CN105695364B

CN105695364B - 一株新洋葱伯克霍尔德菌及应用

Info

Publication number: CN105695364B
Application number: CN201610181837.XA
Authority: CN
Inventors: 陈军; 吴林坤; 林文雄; 林翰; 刘冰; 宋依然; 吴红淼
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2016-03-28
Filing date: 2016-03-28
Publication date: 2019-02-22
Anticipated expiration: 2036-03-28
Also published as: CN105695364A

Abstract

本发明提供一株新洋葱伯克霍尔德菌及应用，该菌经鉴定为新洋葱伯克氏菌，命名为Burkholderia cenocepacia CJ‑P8,保藏号为CGMCC NO.12119。该发明公开的新洋葱伯克氏菌CJ‑P8是经平板对峙方法从太子参根际土壤中筛选获得，对前期分离到的太子参土传病原菌—尖孢镰刀菌和串珠镰刀菌均具有强拮抗作用，并且对太子参产区其他作物无致病性。同时本发明提供了该拮抗菌生长的最适培养基，最佳配方为1/4 LB+1/80 MS(不含铁盐)+0.1wt.%红糖，发酵菌液具有明显的拮抗效应。该发明提供的拮抗菌株可以有效防治太子参的土传病害，并且无污染、生态、安全，具有良好的应用前景。

Description

一株新洋葱伯克霍尔德菌及应用

技术领域

本发明涉及一株细菌菌株，特别涉及一株对太子参根腐病有拮抗作用的拮抗细菌，可用于克服或缓解连作太子参土传病害问题，属于微生物和生物防治技术领域。

背景技术

作物连作障碍的问题存在已久，有研究表明在大豆、黄瓜、芹菜、辣椒、番茄、花生、马铃薯、西瓜、草莓等都存在不同程度的连作障碍。近年来，太子参、人参、地黄、百合、丹参等药用植物连作障碍的报道也逐渐增多。

太子参又称孩儿参，是一种名贵中药材，其在福建、贵州、江苏、安徽、山东、浙江等地多有种植。太子参含有挥发性物质、环肽类、糖类、及酯类等化学成分，具有抗肿瘤、心肌保护、免疫增强、抗氧化、抗应激、治疗糖尿病及止咳等药理作用，是儿科临床组方常用中药。上世纪70年代前，这种中药材主要是从野生采集用以供应医药之需。之后，太子参主要由人工栽培获得。但是此药材栽培过程中发生明显的连作障碍现象。连作下太子参植株往往表现出地上部植株矮小弱化、叶片光合作用减弱、易枯萎倒伏；地下部须根无法正常膨大（如图1所示）、药效成分无法有效积累，药用品质下降；病虫害发生猖獗，常发生大面积枯死现象通常，每茬太子参收获后须间隔2～4年方可在同一地块上再次种植。连作不仅造成太子参产量、品质急剧下降。然而在连作障碍成因及作用机理尚不明确的情况下，大部分农户试图通过增施肥料化学肥料、撒石灰以及滥用农药等措施来维持产量，不但效果不佳，而且还提高了生产成本投入，加重环境污染以及农田生态系统功能退化等一系列问题，使太子参的栽培生产陷入了恶性循环。因此，构建一种合理有效的措施用于克服或缓解连作障碍和土传病害问题成为药用植物资源生态学研究的重要内容。课题组前期研究发现，尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌（如图2所示）是导致太子参土传病害猖獗的两类重要病原菌，其含量均随太子参连作年限增加而不断增加。而利用拮抗菌进行植物土传病害的生物防治被认为是一种科学、合理、高效、环境友好型的措施。本发明针对太子参专化型尖孢镰刀菌和串珠镰刀菌，分离筛选到一株高效拮抗这两类病原真菌的拮抗细菌，鉴定为新洋葱伯克霍尔德菌，命名为Burkholderia cenocepacia CJ-P8。

发明内容

本发明的目的是提供一株高效拮抗太子参根腐病病原菌的拮抗菌，用于生物防治太子参连续种植过程中常见的根腐病问题，为克服或缓解太子参连作障碍问题提供生防菌株。

本发明的技术方案如下：

本发明所提供的拮抗细菌为新洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cenocepacia）CJ-P8，该菌株已于2016年1月28日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.12119。

