CN109182198A - 洋葱伯克霍尔德菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)WY6‑5及其应用，保藏号为：CCTCC M 2018248。该洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)WY6‑5在磷降解、抑菌及促进植物生长、制备二甲基二硫醚中具有很好的应用。

Description

洋葱伯克霍尔德菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物肥料技术领域，具体涉及洋葱伯克霍尔德菌及其应用。

背景技术

中国是农业生产大国，同时也是一个粮食生产和消耗大国，土壤肥力对粮食产量的稳定和社会发展具有重要意义。长期以来，由于对化学肥料的过度依赖，导致土壤组份失衡，造成土壤酸化、板结、盐渍化等，严重制约着粮食产量的增长和品质的提升。改善土壤环境，提高土壤肥力，是目前乃至将来很长一段时间内研究的重点。为此，2015年，中国农业部制订了《到2020年化肥使用量零增长行动方案》，计划到2020年实现农药和化肥的零增长计划，解决土壤持续恶化问题。磷是农作物生长必需的三大营养元素之一，是植物体多种功能有机物的组成成分，对植物生长至关重要。然而，在我国，磷肥的利用率极低，仅有5-10％，95％以上的磷肥施用后，短期内即被土壤中的Ca²⁺、Fe³⁺、Al³⁺等离子固定，形成难溶性的磷酸钙/铁/铝等矿物质，无法被植物吸收利用。如何改善土壤中的磷肥状况，提高土壤中的可溶性磷含量，是目前研究的热点。

土壤中微生物种类繁重、功能多样，已报道多种微生物可将难溶磷转化为植物可利用的可溶性磷，提高土壤肥力。朱培淼等人(朱培淼等，高效解磷细菌的筛选及其对玉米苗期生长的促进作用[J].应用生态学报,2007)筛选到一株解磷微生物K3，可降解土壤中的无机磷，对植物生长具有明显的促进作用。王婧(王婧，桔黄假单胞菌JD37菌株对植物的促生作用及其微生物肥料的研制[D].上海,上海师范大学,2012)筛选到一株橘黄假单胞菌JD37，具有较好的解磷效果，田间试验表明，对植物生长具有明显的促进作用。除此之外，芽孢杆菌、欧文氏菌、假单胞菌、土壤杆菌、沙雷氏菌、青霉菌和黄杆菌等均被报道具有解磷活性。

发明内容

本发明目的在于提供一种洋葱伯克霍尔德菌及其应用。

基于上述目的，本发明采取了如下技术方案：

洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)WY6-5，其保藏号为CCTCC M2018248。

该菌株的16S rDNA核酸序列如列表SEQ ID NO:1。

所述的洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)WY6-5在磷降解、抑菌及促进植物生长、制备二甲基二硫醚中的应用。

本发明通过微生物学方法，以信阳毛尖茶100年树龄的茶树根际土壤为材料，分离到一株具有降解难溶性磷的洋葱伯克霍尔德菌，将其命名为洋葱伯克霍尔德菌Burkholderia cepacia WY6-5，并将该菌株于2018年05月03日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2018248。

本发明针对我国土壤肥力降低，可溶性磷含量匮乏进行研究，旨在开发。研究中筛选到一株高效解磷微生物，可降解土壤中难溶性无机磷和有机磷，提高土壤磷肥肥力，促进植物生长，同时可产生挥发性抑菌物质，具有较好的生防潜能，为研发新型的抑菌微生物肥料提供新材料。

所得洋葱伯克霍尔德菌在土壤中广泛存在，其能够高效降解难溶性的有机磷和无机磷，将其转化为植物可以吸收利用的可溶性磷，对提高土壤中的磷肥含量，促进植物生长具有重要意义。同时该菌株还可产生挥发性的抑菌物质，对包括禾谷镰刀菌在内的8种植物病原真菌具有明显抑制作用，后期可以作为高效生防菌剂开发生物菌肥。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)本发明筛选的洋葱伯克霍尔德菌WY6-5为百年茶龄茶树根际土壤微生物，为耐酸性茶树根际土壤的特异菌种，具有较好的应用前景；

