CN107418984A - 利用海洋解淀粉芽孢杆菌制备酰胺类及酯类化合物的方法与用途 - Google Patents

利用海洋解淀粉芽孢杆菌制备酰胺类及酯类化合物的方法与用途 Download PDF

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Abstract

一种利用海洋解淀粉芽孢杆菌BMF01菌株发酵制备13‑碳二十二烯酰胺的方法，其步骤包括BMF01菌株的发酵及其发酵液的制备、BMF01菌株发酵液的酸沉淀及甲醇提取、BMF01菌株发酵液甲醇抽提物的硅胶柱层析、Sephadex LH‑20柱层析，得到MD‑4组分在11.5 min时出现吸收峰，经结构鉴定该化合物为13‑碳二十二烯酰胺。本发明还涉及海洋解淀粉芽孢杆菌BMF01中制备酯类化合物的方法。本发明方法制得的13‑碳二十二烯酰胺、酯类化合物具有抑制小麦根腐病菌的用途。本发明首次以BMF01菌株为基础制得5种具有抑菌用途的化合物，其方法简单，可操作性强。

Description

利用海洋解淀粉芽孢杆菌制备酰胺类及酯类化合物的方法与 用途
技术领域
本发明涉及从来自海洋的细菌发酵液中提取化合物的方法，特别是从一种海洋解淀粉芽孢杆菌（Ｂacillus amyloliquefaciens）BMF01菌株发酵液中提取抗菌化合物的方法。
背景技术
解淀粉芽孢杆菌在生长过程中可以产生一系列的抗菌物质，如酶类、脂肽、β-1,3葡聚糖酶、表面活性素及伊枯草菌素A等，对多种植物病原菌具有防治作用。许多学者采用大孔树脂法、酸碱沉淀法、硫酸铵沉淀法、色谱法等分离提取的方法对解淀粉芽孢杆菌的代谢产物进行研究，分离纯化出多种对植物病原真菌有抑制作用的物质，明确了解淀粉芽孢杆菌产生的抑菌物质种类，为植物病害的防治提供优良物质，对于生防机理的理解、生物农药的生产及如何提高田间应用的防效具有重要意义。
解淀粉芽孢杆菌可分泌产生芬枯草菌素（fengycin）、伊枯草菌素（iturin）、表面活性素（surfcatin）等脂肽类抗生素，这些脂肽类抗生素可抑制植物病原真菌的生长。相关学者从不同株解淀粉芽孢杆菌中分离到了脂肽类抗菌物质，如从解淀粉芽孢杆菌ES-2的代谢产物中发现了对苹果青霉病菌（Penicillium expansum）具有较好抑制作用的表面活性素、伊枯草菌素和芬枯草菌素等；从一株解淀粉芽孢杆菌分离出对李斯特菌（Listeria）、加德纳菌（Gardnerella vaginali）和无乳链球菌（Streptococcus vaccine）有抑制作用的细菌素；从解淀粉芽孢杆菌PPCB004培养物中发现对7种不同柑橘采后的真菌病原体具有抗菌活性的伊枯草菌素A。已有的研究表明，不同解淀粉芽孢杆菌产生的抑菌物质种类不同，目前研究较多的有关解淀粉芽孢杆菌抑菌物质的菌株均来自于陆源，有关海洋解淀粉芽孢杆菌抗菌物质的提取和鉴定较少，有关源自海洋的解淀粉芽孢杆菌发酵液中分离得到13-碳二十二烯酰胺以及13-碳二十二烯酰胺的抗菌活性的研究未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的利用海洋解淀粉芽孢杆菌BMF01发酵制备13-碳二十二烯酰胺的方法。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供了利用海洋解淀粉芽孢杆菌发酵制备酯类化合物的方法与用途。
本发明所要解决的再一个技术问题是提供了利用海洋解淀粉芽孢杆菌发酵制备酰胺类化合物的方法与用途。
本发明涉及的海洋解淀粉芽孢杆菌（Ｂacillus amyloliquefaciens）BMF01菌株（以下简称BMF01菌株或者BMF01）已由申请人于2017年3月30日保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏号为CCTCC NO：M2017153。保藏单位地址为：中国武汉市武汉大学，邮编430072，电话027－68754052。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种利用海洋解淀粉芽孢杆菌（Ｂacillus amyloliquefaciens）BMF01菌株发酵制备13-碳二十二烯酰胺的方法及其用途，其特点是，其步骤如下：
