Concepts and Technolo- gies of Selected Seed Treatments", Annu. Rev. Phytopathol. 28: 321- 339 (1990). Os agentes de estabilização podem incluir agentes anti- aglomeração, agentes antioxidantes, dessecantes, protetores ou con- servantes. Os nutrientes podem incluir fontes de carbono, nitrogênio e fósforo, tais como açúcares, polissacarídeos, óleo, proteínas, aminoáci- dos, ácidos graxos e fosfatos. Os modificadores de propriedades físicas podem incluir agentes de volume, agentes umectantes, espessantes,

modificadores de pH, modificadores da reologia, dispersantes, adjuvan- tes, tensoativos, agentes anticongelantes ou corantes. Em algumas mo- dalidades, a composição que compreende células, preparação sem cé- lulas ou metabolitos produzidos pela fermentação pode ser usada dire- tamente com ou sem água como o diluente sem qualquer outra prepa- ração de formulação. Em algumas modalidades, as substâncias inertes para formulação são adicionadas depois da concentração do caldo de fermentação e durante e/ou depois da secagem.

[0082] Todas as plantas e partes de plantas podem ser tratadas de acordo com a invenção. No presente contexto, plantas são entendidas como significando todas as plantas e populações de plantas, tais como plantas selvagens ou plantas de cultivo desejadas e indesejadas (inclu- indo plantas de cultivo de ocorrência natural). As plantas de cultivo po- dem ser plantas que podem ser obtidas por métodos tradicionais de me- lhoramento e otimização ou por métodos biotecnológicos e recombinan- tes, ou combinações desses métodos, incluindo as plantas transgênicas e incluindo as variedades de plantas capazes ou não de serem protegi- das pelos Plant Breeders’ Rights. Por partes de plantas entende-se to- das as partes aéreas e subterrâneas e órgãos das plantas, tais como caule, folha, flor e raiz, exemplos que podem ser mencionados sendo folhas, agulhas, pedúnculos, caules, flores, corpos frutíferos, frutos e sementes e também raízes, tubérculos e rizomas. As partes da planta também incluem material de cultura e material de propagação vegeta- tivo e generativo, por exemplo, estacas, tubérculos, rizomas, mudas e sementes.

[0083] Como já foi mencionado acima, todas as plantas e suas par- tes podem ser tratadas de acordo com a invenção. Em uma modalidade preferida, espécies de plantas e variedades de plantas, e suas partes, que crescem selvagens ou que são obtidas por métodos tradicionais de reprodução biológica, tal como hibridização ou fusão de protoplastos,

são tratadas. Em uma outra modalidade preferida, plantas transgênicas e variedades de plantas que foram obtidas por métodos recombinantes, se apropriado em combinação com métodos tradicionais (organismos geneticamente modificados) e suas partes são tratadas. A expressão "partes" ou "partes de plantas" foi explicada acima. As plantas das vari- edades de plantas que estão em cada caso comercialmente disponíveis ou em uso são tratadas com especial preferência de acordo com a in- venção. Variedades de plantas são entendidas como significando plan- tas com novas características que foram cultivadas tanto por cruza- mento tradicional, por mutagênese ou por técnicas de DNA recombi- nante. Elas podem assumir a forma de variedades, raças, biotipos e ge- nótipos.

[0084] O tratamento das plantas e partes das plantas com as com- posições de acordo com a invenção é realizado diretamente ou pela ação no ambiente, habitat ou espaço de armazenamento usando méto- dos de tratamento habituais, por exemplo, por imersão, pulverização, atomização, nebulização, evaporação, vaporização, nebulização, dis- persão, formação de espuma, pintura, espalhamento, injeção, enchar- camento, irrigação por gotejamento e, no caso de material de propaga- ção, em particular no caso de sementes, além do método de tratamento de sementes secas, o método de tratamento de sementes úmidas, o método de tratamento com emulsão, por incrustação, por revestimento com um ou mais revestimentos e semelhantes. Além disso, é possível aplicar as substâncias ativas pelo método de volume ultrabaixo ou inje- tar a preparação da substância ativa ou a própria substância ativa no solo.

[0085] Um tratamento direto preferido das plantas é o tratamento de aplicação na folha, isto é, as composições de acordo com a invenção são aplicadas na folhagem, sendo possível que a frequência de trata-

mento e taxa de aplicação sejam combinadas com a pressão da infec- ção do patógeno em questão.

[0086] No caso dos compostos sistemicamente ativos, as composi- ções de acordo com a invenção chegam às plantas através do sistema radicular. Neste caso, o tratamento das plantas é efetuado permitindo que as composições de acordo com a invenção atuem sobre o ambiente da planta. Isso pode ser feito, por exemplo, por encharcamento, incor- poração no solo ou na solução de nutrientes, isto é, a localização da planta (por exemplo, o solo ou sistemas hidropônicos) é impregnada com uma forma líquida das composições de acordo com a invenção, ou por aplicação no solo, isto é, as composições de acordo com a invenção são incorporadas no local das plantas na forma sólida (por exemplo na forma de grânulos). No caso das culturas de arroz, isso pode ser feito pela dosagem das composições de acordo com a invenção em um campo de arroz inundado em uma forma de uso sólida (por exemplo, na forma de grânulos).

[0087] As plantas preferidas são as do grupo das plantas úteis, or- namentais, gramas, árvores geralmente utilizadas que são empregadas na ornamentação nos setores público e doméstico e árvores flores- tais. As árvores florestais compreendem árvores para a produção de madeira, celulose, papel e produtos feitos de partes das árvores.

[0088] A expressão "plantas úteis", conforme usada no presente contexto, se refere a plantas de cultivo que são empregadas como plan- tas para a obtenção de alimentos, rações, combustíveis ou para fins in- dustriais.

[0089] As plantas úteis que podem ser tratadas e/ou melhoradas com as composições e métodos da presente invenção incluem, por exemplo, os seguintes tipos de plantas: grama, videiras, cereais, por exemplo, trigo, cevada, centeio, aveia, arroz, milho e milheto/ sorgo; be- terraba, por exemplo beterraba açucareira e beterraba forrageira; frutas,

por exemplo, pomáceas, frutas com caroço e frutas macias, por exemplo maçãs, peras, ameixas, pêssegos, amêndoas, cerejas e bagas, por exemplo morangos, framboesas, amoras; legumes, por exemplo feijão, lentilha, ervilha e soja; culturas de oleaginosas, por exemplo colza, mos- tarda, papoulas, azeitonas, girassóis, cocos, plantas de mamona, cacau e amendoim; cucurbitáceas, por exemplo abóbora/ squash, pepinos e melões; plantas de fibra, por exemplo algodão, linho, cânhamo e juta; frutas cítricas, por exemplo, laranjas, limões, toranja e tangeri- nas; vegetais, por exemplo espinafre, alface, aspargos, espécies de re- polho, cenouras, cebolas, tomates, batatas e pimentões; Lauraceae, por exemplo, abacate, Cinnamomum, cânfora ou plantas como tabaco, no- zes, café, berinjela, cana-de-açúcar, chá, pimenta, videiras, lúpulo, ba- nanas, seringueiras e plantas ornamentais, por exemplo flores, arbus- tos, árvores decíduas e arvores coníferas. Essa enumeração não é uma limitação.

[0090] As seguintes plantas são consideradas alvos de cultura par- ticularmente adequados para a aplicação de composições e métodos da presente invenção: algodão, berinjela, grama, pomáceas, frutas de caroço, frutas macias, milho, trigo, cevada, pepino, tabaco, videiras, ar- roz, cereais, pera, feijão, soja, colza, tomate, pimentão, melão, repolho, batata e maçã.

[0091] A presente invenção também pode ser aplicada a qualquer tipo de gramínea, incluindo gramíneas de estação fria e gramíneas de estação quente. Exemplos de gramíneas de estação fria são grama-azul (Poa ssp.), tal como a grama-azul do Kentucky (Poa pratensis L.), grama-azul áspera (Poa trivialis L.), grama-azul do Canadá (Poa com- pressa L.), grama-azul anual (Poa annua L .), grama-azul de terras altas (Poa glaucantha Gaudin), grama-azul de madeira (Poa nemoralis L.) e grama-azul bulbosa (Poa bulbosa L.); bentgrass (Agrostis ssp.), tais como creeping bentgrass (Agrostis palustris Huds.), bentgrass colonial

(Agrostis tenuis Sibth.), bentgrass aveludada (Agrostis canina L.), ben- tgrass mista do sul da Alemanha (Agrostis ssp. incluindo Agrostis tenuis Sibth., Agrostis canina L. e Agrostis palustris Huds.) e redtop (Agrostis alba L.);

[0092] Festucas (Festuca ssp.), tal como festuca vermelha (Fes- tuca rubra L. ssp. rubra), festuca rasteira (Festuca rubra L.), festuca de mascar (Festuca rubra commutata Gaud.), Festuca de ovelha (Festuca ovina L.) ), festuca dura (Festuca longifolia Thuill.), festuca de cabelo (Festucu capillata Lam.), festuca alta (Festuca arundinacea Schreb.) e festuca do prado (Festuca elanor L.);

[0093] Azevém (Lolium ssp.), tal como azevém anual (Lolium multi- florum Lam.), Azevém perene (Lolium perenne L.) e azevém italiano (Lolium multiflorum Lam.);

[0094] Grama de trigo (Agropyron ssp.), tal como grama de trigo fairway (Agropyron cristatum (L.) Gaertn.), grama de trigo crested (Agropyron desertorum (Fisch.) Schult.) grama de trigo ocidental (Agropyron smithii Rydb.)

[0095] Exemplos adicionais de gramíneas de estação fria são grama marrom americana (Ammophila breviligulata Fern), grama forra- geira lisa (Bromus inermis Leyss.), junco tal como timothy (Phleum pra- tense L.), taboa da areia (Phleum subulatum L.), grama de pomar (Dac- tylis glomerata L.), grama alcalina europeia (Puccinellia distans (L.) Pari.) e rabo de cão (Cynosurus cristatus L.).

[0096] Exemplos de gramíneas de estação quente são grama de Bermuda (Cynodon ssp. LC Rich), grama zoysia (Zoysia ssp. Willd.), grama St. Augustine (Stenotaphrum secundatum Walt Kuntze), grama centípede (Eremochloa ophiuroides Munro Hack. ), capim-carpete (Axo- nopus affinis Chase), capim Bahia (Paspalum notatum Flugge), capim Kikuyu (Pennisetum clandestinum Hochst. ex Chiov.), capim-búfalo (Bu- chloe dactyloids (Nutt.) Engelm.), grama azul (Bouteloua gracilis (HBK)

Lag. Ex Griffiths), seashore paspalum (Paspalum vaginatum Swartz) e sideoats grama (Bouteloua curtipendula (Michx. Torr.). Gramíneas de estação fria são geralmente preferidas para uso de acordo com a inven- ção. São especialmente preferidas a grama azul, bentgrass e redtop, festucas e azevém. Bentgrass é especialmente preferida.

[0097] As composições da invenção têm uma potente atividade mi- crobicida e podem ser utilizadas para o controle de microrganismos in- desejáveis, tais como fungos e bactérias, na proteção de culturas e na proteção de materiais.

[0098] A invenção também se refere a um método para o controle de microrganismos indesejáveis, caracterizado pelo fato de que as com- posições da invenção são aplicadas aos fungos fitopatogênicos, bacté- rias fitopatogênicas e/ou ao seu habitat.

[0099] Fungicidas podem ser usados na proteção de culturas para o controle de fungos fitopatogênicos. Eles são caracterizados por uma excelente eficácia contra um amplo espectro de fungos fitopatogênicos, incluindo patógenos do solo, que são em particular membros das clas- ses Plasmodiophoromycetes, Peronosporomycetes (Syn. Oomycetes), Chytridiomycetes, Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes e Deu- teromycetes (Syn. Fungi imperfecti). Alguns fungicidas são sistemica- mente ativos e podem ser usados na proteção de plantas como um fun- gicida foliar, no revestimento de sementes ou fungicida de solo. Além disso, são adequados para combater fungos que, inter alia, infestam madeira ou raízes de plantas.

[00100] Os bactericidas podem ser usados na proteção de culturas para o controle de Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Enterobacteria- ceae, Corynebacteriaceae e Streptomycetaceae.

