CN110760462A - 一种防治姜瘟病的拮抗菌yj32及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种防治姜瘟病的拮抗菌YJ32及其应用，本发明筛选得到一株双向伯克霍尔德氏菌(Burkholderia ambifaria)YJ32，保藏号为CGMCC NO.15922。本发明的拮抗菌株YJ32适生范围宽，易培养，对姜瘟病的病原菌具有靶向抑制作用，是一种防治姜瘟病效率高、环境友好的生防菌株，应用前景广阔。

Description

一种防治姜瘟病的拮抗菌YJ32及其应用
技术领域
本发明涉及一种防治姜瘟病的拮抗菌YJ32及其应用，属于微生物技术及生物防治领域。
背景技术
姜瘟病又称姜青枯病，主要由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引发，传播途径多，危害大，一旦感染，可导致生姜20-80％减产乃至绝收，对生姜生产及产区经济发展造成巨大影响，已成为制约生姜产业发展的瓶颈问题。但是，由于目前缺乏理想的防治方法，姜瘟病一直未能得到有效控制。
姜瘟病属于土传细菌性病害，采用化学杀菌方法防治，效果不明显，很难从根本上根除姜瘟病的发生，且易造成生姜中有害化学物质的残留以及环境污染等问题。生物防治姜瘟病，是利用拮抗菌靶向防控病原菌，具有高效、无毒、绿色环保等特点，是一条有效的防控途径。然而，目前报道的有关姜瘟病高效拮抗菌株以及应用于田间的有效生防菌剂较少。本发明将提供一种能有效防治姜瘟病土传病害的拮抗菌及其应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种防治姜瘟病的拮抗菌YJ32及其应用。为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为：
1、姜瘟病拮抗菌YJ32的筛选与鉴定，包括以下步骤：
(1)菌株分离与纯化
在姜瘟病发病区，采集姜瘟病土样和染病姜块多份。取土样和姜块，按照土样(姜块)∶无菌生理盐水为1∶9比例，进行10倍梯度稀释，依次得到10-1-10-8梯度的菌悬液，采用涂布分离法，将上述10-4-10-8菌悬液分别在牛肉膏蛋白胨、LB、无机盐与马铃薯固体培养基平板上涂布，于25℃-37℃，培养2-7d，分离菌株。然后，采用平板划线法，在同种培养基上划线，纯化菌株，得到不同的单菌落菌株。
挑取上述纯化好的单菌落，分别接种于牛肉膏蛋白胨或LB液体培养基中，于25-37℃，150-200r/min条件下，震荡培养1-2d，得到各纯化菌株菌液。
(2)靶标致病菌的培养与TZC固体平板制备
选择青枯雷尔氏菌Z-A9-1(Ralstonia solanacearum)和桑细菌性萎蔫病菌JLIY2(Enterobacter mori)2种姜瘟病的病原菌，作为靶标致病菌。
将试管斜面保存的青枯雷尔氏菌Z-A9-1和桑细菌性萎蔫病菌JLIY2，分别接种于LB液体培养基或牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于28-32℃、150-200r/min条件下，震荡培养24-48h，制备得到Z-A9-1和JLIY2菌液，用生理盐水分别将其OD600值调为1.00，然后各取15-20ml，分别添加到1L已在121℃灭菌20min，且冷却至40℃-50℃的TZC固体培养基中，摇均匀后，倒平板，分别得到含有Z-A9-1和JLIY2靶标致病菌的TZC固体平板。
青枯雷尔氏菌Z-A9-1(Ralstonia solanacearum)：由中国农业微生物菌种保藏管理中心提供，菌种保藏号为ACCC No.60145。桑细菌性萎蔫病菌JLIY2(Enterobactermori)，由本实验室从姜瘟病染病土样中分离得到，现保藏在中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为ACCC No.60119，保藏地址：北京市海淀区中关村南大街12号。