本发明所述的新洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cenocepacia）CJ-P8对太子参专化型病原菌—尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌均具有很强的拮抗作用。

其最适生长培养基为1/4LB培养基+1/80不含铁盐MS培养基+0.1wt.%红糖。

所述的不含铁盐MS培养基其配方为：1）大量元素：1900 mg/L KNO₃、1650 mg/LNH₄NO₃、370 mg/L MgSO₄•7H₂O、170 mg/L KH₂PO₄、440 mg/L CaCl₂•2H₂O；2）微量元素：22.3mg/L MnSO₄•4H₂O、8.6 mg/L ZnSO₄•7H₂O、6.2 mg/L H₃BO₃、0.83 mg/L KI、0.25 mg/LNa₂MoO₄•7H₂O、0.025 mg/L CuSO₄•5H₂O、0.025 mg/L CoCl、2.6 mg/L H₂O；3）有机物：2.0mg/L 甘氨酸、0.5 mg/L 盐酸吡哆醇、0.1 mg/L盐酸硫铵素、0.5 mg/L烟酸、100 mg/L 肌酸；所述的LB培养基为：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L。

本发明所述的有益拮抗菌具有以下几个优点：

（1）本发明所述的拮抗菌—新洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cenocepacia ）CJ-P8是通过大量的筛选工作筛选到的，是从1200株土壤细菌中筛选得到的，对太子参专化型尖孢镰刀菌和串珠镰刀菌均具有很强的拮抗效果（如图3所示）。

（2）本发明所述的拮抗菌—新洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cenocepacia）CJ-P8对筛选于药用植物地黄病变根部的尖孢镰刀菌也具有很强的拮抗作用（如图3所示）。

（3）本发明所述的拮抗菌—新洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cenocepacia ）CJ-P8具有较强的纤维素降解能力和解磷能力（如图4所示）。

（4）本发明所述的拮抗菌—新洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cenocepacia ）CJ-P8来源于连作太子参根际土壤中，并非源自其他生境，根际定殖效果较好并且安全可靠，对太子参及后茬其他作物（如水稻、大豆、玉米、蔬菜等太子参道地产区常种作物）均无致病侵染能力。

附图说明

图1为正茬、重茬太子参地下部块根生长状况比较。

图2为太子参植株病害根部分离到的病原菌（尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌）的菌落形态. A，B：分别表示尖孢镰刀菌菌落正面和反面；C，D：分别表示串珠镰刀菌菌落的正面和反面。

图3为新洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cenocepacia CJ-P8）与病原真菌的对峙培养照片. 左侧平板为对照组（仅接种病原菌），右侧平板中心接种各类病原真菌，其中A：尖孢镰刀菌（来源太子参）；B：串珠镰刀菌（来源太子参）；C：尖孢镰刀菌（来源地黄）。

图4为新洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cenocepacia CJ-P8）的纤维素降解能力（A）和解磷能力（B）评价。A：CK表示阴性对照，为荧光假单胞菌，不具有纤维素降解能力。

图5为新洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cenocepacia CJ-P8）最适培养基优化。

图6为新洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cenocepacia CJ-P8）防控尖孢镰刀菌侵染太子参组培苗. Fox：仅接尖孢镰刀菌；P8-Fox：同时接拮抗菌CJ-P8和尖孢镰刀菌；Gm：仅接串珠镰刀菌；P8-Gm：同时接拮抗菌CJ-和串珠镰刀菌。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细的描述。以下实施例仅仅用于说明和解释本发明，而不构成对本发明技术方案的限制。

实施例1 拮抗菌新洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cenocepacia）CJ-P8的筛选及其鉴定

1、拮抗菌新洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cenocepacia CJ-P8）的筛选

本发明所述的拮抗菌新洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cenocepacia CJ-P8）从连作太子参根际土壤中筛选得到。

1.1 LB培养基配制

称取5 g LB干粉（海博生物技术有限公司，中国）和3 g琼脂粉（BIOSHARP，Japan），用去离子水加热溶解并定容至200 mL。115℃高压灭菌20 min，待培养基温度降到55℃左右时（手可触摸）加入那他霉素（真菌抗生素），以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀后迅速倒板。