（1）BMF01菌株的发酵及其发酵液的制备
将活化培养24h的BMF01菌株斜面用5 mL种子液培养基洗下菌苔制成BMF01菌株菌悬液，接种到装有55ml种子液培养基的250ml三角瓶中，28 ℃下，摇床转速180 r/min，振荡培养24 h，调整浓度为108 cfu/mL，即得发酵用种子液；按接种量10%将种子液接入装有27 L发酵培养基的50 L自动发酵罐中进行发酵，根据溶氧需求调整气阀使罐压维持0.04 Mpa，通气量为3 L/min，28 ℃，180 r/min发酵60 h，4℃、12000r/min条件下离心20min去掉菌体，得到发酵液；所述的种子液培养基和发酵培养基为：蔗糖10 g/L，牛肉膏16 g/L，酵母膏3g/L，FeSO4 0.4 g/L，水1000 mL，pH 7.0；
（2）BMF01菌株发酵液的酸沉淀及甲醇提取
用6 mol/L HCl将BMF01菌株发酵液pH调节至2，4℃静置12h，4℃下10000 r/min离心20min，分别收集上清液和沉淀物，沉淀物加入甲醇反复抽提至无色，合并得甲醇提取液，用1moL/L NaOH调节抽提液至pH 7.0，40 ℃下将提取液浓缩至50 mL，测定上清液和沉淀甲醇抽提物对小麦根腐病菌（B. Sorokiniana）的抑菌活性；有活性的沉淀组分进一步进行分离纯化。
（3）BMF01菌株发酵液甲醇抽提物的硅胶柱层析
向BMF01菌株的甲醇提取液中加入适量硅胶，40 ℃减压浓缩得到粗提物样品，用于硅胶柱层析分离；
采用干法上样法，将抽提物样品缓缓均匀加入硅胶柱内，用吸耳球轻轻敲击硅胶柱使样品紧实且表面平整在硅胶柱口塞入适量棉花，分别以1 L石油醚，石油醚:二氯甲烷=1:1，二氯甲烷，二氯甲烷:甲醇=50:1，二氯甲烷:甲醇=10:1，二氯甲烷:甲醇=5:1，二氯甲烷:甲醇=1:1和甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，用真空泵边抽真空边收集洗脱液洗脱下来的组分，每个梯度洗脱夜收集后分别在40 ℃减压浓缩至20 mL；共收集得到8个组分；
以小麦根腐病菌（B. Sorokiniana）为指示菌，采用牛津杯法测定8个不同组分的抑菌活性；得到抑菌效果最好，抑菌带宽度达到分别为41.3 mm和42.0 mm的D组分和MD组分；
（4）Sephadex LH-20 柱层析
采用Sephadex LH-20层析法进一步分离硅胶柱层析后分离得到的抑菌活性组分MD组分；葡聚糖凝胶层析柱（1.5×50 cm）层析，所用色谱分离介质为Sephadex LH-20，湿法上样，以二氯甲烷-甲醇（3:2）为洗脱液进行等度洗脱，流速4 mL.h-1，每管收集2~3 mL，洗脱液通过薄层色谱法（TLC）分析，合并相同组分，得到10个组分，以小麦根腐病菌（B. Sorokiniana）为指示菌，采用牛津杯法测定10个组分的抑菌活性；得到从 MD组分中分离出来的抑菌带宽度为30.00 mm的MD-4组分；TLC检测表明MD-4组分条带单一且清晰，采用高效液相色谱法分析表明，MD-4组分在11.5 min时出现吸收峰且纯度较高，用于结构鉴定；
（5）抑菌活性组分的结构鉴定
采用7890-5975 GC/MS法对具有抑菌活性的MD-4组分进行结构鉴定；条件为：进样口温度250 ℃，流速1 mL/s，柱温程序初温40 ℃，辅助通道温度280 ℃，进样量1 µL，不分流进样，升温程序：40 ℃保持1 min，以30 ℃/min速度升至130 ℃，再以5 ℃/min升至250 ℃，10 ℃/min升至280 ℃保持6 min；离子源为EI，离子源温度150 ℃，四级杆温度150 ℃，发射电流34.6 µA，溶剂延迟6 min，载体为高纯氦气；