(3)姜瘟病拮抗菌的筛选与鉴定
采用双靶标菌抑制法，筛选姜瘟病拮抗菌株。具体为：在上述含有Z-A9-1和JLIY2病原菌的TZC固体平板上，分别采用点接法，接种上述(1)中得到的各纯化菌株的菌液4-8ul，每个平板均匀接种4-6个不同菌株的菌液，然后置于28-32℃条件下，培养2-7d。每天观察并挑选出对2种靶标致病菌Z-A9-1和JLIY2均具有抑菌圈的菌株，并测量抑菌圈直径，从中挑选出抑菌圈大菌株，由此筛选得到对青枯雷尔氏菌Z-A9-1和桑细菌性萎蔫病菌JLIY2两种病原菌的生长，均具有强抑制作用的拮抗菌株YJ32。
TZC固体培养基配置：蛋白胨10.0g，酸水解酪蛋白1.0g，TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)0.05g，葡萄糖10.0g，蒸馏水1L，pH6.8-7.2，琼脂10g-15g，121℃灭菌20min(注TTC配成1％溶液，0.22um滤膜过滤，待培养基冷却到50℃左右时加入，摇均匀)。
本发明的拮抗菌YJ32，显微观察呈杆状，在牛肉膏蛋白胨固体培养基中培养1-3d，菌落直径3-7mm，乳白色，表面粗糙，无光泽，扁平，边缘不整齐，呈不规则形或近圆形。经过16S rDNA提取，PCR扩增与测序，序列比对，进化树构建，并结合形态特征观察，确定YJ32菌株为Burkholderia ambifaria，并命名为双向伯克霍尔德氏菌YJ32(Burkholderiaambifaria YJ32)。该菌株于2018年6月11日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.15922。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
2、本发明菌株YJ32的培养方法，其特征在于，菌株YJ32培养可选用牛肉膏蛋白胨培养基、LB培养基培养基、马铃薯培养基、无机盐培养基、TZC培养基进行培养；该菌株对pH值适应性宽，在pH值为3.0-11.0的培养基中均能生长，其中，在pH值在5.0-9.0之间生长较好。
3、菌株YJ32对姜瘟病病原菌的拮抗作用
菌株YJ32通过种子液制备、发酵培养，离心或过滤，分离等操作环节获得培养物，包括发酵液、代谢产物和菌体；通过实验发现它们对青枯雷尔氏菌Z-A9-1和桑细菌性萎蔫病菌JLIY2均具有拮抗作用；同时发现，发酵液对土壤中姜瘟病病原菌，也具有拮抗作用。菌株YJ32及其培养物可直接应用于姜瘟病的预防或制成菌剂用于姜瘟病的预防。使用方法简单，可叶面喷施，根施，也可以结合滴灌、微灌和浇水等一块施用。
本发明的有益效果
1、本发明提供的姜瘟病拮抗菌株YJ32，对引起姜瘟病的病原菌青枯假单胞菌(Ralstonia pseudosolanacearum)与桑树性细菌萎蔫病(Enterobacter mori)，均具有强抑制作用，可靶向预防姜瘟病。
2、本发明提供的菌株YJ32，适生条件范围宽，易培养，在多种培养基中能生长，如在无机盐、马铃薯、牛肉膏蛋白胨、LB培养基中均可生长，生长速度快，对pH适应性强，在pH值为5-9条件下生长较好，适应多种不同pH值土壤。
3、本发明提供的菌株YJ32及其培养物，包括发酵液、菌体、代谢产物等，对姜瘟病病原菌均有拮抗作用，可直接应用或做成菌剂，应用于姜瘟病防治，持效期长。
4、本发明提供的菌株YJ32及其培养物，制备工艺简单，可以一年四季生产。施用方法灵活，可叶面喷施，根施，也可以结合滴灌、微灌和浇水等一块施用，避免了现有化学方法污染等弊端，是一条绿色环保、且有效的方法。
附图说明
图1为菌株YJ32的菌落形态图。
图2为菌株YJ32的系统发育树。
图3为菌株YJ32在牛肉膏蛋白胨培养基中生长曲线。
图4为菌株YJ32及其培养物对Z-A9-1菌的抑菌圈(其中上方为YJ32菌体，左下方为YJ32发酵液的上清液，右下方为YJ32发酵液)。