1.2根际土壤细菌培养

称取10 g太子参根际土壤，溶于90 mL无菌水中，充分振荡摇匀，得10^-1稀释液。取10 mL 10^-1稀释度的土壤悬浮液至另一瓶90 mL冷却的无菌水中，充分振荡摇匀，得10^-2稀释液。依次稀释得10^-3稀释液，吸取60 μL的土壤稀释液，涂布到LB培养基上后置于37℃恒温培养箱中避光培养16 h。挑选培养基上清晰可辨且生长均匀的单菌落，转接至新的LB培养基平板上37℃继续培养16 h左右，置于4°C冰箱中短暂保存备用。

1.3太子参专化型尖孢镰刀菌及串珠镰刀菌的拮抗菌筛选

马铃薯葡萄糖培养基（PDA），配制如下：马铃薯200 g，用打浆机打成土豆泥后，加适量水煮沸后计时25 min，待其冷却至不烫手后过四层纱布过滤。将滤液收集好后加入葡萄糖30 g、琼脂15 g，加热搅拌混匀并加水定容至1000 mL后分装。115℃高压灭菌15min后保存备用。

使用时，将已高温高压灭菌过的培养基重新加热溶解，待温度降到55℃左右（不烫手）时快速倒平板。待培养基充分凝固后在培养皿底部画十字架，在距离圆心约2.5 cm处接种经活化培养的细菌，置于28℃恒温培养箱中避光培养48 h后，在培养皿的中心位置接种太子参专化型尖孢镰刀菌或者串珠镰刀菌，置于28℃恒温培养箱中避光对峙培养数天，实时观察抑菌圈的有无及大小。对峙培养4天后，通过观察抑菌圈大小筛选出一株对太子参专化型串珠镰刀菌和尖孢镰刀菌具有强拮抗效应的细菌，对该菌株进行了保藏，保藏编号为CGMCC NO. 12119。将筛选到的强拮抗菌株进行纯化培养，并斜面保存备用。

2、拮抗菌的鉴定

2.1本发明所述的拮抗菌（保藏编号为：CGMCC NO. 12119）经显微观察可以看到该菌为短棒状，革兰氏阴性菌。在LB固体培养基上为隆起、波状、湿润的菌落。同时，该拮抗菌的生理生化特性为：能分解蔗糖、果糖、木糖、甘露醇、丙三醇、葡萄糖、丙氨酸，柠檬酸以及肌醇，但不分解乳糖、乙醇和精氨酸。可分解氯化铵、硫酸铵、硝酸钾、硝酸铵、谷氨酸以及尿素。不能水解淀粉，能液化明胶。正常生长的pH范围为5～8。具有较强的纤维素降解能力和解磷能力（如图4所示）。

2.2 分子鉴定

将筛选出的强拮抗菌株（保藏编号为：CGMCC NO. 12119）转接至5ml LB液体培养基进行扩大培养后（28℃，180 rpm）提取DNA。PCR扩增16s-23s rRNA基因，用于细菌分子鉴定。细菌基因组DNA提取方法如下：细菌基因组DNA提取方法如下：取1 mL摇过夜的假单胞菌菌液（28°C，180 rpm），10000 rpm 离心5 min，去上清，往沉淀菌体中加入950 μL TE缓冲液悬浮沉淀，并加50 μL 10% SDS溶液和5 μL 蛋白酶K（20mg/mL），混匀，37°C水浴1 h，再加入150 μL 5 mol/mL NaCl溶液和150 μL CTAB/NaCl溶液（10% CTAB，4.1% NaCl），混匀，65°C水浴20 min，加等体积的酚︰氯仿︰异戊醇（体积比25︰24︰1）溶液进行抽提，12000 rpm离心10 min，将上清液用等体积的氯仿/异戊醇（24/1）再抽提一次，上清液用等体积异丙醇室温沉淀30 min，12000 rpm离心10 min，弃上清，DNA沉淀用70%乙醇进行清洗，自然风干后用50μL无菌水进行溶解。