[00101] Exemplos não limitantes de patógenos de doenças fúngicas que podem ser tratados de acordo com a invenção incluem:

[00102] Doenças causadas por patógenos de míldio pulverulento,

por exemplo espécies de Blumeria, por exemplo, Blumeria graminis; es- pécies de Podosphaera, por exemplo, Podosphaera leucotricha; espé- cies de Sphaerotheca, por exemplo, Sphaerotheca fuliginea; espécies Uncinula, por exemplo, Uncinula necator;

[00103] Doenças causadas por patógenos da doença ferrugem, por exemplo, Gymnosporangium, por exemplo, Gymnosporangium sabi- nae; espécies de Hemileia, por exemplo, Hemileia vastatrix; espécies Phakopsora, por exemplo, Phakopsora pachyrhizi e Phakopsora meibo- miae; Espécies Puccinia, por exemplo, Puccinia recondite, P. triticina, P. graminis ou P. striiformis; espécies Uromyces, por exemplo, Uromyces appendiculatus;

[00104] Doenças causadas pelos patógenos do grupo de Oomyce- tes, por exemplo, espécies de Albugo, por exemplo, Albugo candida; espécies de Bremia, por exemplo, Bremia lactucae; espécies de Pero- nospora, por exemplo, Peronospora pisi ou P. brassicae; espécies de Phytophthora, por exemplo, Phytophthora infestans; espécies de Plas- mopara, por exemplo, Plasmopara viticola; espécies de Pseudopero- nospora, por exemplo, Pseudoperonospora humuli ou Pseudoperonos- pora cubensis; espécies de Pythium, por exemplo, Pythium ultimum;

[00105] Doenças da mancha da folha e doenças da murcha da folha causadas, por exemplo, por espécies de Alternaria, por exemplo, Alter- naria solani; espécies de Cercospora, por exemplo, Cercospora beti- cola; espécies de Cladiosporium, por exemplo, Cladiosporium cucume- rinum; espécies de Cochliobolus, por exemplo, Cochliobolus sativus (forma de conídios: Drechslera, Syn: Helminthosporium), Cochliobolus miyabeanus; espécies de Colletotrichum, por exemplo, Colletotrichum lindemuthanium; Cycloconium, por exemplo, Cycloconium oleaginum; espécies de Diaporthe, por exemplo, espécies de Diaporthe citri; espé- cies de Elsinoe, por exemplo, Elsinoe fawcettii; espécies de Gloeospo- rium, por exemplo, Gloeosporium laeticolor; espécies de Glomerella, por exemplo, Glomerella cingulata; espécies de Guignardia, por exemplo, Guignardia bidwelli; espécies de Leptosphaeria, por exemplo, Leptos- phaeria maculans, Leptosphaeria nodorum; espécies de Magnaporthe, por exemplo, Magnaporthe grisea; Marssonia, por exemplo, Marssonia coronaria; espécies de Microdochium, por exemplo, Microdochium ni- vale; espécies de Mycosphaerella, por exemplo, Mycosphaerella grami- nicola, M. arachidicola e M. fijiensis; espécies de Phaeosphaeria, por exemplo, Phaeosphaeria nodorum; espécies de Pyrenophora, por exemplo, Pyrenophora teres, Pyrenophora tritici repentis; espécies de Ramularia, por exemplo, Ramularia collo-cygni, Ramularia areola; espé- cies de Rhynchosporium, por exemplo, Rhynchosporium secalis; espé- cies de Septoria, por exemplo, Septoria apii, Septoria lycopersii; espé- cies de Typhula, por exemplo, Typhula incarnata; espécies de Venturia, por exemplo, Venturia inaequalis;

[00106] Doenças da raiz e do caule causadas, por exemplo, por es- pécies de Corticium, por exemplo, Corticium graminearum; espécies de Fusarium, por exemplo, Fusarium oxysporum; espécies de Gaeuman- nomyces, por exemplo, Gaeumannomyces graminis; espécies de Rhi- zoctonia, por exemplo, Rhizoctonia solani; doenças causadas por Saro- cladium por exemplo, por Sarocladium oryzae; doenças causadas por Sclerotium, por exemplo, por Sclerotium oryzae; espécies de Tapesia, por exemplo, Tapesia acuformis; espécies de Thielaviopsis, por exem- plo, Thielaviopsis basicola;

[00107] Doenças do grão e da panícula (incluindo espigas de milho) causadas, por exemplo, por espécies de Alternaria, por exemplo, Alter- naria ssp.; espécies de Aspergillus, por exemplo, Aspergillus flavus; es- pécies de Cladosporium, por exemplo, Cladosporium cladosporioides; espécies de Claviceps, por exemplo, Claviceps purpureia; espécies de Fusarium, por exemplo, Fusarium culmorum; espécies de Gibberella,

por exemplo, Gibberella zeae; espécies de Monographella, por exem- plo, Monographella nivalis; espécies de Septoria, por exemplo, Septoria nodorum;

[00108] Doenças causadas por fungos carvão, por exemplo, , espé- cies de Sphacelotheca, por exemplo, Sphacelotheca reiliana; espécies de Tilletia, por exemplo, Tilletia caries, T. controversa; espécies de Urocystis, por exemplo, Urocystis occulta; espécies de Ustilago, por exemplo, Ustilago nuda, U. nuda tritici;

[00109] Apodrecimento dos frutos causado, por exemplo, por Asper- gillus espécies de, por exemplo, Aspergillus flavus; espécies de Botrytis, por exemplo, Botrytis cinerea; espécies de Penicillium, por exemplo, Pe- nicillium expansum e P. purpurogenum; espécies de Sclerotinia, por exemplo, Sclerotinia sclerotiorum; espécies de Verticilium, por exemplo, Verticilium alboatrum;

[00110] Decomposição da semente e do solo, mofo, murchamento, apodrecimento e umidificação causadas, por exemplo, por espécies de Alternaria, causadas, por exemplo, por Alternaria brassicicola; espécies de Aphanomyces, causadas, por exemplo, por Aphanomyces eutei- ches; espécies de Ascochyta, causadas, por exemplo, por Ascochyta lentis; espécies de Aspergillus, causada, por exemplo, por Aspergillus flavus; espécies de Cladosporium, causada, por exemplo, por Clados- porium herbarum; espécies de Cochliobolus, causadas, por exemplo, por Cochliobolus sativus; (Forma de conídia: Drechslera, Bipolaris Syn: Helminthosporium); espécies de Colletotrichum, causadas, por exem- plo, por Colletotrichum coccodes; espécies de Fusarium, causadas, por exemplo, por Fusarium culmorum; espécies de Gibberella, causadas, por exemplo, por Gibberella zeae; espécies de Macrophomina, causa- das, por exemplo, por Macrophomina phaseolina; espécies de Mono- graphella, causadas, por exemplo, por Monographella nivalis; espécies de Penicillium, causadas, por exemplo, por Penicillium expansum; es- pécies de Phoma, causadas, por exemplo, por Phoma lingam; espécies de Phomopsis, causadas, por exemplo, por Phomopsis sojae; espécies de Phytophthora, causadas, por exemplo, por Phytophthora cacto- rum; espécies de Pyrenophora, causadas, por exemplo, por Pyre- nophora graminea; espécies de Pyricularia, causadas, por exemplo, por Pyricularia oryzae; espécies de Pythium, causadas, por exemplo, por Pythium ultimum; espécies de Rhizoctonia, causadas, por exemplo, por Rhizoctonia solani; espécies de Rhizopus, causada, por exemplo, por Rhizopus oryzae; espécies de Sclerotium, causadas, por exemplo, por Sclerotium rolfsii; espécies de Septoria, causadas, por exemplo, por Septoria nodorum; espécies de Typhula, causadas, por exemplo, por Typhula incarnata; espécies de Verticillium, causadas, por exemplo, por Verticillium dahliae;

[00111] Cancros, galhas e vassoura de bruxa causadas, por exem- plo, por espécies de Nectria, por exemplo, Nectria galligena;

[00112] Doenças de murchamento causadas, por exemplo, por es- pécies de Monilinia, por exemplo Monilinia laxa;

[00113] Doenças de bolhas nas folhas ou ondulações nas folhas cau- sadas, por exemplo, por espécies de Exobasidium, por exemplo, Exo- basidium vexans;

[00114] Espécies de Taphrina, por exemplo, Taphrina deformans;

[00115] Doenças com declínio de plantas de madeira causadas, por exemplo, pela doença de Esca, causada, por exemplo, por Phaemoni- ella clamydospora, Phaeoacremonium aleophilum e Fomitiporia medi- terranea; Eutypa dyeback, causado, por exemplo, por Eutypa lata; do- enças por Ganoderma causadas, por exemplo, por Ganoderma boni- nense; doenças por Rigidoporus causadas, por exemplo, por Rigidopo- rus lignosus;

[00116] Doenças de flores e sementes causadas, por exemplo, por espécies de Botrytis, por exemplo, Botrytis cinérea;

[00117] Doenças de tubérculos de plantas causadas, por exemplo, por espécies de Rhizoctonia, por exemplo Rhizoctonia solani, espécies de Helminthosporium, por exemplo Helminthosporium solani;

[00118] Aglomeração da raiz causada, por exemplo, por espécies de Plasmodiophora, por exemplo, Plasmodiophora brassicae;

[00119] Doenças causadas por patógenos bacterianos, por exemplo espécies de Xanthomonas, por exemplo Xanthomonas campestris pv. oryzae; espécies de Pseudomonas, por exemplo Pseudomonas syringae pv. lachrymans; espécies de Erwinia, por exemplo Erwinia amylovora.

[00120] As seguintes doenças de feijões de soja podem ser contro- ladas de preferência:

[00121] Doenças fúngicas das folhas, caules, vagens e sementes causadas, por exemplo, pela mancha foliar por Alternaria (Alternaria spec, atrans tenuissima), Antracnose (Colletotrichum gloeosporoides dematium var. truncatum), mancha marrom (Septoria glycines), mancha e ferrugem da folha por cercospora (Cercospora Idkuchii), mancha da folha por coanefora (Choanephora infundibulifera trispora (Syn.)), man- cha da folha por dactuliofora (Dactuliophora glycines), míldio penugento (Pershuronica), mancha por drechslera (Drechslera glycini), mancha fo- liar em olho de sapo (Cercospora sojina), mancha foliar por leptosfaeru- lina (Leptosphaerulina trifolii), mancha foliar por filostica (Phyllosticta so- jaecola), ferrugem da vagem e do caule (Phomopsis sojae), míldio pul- verulento (Microsphaera Pyrocusa), mancha foliar por pirenoqueta (Pyrenochaeta glycines), rizoctonia aérea, folhagem e mancha areolada (Rhizoctonia solani), ferrugem (Phakopsora pachyrhizi, Phakopsora meibomiae), sarna (Sphaceloma glycines), praga das folhas de stem- phylium (Stemphylium botryosum), mancha alvo (Corynespora cassii- cola).

[00122] Doenças fúngicas nas raízes e na base do caule causadas, por exemplo, pelo podridão negra da raiz (Calonectria crotalariae), po- dridão do carvão (Macrophomina phaseolina), ferrugem ou murcha- mento por fusarium, podridão da raiz e podridão da vagem e do colo (Fusarium oxysporum, Fusarium ortoceras, Fusarium semitectum, Fu- sarium equiseti), podridão da raiz por mycoleptodiscus (Mycoleptodis- cus terrestris), neocosmospora (Neocosmospora vasinfecta), podridão e praga do caule (Diaporthe phaseolomm), cancro do caule (Diaporthe phaseolomm var. caulivora), podridão por phytophthora (Phytophthora megasperma), podridão do caule marrom (Phialophora gregata), podri- dão por pythium (Pythium aphanidermatum, Pythium irregulare, Pythium debaryanum, Pythium myriotylum, Pythium ultimum), podridão da raiz, declínio do caule e umedecimento por rizoctonia (Rhizoctonia solani), declínio do caule por esclerotinia (Sclerotinia sclerotiorum), mancha do sul por esclerotinia (Sclerotinia rolfsii), podridão da raiz por thielaviopsis (Thielaviopsis basicola).

[00123] As composições fungicidas da invenção podem ser usadas para o controle curativo ou protetor/preventivo de fungos fitopatogêni- cos. A invenção, portanto, também se refere a métodos curativos e pro- tetores para controlar fungos fitopatogênicos pelo uso das composições inventivas, que são aplicadas à semente, à planta ou partes da planta, ao fruto ou ao solo no qual as plantas se desenvolvem.

[00124] O fato de que as composições são bem toleradas pelas plan- tas nas concentrações necessárias para o controle das doenças das plantas, permite o tratamento da parte aérea das plantas, do material de propagação e das sementes e do solo.

[00125] De acordo com a invenção, todas as plantas e partes de plantas podem ser tratadas, incluindo cultivares e variedades de plantas (sejam ou não protegidas pela variedade de plantas ou pelos direitos do agricultor). Cultivares e variedades de plantas podem ser plantas obti- das por métodos convencionais de propagação e melhoramento que podem ser assistidos ou suplementados por um ou mais métodos bio- tecnológicos, tais como o uso de haplóides duplos, fusão de protoplas- tos, mutagênese aleatória e direcionada, marcadores moleculares ou genéticos ou por bioengenharia e métodos de manipulação genética.

