CN112893429B - 一种伯克霍尔德氏菌及其在土壤重金属修复的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种伯克霍尔德氏菌及其在土壤重金属修复的应用，涉及土壤修复技术领域，伯克霍尔德氏菌QY14的保藏编号为CGMCC NO：21375。QY14一方面能够分泌小分子酸活化重金属，起到促进植物吸收土壤中重金属的作用，另一方面，还能矿化有机磷底物制取磷酸盐钝化材料，该磷酸盐钝化材料具有重金属钝化作用。相对于现有其他的菌种而言，本发明提供的菌株能够适用于不同类型的污染土壤修复，通过两种方式实现对重金属污染土壤的双效修复。

Description

一种伯克霍尔德氏菌及其在土壤重金属修复的应用

技术领域

本发明涉及土壤修复技术领域，具体而言，涉及一种伯克霍尔德氏菌及其在土壤重金属修复的应用。

背景技术

由于工业发展、农业活动以及土壤背景值高等原因，土壤重金属污染严重，危及农产品安全。

农用地土壤按照耕地土壤环境质量类别为划分依据，分为优先保护类土壤、安全利用类土壤和严格管控类土壤。优先保护类土壤的土壤污染程度＜安全利用类土壤的土壤污染程度＜严格管控类土壤的土壤污染程度。

其中，安全利用类土壤治理和修复技术主要包括土壤改良技术、农艺调控技术，以降低农作物中镉为主要目的；严格管控类土壤治理和修复技术主要包括土壤淋滤修复技术、电动力学修复技术、植物修复技术，以降低土壤中镉为主要目的。

目前，土壤修复主要着重于研究单个修复技术，例如，发明名称为一种促进超积累植物生长及强化萃取土壤重金属的生物修复试剂及修复方法、申请号为CN201810155094.8中记载的方法，该方法由于修复周期长，不适用于安全利用类土壤修复，无法同时满足污染程度低的土壤(安全利用类土壤)或污染程度高的土壤(严格管控类土壤)的治理与修复。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种伯克霍尔德氏菌及其在土壤重金属修复的应用。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供了一种伯克霍尔德氏菌(Burkholderiaambifaria)，其保藏编号为CGMCC NO：21375。

第二方面，本发明实施例提供了一种土壤重金属的钝化剂和/或促进植物吸收重金属的活化剂的制备方法，其包括对前述实施例所述的伯克霍尔德氏菌进行培养。

第三方面，本发明实施例提供了一种生物修复剂，其包括：由前述实施例所述的土壤重金属的钝化剂和/或促进植物吸收重金属的活化剂的制备方法制备获得的钝化剂和活化剂中的至少一种。

第四方面，本发明实施例提供了修复土壤的方法，其包括采用前述实施例所述的伯克霍尔德氏菌或如前述实施例所述的生物修复剂对待修复土壤进行修复。

第五方面，本发明实施例提供了一种植物的种植方法，其包括：采用前述实施例所述的伯克霍尔德氏菌或如前述实施例所述的生物修复剂对种植植物的土壤进行修复。

本发明具有以下有益效果：

本发明实施例提供了一种伯克霍尔德氏菌，其保藏编号为CGMCC NO：21375。QY14一方面能够分泌小分子酸活化重金属，起到促进植物吸收土壤中重金属的作用，另一方面，QY14还能矿化有机磷底物制取磷酸盐钝化材料，该磷酸盐钝化材料具有重金属钝化作用。相对于现有其他的菌种而言，QY14能够适用于不同类型的污染土壤修复，通过两种方式实现对重金属污染土壤的双效修复。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例1提供的伯克霍尔德氏菌QY14的进化树；

图2为实施例1中磷酸盐钝化材料的扫描电镜和X射线能谱分析图片；其中，(a)为扫描电镜图片，(b)为X射线能谱分析图片；

图3为磷酸盐钝化材料不同添加比例TCLP浸提方法镉的钝化率。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