具体实施方式
下面具体实施方式，是对本发明技术方案作进一步具体的说明，但本发明不局限于以下所列举具体实施方式。
实施例1：菌株YJ32的筛选与鉴定
1、菌株筛选
(1)土样采集与菌株分离纯化
在生姜姜瘟病发病区，采集染病土样和染病姜块多份，作为筛菌的菌样材料。采用稀释涂布法分离菌株，具体操作为：取多份土样(姜块)，分别置于三角瓶中，按照土样(姜块)∶无菌生理盐水比例为1∶9，加入无菌生理盐水，置于摇床中，在180rpm、28℃条件下，振荡20min，得到的菌悬液，继续用无菌生理盐水按照10倍梯度稀释法稀释，分别得到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8梯度稀释液。取10-4-10-8梯度稀释液100-200ul，分别涂布于牛肉膏蛋白胨、LB、无机盐和马铃薯固体培养基平板上，将平板置于25-37℃条件下，培养2-7d。每天挑取菌落形态不同的菌株，并采用平板划线法纯化菌株，在相同的培养基平板上划线纯化，得到单菌落菌株，并用试管斜面4℃保存。
挑取上述纯化好的单菌落菌株，分别接种于牛肉膏蛋白胨或LB液体培养基中，于25℃-37℃，150-200r/min条件下，震荡培养1-2d，得到不同纯化菌株的菌液，备用。
(2)靶标致病菌的培养与TZC固体平板的制备
选择青枯雷尔氏菌Z-A9-1(Ralstonia solanacearum)和桑细菌性萎蔫病菌JLIY2(Enterobacter mori)2种姜瘟病致病菌，作为靶标致病菌。
将试管斜面保存的Z-A9-1和JLIY2菌，分别接种于LB液体培养基或牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于28-32℃、150-200rpm摇床中，培养24-36h，制得2种靶标致病菌的菌液，用生理盐水将其OD600值调为1.00，然后各取15-20ml，分别添加到1L已在121℃灭菌20min，且冷却至40℃-50℃的TZC固体培养基中，摇均匀后，倒平板，制成分别含有青枯雷尔氏菌Z-A9-1和桑细菌性萎蔫病JLIY2靶标致病菌的TZC固体平板，用于姜瘟病拮抗菌株的筛选。
青枯雷尔氏菌Z-A9-1(Ralstonia solanacearum)：由中国农业微生物菌种保藏管理中心提供，菌种保藏号为ACCC No.60145，保藏地址：北京市海淀区中关村南大街12号。
桑细菌性萎蔫病菌JLIY2(Enterobacter mori)：是一种引起植物“枯萎”的致病菌，也是姜瘟病致病菌。本发明使用的桑细菌性萎蔫病菌JLIY2(Enterobacter moriJLIY2)，由本实验室从姜瘟病病区土样中分离得到，现保藏在中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为ACCC No.60119，保藏地址：北京市海淀区中关村南大街12号。
所用的培养基配置方法如下：
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水或自来水1L，pH自然，121℃灭菌15-20min。固体培养基添加琼脂10.0-15.0g。
LB培养基：蛋白胨10g，NaCl 5g，酵母粉5g，蒸馏水1000ml，pH值7.0-7.5，121℃高温灭菌15-20min。固体培养基添加琼脂10.0-15.0g。
马铃薯葡萄糖培养基(PDA)：马铃薯200g，葡萄糖10-20g，蒸馏水1L，pH自然，115℃灭菌20-25min。固体培养基添加琼脂10.0-15.0g。
无机盐培养基：K2HPO4 1.000-3.000g/L，KH2PO4 1.000-3.000g/L，NaCl 5.000-8.000g/L，MgSO4 0.200-0.800g/L，CaCl2 0.010-0.050g/L，FeSO4 0.005-0.010g/L，H3BO30.100-0.200mg/L，ZnSO4 0.100-0.200mg/L，葡萄糖5.000-10.000g/L，121℃灭菌15-20min。固体培养基添加琼脂10.0-15.0g/L。