MD-4组分经GC/MS法分析，在保留时间31.2 min时出现单一峰；对该峰的组分进行离子扫描分析，根据扫描图谱分析确认该化合物为13-碳二十二烯酰胺。
本发明还公开了一种从海洋解淀粉芽孢杆菌（Ｂacillus amyloliquefaciens）BMF01中制备酯类化合物的方法，其特点是，其步骤如下：
（1）采用以上技术方案所述的步骤（1）－（3）制得抑菌带宽度为41.3 mm的MD组分；
（2）Sephadex LH-20 柱层析
采用Sephadex LH-20层析柱进一步分离硅胶柱层析后分离到的抑菌活性组D组分；葡聚糖凝胶层析柱（1.5×50 cm）层析，所用色谱分离介质为Sephadex LH-20，湿法上样，以二氯甲烷-甲醇（3:2）为洗脱液进行等度洗脱，流速4 mL.h-1，每管收集2~3 mL；Sephadex LH-20柱层析对D组分进行分离，D组分得到10个组分，采用TLC法进行纯度检测，合并相同组分；以小麦根腐病菌（B. Sorokiniana）为指示菌，采用牛津杯法测定组分的抑菌活性；得到从D组分中分离出来的抑菌带宽度分别为41.00 mm、38.00 mm、36.00 mm、30.00 mm和30.50 mm的 D-2、D-3、D-4、D-5和D-9组分；
（3）抑菌活性组分的结构鉴定
采用7890-5975 GC/MS法；条件为：进样口温度250 ℃，流速1 mL/s，柱温程序初温40℃，辅助通道温度280 ℃，进样量1 µL，不分流进样，升温程序：40 ℃保持1 min，以30 ℃/min速度升至130 ℃，再以5 ℃/min升至250 ℃，10 ℃/min升至280 ℃保持6 min；离子源为EI，离子源温度150 ℃，四级杆温度150 ℃，发射电流34.6 µA，溶剂延迟6 min，载体为高纯氦气；
对D-2组分的GC/MS法进行分析，分别在保留时间16.8 min、18.2 min、18.8 min和28.4min时出现4个峰；对4个峰的组分进行离子扫描分析，确认峰1为邻苯二甲酸二异丁酯，峰2为3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸甲酯，峰3为邻苯二甲酸二丁酯，峰4为邻苯二甲酸二异辛酯。
本发明以BMF01菌株为基础，对小麦根腐病菌（B. Sorokiniana）的生物活性为目标进行追踪，通过酸沉淀法、甲醇提取法、硅胶柱层析以及Sephadex LH-20层析等分离方法，对BMF01菌株发酵液中抑菌化合物进行分离，采用薄层层析法和高效液相色谱法检验纯度，通过GC/MS技术对分离部分组分进行结构分析。得到对小麦根腐病菌（B. Sorokiniana）具有抑菌作用的化合物。这些化合物为13-碳二十二烯酰胺，邻苯二甲酸二异丁酯， 3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸甲酯，邻苯二甲酸二丁酯，邻苯二甲酸二异辛酯。前述这些化合物都是首次从解淀粉芽孢杆菌发酵液中分离得到，并首次明确了这5种化合物对小麦根腐病菌的抑制作用。
附图说明
图1为 BMF01菌株无菌发酵液对小麦根腐病菌的抑菌活性图；图1中：a 为BMF01菌株无菌发酵液；ck 无菌发酵液培养基；
图2为 BMF01菌株发酵液酸沉淀后各组分的抑菌活性图；
图3为 MD组分的抑菌活性图，其中ck为对照；
图4为 MD组分的抑菌活性图，其中ck为对照；
图5为MD-4组分的TLC检测结果图；
图6为MD-4组分HPLC分析图；
图7 为D-2组分的TLC检测结果图；
图8为D-2组分HPLC分析图；
图9为 MD-4组分的GC/MS的总离子图；
图10 为MD-4组分主要成分的分子式及结构式；
图11为 D-2组分的GC/MS的总离子图；
图12为峰1为邻苯二甲酸二异丁酯的分子式及结构式；