[00126] Em certos aspectos, as composições da presente invenção são aplicadas em cerca de 1 x 108 a cerca de 1 x 1014 unidades forma- doras de colônia (CFU) da cepa fungicida de Paenibacillus sp. NRRL B- 50972 ou sua cepa fungicida mutante por hectare. Em outros aspectos, as composições da presente invenção são aplicadas em cerca de 1 x 109 a cerca de 1 x 1013 unidades formadoras de colônia (CFU) da cepa fungicida de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 ou sua cepa fungicida mu- tante por hectare. Em ainda outros aspectos, as composições da pre- sente invenção são aplicadas em cerca de 1 x 1010 a cerca de 1 x 1012 unidades formadoras de colônia (CFU) da cepa fungicida de Paenibaci- llus sp. NRRL B-50972 ou sua cepa fungicida mutante por hectare.

[00127] Em algumas modalidades, as composições da presente in- venção são aplicadas em cerca de 0,1 kg a cerca de 10 kg de sólidos de fermentação por hectare. Em outras modalidades, as composições da presente invenção são aplicadas em cerca de 0,25 kg a cerca de 7,5 kg de sólidos de fermentação por hectare. Em ainda outras modalida- des, as composições da presente invenção são aplicadas em cerca de 0,5 kg a cerca de 5 kg de sólidos de fermentação por hectare. As com- posições da presente invenção também podem ser aplicadas a cerca de 1 kg ou cerca de 2 kg de sólidos de fermentação por hectare.

[00128] As composições inventivas, quando bem toleradas pelas plantas, têm toxicidade homeotérmica favorável e são bem toleradas pelo meio ambiente, são adequadas para proteger plantas e órgãos das plantas, para aumentar os rendimentos da colheita, para melhorar a qualidade do material colhido. Elas podem ser preferivelmente usadas como composições para a proteção de culturas. Eles são ativas contra espécies normalmente sensíveis e resistentes e contra todos ou alguns estágios de desenvolvimento.

[00129] As plantas que podem ser tratadas de acordo com a inven- ção incluem as seguintes plantas de cultura principais: milho, soja, al- fafa, algodão, girassol, sementes oleaginosas de Brassica, tais como Brassica napus (por exemplo, canola, colza), Brassica rapa, B . juncea (por exemplo, mostarda (de campo)) e Brassica carinata, Arecaceae sp. (por exemplo, óleo de palma, coco), arroz, trigo, beterraba açuca- reira, cana-de-açúcar, aveia, centeio, cevada, milheto e sorgo, triticale, linho, nozes, uvas e videiras e várias frutas e vegetais de vários grupos taxonômicos botânicos, por exemplo, Rosaceae sp. (por exemplo, po- máceas, tais como maçãs e peras, mas também frutas com caroço, tais como damascos, cerejas, amêndoas, ameixas e pêssegos, e frutas ver- melhas, como morangos, framboesas, groselha preta, groselha verme- lha e groselha verde ), Ribesioidae sp., Juglandaceae sp ., Betulaceae sp., Anacardiaceae sp., Fagaceae sp., Moraceae sp., Oleaceae sp. (por exemplo, oliveira), Actinidaceae sp., Lauraceae sp. (por exemplo, aba- cate, canela, cânfora), Musaceae sp. (por exemplo, bananeiras e plan- tações), Rubiaceae sp. (por exemplo, café), Theaceae sp. (por exem- plo, chá), Sterculiceae sp. , Rutaceae sp. (por exemplo, limões, laranjas, tangerinas e toranjas); Solanaceae sp. (por exemplo, tomates, batatas, pimentões, capsicum, beringelas, tabaco), Liliaceae sp., Compositae sp. (por exemplo, alface, alcachofra e chicória - incluindo raiz de chicó- ria, escarola ou chicória comum), Umbelliferae sp. (por exemplo, ce- noura, salsa, aipo e aipo), Cucurbitaceae sp. (por exemplo, pepinos - incluindo pepinos, abóboras, melancias, cabaças e melões), Alliaceae sp. (por exemplo, alho-poró e cebola), Cruciferae sp. (por exemplo, re- polho branco, repolho roxo, brócolis, couve-flor, couve de Bruxelas, pak choi, couve-rábano, rabanete, raiz-forte, agrião e couve chinesa), Legu- minosae sp. (por exemplo, amendoim, ervilha, lentilha e feijão - por exemplo, feijão comum e favas), Chenopodiaceae sp. (por exemplo, acelga, beterraba forrageira, espinafre, beterraba), Linaceae sp. (por exemplo, cânhamo), Cannabeacea sp. (por exemplo, cannabis), Malva- ceae sp. (por exemplo, quiabo, cacau), Papaveraceae (por exemplo, pa- poula), Asparagaceae (por exemplo, aspargos); plantas úteis e plantas ornamentais de jardim e floresta, incluindo gramíneas, relva, grama e Stevia rebaudiana; e em cada caso, tipos dessas plantas geneticamente modificados.

[00130] Em certos aspectos, o produto de fermentação compreende ainda um ingrediente de formulação. O ingrediente da formulação pode ser um agente umectante, diluente, solvente, promotor de espontanei- dade, emulsificante, dispersante, protetor de congelamento, espessante e/ou um adjuvante. Em uma modalidade, o ingrediente da formulação é um agente umectante. Em outros aspectos, o produto de fermentação é um pó liofilizado ou um pó seco por pulverização.

[00131] As composições da presente invenção podem incluir ingredi- entes de formulação adicionados às composições da presente invenção para melhorar a recuperação, eficácia ou propriedades físicas e/ou para auxiliar no processamento, embalagem e administração. Tais ingredien- tes da formulação podem ser adicionados individualmente ou em com- binação.

[00132] Os ingredientes da formulação podem ser adicionados às composições que compreendem células, preparações livres de células, compostos isolados e/ou metabolitos para melhorar a eficácia, estabili- dade e propriedades físicas, usabilidade e/ou para facilitar o processa- mento, embalagem e aplicação de uso final. Tais ingredientes de formu- lação podem incluir transportadores, inertes, agentes de estabilização,

conservantes, nutrientes ou agentes modificadores de propriedades fí- sicas aceitáveis para a agricultura, que podem ser adicionados individu- almente ou em combinação.

Em algumas modalidades, os veículos po- dem incluir materiais líquidos, tais como água, óleo e outros solventes orgânicos ou inorgânicos e materiais sólidos, tais como minerais, polí- meros ou complexos de polímeros derivados biologicamente ou por sín- tese química.

Em algumas modalidades, o ingrediente da formulação é um aglutinante, adjuvante, ou adesivo que facilita a aderência da com- posição a uma parte da planta, tal como folhas, sementes ou raí- zes.

Veja, por exemplo, Taylor, AG, et al., "Concepts and Technologies of Selected Seed Treatmentments", Annu.

Rev.

Phytopathol., 28: 321- 339 (1990). Os agentes de estabilização podem incluir agentes anti- aglomerantes, agentes antioxidantes, agentes anti-sedimentação, agentes anti-espuma, dessecantes, protetores ou conservantes.

Os nu- trientes podem incluir fontes de carbono, nitrogênio e fósforo, tais como açúcares, polissacarídeos, óleo, proteínas, aminoácidos, ácidos graxos e fosfatos.

Os modificadores de propriedade física podem incluir agen- tes de volume, agentes umectantes, espessantes, modificadores de pH, modificadores de reologia, dispersantes, adjuvantes, tensoativos, for- madores de filme, hidrotrópicos, construtores, agentes anticongelantes ou corantes.

Em algumas modalidades, a composição que compreende células, preparação sem células e/ou metabólitos produzidos pela fer- mentação pode ser usada diretamente com ou sem água como o dilu- ente sem qualquer outra preparação de formulação.

Em uma modali- dade particular, um agente umectante ou um dispersante, é adicionado a um sólido de fermentação, tal como um pó liofilizado ou seco por pul- verização.

Um agente umectante aumenta as propriedades de propaga- ção e penetração, ou um dispersante aumenta a capacidade de disper- são e solubilidade do ingrediente ativo (uma vez diluído) quando é apli-

cado às superfícies. Agentes umectantes exemplificadores são conhe- cidos por aqueles versados na técnica e incluem sulfosuccinatos e deri- vados, tais como MULTIWET™ MO-70R (Croda Inc., Edison, NJ); siloxanos como BREAK-THRU® (Evonik, Alemanha); compostos não iônicos, como ATLOX™ 4894 (Croda Inc., Edison, NJ); alquil poliglico- sídeos, tais como TERWET® 3001 (Huntsman International LLC, The Woodlands, Texas); etoxilato de álcool C12-C14, tal como TERGITOL® 15-S-15 (The Dow Chemical Company, Midland, Michigan); ésteres de fosfato, tais como RHODAFAC® BG-510 (Rhodia, Inc.); e carboxilatos de éter alquílico, tais como EMULSOGEN™ LS (Clariant Corporation, Carolina do Norte).

[00133] A presente invenção fornece ainda formulações e formas de aplicação preparadas a partir delas, como agentes de proteção de co- lheita e/ou agentes pesticidas, tais como líquidos para rega, goteja- mento e pulverização, compreendendo pelo menos um dos compostos ativos da invenção. As formas de aplicação podem compreender outros agentes de proteção de colheita e/ou agentes pesticidas e/ou adjuvan- tes de aumento de atividade, tais como penetrantes, exemplos sendo óleos vegetais, tais como, por exemplo, óleo de colza, óleo de girassol, óleos minerais, tais como, por exemplo, parafinas líquidas, ésteres al- quílicos de ácidos graxos vegetais, tais como ésteres metílicos de óleo de colza ou óleo de soja ou alcoxilatos de alcanol e/ou disseminadores, tais como, por exemplo, alquilsiloxanos e/ou sais, exemplos sendo sais orgânicos ou inorgânicos de amônia ou fosfônio, exemplos sendo sul- fato de amônio ou hidrogeniofosfato de diamônia e/ou promotores de retenção tais como sulfossuccinato de dioctila ou polímeros de hidroxi- propilguar e/ou umectantes tal como glicerol e/ou fertilizantes tais como amônia, potássio ou fertilizantes de fósforo, por exemplo.

[00134] As formulações ou formas de aplicação em questão compre-

endem preferivelmente auxiliares, tais como extensores, solventes, pro- motores de espontaneidade, veículos, emulsionantes, dispersantes, protetores de congelamento, biocidas, espessantes e/ou outros auxilia- res, tais como adjuvantes, por exemplo. Um adjuvante, neste contexto, é um componente que potencializa o efeito biológico da formulação, sem que o próprio componente tenha efeito biológico. Exemplos de ad- juvantes são agentes que promovem a retenção, propagação, fixação à superfície da folha ou penetração.

[00135] Estas formulações são produzidas de forma conhecida, por exemplo, misturando os compostos ativos com auxiliares tais como, por exemplo, extensores, solventes e/ou veículos sólidos e/ ou outros auxi- liares, tais como, por exemplo, tensoativos.

[00136] Substâncias adequadas para uso como auxiliares são subs- tâncias que são adequadas para transmitir à formulação do composto ativo ou as formas de aplicação preparadas a partir dessas formulações (tais como, por exemplo, agentes de proteção de colheita utilizáveis, tais como líquidos para pulverização ou revestimentos para sementes) em particular propriedades como certas propriedades físicas, técnicas e/ou biológicas.

[00137] Os extensores adequados são, por exemplo, água, líquidos químicos orgânicos polares e não polares, por exemplo, das classes dos hidrocarbonetos aromáticos e não aromáticos (tais como parafinas, al- quilbenzenos, alquilnaftalenos, clorobenzenos), os álcoois e polióis (que, se apropriado, também podem ser substituídos, eterificados e/ou esterificados), as cetonas (tais como acetona, ciclohexanona), ésteres (incluindo gorduras e óleos) e (poli)éteres, as aminas não substituídas e substituídas, amidas, lactamas (tais como N-alquilpirrolidonas) e lac- tonas, as sulfonas e sulfóxidos (tais como dimetil sulfóxido).

[00138] Se o diluente utilizado for água, também é possível empre-

gar, por exemplo, solventes orgânicos como solventes auxiliares. Es- sencialmente, os solventes líquidos adequados são: aromáticos, tais como xileno, tolueno ou alquilnaftalenos, aromáticos clorados e hidro- carbonetos alifáticos clorados, tais como clorobenzenos, cloroetilenos ou cloreto de metileno, hidrocarbonetos alifáticos, tal como ciclohexano ou parafinas, por exemplo frações de petróleo, óleos minerais e vege- tais, álcoois tais como butanol ou glicol e também seus éteres e ésteres, cetonas tais como acetona, metil etil cetona, metil isobutil cetona ou ci- clohexanona, solventes fortemente polares tais como dimetilformamida e dimetil sulfóxido e também água.