TZC固体培养基配置：蛋白胨10.0g，酸水解酪蛋白1.0g，TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)0.05g，葡萄糖10.0g，蒸馏水1L，pH6.8-7.2，琼脂10-15g，121℃灭菌20min。(注TTC配成1％溶液，0.22um滤膜过滤，待培养基冷却到50℃左右时加入，摇均匀)。
(3)姜瘟病拮抗菌株筛选
采用双靶标菌抑制法，筛选姜瘟病拮抗菌。在上述(2)中制备的含有青枯雷尔氏菌Z-A9-1和桑细菌性萎蔫病菌JLIY2的TZC固体平板上，分别采用点接法，接种上述(1)中不同纯化菌株的菌液4-8ul，每个平板均匀接种4-6个不同菌株的菌液，置于培养箱中，于28-32℃条件下培养2-7d。每天观察并记录各接种菌株形成抑菌圈情况，挑选出对2种靶标致病菌Z-A9-1和JLIY2均具有抑菌圈菌株，并测定抑菌圈直径大小，根据抑菌圈直径大小进行排序，由此筛选得到对青枯雷尔氏菌Z-A9-1和桑细菌性萎蔫病菌JLIY2两种姜瘟病致病菌抑菌圈大、具有抑制作用强的拮抗菌株，编号为YJ32。
2、菌株YJ32形态与分子生物学鉴定
2.1 形态特征
菌株YJ32显微观察呈杆状，在牛肉膏蛋白胨固体培养基中培养1-3d，菌落直径大小3-7mm，乳白色，表面粗糙，无光泽，扁平，边缘不整齐，呈不规则形或近圆形，菌落形态见图1。
2.2 菌株YJ32分子生物学鉴定
2.2.1 基因组提取
(1)菌株活化：挑取试管斜面菌株YJ32，接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在温度为28℃-37℃，150-200r/min，培养为1-2天。
(2)取1.5ml培养物5000rpm离心10min，去上清，收集菌体。
(3)菌体中加入0.5mlTE缓冲液，反复吹打，12000rpm离心2min，弃上清。
(4)加入0.5ml的TE缓冲液，使之重新悬浮，加入30μl 10％SDS和15μl的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h，期间不断轻轻混匀。
(5)加入100μl 5mol/L NaCl，充分混匀，加入80μl CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃温育10min。
(6)置于冰中冷却至室温，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀(25∶24∶1)，充分混匀，4℃，10000g，离心10min，取上清液至新EP管中。
(7)加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，充分混匀，4℃，10000g，离心10min，取上清液至新EP管中。
(8)加入0.6-0.8倍体积的预冷异丙醇和1/10体积的NaAc(3mol/L)，轻轻混合，放入-20℃，沉淀30-60min，4℃，12000rpm离心5-10min，弃上清。
(9)用1ml预冷的70％乙醇洗涤后，4℃，12000rpm离心5min弃乙醇，在超净工作台中稍加干燥，溶于20-50μl TE缓冲液中。
(10)用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。
2.2.2 PCR扩增
采用细菌通用引物27F(GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG)和1492R(GGTCCGTGTTTCAAGACGG)，对菌株的16SrDNA基因进行PCR序列扩序。PCR扩增采用50μL反应体系：5μL 10×PCR Buffer，1μL dNTP mix，2μL DNA模板，引物27F4μl，1492R4μl，TaqDNA聚合酶0.25μl，ddH2O 33.75μl。
