CN101153272A - 一种铅镉抗性细菌及其用于土壤重金属污染的植物修复方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种重金属铅镉抗性细菌及其强化植物提取土壤中的铅镉重金属的方法，属于农业和环境污染治理技术领域。J62菌株经鉴定为伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia sp.)，对多种重金属具有抗性，尤其是铅和镉，分别达到Pb2+1000mg/L，Cd2+2000mg/L。具有固氮、溶磷特性，促进植物生长，提高植物抗逆性。液体制剂有效活菌数为10亿个以上/毫升，固体制剂含有效活菌数2亿个以上/克。在含重金属的湿润土壤中播种植物种子，每千克土壤接种108个细菌J62/mL的菌液10～20mL，分1－2次接种。促进植物生长，强化植物富集重金属铅镉，提高植物提取修复效率。

Description

一种铅镉抗性细菌及其用于土壤重金属污染的植物修复方法
一、技术领域
本发明涉及一种铅镉抗性细菌及其用于土壤重金属污染的植物修复方法，属于农业和环境污染治理技术领域，从而实现土壤重金属污染的植物修复。
二、技术背景
由于重金属在土壤中难降解、难迁移、危害期长，土壤重金属污染已成为国内外普遍关注的环境问题之一，世界各国对重金属污染及其治理给予了高度重视。但常用的物理和物理化学修复方法一般投资昂贵、设备复杂且易导致土壤结构破坏；而植物提取修复技术则因为超积累植物通常矮小、生长缓慢、生物量低，对固定相的铅、镉无法吸收富集等缺点而限制了在实际生产中的应用。重金属在土壤中的活性和生物有效性受到多种因素的制约，微生物能通过其代谢活动及其产物促进重金属的溶解，提高重金属在土壤中的生物有效性，促进植物对重金属的吸收富集，此外微生物还能分泌植物激素促进植物旺盛生长，增大其生物量，提高植物修复土壤重金属污染的效率。
三、发明内容
技术问题
本发明的目的就是提供一种重金属抗性细菌及其强化土壤重金属污染的植物提取修复方法。通过分离筛选重金属抗性细菌，将其接种于植物根际，实现土壤重金属铅、镉污染的高效快速的修复。
技术方案
本发明所述的重金属抗性细菌J62菌株，于2007年7月26日保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC M 207116。从浙江省富阳市重金属污染菜地土中分离得到，经鉴定为伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia sp.)。主要生物学特性为：G-，菌体杆状，无芽孢。柠檬酸盐、过氧化氢酶、精氨酸双水解酶、硫化氢试验为阳性，V.P.、M.R.、水解淀粉试验为阴性。该菌株的菌落为圆形，直径1.0～1.5mm，不透明，在LB培养平板上为黄色，在有氮平板上为棕色。
通过常规的微生物发酵方法，可以培养本发明所述的重金属抗性细菌J62菌株，并制得以本发明所述的J62菌株为有效成分的生物修复制剂。可使用草炭、蛭石等载体吸附配制呈颗粒剂或粉剂等剂型。
上述重金属抗性细菌用于土壤重金属污染的植物修复方法，其特征在于：在含重金属的湿润土壤中播种植物种子，接种菌株J62生物修复制剂，每千克土壤接种108个细菌/mL的菌液10～20mL，分1-2次接种。
有益效果
本发明所提供菌株对多种重金属具有抗性，尤其是铅和镉，分别达到Pb2+1000mg/L，Cd2+2000mg/L，Cu2+50mg/L，Ni+50mg/L，Zn+400mg/L，不抗Cr6+。
用于土壤重金属污染的植物修复方法为在含重金属的湿润土壤中播种植物，同时接种以本发明所述的J62菌株为有效成分的生物修复制剂，并在植物生长旺盛时期再接种一次，促进植物对铅镉的吸收提取。
本发明所述的重金属活化细菌及其强化植物土壤重金属污染修复的方法与现有技术相比有如下优点：
(1)本发明所述的J62菌株对培养液中PbCO3和CdCO3的活化效率能达到2～6倍和3～17倍，对土壤中重金属铅和镉的活化能力达到57％和100％。
(2)本发明所述的J62菌株具有ACC脱氨酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylicacid)活性，产生铁载体，有助于提高植物抗逆性(抗旱、抗涝、抗盐碱、抗病虫害)；该菌株能代谢产生IAA，促进植物生长；该菌株具有固氮、溶磷特性，能使培养液中可溶性磷浓度比对照增加237.5μg/mL，提供植物矿质营养元素起促生作用。
(3)利用重金属抗性细菌的作用强化植物土壤重金属污染修复，提高植物提取修复效率85％左右。
(4)可以回收重金属，无二次污染。
四、具体实施方式
重金属抗性细菌J62菌株从浙江省富阳市重金属污染菜地土中分离纯化得到。
实施例1菌株J62活化溶液中不溶性重金属铅和镉
在250ml的三角瓶中装入100ml称有PbCO3  0.064g和CdCO3  0.077g的有氮培养基(蔗糖10g，(NH4)2SO4  1g，KH2PO4  2g，MgSO4  0.5g，NaCl  0.1g，CaCO3  0.5g，酵母膏0.5g)，121℃灭菌30min。接种菌株J62，在30℃、150r/min摇床振荡培养，分别于不同时间点取样分析。稀释涂布法测定菌株数量变化；用pH计测定培养液中pH值；培养液离心，取上清液用原子吸收法测定Pb2+和Cd2+的浓度。结果见表1。菌株J62对培养液中PbCO3和CdCO3的活化效率能达到1.5～6倍和2.7～17.2倍。