鉴定16s-23s区间的引物序列为1407f（5'-TTGTACACACCGCCCGTC-3'）和456r（5'-CCTT TCCCTCACGGTACTG-3'）。PCR扩增体系（50 μL）为：25 μL Taq PCR Master Mix (2×)（TransGen，北京），1.0 μL 上下游引物（10 μM），1 μL DNA模板（20 ng），22 μL 无菌水。PCR扩增程序为：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，60.5℃退火 1 min，72℃延伸 90 sec，35个循环，继续72℃延伸10 min。扩增的基因片段用1%琼脂糖凝胶电泳检测，并用UniversalDNA Purification Kit胶回收试剂盒（TIANGEN，北京）纯化回收目的条带，并送上海生工测序部进行测序。测序序列采用BLAST工具与NCBI数据库（Nucleotide collection（nr/nt））进行比对分析，序列如SEQ ID NO.3所示。分子生物学鉴定该拮抗菌为新洋葱伯克霍尔德菌，命名为Burkholderia cenocepacia CJ-P8。

实施例2 拮抗菌的抑菌效果检测

用PDA培养基，在距离圆心2.5 cm处接种经活化培养的新洋葱伯克霍尔德菌CJ-P8，置于28℃恒温培养箱中避光培养48 h后,在培养皿的中心位置接种各种病原真菌（太子参专化型尖孢镰刀菌和串珠镰刀菌、地黄专化型尖孢镰刀菌），置于28℃恒温培养箱中避光对峙培养数天，实时观察抑菌圈的形成。培养5天发现，新洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cenocepacia CJ-P8）能够高效拮抗太子参专化型尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌以及地黄专化型尖孢镰刀菌抑制其菌丝生长（如图3所示）。

实施例3 新洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cenocepacia CJ-P8）最适培养基优化

配制以下培养基对新洋葱伯克霍尔德菌CJ-P8的最适生长培养基进行优化，培养基如下：1）全LB溶液；2）1/4 LB溶液；3）1/4LB+1/20MS；4）1/4LB+1/40MS；5）1/4LB+1/80MS；6）1/4LB+1/20MS +0.1wt.%红糖；7）1/4LB+1/40MS+0.1wt.%红糖；8）1/4LB+1/80MS+0.1wt.%红糖。

其中，MS培养基（均不含铁盐）配方为：1）大量元素：1900 mg/L KNO₃、1650 mg/LNH₄NO₃、370 mg/L MgSO₄•7H₂O、170 mg/L KH₂PO₄、440 mg/L CaCl₂•2H₂O；2）微量元素：22.3mg/L MnSO₄•4H₂O、8.6 mg/L ZnSO₄•7H₂O、6.2 mg/L H₃BO₃、0.83 mg/L KI、0.25 mg/LNa₂MoO₄•7H₂O、0.025 mg/L CuSO₄•5H₂O、0.025 mg/L CoCl、2.6 mg/L H₂O；3）有机物：2.0mg/L 甘氨酸、0.5 mg/L 盐酸吡哆醇、0.1 mg/L盐酸硫铵素、0.5 mg/L烟酸、100 mg/L 肌酸；LB培养基配方为：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L。

具体操作步骤如下：5mL以上各培养基分别接入等量（10 μL）已活化的拮抗菌菌液，置于37℃、180 rpm摇床上震荡培养10 h，之后取出培养试管，菌液充分摇匀后于600 nm波长下迅速测定吸光值（0D₆₀₀）。结果显示：“1/4LB+1/80MS+0.1wt.%红糖”这一配方的培养基最适合该拮抗菌的生长（如图5所示）。

实施例4 拮抗菌防控镰刀菌侵害太子参组培苗效果评价

配制太子参组培苗MS培养基（MS + 0.5 mg/L 6-BA + 0.3 mg/L NAA + 30 g/L蔗糖 + 7 g/L 琼脂 + 8 g/L 马铃薯淀粉，pH=6.5），每个组培瓶添加35 mL毫升左右的培养基，经高温高压灭菌，待冷却凝固后，用镊子在培养基表面烫出一条小沟，在小沟一侧接种太子参幼苗2株，置于25℃恒温组培室中培养40天后，在小沟中添加以最适培养基（1/4LB+1/80MS+0.1wt.%红糖）培养过夜的拮抗菌菌液300 μL，对照组添加等量LB培养基代替，在小沟的另一侧接种尖孢镰刀菌或者串珠镰刀菌，期间持续往小沟内添加Burkholderia cenocepacia CJ-P8菌液，在20天左右时观察侵染情况。结果显示，病原菌与组培苗间添加有拮抗菌的试验组中，尖孢镰刀菌或串珠镰刀菌的生长均被抑制，仅在小沟外侧范围内生长，而添加等量LB培养基的对照组中，尖孢镰刀菌或串珠镰刀菌的生长快速，能够越过小沟，侵染太子参组培苗植株，造成组培苗茎腐烂，叶片发黄枯萎，最终死亡（如图6所示）。