图13为峰2为3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸甲酯的分子式及结构式；
图14为峰3为邻苯二甲酸二丁酯的分子式及结构式；
图15为峰4为邻苯二甲酸二异辛酯的分子式及结构式。
具体实施方式
以下参照附图，进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。
实施例：利用海洋解淀粉芽孢杆菌发酵制备酰胺类及酯类化合物的方法
1 材料与方法（Materials and methods）
1.1 试验材料
试验菌株及培养基：海洋解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）BMF01菌株和小麦根腐病菌（B. Sorokiniana）皆由本实验室保藏。
BMF01菌株及小麦根腐病菌活化培养基：PDA。BMF01菌株种子液培养基和发酵培养基: 蔗糖10 g/L，牛肉膏16 g/L，酵母膏3 g/L，FeSO4 0.4 g/L，水1000 mL，pH 7.0。
1.2 BMF01菌株发酵液的制备
将活化培养24 h的BMF01菌株斜面用5 mL种子液培养基洗下制成菌悬液，接种到60 mL（250 mL三角瓶）种子液培养基中，28 ℃下，摇床转速180 r/min，振荡培养24 h，即得发酵用种子液（浓度为108 cfu/mL）。按接种量10%将种子液接入装有27 L发酵培养基的50 L自动发酵罐（上海百仑生物科技有限公司）进行发酵，根据溶氧需求调整气阀使罐压维持0.04Mpa左右，通气量为3 L/min，28 ℃，180 r/min发酵60 h，4℃、12000r/min条件下离心20min去掉菌体，得到发酵液。发酵3批，制备90 L BMF01菌株发酵液。
1.3 BMF01菌株发酵液的酸沉淀及甲醇提取
提取液的制备：用6 mol/L HCl将BMF01菌株发酵液pH调节至2，4℃静置12h，4℃下10000 r/min离心20 min，分别收集上清液和沉淀物，沉淀物加入甲醇反复抽提至无色，合并得甲醇提取液，用1 moL/L NaOH调节抽提液至pH 7.0，40 ℃下将提取液浓缩至50 mL，分别测定上清液和沉淀甲醇抽提物对小麦根腐病菌（B. Sorokiniana）的抑菌活性；有活性的组分进一步进行分离纯化。
在甲醇提取液中加入少量硅胶，40 ℃减压浓缩得到粗提物样品，用于硅胶柱层析分离。
1.4 硅胶柱层析
（1）装柱：将硅胶柱（2.5 cm×60 cm）下端的活塞关闭，称量70倍于上样量的硅胶均匀加入硅胶柱，用真空泵抽真空同时用吸耳球敲打硅胶柱使填料紧实均匀且硅胶面平整。
（2）上样：采用干法上样。将抽提物样品缓缓均匀加入硅胶柱内，用吸耳球轻轻敲击硅胶柱使样品紧实且表面平整。
（3）洗脱：在硅胶柱口塞入少量棉花，分别以1 L石油醚、石油醚:二氯甲烷=1:1、二氯甲烷、二氯甲烷:甲醇=50:1、二氯甲烷:甲醇=10:1，二氯甲烷:甲醇=5:1、二氯甲烷:甲醇=1:1和甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱。
（4）收集：用真空泵边抽真空边收集不同洗脱液洗脱下来的组分。每个梯度洗脱液收集后分别在40 ℃减压浓缩至20 mL。
（5）抑菌活性测定：以小麦根腐病菌为指示菌，采用牛津杯法测定到的不同极性收集液的抑菌活性。
1.5 Sephadex LH-20 柱层析
采用Sephadex LH-20层析柱（1.5 cm×50 cm）进一步分离硅胶柱层析分离得到的抑菌活性组分。葡聚糖凝胶层析柱（1.5×50 cm）层析，所用色谱分离介质为Sephadex LH-20，湿法上样，以二氯甲烷-甲醇（3:2）为洗脱液进行等度洗脱，流速4 mL.h-1，每管收集2~3 mL，洗脱液通过薄层色谱法（TLC）分析，合并相同组分。采用牛津杯法测定不同组分的抑菌活性。
1.6测不同组分的纯度检测