[00139] Em princípio, é possível usar todos os solventes adequa- dos. Os solventes adequados são, por exemplo, hidrocarbonetos aro- máticos, tais como xileno, tolueno ou alquilnaftalenos, por exemplo, hi- drocarbonetos clorados aromáticos ou alifáticos, tais como cloroben- zeno, cloroetileno ou cloreto de metileno, por exemplo, hidrocarbonetos alifáticos, tais como ciclohexano, por exemplo, parafinas, frações de pe- tróleo, óleos minerais e vegetais, álcoois, tais como metanol, etanol, iso- propanol, butanol ou glicol, por exemplo, e também seus éteres e éste- res, cetonas, tais como acetona, metil etil cetona, metil isobutil cetona ou ciclohexanona, por exemplo, solventes fortemente polares, como di- metilsulfóxido e água.

[00140] Todos os veículos adequados podem, em princípio, ser usa- dos. Os veículos adequados são, em particular: por exemplo, sais de amônia e minerais naturais moídos, tais como caulins, argilas, talco, giz, quartzo, atapulgita, montmorilonita ou terra de diatomáceas e minerais sintéticos moídos, tais como sílica finamente dividida, alumina e silicatos naturais ou sintéticos, resinas, ceras e/ou fertilizantes sólidos. Também podem ser utilizadas misturas de tais veículos. Os veículos adequados para grânulos incluem os seguintes: por exemplo, minerais naturais tri-

turados e fracionados, tais como calcita, mármore, pedra-pomes, sepi- olita, dolomita e também grânulos sintéticos de farinhas inorgânicas e orgânicas, e também grânulos de material orgânico, tais como serra- gem, papel, cascas de coco, espigas de milho e caules de tabaco.

[00141] Extensores ou solventes gasosos liquefeitos também podem ser usados. Particularmente adequados são aqueles extensores ou ve- ículos que em temperatura padronizada e sob pressão padronizada são gasosos, sendo exemplos os propelentes de aerossol, tais como hidro- carbonetos halogenados e também butano, propano, nitrogênio e dió- xido de carbono.

[00142] Exemplos de emulsificantes e/ou formadores de espuma, dispersantes ou agentes umectantes que possuem propriedades iôni- cas e não iônicas ou misturas dessas substâncias ativas na superfície, são sais de ácido poliacrílico, sais de ácido lignosulfônico, sais de ácido fenolsulfônico ou ácido naftalenosulfônico, policondensados de óxido de etileno com álcoois graxos ou com ácidos graxos ou com aminas graxas com fenóis substituídos (preferivelmente alquilfenóis ou arilfenóis), sais de ésteres sulfosuccínicos, derivados de taurina (preferivelmente alqui- ltauratos), ésteres fosfóricos de álcoois polietoxilado ou fenóis, ésteres de ácido graxo de polióis e derivados dos compostos que contêm sulfa- tos, sulfonatos e fosfatos, sendo exemplos éteres alquilarílico de poligli- col, alquilsulfonato, sulfatos de alquila, sulfonatos de arila, hidrolisados de proteína, líquidos de rejeitos de lignina-sulfito e metilcelulose. A pre- sença de uma substância ativa na superfície é vantajosa se um dos compostos ativos e/ou um dos veículos inertes não for solúvel em água e se a aplicação ocorrer na água.

[00143] Outros auxiliares que podem estar presentes nas formula- ções e nas formas de aplicação derivadas delas incluem corantes, tais como pigmentos inorgânicos, exemplos sendo óxido de ferro, óxido de titânio, Azul da Prússia e corantes orgânicos, tais como corantes de ali- zarina, corantes azo e corantes de ftalocianina de metal e nutrientes e nutrientes residuais, tais como sais de ferro, manganês, boro, cobre, cobalto, molibdênio e zinco.

[00144] Estabilizadores, tais como estabilizadores em baixa tempe- ratura, conservantes, antioxidantes, estabilizadores de luz ou outros agentes que melhoram a estabilidade química e/ou física também po- dem estar presentes. Adicionalmente, podem estar presentes formado- res de espuma ou antiespumantes.

[00145] Além disso, as formulações e formas de aplicação derivadas delas também podem compreender, como auxiliares adicionais, adesi- vos, tais como carboximetilcelulose, polímeros naturais e sintéticos em forma de pó, grânulos ou látex, tais como goma arábica, álcool poliviní- lico, acetato de polivinila e também fosfolipídios naturais, tais como ce- falinas e lecitinas, e fosfolipídios sintéticos. Outros auxiliares possíveis incluem óleos minerais e vegetais.

[00146] Pode haver outros auxiliares presentes nas formulações e nas formas de aplicação delas derivadas. Exemplos de tais aditivos in- cluem fragrâncias, coloides protetores, aglutinantes, adesivos, espes- santes, substâncias tixotrópicas, penetrantes, promotores de retenção, estabilizadores, sequestrantes, agentes complexantes, umectantes e disseminadores. De um modo geral, os compostos ativos podem ser combinados com qualquer aditivo sólido ou líquido comumente usados para fins de formulação.

[00147] Os promotores de retenção adequados incluem todas as substâncias que reduzem a tensão superficial dinâmica, como o sulfos- succinato de dioctila, ou aumentam a viscoelasticidade, tais como os polímeros de hidroxipropilguar, por exemplo.

[00148] Penetrantes adequados no presente contexto incluem todas as substâncias que são tipicamente utilizadas para aumentar a penetra- ção de compostos agroquímicos ativos nas plantas. Os penetrantes neste contexto são definidos pelo fato de que, a partir do líquido de apli- cação (geralmente aquoso) e/ou do revestimento por pulverização, são capazes de penetrar na cutícula da planta e dessa maneira aumentar a mobilidade dos compostos ativos na cutícula. Esta propriedade pode ser determinada usando o método descrito na literatura (Baur et al., 1997, Pesticide Science 51, 131-152). Exemplos incluem alcoxilatos de álcool, tais como etoxilato graxo de coco (10) ou etoxilato de isotridecila (12), ésteres de ácidos graxos, tais como ésteres metílicos de óleo de semente de colza ou soja, alcoxilatos de aminas graxas, tais como eto- xilato de amina de sebo (15), ou sais de amônia e/ou fosfônio, tais como sulfato de amônia ou hidrogeniofosfato de diamônia, por exemplo.

INFORMAÇÕES DE DEPÓSITO

[00149] Amostras de cepas de Paenibacillus sp. da invenção foram depositadas com o Agricultural Research Service Culture Collection lo- calizado no National Center for Agricultural Utilization Research, Agri- cultural Research Service, US Department of Agriculture (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, IL 61604, U.S.A., sob o Tratado de Bu- dapeste. A cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 foi depositada em 28 de agosto de 2014. Paenibacillus sp. NRRL B-67129 foi depositada em 01 de setembro de 2015. Paenibacillus sp. NRRL B-67304 e Paeni- bacillus sp. NRRL B-67306 foram ambas depositadas em 22 de julho de

2016. Paenibacillus sp. NRRL B-67615 foi depositada em 3 de maio de

2018.

[00150] As cepas de Paenibacillus sp. foram depositadas sob condi- ções que garantem que o acesso à cultura estará disponível durante a pendência deste pedido de patente para aquele determinado pelo Commissioner of Patents and Trademarks para ter direito sob 37 CFR §

1.14 e 35 USC §122. Entretanto, deve ser entendido que a disponibili- dade de um depósito não constitui uma licença para praticar a invenção em questão em derrogação dos direitos de patente concedidos por ação governamental.

[00151] Os seguintes exemplos são dados para fins puramente ilus- trativos e não limitantes dos propósitos da presente invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1. Atividade Antifúngica de Formulações Estabilizadas de Paenibacillus

[00152] A cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 foi cultivada em um meio à base de soja para produzir uma cultura em caldo inte- gral. Todo o caldo da cultura completa foi então centrifugado e concen- trado para gerar um caldo concentrado (BC). Para avaliar o efeito de vários compostos como agentes estabilizadores em amostras da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC foram coletadas e misturadas com ureia, cloridrato de guanidina, trietanolamina ou oxilato de etil gli- cerol até uma concentração final de 2% (isto é, 20 mg/mL) em uma di- luição de 60:40 (BC: água). As amostras foram divididas em três grupos que foram mantidos em uma das seguintes condições de armazena- mento: 1) temperatura ambiente (23°C) por duas semanas; 2) 40°C por duas semanas; ou 3) 54°C por duas semanas. Uma diluição de 60:40 (BC: água) da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC sem qual- quer agente estabilizador foi incluída como um controle em cada grupo.

[00153] No final das duas semanas de armazenamento, as amostras foram aplicadas a tomateiros nas concentrações mostradas na Tabela

2. As concentrações (isto é, taxas de aplicação) são diluições do trata- mento referenciado em água. Após a aplicação dos vários tratamentos, uma solução contendo um inóculo de Alternaria solani foi pulverizada sobre as plantas. Vários dias após a exposição ao inóculo do patógeno de planta, cada planta foi avaliada quanto ao percentual de controle do patógeno em relação às plantas de controle não tratadas. A incidência da doença presente nas plantas controle não tratadas em cada ensaio estava entre 75% e 100%. Os tratamentos foram avaliados com três ou quatro repetições e o percentual de controle médio e o desvio padrão foram relatados (veja a Tabela 2). 0% significa uma eficácia que corres- ponde à do controle não tratado, enquanto que uma eficácia de 100% significa que nenhuma doença foi observada. Um tratamento de con- trole com SERENADE® ASO (Bacillus subtilis QST713), que é conhe- cido por ter atividade contra Alternaria solani, foi incluído em cada en- saio. Além disso, um branco contendo apenas ureia diluída em água foi aplicado às plantas e não foi observado ter qualquer atividade contra Alternaria solani.

[00154] Amostras da diluição de 60:40 (BC:água) da cepa de Paeni- bacillus sp. NRRL B- 50972 BC misturada com ureia, cloridrato de gua- nidina ou trietanolamina também foi submetida à condições de armaze- namento de: 1) 4°C durante oito semanas; 2) temperatura ambiente (23°C) por oito semanas; ou 3) 40°C por oito semanas. As amostras fo- ram diluídas em água e avaliadas com o ensaio de atividade contra Al- ternaria solani em tomateiros como descrito acima. Os resultados deste segundo conjunto de ensaios são apresentados na Tabela 3.

[00155] Um terceiro conjunto de ensaios foi conduzido com as amos- tras de diluições de 60:40 (BC:água) da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC misturada com ureia, guanidina, cloridrato, trietanolamina ou oxilato de etil glicerol submetidas à condições de armazenamento de: 1) 4°C por seis meses; ou 2) temperatura ambiente (23°C) por seis meses. Os resultados desses ensaios são mostrados na Tabela 4.

[00156] Através dos três ensaios, ureia, cloridrato de guanidina e tri- etanolamina preservaram a atividade antifúngica da cepa de Paenibaci- lus sp. NRRL B-50972 BC enquanto que a adição de oxilato de etil gli- cerol teve pouco efeito. Como esperado, o efeito estabilizador dos com- postos foi mais pronunciado nas amostras submetidas às mais severas condições de armazenamento (ou seja, 54°C por duas semanas mos- trado na Tabela 2, 40°C por oito semanas na Tabela 3 e temperatura ambiente (23°C) por seis meses na Tabela 4).Tabela 2. Atividade anti- fúngica do caldo concentrado (BC) da cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 misturado com ureia, guanidina HCl, trietanolamina ou oxilato de etil glicerol contra Alternaria solani depois de duas semanas de ar- mazenamento em temperatura ambiente (23oC), 40oC ou 54oC.

Atividade Antifúngica dos Controles

Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Desvio Padrão

Controle Não Tratado 0 --

SERENADE® ASO (Bacillus subtilis QST713) 2,5 99 1

1,25 98 1

0,625 80 17

Atividade Antifúngica após Armazenamento em Temperatura Ambiente por 2 Semanas

Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Desvio Padrão

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC 99 1 2,5 96 1 1,25

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC + Ureia 2,5 100 0

1,25 98 3

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC + Guanidina HCl 2,5 100 1

1,25 99 2

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC + Trietanolamina 2,5 99 1

1,25 96 1

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC + Oxilato de Etil Glicerol 2,5 98 1

1,25 89 0

Atividade Antifúngica após Armazenamento a 40oC por 2 Semanas

Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Desvio Padrão Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC 99 1 2,5 89 5 1,25

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC + Ureia 2,5 99 1

1,25 96 2

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC + Guanidina HCl 2,5 99 1

1,25 98 3

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC + Trietanolamina 2,5 98 2

1,25 91 6

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC + Oxilato de Etil Glicerol 2,5 95 0

1,25 77 11

Atividade Antifúngica após Armazenamento a 54oC for 2 Semanas

Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Desvio Padrão Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC 86 3 2,5 54 12 1,25

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC + Ureia 2,5 91 6

1,25 93 3

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC + Guanidina HCl 2,5 99 2

1,25 93 3

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC + Trietanolamina 2,5 97 0

1,25 95 0

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC + Oxilato de Etil Glicerol 2,5 79 5

1,25 59 34

Tabela 3. Atividade antifúngica da cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B- 50972 BC misturada com ureia, guanidina HCl ou Trietanolamina con- tra Alternaria solani após oito semanas de armazenamento a 4oC, tem- peratura ambiente (23oC) ou 40oC.