2)本发明筛选的洋葱伯克霍尔德菌WY6-5首次证明可同时降解难溶性的无机磷和有机磷，可提高水体或土壤中有效磷的含量，改善土壤状况，减少化学肥料的使用和危害；

3)本发明筛选的洋葱伯克霍尔德菌WY6-5可降解无机磷，显著提高土壤磷肥含量，在植物盆栽试验中，促进植物生长，是良好的微生物菌肥材料；

4)本发明筛选的洋葱伯克霍尔德菌WY6-5可产生挥发性抑菌代谢物质，抑制多种病原真菌的生长，且培养简单，效果明显，可作为生防菌株和微生物菌肥，发挥双重作用，应用前景广泛；

5)本发明筛选的洋葱伯克霍尔德菌WY6-5产生的挥发性物质抑菌效果显著，分析后证明主要产生二甲基二硫醚，抑菌效果显著，可作为潜在杀菌剂使用。

附图说明：

WY6-5保藏日期：2018年5月3日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号NO：M 2018248。

序列表SEQ ID NO：1是本发明分离的洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)WY6-5的16S rDNA的序列；

图1为洋葱伯克霍尔德菌WY6-5对难溶性无机磷和难溶性有机磷的降解作用；

图2为洋葱伯克霍尔德菌WY6-5的菌落形态；

图3为洋葱伯克霍尔德菌WY6-5及其近缘种菌株基于16S rDNA序列的系统发育树分析；

图4为洋葱伯克霍尔德菌WY6-5在液体摇培(A)和土壤培养(B)条件下对难溶性无机磷的降解作用；

图5为洋葱伯克霍尔德菌WY6-5对盆栽玉米生长的影响；

图6为洋葱伯克霍尔德菌WY6-5产生挥发性抑菌物质的广谱抑菌作用；

图7为洋葱伯克霍尔德菌WY6-5的挥发性气体检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1高效解磷菌株的分离与筛选

1)高效解磷菌株的分离

通过微生物学方法，从信阳市百年树龄茶树取根际土壤，用于微生物分离，称取1g土样，放入2mL的离心管中，加入1mL无菌水后混匀，依次稀释至10^-6。取100μL菌悬液，涂布于难溶性磷培养基(无机磷或有机磷)表面，37℃下培养3～5天。在培养基表面挑取具有透明圈直径较大、透明度高的菌株，作为备选菌株，取单菌落划线培养于牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.2-7.4)。

所述无机磷培养基配方为：(NH₄)₂SO₄ 0.5g，MgSO₄ 0.3g，NaCl 0.3g，Ca₃(PO₄)₂8.0g，葡萄糖10.0g，MnSO₄(11％)1mL，FeSO₄(1％)1mL，琼脂21g，水1L，pH 7.2)；

所述有机磷培养基配方：((NH4)₂SO₄ 0.5g，MnSO₄(11％)1mL，FeSO₄(1％)1mL，NaCl0.3g，KCl 0.3g，CaCO₃ 5g，卵磷脂0.8g，酵母膏0.8g，琼脂21g，水1L，pH 7.0)培养3～5天后，筛选降解效果显著单菌落，获得纯培养。

2)高效解磷菌株的筛选

采用滤纸片培养法，解无机磷菌株于NA培养基培养24h后，用无菌水将其冲洗下来，调整菌液浓度至10⁸cfu/ml；制备无机磷和有机磷培养平板，凝固后在培养皿中对称两点分别打孔(5mm)和贴滤纸片，分别加入20μl菌液,37℃下培养3～5天，测量溶磷圈的直径。

经过上述筛选，获得一株既解难溶性无机磷又可降解难溶性有机磷的菌株WY6-5(图1)，培养3天后，其溶磷圈直径可达1cm。

实施例2解磷菌株WY6-5的鉴定

(1)WY6-5的形态学鉴定

WY6-5于NA培养基培养后获得单菌落，菌落乳白色，不透明，边缘规则，表面光滑且湿润，菌落粘稠且突起，革兰氏染色阴性(图2)。

(2)WY6-5的分子生物学鉴定

WY6-5于NB培养液(牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1000mL，pH7.2-7.4)培养48h，收集菌体，采用tris-HCl(Amresco公司)和EDTA(Amresco公司)方法提取基因组DNA，苯酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)抽提，TER溶解。用特异性引物扩增出16S rDNA，克隆到大肠杆菌中，挑取单菌落，并送公司进行测序。测序序列长度为1414bp，序列编号为SEQ IDNO.1。