PCR反应条件：95℃ 5min，循环一次；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，循环35次；72℃ 7min。PCR扩增产物，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测。
2.2.3 测序及系统发育树构建
将PCR扩增产物，送北京生工基因组研究中心测序，得到菌株YJ32的16SrDNA基因序列如下：
Figure BSA0000194380760000091
Figure BSA0000194380760000101
将上述测序结果与网站https：//www.ezbiocloud.net/identify中基因序列比对，发现菌株YJ32的16S rDNA基因序列与Burkholderia ambifaria菌中的一些菌株的序列的同源性最高。依据比对结果，在EZbiocloud数据库里挑选相似度接近的菌株的基因序列，用Clustalx软件进行序列比对，并用MEGA6.0软件构建系统发育树，结果见图2。菌株YJ32与菌株Burkholderia ambifaria AMMD聚于同一分支，系统发育关系最为密切。
根据菌株YJ32菌落形态特征和分子生物学鉴定结果，确定菌株YJ32为双向伯克霍尔德氏菌(Burkholderia ambifaria)，并命名为双向伯克霍尔德氏菌YJ32(Burkholderiaambifaria YJ32)。该菌株于2018年6月11日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.15922，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
目前，国内外尚无文献报道双向伯克霍尔德氏菌(Burkholderia ambifaria)具有抑制姜瘟病的功能。因此，菌株YJ32是一株具有防治姜瘟病病原菌的新功能菌株，为姜瘟病的生物防治提供了新的微生物资源。
实施例2：姜瘟病拮抗菌YJ32的生长特性
1、菌株YJ32易培养，适应性宽
菌株YJ32可在多种培养基中生长：将菌株YJ32按照2％的接种量，分别接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基、LB液体培养基、无机盐液体培养基和马铃薯液体培养基中，置于转速为150-180r/min，温度为28℃-32℃摇床中培养24h，发酵液均变为浑浊，OD600值由初始的0.01-0.03增长到1.21-3.14，说明菌株YJ32在上述培养基中均能生长。其中，在牛肉膏液体培养基中，生长的OD600nm值可达到3.0以上。同时，菌株YJ32接种到上述固体培养基中以及TZC固体培养基中，菌株也均能生长。
菌株YJ32对pH值适应性宽：使用盐酸和氢氧化钠调节牛肉膏液体培养基pH值为3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，将菌株YJ32按2％的接种量接种于不同pH培养基中，在转速为150-180r/min，培养温度28-32℃的条件下震荡培养，20h时测定OD600nm值，发现菌株YJ32在pH值为3.0-11.0的培养基中均能生长，对pH值适应性宽。其中在pH值在5.0-9.0之间生长较好，OD600nm值在1.6以上。可见，该菌株可应用于pH值为5.0-9.0的土壤中。
2、菌株YJ32生长曲线