Atividade Antifúngica dos Controles

Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Desvio Padrão

Controle Não Tratado 0 --

SERENADE® ASO (Bacillus subtilis QST713) 2,5 69 3

1,25 45 7

0,625 10 17

Atividade Antifúngica após Armazenamento a 4oC por 8 Semanas

Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Desvio Padrão

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC 2,5 82 0

1,25 63 9

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC + Ureia 2,5 82 6

1,25 61 14

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC + Guanidina HCl 2,5 80 3

1,25 63 21

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC + Trietanolamina 2,5 78 7

1,25 63 9

Atividade Antifúngica após Armazenamento em Temperatura Ambiente por 8 Semanas

Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Desvio Padrão

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC 2,5 71 16

1,25 73 9

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC + Ureia 2,5 80 9

1,25 76 20

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC + Guanidina HCl 2,5 90 7

1,25 76 6

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC + Trietanolamina 2,5 73 17

1,25 69 15 o Atividade Antifúngica após Armazenamento a 40 C por 8 Semanas

Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Desvio Padrão

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC 2,5 61 7

1,25 53 0

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC + Ureia 2,5 86 3

1,25 61 7

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC + Guanidina HCl 2,5 90 3

1,25 67 15

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC + Trietanolamina 2,5 53 12

1,25 49 7

Tabela 4. Atividade antifúngica da cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B- 50972 BC misturada com ureia, guanidina HCl, trietanolamina ou oxi- lato de etil glicerol contra Alternaria solani após seis meses de armaze- namento a 4oC ou temperatura ambiente (23oC). Atividade Antifúngica dos Controles

Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Desvio Padrão

Controle Não Tratado 0 --

SERENADE® ASO (Bacillus subtilis QST713) 5,0 89 5

2,5 89 5

1,25 77 8

0,625 40 30

Atividade Antifúngica após Armazenamento a 4oC por 6 Meses

Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Desvio Padrão

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC 2,5 97 3

1,25 84 11

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC + Ureia 2,5 97 3

1,25 88 3

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC + Guanidina HCl 2,5 99 2

1,25 91 3

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC + Trietanolamina 2,5 97 3

1,25 86 3

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC + Oxilato de Etil Glicerol 2,5 97 0

1,25 92 7

Atividade Antifúngica após Armazenamento em Temperatura Ambiente por 6 Meses

Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Desvio Padrão

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC 2,5 88 8

1,25 67 8

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC + Ureia 2,5 98 2

1,25 91 3 Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC + Guanidina HCl 2,5 98 2 1,25 89 0 Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC + Trietanolamina 2,5 92 4 1,25 86 8 Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC + Oxilato de Etil Glicerol 2,5 77 8 1,25 77 3 Exemplo 2. Quantificação de Fusaricidina A em Formulações Es- tabilizadas de Paenibacillus

[00157] As células de Paenibacillus são conhecidas por produzir vá- rios compostos antifúngicos, incluindo a fusaricidina A. Para determinar o efeito dos agentes estabilizadores sobre os níveis de fusaricidina A nas amostras da cepa de Paenibacilus sp. NRRL B-50972 BC misturada com ureia, cloridrato de guanidina, trietanolamina ou oxilato de etil gli- cerol analisado no Exemplo 1, as amostras foram extraídas com sol- vente orgânico para produzir extratos celulares.

[00158] Os níveis relativos de fusaricidina A nestes extratos foram quantificados com um método cromatográfico usando cromatografia lí- quida de alto desempenho/espectrometria de massa time of flight (HPLC/MS TOF) como a seguir: Coluna: YMC™ Basic 4,6 x 250 mm, 5 µm; Água (0,1% FA) e Acetonitrila (0,1% ácido fórmico (FA)); Gradiente (% B): 0-9 min 28-30%; 9-14 min 30-33%; 14-34 min 33-50%; Lavagem.

[00159] Uma amostra padronizada armazenada a -80°C contendo uma cultura de caldo integral da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B- 50972 foi corrida com cada análise de HPLC/MS-TOF e a área do pico da fusaricidina A a partir destra amostra padronizada foi usada como base para normalizar as áreas dos picos nas amostras restantes e cal- cular as quantidades relativas relatadas.

[00160] As quantidades relativas de fusaricidina A nas amostras da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC com e sem agentes esta- bilizadores armazenadas a 54°C por duas semanas ou a 40°C por oito semanas são mostradas nas FIG. 1 e FIG. 2, respectivamente. Para a cepa de Paenibacillus sp. NRRL B- 50972 BC armazenada a 40°C, as amostras foram retiradas e analisadas a partir de 0 semanas, 2 sema- nas, 4 semanas e 8 semanas de armazenamento.

[00161] A ureia, cloridrato de guanidina e a trietanolamina inibiram a degradação da fusaricidina A nas amostras da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC. Em contraste, a adição de oxilato de etil glicerol teve pouco efeito na estabilização da fusaricidina A nessas amostras. A quantificação relativa de fusaricidina A nas amostras da cepa de Paeni- bacillus sp. NRRL B-50972 BC armazenadas em temperatura ambiente (23°C) durante seis meses confirmaram a tendência observada nas FIG. 1 e 2.

[00162] Esses resultados concordam com os dados apresentados nas Tabelas 2-4, onde a ureia, o cloridrato de guanidina e a trietanola- mina preservaram a atividade antifúngica contra Alternaria solani após o armazenamento da cepa de Paenibacilus sp. NRRL B-50972 BC du- rante longos períodos de tempo e/ou em temperaturas elevadas en- quanto que o oxilato de etil glicerol teve pouco efeito. Exemplo 3. Avaliação das Formulações Adicionais Estabilizadas de Paenibacillus

[00163] Formulações estabilizadas adicionais de Paenibacillus sp. cepa NRRL B-50972 BC contendo um de vários agentes estabiliza- dores candidatos foram preparadas e avaliadas quanto à atividade an- tifúngica contra Alternaria solani como descrito no Exemplo 1. Os agen- tes estabilizantes candidatos foram adicionados em uma diluição de 70:30 (BC:água) da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC para concentrações finais de 2% ou 0,5%. As formulações estabilizadas fo- ram então armazenadas a 54°C por duas semanas ou a 40°C por oito semanas e comparadas com a cepa de Paenibacilus sp. NRRL B-50972 BC sem qualquer agente estabilizador.

[00164] Os ensaios que determinam a atividade antifúngica das dife- rentes formulações estabilizadas foram realizados conforme descrito no Exemplo 1. A atividade contra Alternaria solani ou Botrytis cinerea foi medida nas taxas de aplicação indicadas nas Tabelas 5-8. As concen- trações (ou seja, taxas de aplicação) são diluições do tratamento refe- renciado na água. 0% significa uma eficácia que corresponde àquela do controle não tratado, enquanto que uma eficácia de 100% significa que nenhuma doença foi observada.

[00165] Junto com a ureia, o cloridrato de betaína mostrou um efeito robusto na estabilização da atividade antifúngica da cepa de Paenibaci- lus sp. NRRL B-50972 BC contra Alternaria solani e Botrytis cinerea. O efeito estabilizador do fosfato de potássio (dibásico) foi menor do que o da ureia e do cloridrato de betaína. Vários outros agentes estabilizado- res candidatos não tiveram efeito significativo sobre a atividade antifún- gica da cepa de Paenibacilus sp. NRRL B-50972 BC. Tabela 5. Atividade antifúngica do caldo concentrado (BC) da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 misturada com ureia, betaína HCl ou fosfato de potássio (dibásico) contra Alternaria solani depois de duas semanas de armazenamento a 54oC. Atividade Antifúngica dos Controles Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Desvio Padrão Controle Não Tratado 0 -- Branco Ureia 2% 1,25 0 0 Branco Betaína HCl 2% 1,25 0 0 Branco Fosfato de Potássio (Dibásico) 2% 1,25 0 0 SERENADE® ASO (Bacillus subtilis 5 88 3 QST713) 2,5 67 12 1,25 47 12 0,625 25 15 Atividade Antifúngica Inicial Antes do Armazenamento Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Desvio Padrão Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B- 1,25 87 8 50972 BC 0,625 57 15

Atividade Antifúngica após Armazenamento a 54oC por 2 Semanas

Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Desvio Padrão

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC 1,25 3 6

0,625 20 35

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC + 1,25 78 8 Ureia 2%

0,625 57 15

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC + 1,25 57 21 Ureia 0,5%

0,625 10 13

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC + 1,25 63 6 Betaina HCl 2%

0,625 50 39

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC + 1,25 42 18 Betaina HCl 0,5%

0,625 0 0

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC + 1,25 68 18 Fosfato de Potássio (Dibásico) 2%

0,625 63 6 Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC + 1,25 5 5 Fosfato de Potássio (Dibásico) 0,5%

0,625 0 0

Tabela 6. Atividade antifúngica do caldo concentrado (BC) da cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 misturada com ureia, betaína HCl ou fosfato de potássio (dibásico) contra Botrytis cinerea depois de duas semanas de armazenamento a 54oC.

Atividade Antifúngica dos Controles

Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Desvio Padrão

Controle Não Tratado 0 --

Branco Ureia 2% 1,25 0 0

Branco Betaína HCl 2% 1,25 0 0

Branco Fosfato de Potássio (Dibásico) 2% 1,25 0 0

SERENADE® ASO (Bacillus subtilis QST713) 5 100 0

2,5 98 2

1,25 80 21

0,625 53 41

Atividade Antifúngica Inicial Antes do Armazenamento

Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Desvio Padrão

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC 1,25 81 18

0,625 26 20

Atividade Antifúngica após Armazenamento a 54oC por 2 Semanas Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Desvio Padrão Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC 1,25 21 23 0,625 6 6 Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC + Ureia 2% 1,25 61 5 0,625 23 5 Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC + Betaina HCl 2% 1,25 59 9 0,625 25 33 Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC + Fosfato de Potás- 1,25 39 21 sio (Dibásico) 2% 0,625 9 11

[00166] Tabela 7. Atividade antifúngica do caldo concentrado (BC) da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 misturada com ureia, be- taína HCl ou fosfato de potássio (dibásico) contra Alternaria solani após oito semanas de armazenamento a 40oC. Atividade Antifúngica dos Controles Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Desvio Padrão Controle Não Tratado 0 -- ® SERENADE ASO (Bacillus subtilis QST713) 5 88 6 2,5 78 9 1,25 65 20 0,625 53 20 Atividade Antifúngica Inicial Antes do Armazenamento Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Desvio Padrão Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC 1,25 86 9 0,625 82 10 Atividade Antifúngica após Armazenamento a 40oC por 8 Semanas Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Desvio Padrão Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC 1,25 69 7 0,625 41 12 Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC + Ureia 2% 1,25 85 8 0,625 80 7 Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC + Ureia 0,5% 1,25 73 3 0,625 47 33 Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC + Betaina HCl 2% 1,25 83 12 0,625 83 13 Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC + Betaine HCl 1,25 84 7 0,5% 0,625 45 7

Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC + Fosfato de Po- 1,25 61 7 tássio (Dibásico) 2% 0,625 55 15 Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC + Fosfato de Po- 1,25 41 12 tássio (Dibásico) 0,5% 0,625 51 21

[00167] Tabela 8. Atividade antifúngica do caldo concentrado (BC) da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 misturada com ureia, be- taína HCl ou fosfato de potássio (dibásico) contra Botrytis cinerea após oito semanas de armazenamento a 40oC. Atividade Antifúngica dos Controles Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Desvio Padrão Controle Não Tratado 0 -- ® SERENADE ASO (Bacillus subtilis QST713) 5 100 1 2,5 98 2 1,25 90 13 0,625 24 20 Atividade Antifúngica Inicial Antes do Armazenamento Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Desvio Padrão Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC 1,25 81 12 0,625 58 26 Atividade Antifúngica após Armazenamento a 40oC por 8 Semanas Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Desvio Padrão Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC 1,25 3 2 0,625 3 5 Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC + Ureia 1,25 71 9 2% 0,625 21 22 Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC + Betaina 1,25 64 9 HCl 2% 0,625 46 33 Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC + Fosfato 1,25 34 23 de Potássio (Dibásico) 2% 0,625 23 15 Exemplo 4. Quantificação da Fusaricidina A em Formulações de Paenibacillus Estabilizadas Adicionais

[00168] O método quantitativo descrito no Exemplo 2 foi usado para determinar as quantidades relativas de fusaricidina A presentes nas amostras preparadas no Exemplo 3. As quantidades relativas de fusari- cidina A nessas amostras adicionais da cepa de Paenibacillus sp. NRRL

B-50972 BC com e sem agentes estabilizadores após armazenamento a 54°C por duas semanas ou armazenamento a 40°C por oito semanas são apresentadas nas FIG. 3 e FIG. 4, respectivamente.