测序引物序列如下：

16S rDNA(正向引物)：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG

16S rDNA(反向引物)：AAGGAGGTGATCCAGCCGCA

将WY6-5菌株的16S rDNA序列BLAST检索，发现其为洋葱伯克霍尔德菌相似度较高，达到95％以上，为进一步分析其分类地位，筛选相似度高于95％的近缘种，进行系统发育树分析(见图3)。菌株WY6-5与洋葱伯克霍尔德菌GJ8聚为同一分支，同源性最高，且二者遗传距离较近，初步确定WY6-5为洋葱伯克霍尔德菌。

(3)菌株WY6-5的生理生化鉴定

为进一步确定该菌株的分类地位，使用Biolog GEN III MicroStation仪器进行生理生化特性分析。将菌株在NA培养基上进行活化，挑取单菌落接种培养液进行培养，培养10h后检测不同生理生化指标，相关结果与洋葱伯克霍尔德菌菌株相似度最高，生理生化分析将菌株WY6-5鉴定为洋葱伯克霍尔德菌，检测结果如表1。

表1菌株WY6-5的生理生化鉴定

注：“++”阳性或者利用效果明显；“+”弱阳性或利用效果微弱；“-”阴性或者不能利用

结合菌株表型观察、分子生物学鉴定、生理生化检测，确定菌株WY6-5为洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)。

实施例3洋葱伯克霍尔德菌WY6-5的解磷效果分析

(1)解磷菌株WY6-5在无机磷液体培养基培养下的解磷效果

将菌株WY6-5培养于NB培养液(牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.2-7.4)中，200rpm，37℃摇培24h，离心收集菌体，无菌水清洗2次，调整浓度为10⁸cfu/mL，按6％(菌液体积/培养液总体积)的接种量，接种到40mL无机磷液体培养基((NH₄)₂SO₄ 0.5g，MgSO₄ 0.3g，NaCl 0.3g，Ca₃(PO₄)₂ 8.0g，葡萄糖10.0g，MnSO₄(11％)1mL，FeSO₄(1％)1mL，水1L，pH 7.2)，以接种等量无菌水的无机磷液体培养基为对照，于37℃，200rpm摇床培养。每个处理重复3次，分别于T₀、T₃、T₆、T₁₂、T₂₀时间点取样，采用孔径为0.22μm的滤膜过滤后，流动分析仪测定水溶性磷酸根离子含量。

解磷菌株在无机磷液体培养基中生长，将不溶性无机磷转化为可溶性磷，可明显提高可溶性磷含量。如图4A所示，不接种WY6-5的对照组中，上清液中可溶性磷含量基本维持不变，接种WY6-5菌株处理组中，可溶性磷含量随时间的变化明显增多，第6天磷含量达到181.0208mg/L，第20天达到520.4384mg/L，是对照组的176倍，表明菌株WY6-5在摇培中，具有高效的解磷作用，为潜在的高效微生物菌剂。

(2)解磷菌株WY6-5在土壤培养下的解磷效果实验

实验选取土壤接种培养法，土壤取自信阳师范学院生命科学学院旁的钟秀岭地下5-10cm，烘干后过40目筛，取1500g土壤于透明可灭菌塑料袋中，121℃下灭菌30min，灭菌三次后冷却到室温待用。按20％(培养液体积/土壤重量)接种量添加无机磷培养液60mL，按1％(菌液体积/土壤重量)接种量接种WY6-5菌悬液(10⁸cfu·mL^-1)3mL，混合均匀；以接种相同体积的无菌水作为对照，于室温下静置培养。两组分别培养至第0、3、12、20天时取样，每组重复三次，使用连续流动分析仪测定速效磷含量。

采用Olsen法对土样浸提，分别称取不同处理组风干土样2.5g(过20目筛，精确到0.001g)于150mL三角瓶中，加入50mL浓度为0.5mol/L的NaHCO₃(pH为8.5)，再加适量无磷活性碳，振荡30min，立即用无磷滤纸过滤，每个样品加同等浓度、同等体积的硫酸调节pH到4左右，振荡除去CO₂，使用连续流动分析仪测定速效磷含量(测定结果见图4B)。