实施例2菌株J62活化土壤重金属铅和镉
准确称取含碳酸铅(Pb 500mg/kg)和碳酸镉(Cd500mg./kg)的土样10.00g加入50ml离心管，以纱布包口，高压灭菌。菌株J62于28℃摇床培养20h，离心收集菌体，用去离子水制成菌悬液。接种3ml菌悬液于土样中，以接等量去离子水和接灭活菌为对照，每个处理设3个重复，定期补充水分。离心管放入培养箱中28℃培养3d、7d、13d和21d后取出。称2g土于7ml离心管中，加4ml水，摇床震荡混匀2h，离心取上清液测定水溶态重金属Pb、Cd浓度。称1g土于7ml离心管中，加5ml醋酸铵(1mol/L)，摇床震荡混匀2h，离心取上清液测定交换态重金属Pb、Cd浓度。重金属浓度采用原子吸收法测定。结果见表2。接种J62菌株处理的土壤中铅浓度上升明显，水溶态铅和交换态铅浓度可增加56.5％和71.7％。接菌J62的土壤中，21天左右水溶态镉的浓度达到最大，比同期对照增加了100％；交换态镉的浓度在接菌后3天左右达到最大，比同期对照增加了19.2％。接种J62菌株的土壤中重金属铅、镉浓度均比不接菌对照增加，菌株活化土壤不溶性重金属铅、镉效能明显。
实施例3液体制剂
将斜面菌种接种于有氮培养基中，培养18小时后接入种子罐。种子罐为0.5吨，投料量为0.4吨，培养基成分为蔗糖2.0kg，(NH4)2SO4  0.25kg，KH2PO4  0.7kg，MgSO4  0.17kg，NaCl  0.07kg，CaCO3  0.4kg，酵母膏0.2kg。种子罐须先用蒸汽灭菌并冷却至28-30℃，接种量体积比为5％，种子罐培养温度控制在28-32，搅拌速度为220转/分，无菌空气通入量为1∶0.8，培养20小时后将种子液接入生产罐。生产罐为7吨，投料量为4.5吨，培养基成分为蔗糖8kg，淀粉18kg，(NH4)2SO4  4.5kg，KH2PO4  9.0kg，MgSO4  2.3kg，NaCl 0.9kg，CaCO3  4.5kg，酵母膏0.9kg。生产罐预先用蒸汽灭菌并冷却至28-30，培养温度控制在28-32，搅拌速度为250转/分，无菌空气通入量为1∶0.8。培养结束后培养液中菌体数量达到10亿/ml以上。培养液即可灌装为生物修复制剂。
实施例4粉剂
将实施例3所得的培养液用草炭吸附，培养液与草炭之比为1∶3.5，搅拌混合、粉碎，即得制剂。
实施例5重金属抗性细菌强化番茄提取土壤中的铅和镉
以溶液态分析纯CdSO4·8H2O，分析纯Pb(CH3COO)2·3H2O按浓度Cd 50mg/kg、Pb100mg/kg加入土壤充分混合并老化1个月。将处理过的土壤装入塑料盆钵，每钵800g，用分析纯K2HPO4加入磷80mg/kg和钾100mg/kg，氮肥以分析纯尿素加入(氮80mg/kg)。土样混匀后，加入蒸馏水使含水量为田间持水量的60％，保持2d，每盆播入番茄种子2粒。接种实施例3所得的以J62菌株为有效成分的生物修复菌剂10ml，对照分别接等量无菌水和EDTA。植株生长期间每天以称重法加入蒸馏水，保持土壤湿度为田间持水量的60％。生长30天后再接种实施例3所得的以J62菌株为有效成分的生物修复菌剂10ml一次。播种60d收获，沿土面剪取植株地上部，同时洗出根系，在105℃下杀青，70℃烘干，称量地上部和根的干重，植物样品磨碎后用硝酸-高氯酸法消煮，原子吸收分光光度计测定植株中重金属Pb、Cd含量。结果见表3。在重金属铅和镉污染土壤修复中，接种菌株J62能够使番茄生物量增加61.1％，促进番茄吸收铅和镉分别达20.7％和61.3％，修复效率好于加EDTA的措施。
实施例6重金属抗性细菌强化玉米提取土壤中的铅和镉
采集铅和镉污染的土壤，风干磨碎，装入塑料盆钵，每钵800g，加水使含水量为田间持水量的60％，保持2d，每盆播入玉米种子2粒。接种实施例3所得的以J62菌株为有效成分的生物修复菌剂10ml，对照分别接等量无菌水和EDTA。植株生长期间保持土壤湿度为田间持水量的60％。生长30天后再接种实施例3所得的以J62菌株为有效成分的生物修复菌剂10ml一次。播种60d收获，沿土面剪取植株地上部，同时洗出根系，在105℃下杀青，70℃烘干，称地上部和根的干重，植物样品磨碎后用硝酸-高氯酸法消煮，原子吸收分光光度计测植株中重金属Pb、Cd含量。结果见表4。在重金属铅和镉污染土壤修复中，接种菌株J62能够使玉米生物量增加28.4％，促进番茄吸收铅和镉分别达84.5％和56.2％，提高植物富集重金属的效率，修复效率好于加EDTA的措施。
表1菌株J62对溶液中不溶性重金属铅和镉的活化作用
项目 处理   时间(h)
  0   12   22   33   48   72   84
pH   对照   7.27   7.25   7.21   7.29   7.32   7.26   7.22
  接菌   7.2   7.21   6.74   6.17   4.84   5.23   5.26
细胞数量(×106cfu/mL)   对照   0   0   0   0   0   0   0
  接菌   3.36   49.7   200.3   280.7   382.7   439.7   353.3
溶液中pb2+浓度(mg/L)   对照   0.626   0.610   0.592   0.637   0.711   0.676   0.612