[00169] Ureia e cloridrato de betaína preservaram a fusaricidina A nas amostras da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC enquanto o fosfato de potássio (dibásico) teve menos efeito na estabilização da fusaricidina A nessas amostras. As amostras da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B- 50972 BC misturadas com agentes estabilizadores candi- datos que não preservaram a atividade antifúngica também foram ana- lisadas. A degradação da fusaricidina A nessas amostras foi seme- lhante àquela da cepa de Paenibacilus sp. NRRL B-50972 BC sem qual- quer agente estabilizador.

[00170] Estes resultados concordam com os dados apresentados nas Tabelas 5-8, onde a adição de ureia e cloridrato de betaína manteve a atividade antifúngica contra Alternaria solani e Botrytis cinerea após o armazenamento da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC em 54°C por duas semanas ou a 40°C por oito semanas, enquanto o fosfato de potássio (dibásico) teve menos efeito de estabilização. Exemplo 5. Avaliação das Formulações Estabilizadas de Paenibacillus com Fosfato de Potássio (Monobásico), Fosfato de Potássio (Dibásico) ou Citrato de Potássio (Tribásico)

[00171] Vários compostos intimamente relacionados foram testados quanto ao seu potencial para estabilizar a cepa de Paenibacilus sp. NRRL B-50972 BC após armazenamento a 54°C durante duas sema- nas. As amostras foram preparadas e analisadas conforme descrito no Exemplo 3 e continham ureia, fosfato de potássio (monobásico), fosfato de potássio (dibásico) ou citrato de potássio (tribásico) a 2% na diluição 70:30 (BC: água) da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC. Uma amostra do caldo integral (WB) da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B- 50972 antes da centrifugação e a concentração foi incluída como um controle. Após armazenamento a 54°C por duas semanas, a atividade antifúngica na amostra de controle com WB foi reduzida de modo que a doença presente nas plantas tratadas com WB não foi distinguida das plantas não tratadas (dados não mostrados).

[00172] A atividade antifúngica das amostras da cepa de Paenibaci- llus sp. NRRL B-50972 BC misturadas com uréia, fosfato de potássio (monobásico), fosfato de potássio (dibásico) ou citrato de potássio (tri- básico) após armazenamento a 54°C por duas semanas é mostrada na Tabela 9. As concentrações (ou seja, taxas de aplicação ) são diluições do tratamento referenciado em água. 0% significa uma eficácia que cor- responde à do controle não tratado, enquanto uma eficácia de 100% significa que nenhuma doença é observada. Surpreendentemente, o fosfato de potássio (dibásico) estabilizou a atividade antifúngica, en- quanto o fosfato de potássio (monobásico) não. O citrato de potássio (tribásico) também demonstrou efeito estabilizador sobre a cepa de Pa- enibacilus sp. NRRL B-50972 BC. Tabela 9. Atividade antifúngica do caldo concentrado (BC) da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 (BC) misturada com ureia, fosfato de potássio (monobásico), fosfato de potássio (dibásico) ou citrato de po- tássio (tribásico) contra Alternaria solani depois de duas semanas de armazenamento a 54oC. Atividade Antifúngica dos Controles Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Desvio Padrão Controle Não Tratado 0 -- SERENADE® ASO (Bacillus subtilis QST713) 5 90 5 2,5 63 12 1,25 70 9 Atividade Antifúngica após Armazenamento a 54oC por 2 Semanas Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Desvio Padrão Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC + Ureia 2% 1,25 82 10 0,625 53 38 Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC + 2% Fosfato de 1,25 28 20 potássio (Monobásico)

0,625 8 14 Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC + Fosfato de Po- 1,25 80 9 tássio (Dibásico) 2% 0,625 77 3 Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC + Citrato de Po- 1,25 65 22 tássio (Tribásico) 2% 0,625 57 15 Exemplo 5. Determinação do Efeito dos Solventes sobre as Formula- ções de Paenibacillus

[00173] A cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 foi cultivada em um meio à base de soja para produzir uma cultura de caldo integral. O caldo de cultura integral foi então centrifugado e concentrado para gerar um caldo concentrado (BC). Uma diluição de 50:50 da cepa de Paeni- bacillus sp. NRRL B- 50972 BC em água ou propileno glicol foi prepa- rada e submetida a análise de atividade antifúngica e níveis relativos de fusaricidina A como descrito nos Exemplos 1 e 2. As concentrações (isto é, taxas de aplicação) são diluições do tratamento referenciado em água. 0% significa uma eficácia que corresponde à do controle não tra- tado, enquanto que uma eficácia de 100% significa que nenhuma do- ença é observada.

[00174] A diluição em propilenoglicol preservou a atividade antifún- gica da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC em um grau maior do que a diluição em água após o armazenamento por duas semanas a 54°C ou por duas, quatro ou oito semanas a 40°C (compare as Tabelas 10 e 11). Além disso, a cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC diluída em propilenoglicol teve uma taxa mais lenta de degradação da fusaricidina A após armazenamento por duas semanas a 54°C ou por duas, quatro ou oito semanas a 40°C do que a cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC diluída em água (compare as FIG. 5 e 6). Tabela 9. Atividade antifúngica do caldo concentrado (BC) da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 (BC) misturada com ureia, fosfato de potássio (monobásico), fosfato de potássio (dibásico) ou citrato de po- tássio (tribásico) contra Alternaria solani depois de duas semanas de armazenamento a 54oC.

Atividade Antifúngica dos Controles

Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Desvio Padrão

Controle Não Tratado 0 --

SERENADE® ASO (Bacillus subtilis QST713) 5 90 5

2,5 63 12

1,25 70 9

Atividade Antifúngica após Armazenamento a 54oC por 2 Semanas

Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Desvio Padrão

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC + Ureia 2% 1,25 82 10

0,625 53 38

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC + 2% Fosfato de potássio (Mo- 1,25 28 20 nobásico)

0,625 8 14

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC + Fosfato de Potássio (Dibá- 1,25 80 9 sico) 2%

0,625 77 3

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC + Citrato de Potássio (Tribá- 1,25 65 22 sico) 2%

0,625 57 15

Tabela 10. Atividade antifúngica do caldo concentrado (BC) da cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 em uma diluição 50:50 com água con- tra Alternaria solani depois de duas semanas de armazenamento a 54oC ou depois de duas, quatro ou oito semanas de armazenamento a 40oC.

Atividade Antifúngica dos Controles

Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Desvio Padrão

Controle Não Tratado 0 --

SERENADE® ASO (Bacillus subtilis QST713) 5 100 0

2,5 90 0

1,25 72 3

0,625 67 8

Atividade Antifúngica após Armazenamento a 54oC por 2 Semanas

Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Desvio Padrão

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-50972 BC + Água (0 5 95 0 Semanas)

2,5 93 3

1,25 88 3

Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC + Água (2 5 62 12 Semanas) 2,5 40 15 1,25 10 11 Atividade Antifúngica após Armazenamento a 40oC por 2, 4, ou 8 Semanas Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Desvio Padrão Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC + Água (0 5 95 0 Semanas) 2,5 93 3 1,25 88 3 Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC + Água (2 5 95 0 Semanas) 2,5 90 5 1,25 64 14 Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC + Água (4 5 93 3 Semanas) 2,5 66 6 1,25 15 13 Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC + Água (8 5 66 22 Semanas) 2,5 53 19 1,25 13 22

[00175] Tabela 11. Atividade antifúngica do caldo concentrado (BC) da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 em uma diluição 50:50 com propileno glicol contra Alternaria solani depois de duas semanas de ar- mazenamento a 54oC ou depois de duas, quatro ou oito semanas de armazenamento a 40oC. Atividade Antifúngica dos Controles Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Desvio Padrão Controle Não Tratado 0 -- SERENADE® ASO (Bacillus subtilis QST713) 5 96 2 2,5 83 12 1,25 68 8 0,625 40 26 o Atividade Antifúngica após Armazenamento a 54 C por 2 Semanas Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Desvio Padrão Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC + Propi- 5 93 3 leno Glicol (0 Semanas) 2,5 88 3 1,25 80 0 Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC + Propi- 5 88 3 leno Glicol (2 Semanas)

2,5 52 36 1,25 50 10 Atividade Antifúngica após Armazenamento a 40oC por 2, 4, ou 8 Semanas Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Desvio Padrão Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC + Propileno Glicol(0 Se- 5 93 3 manas) 2,5 88 3 1,25 80 0 Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC + Propileno Glicol(2 Se- 5 90 5 manas) 2,5 83 8 1,25 50 31 Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC + Propileno Glicol(4 Se- 5 87 6 manas) 2,5 58 33 1,25 57 15 Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC + Propileno Glicol(8 Se- 5 77 8 manas) 2,5 47 26 1,25 30 26

[00176] Exemplo 6. Aperfeiçoamento nas Propriedades Físicas das Formulações de Paenibacillus Estabilizadas

[00177] A cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC foi preparada e diluída com uma mistura de propilenoglicol e água. Uma porção da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC diluída foi misturada com 2% de ureia e o restante não continha ureia.

[00178] Uma formulação é considerada ser fisicamente estável se pouca ou nenhuma sinérese ou sedimentação dos componentes da for- mulação for observada por um período de tempo prolongado. Quanto mais tempo leva para a sinérese ou sedimentação ocorrer, mais estável fisicamente é a formulação. Uma formulação é considerada ser fisica- mente estável se pouca ou nenhuma sinérese ou sedimentação for ob- servada após 2 semanas a 54°C

[00179] Amostras diluídas da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B- 50972 BC com e sem ureia foram armazenadas durante 2 semanas a 54°C. Nenhuma sinérese ou sedimentação das amostras foi observada antes do armazenamento. Fotografias das amostras após armazena- mento mostram que a cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC di- luída com uréia experimentou pouca ou nenhuma sinérese ou sedimen- tação. Em contraste, a fotografia da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B- 50972 BC sem ureia mostra separação da formulação em camadas dis- tintas indicando sinérese e sedimentação. Os resultados demonstraram a melhora na estabilidade física da cepa de Paenibacilus sp. NRRL B- 50972 BC resultante da adição de ureia. Exemplo 7. Níveis Relativos de Fusaricidina A e Atividade Antifúngica da Formulação Estabilizada de Paenibacillus após 2 anos a 23ºC

[00180] Caldos concentrados (BC) da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 foram preparados com e sem 2% de ureia e suas ativi- dades antifúngicas contra Altemaria solani foram medidas como des- crito no Exemplo 1 após dois anos de armazenamento a 23°C. As con- centrações (ou seja, taxas de aplicação) são diluições do tratamento referenciado em água. 0% significa uma eficácia que corresponde à do controle não tratado, enquanto uma eficácia de 100% significa que ne- nhuma doença é observada. Os níveis relativos de fusaricidina A nos caldos concentrados também foram determinados conforme descrito no Exemplo 2.

[00181] A atividade antifúngica da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC contendo 2% de uréia permaneceu em cerca de 90% mesmo após dois anos de armazenamento a 23°C, enquanto a ativi- dade antifúngica da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC sem uréia caiu para menos da metade desse nível (ver Tabela 12). Da mesma forma, os níveis de fusaricidina A na cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC contendo 2% de uréia permaneceram relativamente constantes ao longo de dois anos de armazenamento a 23°C, enquanto que os níveis de fusaricidina A na cepa de Paenibacillus sp. NRRL B- 50972 BC sem ureia caiu para cerca de um quarto dos níveis iniciais durante este mesmo período de armazenamento (ver FIG. 8). Exemplo 8. Níveis Relativos de Fusaricidina A e Atividade Antifúngica das Formulações Estabilizadas com Várias Cepas de Paenibacillus sp.

[00182] A cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 está relacionada com a cepa de Paenibacilus sp. NRRL B-67304, cepa de Paenibacilus sp. NRRL B-67306 e cepa de Paenibacilus sp. NRRL B- 67615 como descrito no Pedido de Patente US No. 62/671.067. A cepa de Paeniba- cillus sp. NRRL B-50972 é a cepa parental da qual cada uma das outras cepas foram derivadas por múltiplas rodadas de mutagênese e rastrea- mento para aumento da produção de fusaricidinas e compostos seme- lhantes a fusaricidina e diminuição da viscosidade em cultura líquida. A cepa de Paenibacilus sp. NRRL B-67304, cepa de Paenibacilus sp. NRRL B-67306 e a cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67615 têm, cada uma, mutações nos genes degU e/ou degS que resultam em uma mor- fologia de colônia não mucóide em meio de cultura sólido e viscosidade diminuída em culturas líquidas.