如图4B所示，培养20天中，WY6-5菌液添加处理组的可溶性磷含量明显高于对照组，尤其于前三天表现最为明显，WY6-5添加组中速效磷含量达到2.35mg/kg，明显高于对照组，说明WY6-5菌株提高了土壤中速效磷含量，但随时间的推移解磷作用有所降低。土壤中的可溶性磷容易被金属离子固定，形成难溶性磷，所以对照组中磷含量随时间延伸，逐渐降低，WY6-5添加组可释放土壤中的无机磷，因此可溶性磷含量明显高于对照组，但由于土壤环境复杂，多种因素干扰，微生物活性改变，加之金属离子的固定作用，导致磷含量逐渐降低，接种菌株可能受到土壤微环境、金属离子、外界因素的干扰，导致可溶性磷的动态趋低的变化规律。

(3)洋葱伯克霍尔德菌WY6-5对盆栽玉米的促生长作用

供试玉米品种为河南省常规玉米品种鲲玉8号，购自河南鲲玉种业有限公司。玉米种子表面消毒，用75％酒精浸泡1分钟，0.1％升汞浸泡3分钟，无菌水浸泡20分钟，无菌水冲洗6遍。将玉米种子放置在湿润的纱布上于常温下催芽2-3天，选取发芽情况一致的种子待用。

土壤取自信阳师范学院生命科学学院旁的钟秀岭茶园，茶树根际5-10cm深土壤，过40目筛，将其分装成每袋300g，121℃下灭菌30min，灭菌三次。每盆添加1.4kg土，按照20％(培养液体积/土壤重量，v/w)接种量添加无机磷培养液，按1％(菌液体积/土壤重量，v/w)接种量添加WY6-5的菌悬液(10⁸cfu/mL)，以相同体积的灭菌水为对照，混合均匀后播种玉米，每个花盆播种4粒，每个处理三个重复，自然环境条件下培养27天后，分别测定植株的叶长、叶宽、单叶叶面积、叶片数、株高、茎粗、鲜重和地上、地下干重等指标，结果见表2和图5所示。

图5展示的是盆栽玉米实验中，添加WY6-5和不添加WY6-5培养27天的图片，从图5可以直观看出，菌株WY6-5对苗期玉米具有明显的促生长作用。具体结果如表2所示，培养27d后，相比于对照组，菌株WY6-5可显著促进玉米叶长、叶宽、单叶叶面积、叶片数、茎粗、株高、鲜重和地上部的生长，增长量分别达21.7％、21.1％、47.8％、8.0％、24.6％、13.0％、23.5％和49.5％，表明菌株WY6-5可促进苗期玉米的生长发育。

表2菌株WY6-5对盆栽玉米生长的影响

注:单叶为自下而上第三片鲜叶；表中数值为平均值±标准误(n＝12)，*表示在0.05水平上具有显著性差异(采用独立样本的T检验)。

实施例4洋葱伯克霍尔德菌WY6-5的广谱抑菌作用与代谢产物鉴定

(1)双皿对扣抑菌实验

广谱抑菌作用采用培养皿(直径9cm)对扣的培养法进行。挑选真菌菌丝块接种于PDA(去皮马铃薯200.0g沸水煮20min后纱布过滤收集滤液，葡萄糖20.0g，琼脂15g，蒸馏水1L)的培养皿中央。菌株WY6-5(100μL,10⁸cfu/mL)涂布于另一个含NA培养基的培养皿表面。将接种真菌菌丝块的培养皿对扣于涂布WY6-5的培养皿之上，胶带封口保存。以仅接种黄曲霉菌丝块的处理作为对照，每个处理有3个重复，28℃黑暗条件下培养5天后，统计菌丝直径，计算抑菌率。

抑菌率的计算公式如下：

菌丝生长抑菌率＝(对照菌丝直径-处理菌丝直径)/对照菌丝直径Ⅹ100％。

试验中采用的真菌有灰霉菌(Botrytis cinerea)、禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)，黄曲霉菌(Aspergillus flavus)、芒果炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioiles)、稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)、链格孢菌(Alternaria nees)、大豆炭疽菌(Colletotrichum truncatum)、烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)8种植物病原真菌做双皿对扣培养。培养5d后观察，WY6-5菌株对筛选的病原菌生长均有显著的抑菌作用，抑菌率均高于60％，其中对灰霉菌、稻瘟菌、大豆炭疽菌和烟曲霉菌的抑菌率均高达100％，对禾谷镰刀菌抑菌率为92.6％，对黄曲霉菌抑菌率达86.3％。双皿对扣实验证实菌株WY6-5能产生气体类次级代谢产物，广谱抑菌性效果良好。具体结果见图6所示。