采用薄层层析法检测分离过程中不同组分的纯度，薄层层析检测单一条带组分采用高效液相色谱法(YMC-Pack ODS-A分析柱)进一步检测纯度，柱子大小为6 mm×250 mm，进样量为10 µL，以甲醇和水为流动相进行梯度洗脱。通过UV检测器检测波长为214 nm的吸收峰。
1.7 抗菌活性组分的结构分析
采用7890-5975 GC/MS法对抑菌活性组分进行结构分析。条件为：进样口温度250 ℃，流速1 mL/s，柱温程序初温40 ℃，辅助通道温度280 ℃，进样量1 µL，不分流进样，升温程序：40 ℃保持1 min，以30 ℃/min速度升至130 ℃，再以5 ℃/min升至250 ℃，10 ℃/min升至280 ℃保持6 min。离子源为EI，离子源温度150 ℃，四级杆温度150 ℃，发射电流34.6µA，溶剂延迟6 min，载体为高纯氦气。
2 结果与分析（Results and analysis）
2.1 BMF01菌株发酵液的抑菌活性
测定BMF01菌株发酵液对小麦根腐病菌的抑菌活性，结果如图1所示。BMF01菌株无菌发酵液对小麦根腐病菌的抑菌活性明显，抑菌圈直径达36.50 mm。
2.2 BMF01菌株发酵液酸沉淀甲醇提取结果
BMF01菌株发酵液盐酸沉淀后分别测定上清液和沉淀的抑菌活性。上清液对小麦根腐病菌具有一定抑菌活性，抑菌带宽度为7.54 mm；将沉淀用甲醇抽提，得到甲醇提取液，其对小麦根腐病菌的抑菌带宽度达41.50 mm，明显高于上清液。结果见图2。
因此本试验采用酸沉淀法和甲醇提取法作为BMF01菌株发酵液抑菌活性物质粗提物的制备方法。
2.3 硅胶柱层析结果
酸沉淀甲醇粗提物样品采用硅胶柱层析进行初步分离，用石油醚、石油醚:二氯甲烷=1:1、二氯甲烷、二氯甲烷:甲醇=50:1、二氯甲烷:甲醇=10:1，二氯甲烷:甲醇=5:1、二氯甲烷:甲醇=1:1和甲醇8个不同极性洗脱剂进行洗脱，分别收集得到8个组分，测定8个组分对小麦根腐病菌的抑菌活性，其中D组分和MD组分抑菌效果明显，抑菌带宽度分别为41.3 mm和42.0 mm，如图3－4所示，其他组分对小麦根腐病菌无抑菌活性。
2.4 Sephadex LH-20 柱层析结果
采用Sephadex LH-20柱层析对MD和D组分进行分离，MD得到10个组分，标记为MD-1、MD-2……MD-10，测定10个组分对小麦根腐病菌的抑菌作用，结果表明10个组分均具有一定的抑菌作用，其中 MD-4组分的抑菌作用最强，抑菌带宽度为30.00 mm，见表1。D组分分离后得到9个组分，标记为D-1、D-2……D-9，9个组分对小麦根腐病菌均具有一定的抑菌作用，其中D-2、D-3、D-4、D-5和D-9组分对小麦根腐病菌具有较高的抑菌作用，抑菌带宽度分别为41.00 mm、38.00 mm、36.00 mm、30.00 mm和30.50 mm。见表1。
表1 MD1-10和D 1-9组分对小麦根腐病菌的抑菌带宽度（mm）
TLC检测表明MD-4组分条带单一且清晰（如图5），采用高效液相色谱法分析表明，MD-4组分在11.5 min时出现吸收峰且纯度较高（如图6），可用于结构鉴定和分析。
D-2组TLC检测结果显示2条带清晰但第1号条带稍微有拖尾现象（如图7），高效液相色谱分析表明D-2组分有3个峰，主要集中于12 min左右（如图8）。
其他活性组分TLC检测结果显示条带拖尾现象严重，不利于进行下一步研究，需要进一步分离纯化。
2.5 部分抑菌活性组分的结构鉴定与分析
选取MD和D组分分离后抑菌活性最高的组分MD-4和D-2进行组分分析。
对MD-4组分经GC/MS法分析，在保留时间31.2 min时出现单一峰，见图9。对该峰的组分进行离子扫描分析，得到该组分的主要成分化学式、结构式，如图10。根据结构式分析认为该化合物的结构为13-碳二十二烯酰胺。
对D II组分的GC/MS法进行分析，其总离子流图如图11，分别在保留时间16.8min、18.2 min、18.8 min和28.4 min时出现4个峰。