[00183] Caldos concentrados de caldo da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972, cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67304, cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67306 e a cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67615 foram preparados com ureia, e suas atividades antifúngicas contra Altemaria solani foram medidas como descrito no Exemplo 1 após oito semanas de armazenamento a 40°C e após um ano de arma- zenamento a 23°C. As concentrações (ou seja, taxas de aplicação) são diluições do tratamento referenciado na água. 0% significa uma eficácia que corresponde àquela do controle não tratado, enquanto que uma efi- cácia de 100% significa que nenhuma doença é observada. Os níveis relativos de fusaricidina A nos caldos concentrados também foram de- terminados conforme descrito no Exemplo 2.

[00184] A atividade antifúngica da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC sem uréia não foi significativamente diferente do controle não tratado após oito semanas de armazenamento a 40°C, enquanto que a atividade antifúngica de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC, cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67304 BC e cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67306 BC, cada uma misturada com ureia, permaneceu entre 79% e 89% quando aplicada a 0,625% ou 0,312% às plantas (veja Tabela 13). Resultados semelhantes foram observados com os concen- trados de caldo armazenados por um ano a 23°C, exceto que a atividade antifúngica da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC sem ureia foi detectada em níveis baixos acima do controle não tratado sob essas condições (veja Tabela 14).

[00185] Os níveis de fusaricidina A na cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC, na cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67304 BC e na cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67306 BC, cada uma misturada com ureia, permaneceu relativamente constante após oito semanas de armazenamento a 40°C e após um ano de armazenamento a 23°C en- quanto os níveis de fusaricidina A na cepa de Paenibacillus sp. NRRL B- 50972 BC sem ureia caiu para cerca de um terço dos níveis iniciais ao longo desses mesmos períodos de armazenamento (ver FIGs. 9 e 10). Tabela 12. Atividade antifúngica no caldo concentrado (BC) da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 com e sem ureia contra Alternaria solani depois de dois anos de armazenamento a 23oC. Atividade Antifúngica dos Controles Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Erro Padrão Controle Não Tratado 0 -- SERENADE® ASO (Bacillus subtilis QST713) 2,5 93 3 0,625 88 4 Atividade Antifúngica após Armazenamento a 23oC por 2 Anos Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Erro Padrão Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC 2,5 40 20 0,625 19 19 Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC + Ureia 2% 2,5 88 4 0,625 93 3

Tabela 13. Atividade antifúngica do caldo concentrado (BC) de várias ce- pas de Paenibacillus sp. estabilizadas com ureia contra Alternaria solani depois de oito semanas de armazenamento a 40oC. Atividade Antifúngica dos Controles Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Erro Padrão Controle Não Tratado 0 -- SERENADE® ASO (Bacillus subtilis QST713) 5 82 5 2,5 68 0 1,25 50 8 Atividade Antifúngica após Armazenamento a 40oC por 8 Semanas Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Erro Padrão Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC 0,625 1 1 0,312 0 0 0,156 1 1 Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC + Ureia 0,625 89 3 2% 0,312 79 0 0,156 30 5 Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67304 BC + Ureia 0,625 88 2 2% 0,312 82 2 0,156 38 11 Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67306 BC + Ureia 0,625 86 2 2% 0,312 80 8 0,156 52 5

[00186] Tabela 14. Atividade antifúngica do caldo concentrado (BC) de várias cepas de Paenibacillus sp. estabilizadas com ureia contra Al- ternaria solani depois de um ano de armazenamento a 23oC. Atividade Antifúngica dos Controles Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Erro Padrão Controle Não Tratado 0 -- SERENADE® ASO (Bacillus subtilis QST713) 5 91 5 2,5 88 3 1,25 80 5 Atividade Antifúngica após Armazenamento a 23oC por 1 Ano Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Erro Padrão Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC 0,625 30 8

0,312 11 6 0,156 13 7 Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972 BC + 0,625 86 2 Ureia 2% 0,312 70 9 0,156 42 14 Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67304 BC + 0,625 82 7 Ureia 2% 0,312 74 4 0,156 58 19 Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67306 BC + 0,625 82 9 Ureia 2% 0,312 66 2 0,156 20 9 Exemplo 9. Níveis Relativos de Fusaricidina A e Atividade Antifúngica das Formulações Estabilizadas com as cepas de Paenibacillus sp. NRRL B-67304, NRRL B-67306 e NRRL B-67615

[00187] Caldos integrais e caldos concentrados de Paenibacillus sp. NRRL B-67304, cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67306 e cepa de sp. NRRL B-67615 foram preparados como descrito no Exemplo 1. Ne- nhuma ureia foi adicionada aos caldos integrais enquanto que os caldos concentrados foram estabilizados com ureia. As atividades antifúngicas dos caldos integrais e dos caldos concentrados estabilizados contra Bo- trytis cinerea e Altemaria solani foram medidas como descrito nos Exemplos 1 e 3 após oito semanas de armazenamento a 40°C e após um ano de armazenamento a 23°C. Nos ensaios antifúngicos, as amos- tras de caldo concentrado foram aplicadas com o dobro das taxas das amostras de caldo concentrado para ajustar a diluição das químicas an- tifúngicas em todo o caldo. As concentrações (ou seja, taxas de aplica- ção) são diluições do tratamento referenciado na água. 0% significa uma eficácia que corresponde à do controle não tratado, enquanto uma eficácia de 100% significa que nenhuma doença foi observada. Os ní- veis relativos de fusaricidina A em caldos integrais e caldos concentra- dos também foram determinados conforme descrito no Exemplo 2.

[00188] As atividades antifúngicas de todas as amostras de caldo in- tegral das três cepas de Paenibacillus sp. sem uréia foram semelhantes ou ligeiramente maiores que as do controle não tratado. Em contraste, as atividades antifúngicas dos caldos concentrados estabilizados com ureia das três cepas de Paenibacillus sp. permaneceram relativamente altas e foram mais semelhantes do que aquelas do controle positivo, SERENADE® ASO (Bacillus subtilis QST713). Este controle positivo não foi submetido às condições de armazenamento dos ensaios de es- tabilidade e era conhecido por ter uma atividade antifúngica relativa- mente alta. O efeito estabilizador da ureia foi consistente com ambos os patógenos fúngicos (ou seja, Botrytis cinerea e Alternaria solani) e du- rante ambos os períodos (ou seja, oito semanas de armazenamento a 40°C e um ano de armazenamento a 23°C) (veja Tabelas 15 -18).

[00189] Os níveis de fusaricidina A nas amostras de caldo integral não estabilizadas e nas amostras de caldo concentrado estabilizadas com uréia de Paenibacillus sp. NRRL B-67304, cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67306 e cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67615 ao longo de oito semanas de armazenamento a 40°C e ao longo de um ano de armazenamento a 23°C são apresentados na FIG. 11 e FIG. 12, respec- tivamente. Enquanto que os níveis de fusaricidina A nas amostras de caldo integral não estabilizadas caíram significativamente durante esses períodos, aqueles nas amostras de caldo concentrado contendo uréia permaneceram relativamente constantes. Tabela 15. Atividade antifúngica do caldo integral (WB) e do caldo con- centrado (BC) da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67304, NRRL B- 67306, e NRRL B-67615 estabilizados com ureia contra Botrytis cinerea depois de oito semanas de armazenamento a 40oC. Atividade Antifúngica dos Controles Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Erro Padrão Controle Não Tratado 0 -- SERENADE® ASO (Bacillus subtilis QST713) 2,5 94 3 1,25 9 6

Atividade Antifúngica após Armazenamento a 40oC por 8 Semanas

Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Erro Padrão

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-67304 WB 1,25 33 12

0,313 5 5

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-67304 BC + Ureia 2% 0,625 83 6

0,156 48 14

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-67306 WB 1,25 0 0

0,313 0 0

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-67306 BC + Ureia 2% 0,625 74 5

0,156 14 5

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-67615 WB 1,25 4 4

0,313 0 0

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-67615 BC + Ureia 2% 0,625 90 2

0,156 45 7

Tabela 16. Atividade antifúngica de WB e BC da cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-67304, NRRL B-67306 e NRRL B-67615 estabilizados com ureia contra Botrytis cinerea depois de um ano de armazenamento a 23oC.

Atividade Antifúngica dos Controles

Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Erro Padrão

Controle Não Tratado 0 --

SERENADE® ASO (Bacillus subtilis QST713) 2,5 95 0

1,25 88 3

Atividade Antifúngica após Armazenamento a 23oC por 1 Ano

Erro Pa- Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) drão

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-67304 WB 1,25 38 11

0,313 1 1

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-67304 BC + Ureia 2% 0,625 63 1

0,156 56 4

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-67306 WB 1,25 1 1

0,313 0 0

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-67306 BC + Ureia 2% 0,625 29 3

0,156 23 14

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-67615 WB 1,25 1 1

0,313 0 0

Cepa de Paenibacillus sp.

NRRL B-67615 BC + Ureia 2% 0,625 50 12

0,156 43 7

Tabela 17. Atividade antifúngica de WB e BC da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67304, NRRL B-67306 e NRRL B-67615 estabilizados com ureia contra Alternaria solani depois de oito semanas de armazenamento a 40oC. Atividade Antifúngica dos Controles Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Erro Padrão Controle Não Tratado 0 -- SERENADE® ASO (Bacillus subtilis QST713) 2,5 90 4 1,25 86 5 Atividade Antifúngica após Armazenamento a 40oC por 8 Semanas Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Erro Padrão Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67304 WB 1.25 40 20

0.313 18 14 Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67304 BC + Ureia 2% 0.625 84 8

0.156 52 6 Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67306 WB 1.25 3 3

0.313 0 0 Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67306 BC + Ureia 2% 0.625 88 2

0.156 47 25 Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67615 WB 1.25 27 18

0.313 8 8 Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67615 BC + Ureia 2% 0.625 71 9

0.156 68 9 Tabela 18. Atividade antifúngica de WB e BC da cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67304, NRRL B-67306 e NRRL B-67615 estabilizados com ureia contra Alternaria solani depois de um ano de armazenamento a 23oC. Atividade Antifúngica dos Controles Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Erro Padrão Controle Não Tratado 0 -- SERENADE® ASO (Bacillus subtilis QST713) 2,5 88 2 1,25 82 2 Atividade Antifúngica após Armazenamento a 23oC por 1 Ano Tratamento Concentração (%) Eficácia Média (%) Erro Padrão Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67304 WB 1,25 18 9

0,313 24 14 Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67304 BC + Ureia 2% 0,625 88 4 0,156 65 18 Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67306 WB 1,25 0 0 0,313 8 4 Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67306 BC + Ureia 2% 0,625 82 8 0,156 50 3 Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67615 WB 1,25 7 3 0,313 0 0 Cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67615 BC + Ureia 2% 0,625 92 2 0,156 72 7

[00190] A menos que definido de outra forma, todos os termos técni- cos e científicos aqui contidos têm o mesmo significado como comu- mente entendidos por alguém com habilidade comum na técnica a qual esta invenção pertence. Todas as publicações, patentes e publicações de patentes citadas estão incorporadas aqui por referência em sua to- talidade para todos os fins.

[00191] É entendido que a invenção descrita não está limitada à me- todologia, protocolos e materiais específicos descritos, uma vez que es- tes podem variar. É também entendido que a terminologia usada neste documento tem o propósito de descrever modalidades particulares ape- nas e não se destina a limitar o escopo da presente invenção, que será limitado apenas pelas reivindicações em anexo.

[00192] Aqueles versados na técnica reconhecerão, ou serão capa- zes de determinar usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção aqui des- critas. É pretendido que tais equivalentes sejam abrangidos pelas rei- vindicações a seguir.

Claims (41)

REIVINDICAÇÕES

1. Composição fungicida estabilizada caracterizada pelo fato de que compreende: a) uma cepa de Paenibacillus sp. produtora de fusaricidina; e b) um agente estabilizador selecionado do grupo que con- siste em uma amina, um composto de amônia quaternária, um sal de fosfato ou citrato, um poliol de cadeia curta que possui de 2 a 10 átomos de carbono, uma ureia e suas combinações.