(2)洋葱伯克霍尔德菌WY6-5挥发性代谢物质鉴定

将菌株WY6-5接种于100mL三角瓶中的NA培养基表面，涂布均匀。瓶口用双层塑料薄膜封闭，以不接种WY6-5的NA培养基作为对照，所有三角瓶置于28℃黑暗条件下培养48h。培养后的三角瓶转移到40℃的水浴锅中平衡30min。之后依次进行样品的萃取和GC-MS检测。

采用固相微萃取柱(solid phase micro-extraction,SPME)进行挥发性物质的富集。样品于40℃的水浴锅中平衡30min后，将SPME的萃取头插入塑料薄膜之内，推出纤维头，使纤维头处于样品瓶中部正上空的位置，吸附30min。将纤维头收回萃取头，并拔出样品瓶后转入气相色谱串联质谱联用仪(GC-MS/MS)进样检测(Yuan et al.Antifungal activityof Bacillus amyloliquefaciens NJN-6volatile compounds against Fusariumoxysporum f.sp cubense.Appl Environ Microbiol,2012；Huang et al.Control ofpostharvest Botrytis fruit rot of strawberry by volatile organic compounds ofCandida intermedia.Phytopathology,2011)。

GC-MS/MS检测表明，菌株WY6-5产挥发性物质丰度较高，有唯一一种物质被检出，谱库检索鉴定为二甲基二硫醚(dimethyl disulfide,DMDS)，二甲基二硫醚丰度达到99％以上(图7)。到目前为止，已报道多种菌株可产生该物质，在葱、蒜等植物中也有报道，该物质在土壤中具有高效的生防效果，可抑制根结线虫、立枯似核菌、大丽轮枝菌、尖孢镰刀菌等多种土传病害，较低浓度下56.4g/m²即可发挥显著抑菌作用，可作为潜在的生防菌剂使用(Papazlatani et al.Assessment of the impact of the fumigant dimethyldisulfide on the dynamics of major fungal plant pathogens in greenhouse soils[J].Eur J Plant Pathol,2016)。本研究中的筛选的WY6-5产生的组分二甲基二硫醚，组份单一纯度较高，产量丰度高，作用效果显著，具有较好的研究价值，为后续分析代谢产物编码基因，提升代谢产量，制备工程菌株，开发生防菌剂等均具有重要意义。与此同时。与此同时，WY6-5具有较好的解磷和促生长作用，为很好的生防菌剂材料，具有较好的应用前景。

<110>信阳师范学院, 青岛瀚普生物科技有限公司

<120>洋葱伯克霍尔德菌及其应用

TGACTTACCATGCAGTCGAACGGCAGCACGGGTGCTTGCACCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACATGTCCTGTAGTGGGGGATAGCCCGGCGAAAGCCGGATTAATACCGCATACGATCTTTGGATGAAAGCGGGGGACCTTCGGGCCTCGCGCTATAGGGTTGGCCGATGGCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAATCCTTGGTTCTAATATAGCCGGGGGATGACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTGCTAAGACCGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTGGTGACTGGCAGGCTAGAGTATGGCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGCCAATACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGTTGTTGGGGATTCATTTCCTTAGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGGTCGGAATCCTGCTGAGAGGCGGGAGTGCTCGAAAGAGAACCGATACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCTACGCAAGAGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTCGGAACAGAGGGTTGCCAACCCGCGAGGGGGAGCTAATCCCAGAAAACCGATCGTAGTCCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTTACCAGAAGTGGCTAGTCTAACCGCAAGGAGGACGGTCACCAC

Claims (3)

1.洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）WY6-5，其保藏号为CCTCC NO: M2018248。

2.如权利要求1所述的洋葱伯克霍尔德菌 WY6-5，其特征在于，该菌株的16S rDNA核酸序列如列表SEQ ID NO: 1。

3.权利要求1或2所述的洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）WY6-5在磷降解、抑菌及促进植物生长、制备二甲基二硫醚中的应用。