将菌株YJ32按2％的接种量，接种于装有50mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的100mL三角瓶中，在转速为150-180r/min，培养温度28-32℃的条件下，震荡培养，每隔2h测定一次OD600nm值，用Excel绘制生长曲线，结果见图3。由图3可知，菌株YJ32，在0-2h处于调整期，2h后，进入对数生长期，OD600值上升快，14h时可达3.0以上，显示出YJ32生长速度快的特性，之后为稳定期，16-20h生物量达到最大，20h以后生长开始下降。
实施例3：菌株YJ32对姜瘟病病原菌的抑制作用
(1)含有病原菌的TZC固体平板制备
按照实施例1中的方法，制备得到含有青枯雷尔氏菌Z-A9-1的TZC固体平板1，以及含有桑细菌性萎蔫病菌JLIY2的TZC固体平板2。
(2)菌株YJ32及其培养物制备
菌株YJ32发酵培养与培养物制备：将菌株YJ32按照2-5％的接种量，接种于牛肉膏液体培养基或LB液体培养基中，在温度为28-32℃，转速为150-180r/min，振荡培养20-24h；然后，将20～24h菌龄的种子液，放大培养，按照上述接种量接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基或LB液体培养基中，在温度为28-32℃，转速为150-180r/min条件下，振荡培养1-2d，得到发酵液A。取发酵液3mL，置于7000-9000r/min、4℃条件下离心5min，收集上清液，或采用0.45um滤膜过滤方法，得到发酵液的上清液B。与此同时，收集离心得到的菌体沉淀物，用灭过菌的生理盐水，洗涤并离心三次后，加入无菌生理盐水3mL，混匀，得到菌体悬浊液C。
(3)菌株YJ32及其培养物对病原菌的拮抗作用
取上述(1)种制备的含有Z-A9-1和JLIY2病原菌的平板1和平板2，从平板中心向外辐射均匀分成3个区，然后分别在3个区内距离平板边缘1.5-2.0cm处，采用点接法，接种上面(2)中制备的菌株YJ32及其培养物，分别为YJ32发酵液A，发酵液的上清液B和菌体悬浊液C，每个点接种量为5ul，吸收后，置于28-32℃恒温培养箱中，培养1-7d，每天观察并记录抑菌圈大小。结果发现，菌株YJ35的发酵液A，发酵液的上清液B和菌体悬浊液C，它们对病原菌Z-A9-1和JLIY2的生长均具有抑制作用，即YJ32及其培养物可同时抑制由青枯雷尔氏菌和桑细菌性萎蔫病菌2种病原菌引起的姜瘟病。其中，菌株YJ35发酵液A和菌体悬浊液C对病原菌JLIY2的抑菌圈直径为10-17mm。菌株YJ35的发酵液A和菌体悬浊液C，对病原菌Z-A9-1的抑菌圈直径可达到20-28mm，抑菌作用强，持效期长，发酵液的上清液B对病原菌Z-A9-1也具有抑制作用。菌株YJ32及其培养物对Z-A9-1菌的抑菌圈见图4。
取上述(2)中YJ32菌株的发酵液A，用无菌生理盐水稀释成浓度为OD600nm＝1.0的菌悬液，按照0.3-2.0％(重量比)的施加量，喷施到已在121℃灭菌30min以及未灭菌的姜瘟病土样中，并以喷施无菌水作对照，每隔24h分别取土样，采用稀释涂布法，涂布于TZC固体平板中；28-32℃培养24h-48h时，对平板中红色菌落进行计数，比较红色菌落数量。发现菌株YJ32发酵液对土壤病原菌具有抑制乃至杀死作用，对土壤姜瘟病科起到防治作用。
综上所述，菌株YJ35及其培养物对青枯雷尔氏菌和桑细菌性萎蔫病菌2种病原菌引起的姜瘟病具有抑制作用，对土壤中姜瘟病病原菌也具有拮抗作用。利用YJ32菌体自身、含有菌体的悬浊液、菌体培养液、代谢产物中的至少一种，可应用于姜瘟病的防治，或制成菌剂用于姜瘟病病害的防治。施用方法简便灵活，可叶面喷施，根施，也可以结合滴灌、微灌和浇水等一块施用，起到防治姜瘟病作用。生物方法预防姜瘟病，避免了现有化学方法污染生姜和环境等弊端，是一条绿色环保、且有效的方法。
以上所述的实施例为本发明的目的、技术方案和有益效果的说明，本发明的实施方式不受上述实施例的限制，任何在本发明的精神和原则范围内所做的改进、简化、替代、组合等，均视为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Figure RE-ISB0000185204010000011