对4个峰的组分进行离子扫描分析，峰1为邻苯二甲酸二异丁酯，峰2为3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸甲酯，峰3为邻苯二甲酸二丁酯，峰4为邻苯二甲酸二异辛酯，结果如图12－15所示。
发明人采用酸沉淀、甲醇提取、硅胶柱和柱层析方法从解淀粉芽孢杆菌BMF01菌株发酵液中得到对小麦根腐病菌具有抑菌活性的组分19个，其中一个组分为单一组分，经GC/MS法分析，该组分为13-碳二十二烯酰胺。对其中的另一抑菌活性较强的组分进行GC/MS分析，其中检测到邻苯二甲酸二异辛酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯和3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸甲酯4种物质。并且验证了这几种化合物作为抑制小麦根腐病菌（B. Sorokiniana）的化合物或者组合物的用途。

Claims (4)

1.一种利用海洋解淀粉芽孢杆菌（Ｂacillus amyloliquefaciens）BMF01菌株发酵制备13-碳二十二烯酰胺的方法，其特征在于，其步骤如下：
（1）BMF01菌株的发酵及其发酵液的制备
将活化培养24h的BMF01菌株斜面用5 mL种子液培养基洗下菌苔制成BMF01菌株菌悬液，接种到装有55ml种子液培养基的250ml三角瓶中，28 ℃下，摇床转速180 r/min，振荡培养24 h，调整浓度为108 cfu/mL，即得发酵用种子液；按接种量10%将种子液接入装有27 L发酵培养基的50 L自动发酵罐中进行发酵，根据溶氧需求调整气阀使罐压维持0.04 Mpa，通气量为3 L/min，28 ℃，180 r/min发酵60 h，4℃、12000r/min条件下离心20min去掉菌体，得到发酵液；所述的种子液培养基和发酵培养基为：蔗糖10 g/L，牛肉膏16 g/L，酵母膏3g/L，FeSO4 0.4 g/L，水1000 mL，pH 7.0；
（2）BMF01菌株发酵液的酸沉淀及甲醇提取
用6 mol/L HCl将BMF01菌株发酵液pH调节至2，4℃静置12h，4℃下10000 r/min离心20min，分别收集上清液和沉淀物，沉淀物加入甲醇反复抽提至无色，合并得甲醇提取液，用1moL/L NaOH调节抽提液至pH 7.0，40 ℃下将提取液浓缩至50 mL，测定上清液和沉淀甲醇抽提物对小麦根腐病菌（B. Sorokiniana）的抑菌活性；有活性的组分甲醇抽提物沉淀有明显的抑菌作用，可进一步进行分离纯化；
（3）BMF01菌株发酵液甲醇抽提物的硅胶柱层析
向BMF01菌株的甲醇提取液中加入适量硅胶，40 ℃减压浓缩得到粗提物样品，用于硅胶柱层析分离；
采用干法上样法，将抽提物样品缓缓均匀加入硅胶柱内，用吸耳球轻轻敲击硅胶柱使样品紧实且表面平整在硅胶柱口塞入适量棉花，分别以1 L石油醚，石油醚:二氯甲烷=1:1，二氯甲烷，二氯甲烷:甲醇=50:1，二氯甲烷:甲醇=10:1，二氯甲烷:甲醇=5:1，二氯甲烷:甲醇=1:1和甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，用真空泵边抽真空边收集洗脱液洗脱下来的组分，每个梯度洗脱夜收集后分别在40 ℃减压浓缩至20 mL；共收集得到8个组分；
以小麦根腐病菌（B. Sorokiniana）为指示菌，采用牛津杯法测定8个不同组分的抑菌活性；得到抑菌效果最好，抑菌带宽度达到分别为41.3 mm和42.0 mm的D组分和MD组分；
（4）Sephadex LH-20 柱层析