本发明实施例提供了一种伯克霍尔德氏菌(Burkholderia ambifaria)，所述伯克霍尔德氏菌的保藏编号为CGMCC NO：21375。本发明提供的伯克霍尔德氏菌为伯克霍尔德氏菌QY14，已于2020年12月14日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明实施例提供的伯克霍尔德氏菌QY14一方面能够分泌小分子酸活化重金属，起到促进植物吸收土壤中重金属的作用，另一方面，QY14还能矿化有机磷底物制取磷酸盐钝化材料，该磷酸盐钝化材料还具有重金属钝化作用。相对于现有其他的菌种而言，QY14能够适用于不同类型的污染土壤(污染程度轻和污染程度重)修复，通过上述两种方式实现对重金属污染土壤的双效修复。

本发明实施例提供了一种土壤重金属的钝化剂和/或促进植物吸收重金属的活化剂的制备方法，其包括对前述实施例所述的伯克霍尔德氏菌进行培养。

在一些实施例中，对伯克霍尔德氏菌的培养方式不作限制，可以采用现有用于培养微生物的培养基和培养方法，只要能够扩增伯克霍尔德氏菌，则属于本申请的保护范围内。

优选地，所述制备方法包括：将所述伯克霍尔德氏菌QY14接种于包含有机磷底物和矿化剂的培养基中进行培养；

优选地，所述有机磷底物为甘油磷酸钠，所述矿化剂为氯化钙；

优选地，甘油磷酸钠在培养基中的浓度为10～40mM，氯化钙在培养基中的浓度为1～20mM。在一些实施例中，甘油磷酸钠在培养基中的浓度还可以为10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM中的任意浓度；氯化钙在培养基中的浓度可以为1mM、5mM、10mM、15mM、20mM中的任意浓度。

优选地，所述伯克霍尔德氏菌的接种量为0.1％～10％。在一些实施例中，所述伯克霍尔德氏菌的接种量为0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、7％、8％、9％、10％中的任意接种量。

优选地，所述培养的条件为35～39℃，20～30h。在一些实施例中，培养的温度可以为35℃、37℃、39℃中的任意温度，培养时间可以为20h、22h、24h、26h、28h、30h中的任意时间。

优选地，所述培养基为牛肉膏蛋白胨培养基。

优选地，所述制备方法还包括对培养后的产物进行离心，获取用于作为钝化剂的沉淀和/或用于作为活化剂的上清液；

若获取上清液，则结合植物，采用所述上清液与土壤混合；

若获取沉淀，则采用所述沉淀与土壤混合。

在一些实施例中，培养后的产物离心的条件可以为：2000～3000rpm，1～10min。

该沉淀或其加工物后续均可作为钝化剂(磷酸盐钝化材料)。优选地，获取沉淀后，所述制备方法还包括将沉淀烘干，研磨获得粉末。经SEM-EDS检测，这种粉末主要由200纳米棒状结构组成并且主要含Ca、P和O；该粉末具有重金属钝化作用，可以用于安全利用类土壤(污染程度低)修复。

该上清液或其加工物后续均可作为活化剂，联合植物，将上清液添加入土壤中，用于土壤重金属修复。在一些实施例中，将上清液添加时机为植物种植前、种植时和种植后中的任意时机。

优选地，将获取的上清液于7000～9000rpm离心1～10min，离心后，去除上清，在沉淀中加入与上清等量的蒸馏水，重悬菌液作为活化剂。

优选地，将重悬菌液或上清液与土壤混合，重悬菌液或上清液与土壤的质量混合比为1:(1～10)。在一些实施例中，可以为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9和1：10中的任意比例。

QY14菌液具有重金属耐受性、植物促生性和土壤重金属活化作用，可以和高富集植物联合使用用于严格管控类土壤(污染程度高)的修复。

需要说明的是，土壤按照污染程度可以划分为优先保护类土壤、安全利用类土壤和严格管控类土壤，请参照表1。

表1土壤划分标准

镉浓度低于风险筛查值为优先保护类土壤，高于风险筛查值且低于风险管控值为安全利用类土壤，高于风险管控值为严格管控类土壤。

本发明实施例还提供了一种生物修复剂，其包括：前述任意实施例提供的土壤重金属的钝化剂和/或促进植物吸收重金属的活化剂的制备方法制备获得的钝化剂和活化剂中的至少一种。