2. Composição fungicida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a cepa de Paenibacillus sp produtora de fusaricidina é P. agarexedens, P. agaridevorans, P. alginolyticus, P. al- kaliterrae, P. alvei, P. amylolyticus, P. anaericanus, P. antarcticus, P. assamensis, P. azoreducens, P. azotofixans, P. barcinonensis, P. bore- alis, P. brasiliensis, P. brassicae, P. campinasensis, P. chinjuensis, P. chitinolyticus, P. chondroitinus, P. cineris, P. cookie, P. curdlanolyticus, P. daejeonensis, P. dendritiformis, P. durum, P. ehimensis, P. elgii, P. favisporus, P. glucanolyticus, P. glycanilyticus, P. gordonae, P. graminis, P. granivorans, P. hodogayensis, P. illinoisensis, P. jamilae, P. kobensis, P. koleovorans, P. koreensis, P. kribbensis, P. lactis, P. larvae, P. lautus, P. lentimorbus, P. macerans, P. macquariensis, P. massiliensis, P. men- delii, P. motobuensis, P. naphthalenovorans, P. nematophilus, P. nov. spec. epiphyticus, P. odorifer, P. pabuli, P. peoriae, P. phoenicis, P. phyl- losphaerae, P. polymyxa, P. polymyxa ssp. polymyxa, P. polymyxa ssp. plantarum, P. popilliae, P. pulvifaciens, P. rhizosphaerae, P. sanguinis, P. stellifer, P. taichungensis, P. terrae, P. thiaminolyticus, P. timonensis, P. tylopili, P. turicensis, P. validus, P. vortex, P. vulneris, P. wynnii ou P. xylanilyticus.

3. Composição fungicida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a cepa de Paenibacillus sp produtora de fusaricidina é a cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972, cepa de Pa- enibacillus sp. NRRL B- 67129, cepa de Paenibacillus sp. NRRL B- 67304, cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67306, cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67615 ou uma cepa fungicida mutante destas.

4. Composição fungicida, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a cepa fungicida mutante tem uma se- quência genômica com mais do que cerca de 90% de identidade de se- quência com a respectiva cepa.

5. Composição fungicida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o agente estabiliza- dor é uma ureia.

6. Composição fungicida de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a ureia é diamida carbônica (CO(NH2)2) ou uma ureia substituída de fórmula (I) (I) em que R1, R2, e R3 são independentemente -H, -OH, C1-C6 alquila ou -R5OH; R4 é -R5OH; e R5 é C1-C6 alquila.

7. Composição fungicida de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um sal de fosfato ou citrato.

8. Composição fungicida de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o sal de fosfato ou citrato é selecionado a partir do grupo que consiste em fosfato de potássio monobásico, fos- fato de potássio dibásico, citrato de potássio monobásico, citrato de po- tássio dibásico e suas combinações.

9. Composição fungicida de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizada pelo fato de que a ureia e o sal de fosfato ou citrato estão presentes na composição fungicida em uma concentração combi- nada entre cerca de 0,1% e cerca de 3%.

10. Composição fungicida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o agente estabili- zante é uma amina.

11. Composição fungicida de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a amina é cloridrato de guanidina ou tri- etanolamina.

12. Composição fungicida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o agente estabiliza- dor é um composto de amônia quaternária.

13. Composição fungicida de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o composto de amônia quaternária é clo- ridrato de betaína.

14. Composição fungicida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o agente estabili- zante é um sal de fosfato ou citrato.

15. Composição fungicida de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o sal é fosfato de potássio (dibásico) ou citrato de potássio (tribásico).

16. Composição fungicida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o agente estabili- zante é um poliol de cadeia curta que possui 2 a 10 átomos de carbono.

17. Composição fungicida de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o poliol de cadeia curta que possui 2 a 10 átomos de carbono é selecionado do grupo que consiste em dietileno glicol, trietileno glicol, propileno glicol, 1,3-butileno glicol, tetrametileno glicol, pentametileno glicol, hexametileno glicol, etileno glicol, 1,3-propi- leno glicol, 1,4-butanodiol, neopentil glicol, 3-metil-1,5-pentanodiol, p-xi- leno glicol, 1,4-bis-(β-hidroxietóxi)benzeno, 1,3-bis(β-hidroxietóxi) ben- zeno, ciclohexano1,4-dimetanol, octano-1,8-diol, decano-1,10-diol e suas combinações.

18. Composição fungicida de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o poliol de cadeia curta que possui de 2 a 10 átomos de carbono é o propileno glicol.

19. Composição fungicida de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que compreende uma cultura biologicamente pura da cepa de Paenibacillus sp. produtora de fusaricidina.

20. Composição fungicida de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a proporção em peso entre a cepa de Paenibacillus sp. produtora de fusaricidina e o agente estabilizador é de cerca de 200:1 a cerca de 1:200.

21. Composição fungicida de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a composi- ção fungicida é formulada como aquela selecionada do grupo que con- siste em uma composição líquida, um concentrado que pode ser emul- sionado, uma suspo-emulsão, um concentrado em suspensão e uma solução aquosa.

22. Composição fungicida de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um solvente orgânico polar miscível em água agricolamente acei- tável.

23. Formulação aquosa estável aceitável em agricultura ca- racterizada pelo fato de que compreende: a) uma cepa de Paenibacillus sp. produtora de fusaricidina em uma quantidade de 3% p/p a 90% p/p;

b) um agente estabilizador selecionado a partir do grupo que consiste em uma amina, um composto de amônio quaternário, um sal de fosfato ou citrato, um poliol de cadeia curta tendo de 2 a 10 átomos de carbono, uma ureia e combinações dos mesmos em uma quantidade de 0,1% p/p a 20% p/p; c) água; e d) opcionalmente, um solvente orgânico miscível em água polar numa quantidade de 2% p/p para 60% p/p.

24. Formulação aquosa de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que a cepa de Paenibacillus sp. produtora de fusaricidina é a cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-50972, a cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67129, a cepa de Paenibacillus sp. NRRL B- 67304, a cepa de Paenibacillus sp. NRRL B-67306, a cepa de Paeniba- cillus sp. NRRL B-67615 ou uma cepa fungicida mutante destas.

25. Formulação aquosa de acordo com a reivindicação 23 ou 24, caracterizada pelo fato de que o agente estabilizador é uma ureia.

26. Formulação aquosa de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que a ureia é diamida carbônica (CO(NH2)2) ou uma ureia substituída de fórmula (I). (I) em que R1, R2 e R3 são independentemente -H, - OH, alquila C1-C6 ou -R5OH; R4é -R5OH; e R5 é C1-C6alquila.

27. Formulação aquosa de acordo com a reivindicação 25 ou 26, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um sal de fosfato ou citrato.

28. Formulação aquosa de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que o sal de fosfato ou citrato é selecionado do grupo que consiste em fosfato de potássio monobásico, fosfato de potássio dibásico, citrato de potássio monobásico, citrato de potássio dibásico e suas combinações.

29. Formulação aquosa de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracterizada pelo fato de que a ureia e o sal de fosfato ou citrato estão presentes na formulação aquosa em uma concentração combi- nada entre cerca de 0,1% e cerca de 3%.

30. Formulação aquosa de acordo com a reivindicação 23 ou 24, caracterizada pelo fato de que o agente estabilizador é uma amina.

31. Formulação aquosa, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que a amina é cloridrato de guanidina ou tri- etanolamina.

32. Formulação aquosa de acordo com a reivindicação 23 ou 24, caracterizada pelo fato de que o agente estabilizante é um composto de amônia quaternária.

33. Formulação aquosa, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que o composto de amônia quaternária é clo- ridrato de betaína.

34. Formulação aquosa, de acordo com a reivindicação 23 ou 24 caracterizada pelo fato de que o agente estabilizador é um sal de fosfato ou citrato.

35. Formulação aquosa, de acordo com a reivindicação 34, caracterizada pelo fato de que o sal é fosfato de potássio (dibásico) ou citrato de potássio (tribásico).

36. Formulação aquosa de acordo com a reivindicação 23 ou 24, caracterizada pelo fato de que o agente estabilizador é um poliol de cadeia curta que possui 2 a 10 átomos de carbono.

37. Formulação aquosa de acordo com a reivindicação 36,

caracterizada pelo fato de que o poliol de cadeia curta tendo de 2 a 10 átomos de carbono é selecionado do grupo que consiste em dietileno glicol, trietileno glicol, propileno glicol, 1,3-butileno glicol, tetrametileno glicol, pentametileno glicol, hexametileno glicol, etileno glicol, 1,3-propi- leno glicol, 1,4-butanodiol, neopentil glicol, 3-metil-1,5-pentanodiol, p-xi- leno glicol, 1,4-bis-(β-hidroxietóxi)benzeno, 1,3-bis(β-hidroxietóxi) ben- zeno, ciclohexano1,4-dimetanol, octano-1,8-diol, decano-1,10-diol e suas combinações.

38. Formulação aquosa de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que o poliol de cadeia curta que possui 2 a 10 átomos de carbono é o propilenoglicol.

39. Método de tratamento de uma planta para controlar uma doença, caracterizado pelo fato de compreender a aplicação de uma quantidade eficaz de uma composição fungicida como definida em qual- quer uma das reivindicações 1 a 22 ou uma formulação aquosa como definida em qualquer uma das reivindicações 23 a 38 à planta, a uma parte da planta e/ou a um local da planta.

40. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de compreender a aplicação da composição fungicida ou for- mulação aquosa às partes foliares da planta.

41. Método de acordo com a reivindicação 39 ou 40, carac- terizado pelo fato de que a doença da planta é causada por um pató- geno fúngico selecionado do grupo que consiste em Alternaria alternata, Alternaria solani, Botrytis cinerea, Colletotrichum lagenarium, Fusarium culmorum, Phaeosphaeria nodorum, Zymoseptoria tritici, Phytophthora cryptogea, Phytophthora infestans, Pseudoperonospora cubensis, Pythium ultimum, Magnaporthe oryzae, Thanatephorus cucumeris, Us- tilago segetum var. avenae, Uromyces appendiculatus, e Puccinia triti- cina.

Fusaricidina A em Formulações Líquidas Estabilizadas Armazenadas a 54ºC

Guanidina

Petição 870200144294, de 16/11/2020, pág. 10/116 trietanolamina oxalato de etil glicerol Agente estabilizador 1/12

Quantidade Relativa de Fusaricidina A Tempo (Semanas)

Fusaricidina A em Formulações Líquidas Estabilizadas Armazenadas a 40ºC

Petição 870200144294, de 16/11/2020, pág. 11/116 BC+Ureia BC +Guanidina HCL BC+Trietanolamina BC+Oxalato de Etil Glicerol BC-Agente Estabilizador 2/12

Quantidade Relativa de Fusaricidina A Tempo (semanas)

Fusaricidina A em Formulações Líquidas Estabilizadas Armazenadas a 54ºC

Betaína Fosfato K Dibásico Agente estabilizador

Petição 870200144294, de 16/11/2020, pág. 12/116 3/12

Quantidade Relativa de Fusaricidina A Tempo (semanas)

Fusaricidina A em Formulações Líquidas Estabilizadas Armazenadas a 40ºC Betaína Fosfato K Dibásico Agente estabilizador

Petição 870200144294, de 16/11/2020, pág. 13/116 4/12

Quantidade Relativa de Fusaricidina A Tempo (semanas)

Fusaricidina A em Formulações Líquidas de Paenibacillus com Água ou Propileno Glicol Armazenadas a 54ºC

Petição 870200144294, de 16/11/2020, pág. 14/116 água Propileno glicol 5/12

Quantidade Relativa de Fusaricidina A Tempo (semanas)

Fusaricidina A em Formulações Líquidas de Paenibacillus com Água ou Propileno Glicol Armazenadas a 40ºC

Petição 870200144294, de 16/11/2020, pág. 15/116 água Propileno glicol 6/12

Quantidade Relativa de Fusaricidina A Tempo (semanas)

Petição 870200144294, de 16/11/2020, pág. 16/116 Separação de BC em camadas distintas 7/12

BC + Ureia depois BC + Ureia depois de 2 Semanas de de 2 Semanas de armazenamento a 54ºC armazenamento a 54ºC

Fusaricidina A em Formulações Líquidas Armazenadas a 23ºC

Petição 870200144294, de 16/11/2020, pág. 17/116 8/12

Quantidade Relativa de Fusaricidina A Tempo (semanas)

Fusaricidina A em Formulações Liquidas Estabilizadas de Várias Cepas de Paenibacillus sp. a 40ºC

Petição 870200144294, de 16/11/2020, pág. 18/116 9/12

Quantidade Relativa de Fusaricidina A Tempo (semanas)

Fusaricidina A em Formulações Liquidas Estabilizadas de Várias Cepas de Paenibacillus sp. a 23ºC

Petição 870200144294, de 16/11/2020, pág. 19/116 10/12

Quantidade Relativa de Fusaricidina A Tempo (semanas)

Fusaricidina A em Formulações Liquidas Estabilizadas de Cepas de Paenibacillus sp.

NRRL B-67304, NRRL B-67306 e NRRL B-67615

Petição 870200144294, de 16/11/2020, pág. 20/116 11/12

Quantidade Relativa de Fusaricidina A Tempo (semanas)

Fusaricidina A em Formulações Liquidas Estabilizadas de Cepas de Paenibacillus sp.

NRRL B-67304, NRRL B-67306 e NRRL B-67615

Petição 870200144294, de 16/11/2020, pág. 21/116 12/12

Quantidade Relativa de Fusaricidina A Tempo (semanas)