采用Sephadex LH-20层析法进一步分离硅胶柱层析后分离得到的抑菌活性组分MD组分；葡聚糖凝胶层析柱（1.5×50 cm）层析，所用色谱分离介质为Sephadex LH-20，湿法上样，以二氯甲烷-甲醇（3:2）为洗脱液进行等度洗脱，流速4 mL.h-1，每管收集2~3 mL，洗脱液通过薄层色谱法（TLC）分析，合并相同组分，得到10个组分，以小麦根腐病菌（B. Sorokiniana）为指示菌，采用牛津杯法测定10个组分的抑菌活性；得到从 MD组分中分离出来的抑菌带宽度为30.00 mm的MD-4组分；TLC检测表明MD-4组分条带单一且清晰，采用高效液相色谱法分析表明，MD-4组分在11.5 min时出现吸收峰且纯度较高，用于结构鉴定；
（5）抑菌活性组分的结构鉴定
采用7890-5975 GC/MS法对具有抑菌活性的MD-4组分进行结构鉴定；条件为：进样口温度250 ℃，流速1 mL/s，柱温程序初温40 ℃，辅助通道温度280 ℃，进样量1 µL，不分流进样，升温程序：40 ℃保持1 min，以30 ℃/min速度升至130 ℃，再以5 ℃/min升至250 ℃，10 ℃/min升至280 ℃保持6 min；离子源为EI，离子源温度150 ℃，四级杆温度150 ℃，发射电流34.6 µA，溶剂延迟6 min，载体为高纯氦气；
MD-4组分经GC/MS法分析，在保留时间31.2 min时出现单一峰；对该峰的组分进行离子扫描分析，根据扫描图谱分析确认该化合物为13-碳二十二烯酰胺。
2.一种如权利要求1所述方法制得的13-碳二十二烯酰胺作为抑制小麦根腐病菌（B. Sorokiniana）的化合物的用途。
3.一种从海洋解淀粉芽孢杆菌（Ｂacillus amyloliquefaciens）BMF01中制备酯类化合物的方法，其特征在于，其步骤如下：
（1）采用权利要求1所述的步骤（1）－（3）制得抑菌带宽度为41.3 mm的MD组分；
（2）Sephadex LH-20 柱层析
采用Sephadex LH-20层析柱进一步分离硅胶柱层析后分离到的抑菌活性组D组分；葡聚糖凝胶层析柱（1.5×50 cm）层析，所用色谱分离介质为Sephadex LH-20，湿法上样，以二氯甲烷-甲醇（3:2）为洗脱液进行等度洗脱，流速4 mL.h-1，每管收集2~3 mL；Sephadex LH-20柱层析对D组分进行分离，D组分得到10个组分，采用TLC法进行纯度检测，合并相同组分；以小麦根腐病菌（B. Sorokiniana）为指示菌，采用牛津杯法测定组分的抑菌活性；得到从D组分中分离出来的抑菌带宽度分别为41.00 mm、38.00 mm、36.00 mm、30.00 mm和30.50 mm的 D-2、D-3、D-4、D-5和D-9组分；
（3）抑菌活性组分的结构鉴定
采用7890-5975 GC/MS法；条件为：进样口温度250 ℃，流速1 mL/s，柱温程序初温40℃，辅助通道温度280 ℃，进样量1 µL，不分流进样，升温程序：40 ℃保持1 min，以30 ℃/min速度升至130 ℃，再以5 ℃/min升至250 ℃，10 ℃/min升至280 ℃保持6 min；离子源为EI，离子源温度150 ℃，四级杆温度150 ℃，发射电流34.6 µA，溶剂延迟6 min，载体为高纯氦气；
对D-2组分的GC/MS法进行分析，分别在保留时间16.8 min、18.2 min、18.8 min和28.4min时出现4个峰；对4个峰的组分进行离子扫描分析，确认峰1为邻苯二甲酸二异丁酯，峰2为3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸甲酯，峰3为邻苯二甲酸二丁酯，峰4为邻苯二甲酸二异辛酯。
4.一种如权利要求3所述方法制得的邻苯二甲酸二异丁酯， 3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸甲酯，邻苯二甲酸二丁酯，邻苯二甲酸二异辛酯中的一种或多种作为抑制小麦根腐病菌（B. Sorokiniana）的化合物或者组合物的用途。
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