Claims (10)

1.一种防治姜瘟病的拮抗菌YJ32及其应用，其特征在于：通过形态特征观察与分子生物学鉴定，确定菌株YJ32为Burkholderia ambifaria，并命名为双向伯克霍尔德氏菌YJ32(Burkholderia ambifaria YJ32)；该菌株于2018年6月11日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.15922。
2.根据权利要求1所述的一种防治姜瘟病的拮抗菌YJ32，其特征在于，菌株YJ32的筛选方法，所述方法包括：(1)菌株分离与纯化，采集姜瘟病土样和染病姜块多份，采用梯度稀释与涂布法分离菌株，并利用平板划线法纯化菌株，得到不同纯化菌株；(2)靶标致病菌的培养与TZC固体平板制备：将青枯雷尔氏菌Z-A9-1(Ralstonia solanacearum)与桑细菌性萎蔫病菌(Enterobacter mori)2种病原菌，分别接种于LB液体培养基或牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于28-32℃、150-200r/min条件下，培养24-48h，制备得到2种病原菌菌液，用生理盐水分别将其OD600值调为1.00，然后分别取15-20ml，添加到1L已在121℃灭菌20min，且冷却至40℃-50℃的TZC固体培养基中，摇匀后，倒平板，分别得到含有青枯雷尔氏菌Z-A9-1与桑细菌性萎蔫病菌JLIY2的TZC固体平板；(3)拮抗菌的筛选与鉴定，取不同纯化菌株，分别接种于牛肉膏蛋白胨或LB液体培养基中，于25-37℃摇床中培养1-2d，得到各纯化菌株菌液，取菌液4-8u，采用点接法，分别接种到含有青枯雷尔氏菌Z-A9-1与桑细菌性萎蔫病菌JLIY2的TZC固体平板中，置于28-32℃条件下培养2-7d；每天观察并挑选出对2种病原菌生长均具有抑制作用，且抑菌圈大菌株，由此筛选得到拮抗菌株YJ32。
3.根据权利要求1所述的拮抗菌YJ32，其特征在于，拮抗菌YJ32对姜瘟病病原菌青枯雷尔氏菌(Ralstonia pseudosolanacearum)和桑细菌性萎蔫病菌(Enterobacter mori)均具有拮抗作用；这里所述的拮抗菌YJ32，是指YJ32菌株及其培养物，包括发酵液、代谢产物和菌体。
4.根据权利要求1所述的一种的拮抗菌YJ32，其特征在于：YJ32菌株的培养方法，在多种培养基质中能生长，在无机盐培养基、马铃薯培养基，牛肉膏培养基，LB培养基以及TZC培养基中能生长；菌株对pH值适应性强，在pH值为3.0-11.0的培养基中能生长，其中，在pH值5.0-9.0之间生长较好。
5.根据权利要求1所述的拮抗菌YJ32的应用，其特征是，拮抗菌YJ32在防治姜瘟病中的应用。
6.根据权利要求5所述的拮抗菌YJ32在防治姜瘟病的应用，其特征是，拮抗菌株YJ32应用于防治病原菌引起的姜瘟病。
7.根据权利要求5所述的拮抗菌YJ32的应用，其特征是，菌株YJ32及其培养物，包括发酵液、代谢产物和菌体；用菌株YJ32及其培养物中的一种到多种，应用于姜瘟病的防治。
8.根据权利要求5所述的拮抗菌YJ32的应用，其特征是，菌株YJ32及其培养物，包括发酵液、代谢产物和菌体；用菌株YJ32及其培养物中的一种到多种，制成菌剂，应用于姜瘟病的防治。
9.根据权利要求5所述的菌的拮抗菌YJ32的应用，其特征在于，菌株YJ32及其培养物，发酵液、代谢产物和菌体的获取方法，通过种子液制备、发酵培养，离心或过滤，分离等操作环节获得。
10.根据权利要求5所述的菌株YJ32的应用，其特征在于：菌株YJ32及其培养物直接施用或做成菌剂的施用方法，可叶面喷施，根施，也可以结合滴灌、微灌和浇水等一块施用，对土壤姜瘟病进行防治。
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