本发明实施例还提供了一种修复土壤的方法，其包括采用前述实施例所述的伯克霍尔德氏菌或如前述实施例所述的生物修复剂对待修复土壤进行修复。

当采用所述伯克霍尔德氏菌进行修复时，所述方法包括：将伯克霍尔德氏菌接种于包含有机磷底物和矿化剂的培养基中进行培养，将培养物离心后，获取上清液和/或沉淀；

若获取上清液，则结合植物，采用所述上清液与土壤混合；

若获取沉淀，则采用所述沉淀与土壤混合。

优选地，所述上清液与土壤的质量混合比为1:(1～10)；所述沉淀与土壤的质量混合百分比为0.1％～10％。

需要说明的是，采用上清液修复和采用沉淀修复的具体步骤同前述任一实施例所述，不再赘述。

此外，本发明还提供了一种植物的种植方法，其包括采用前述实施例所述的伯克霍尔德氏菌或如前述实施例所述的生物修复剂对种植植物的土壤进行修复。

该种植方法能够在促进植物生长的同时，达到修复土壤重金属污染的效果，绿色环保，易于推广。

实施例1

本发明实施例提供了一种伯克霍尔德氏菌QY14，其保藏编号为CGMCC NO：21375。其分类学特征如下：革兰氏染色阴性，氧化酶、硝酸盐还原、明胶液化阳性，淀粉水解、脲酶、精氨酸水解、V-P实验阴性。根据测序结果，其进化树分析如图1所示。

对伯克霍尔德氏菌QY14按照以下培养方法进行培养：将伯克霍尔德氏菌QY14按照2％的接种量接入含20mM甘油磷酸钠(有机磷底物)和10mM氯化钙(矿化剂)的牛肉膏蛋白胨培养基中，于37℃150rpm下培养24小时，获取培养液。

将获得的培养液于3000rpm离心5分钟后，获取上清液和磷酸盐沉淀：

将磷酸盐沉淀50℃烘干12小时，研磨获得粉末(磷酸盐钝化材料)。经SEM-EDS检测这种磷酸盐钝化材料主要由200纳米棒状结构组成并且主要含Ca、P、O，检测结果参照附图2；该磷酸盐钝化材料具有重金属钝化作用，可以用于安全利用类土壤修复；

将获取的上清液于8000rpm离心5分钟，去除上清后，再用与上清等量的蒸馏水重悬，获得重悬菌液。

实施例2

检测实施例1提供的伯克霍尔德氏菌QY14对植物促生的能力。

将实施例1提供的伯克霍尔德氏菌QY14于含0.5mg/mL色氨酸的LB培养基中，以1％的接种量培养3天，3天后测试吲哚乙酸IAA浓度，浓度为7.1±0.9mg/L，说明QY14具备产吲哚乙酸能力。

实施例3

检测实施例1提供的伯克霍尔德氏菌QY14对植物促生的能力。

将实施例1提供的伯克霍尔德氏菌QY14在无机磷培养基NBRIP中，以2％的接种量培养7天，培养后对可溶性磷的浓度进行检测，可溶性磷浓度为647.0±5.6mg/L，说明QY14具备溶磷能力。

实施例4

将实施例1提供的伯克霍尔德氏菌QY14按照2％的接种量接入含20mM甘油磷酸钠和10mM氯化钙的牛肉膏蛋白胨培养基中，37℃150rpm下培养24小时，获取培养液。

将培养液于3000rpm离心5min，收集沉淀(磷酸盐)，将沉淀置于50℃烘干12小时，研磨成粉末。

将获得的粉末与土壤的质量百分比为0.5％、1％以及2％的比例将粉末添加至供试土壤中，土壤湿度保持15％，室温下静置7天。7天后采用TCLP浸出方法检测，结果参照附图3。由结果可知，在0.5％添加比例下，镉钝化率达到19.35％；1％添加比例下，钝化率达到35.48％；2％添加比例下，钝化率达到53.76％。

实施例5

伯克霍尔德氏菌菌QY14对土壤重金属的活化作用。

将实施例1提供的伯克霍尔德氏菌QY14按照2％的接种量接入含20mM甘油磷酸钠和10mM氯化钙的牛肉膏蛋白胨培养基中，37℃、150rpm下培养24小时，获得培养液。