  接菌   0.429   0.446   1.487   1.467   3.428   5.294   4.309
溶液中Cd2+浓度(mg/L)   对照   1.455   1.510   1.335   1.435   1.420   2.060   2.140
  接菌   2.042   2.053   4.99   9.657   25.895   25.122   21.250
表2菌株J62对土壤中不溶性重金属铅和镉的活化作用
项目 处理   时间(d)
  3   7   13   21
水溶态铅(mg/kg)   接菌   0.239±0.037   0.455±0.017   0.588±0.040   0.820±0.209
  接灭活菌对照   0.208±0.048   0.434±0.014   0.555±0.026   0.608±0.057
  对照   0.395±0.052   0.452±0.014   0.554±0.006   0.524±0.072
交换态铅(mg/kg)   接菌   23.09±0.916   11.18±0.842   9.65±0.686   7.16±0.890
  接灭活菌对照   21.19±0.407   10.47±0.318   7.64±0.623   6.61±1.140
  对照   16.35±0.523   10.65±0.100   5.62±0.583   6.44±2.740
  水溶态镉(mg/kg)   接菌   0.983±0.067   0.657±0.072   0.900±0.174   0.680±0.028
  接灭活菌对照   0.702±0.028   0.549±0.040   0.590±0.137   0.382±0.020
  对照   0.550±0.037   0.500±0.021   0.545±0.051   0.340±0.057
交换态镉(mg/kg)   接菌   18.01±1.860   17.52±0.210   15.18±1.220   15.05±1.840
  接灭活菌对照   18.09±4.510   17.94±1.270   13.84±1.980   14.01±0.690
  对照   15.11±1.870   17.37±0.130   15.16±0.660   14.29±1.290
表3重金属抗性细菌菌株J62对番茄提取土壤重金属铅、镉的效果
项目   处理
  对照   加EDTA   接菌
铅吸收量(μg)   茎叶   31.62±2.44   40.79±5.38   42.66±7.95
  根   6.80±1.80   5.59±0.33   10.41±2.47
  植株   38.43±4.24   46.38±5.51   46.38±5.51
镉吸收量(μg)   茎叶   61.58±5.14   67.58±4.90   101.42±12.49
  根   7.62±0.88   4.26±0.76   10.23±3.47
  植株   69.20±9.78   71.85±5.66   111.65±9.14
干重(g)   茎叶   1.02±0.09   1.69±0.04   1.57±0.18
  根   0.45±0.05   0.63±0.07   0.80±0.14
表4重金属抗性细菌菌株J62强化玉米提取土壤重金属铅、镉的效果
项目   处理
  对照   加EDTA   接菌
铅吸收量(μg)   茎叶   13.84±1.02   22.33±2.58   19.02±2.59
  根   6.97±0.93   13.46±2.46   19.38±3.79
  植株   20.81±1.91   35.79±4.83   38.40±2.60
镉吸收量(μg)   茎叶   42.13±2.10   52.83±3.30   44.40±4.64
  根   29.10±4.71   50.78±6.38   66.87±13.59
  植株   71.23±6.71   103.61±7.95   111.27±14.27
干重(g)   茎叶   2.20±0.10   2.11±0.21   2.85±0.10
  根   0.233±0.025   0.167±0.042   0.273±0.064

Claims (3)

1.一种重金属铅镉抗性细菌，其特征在于：该菌株J62为伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia sp.)，2007年7月26日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO：M207116。
2.一种含有权利要求1所述的重金属抗性细菌的生物修复制剂，其特征在于：液体制剂含菌株J62有效活菌数为10亿个以上/毫升，固体制剂含有效活菌数2亿个以上/克。
3.权利要求1所述重金属抗性细菌用于土壤重金属污染的植物修复方法，其特征在于：在含重金属的湿润土壤中播种植物种子，接种菌株J62生物修复制剂，每千克土壤接种108个细菌/mL的菌液10～20mL，分1-2次接种。
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