综上可见，本发明筛选出的一株拮抗菌（保藏号为：CGMCC NO. 12119）对太子参病原菌具有很强的拮抗作用，能够有效防控尖孢镰刀菌以及串珠镰刀菌病原菌对太子参的侵害，在该领域具有广阔的应用前景。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一株新洋葱伯克霍尔德菌及应用

<130> 3

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttgtacacac cgcccgtc 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cctttccctc acggtactg 19

<210> 3

<211> 1161

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag tgggttttac cagaagtggc tagtctaacc 60

gcaaggagga cggtcaccac ggtaggattc atgactgggg tgaagtcgta acaaggtagc 120

cgtatcggaa ggtgcggctg gatcacctcc tttccagagc tatctcgcga agttgagcgc 180

tcacgcttat cggctgtaaa ttaaagacag actcaggggt ctgtagctca gtcggttaga 240

gcaccgtctt gataaggcgg gggtcgttgg ttcgaatcca accagaccca ccattgtctg 300

gcggtagtac cctgaggttc tctgtacata tgggggcata gctcagctgg gagagcacct 360

gctttgcaag cagggggtcg tcggttcgat cccgtctgcc tccaccaatc ttcaatgaca 420

agcgttcgac gtagtcgaac ttttgtcatt ggcgattgag ccagtcagag tgatacgaag 480

taggtatcgg ctgtcgttct ttaacaatct ggaagaagta agtaatttgg atagcggaag 540

cgtcttgaga tggacgtgga agttatccgg gttgtgattg tatcgatgta tctcaagatg 600

attcgaactc tatgtttgac tcaattggaa tacggcacaa cgcgagaact caacctgtag 660

cgactgtcga tgagacagac tcgttatagg gtcaagcgaa caagtgcatg tggtggatgc 720

cttggcgatc acaggcgatg aaggacgcgg tagcctgcga aaagctacgg ggagctggca 780

aacgagcttt gatccgtaga tgtccgaatg gggaaacccg gcccttttgg gtcatcctgg 840

actgaataca taggtccagt gaagcgaacg cggtgaactg aaacatctaa gtaaccgcag 900

gaaaagaaat caaccgagat tcccaaagta gtggcgagcg aaatgggatg agccttgcac 960

tctttatttg tatggttagc cgaacgctct ggaaagtgcg gccatagcag gtgatagccc 1020

tgtaggcgaa aacagtatga aagaactagg tgtgcgacaa gtagggcggg acacgtgaaa 1080

tcctgtctga agatgggggg accatcctcc aaggctaaat actcgtgatc gaccgatagt 1140

gaaccagtac cgtgaggaaa g 1161

Claims

1.一株防治太子参根腐病的拮抗菌，其特征在于：所述的拮抗菌为新洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cenocepacia）CJ-P8，已于2016年1月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCC NO. 12119。

2.一种如权利要求1所述的防治太子参根腐病的拮抗菌的生长培养基，其特征在于：其最适生长培养基为1/4LB培养基+1/80不含铁盐MS培养基+0.1wt.%红糖；

所述的不含铁盐MS培养基其配方为：1）大量元素：1900 mg/L KNO₃、1650 mg/L NH₄NO₃、370 mg/L MgSO₄•7H₂O、170 mg/L KH₂PO₄、440 mg/L CaCl₂•2H₂O；2）微量元素：22.3 mg/LMnSO₄•4H₂O、8.6 mg/L ZnSO₄•7H₂O、6.2 mg/L H₃BO₃、0.83 mg/L KI、0.25 mg/L Na₂MoO₄•7H₂O、0.025 mg/L CuSO₄•5H₂O、0.025 mg/L CoCl₂.6H₂O；3）有机物：2.0 mg/L 甘氨酸、0.5mg/L 盐酸吡哆醇、0.1 mg/L盐酸硫铵素、0.5 mg/L烟酸、100 mg/L 肌酸；所述的LB培养基为：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L。

3.一种如权利要求1所述的防治太子参根腐病的拮抗菌在防治药用植物太子参再植病害和土传病害上的应用。