将获得的培养液于3000rpm离心5min，取上清液。将获取的上清液于8000rpm离心5分钟，去除上清液，再用等量蒸馏水重悬，获取重悬液。

按照重悬液：土壤质量比为1：2的方式，将重悬液添加至供试土壤，室温下静置7天，TCLP浸出方法检测，土壤镉活化率达到64.41％(对照土壤pH＝6.5，TCLP浸出方法镉含量为2.29±0.01mg/L)。

实施例6

已知羟基磷灰石吸附镉后在pH＝2.0下，镉浸出率为20‰。将本发明实施例1提供的QY14所制备的磷酸盐沉淀加入至100mL 10mg/L Cd溶液中，37℃150rpm培养24h，培养后溶液3000rpm离心5min，收集沉淀并于50℃烘干12h并研磨成粉末。称取0.100g上述粉末放入装有5mL纯水的15ml聚丙烯离心管中，使用1M硝酸溶液将pH调节至1.0，将离心管加盖并在37℃和150rpm下培养。7天后，本发明实施例1提供的QY14所制备的磷酸盐沉淀在pH＝1.0下，镉浸出率为15‰。

可见，相比羟基磷灰石，磷酸盐材料具有更好的稳定性。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种土壤重金属镉的钝化剂和/或促进植物吸收重金属镉的活化剂的制备方法，其特征在于，其包括对一种伯克霍尔德氏菌（Burkholderia ambifaria）进行培养；

所述伯克霍尔德氏菌保藏编号为CGMCC NO：21375；

所述制备方法包括：将所述伯克霍尔德氏菌接种于包含有机磷底物和矿化剂的培养基中进行培养；对培养后的产物进行离心，获取用于作为钝化剂的沉淀和/或用于作为活化剂的上清液。

2.根据权利要求1所述的土壤重金属镉的钝化剂和/或促进植物吸收重金属镉的活化剂的制备方法，其特征在于，所述有机磷底物为甘油磷酸钠，所述矿化剂为氯化钙。

3.根据权利要求2所述的土壤重金属镉的钝化剂和/或促进植物吸收重金属镉的活化剂的制备方法，所述甘油磷酸钠在培养基中的浓度为10~40 mM，所述氯化钙在培养基中的浓度为1~20 mM。

4.根据权利要求3所述的土壤重金属镉的钝化剂和/或促进植物吸收重金属镉的活化剂的制备方法，其特征在于，所述伯克霍尔德氏菌的接种量为0.1%~10%。

5.根据权利要求4所述的土壤重金属镉的钝化剂和/或促进植物吸收重金属镉的活化剂的制备方法，其特征在于，所述培养的条件为35~39℃，20~30 h。

6.根据权利要求5所述的土壤重金属镉的钝化剂和/或促进植物吸收重金属镉的活化剂的制备方法，其特征在于，所述培养基为牛肉膏蛋白胨培养基。

7.根据权利要求1~6任一项所述的土壤重金属镉的钝化剂和/或促进植物吸收重金属镉的活化剂的制备方法，其特征在于，所述培养后的产物离心的条件为：2000~3000 rpm，离心1~10 min。

8.根据权利要求7所述的土壤重金属镉的钝化剂和/或促进植物吸收重金属镉的活化剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：将所述上清液于7000~9000 rpm离心1~10 min，离心后去除上清，重悬沉淀获取重悬菌液作为活化剂。

9.一种生物修复剂，其特征在于，其包括：由权利要求1~8任一项所述的土壤重金属镉的钝化剂和/或促进植物吸收重金属镉的活化剂的制备方法制备获得的钝化剂和活化剂中的至少一种。

10.一种修复土壤的方法，其特征在于，其包括：采用权利要求1所述的伯克霍尔德氏菌对待修复土壤进行修复；

所述方法包括：将伯克霍尔德氏菌接种于包含有机磷底物和矿化剂的培养基中进行培养，将培养物离心后，获取上清液和/或沉淀；

若获取上清液，则结合植物，采用所述上清液与土壤混合；

若获取沉淀，则采用所述沉淀与土壤混合。

11.根据权利要求10所述的修复土壤的方法，其特征在于，所述上清液与土壤的质量混合比为1:（1~10）；

所述沉淀与土壤的质量混合百分比为0.1%~10%。

12.一种修复土壤的方法，其特征在于，采用如权利要求9所述的生物修复剂对待修复土壤进行修复。

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