JP2000354486A - Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅｐａｃｉａ１Ａの生育促進法および該生育促進法に用いられるエアリフト型バイオリアクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ
１Ａの生育促進法および該生育促進法に用いられるエ
アリフト型バイオリアクターの提供。 【解決手段】 Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃ
ｉａ １Ａの生育をポリスチレンの存在下で、リアクタ
ー内にドラフトチューブおよび菌体剥離手段を具備した
エアリフト型バイオリアクターを用いて行うことを特徴
とするＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ １
Ａの生育促進法とアクター内にドラフトチューブおよび
菌体剥離手段を具備したＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃ
ｅｐａｃｉａ １Ａ生育促進用エアリフト型バイオリア
クター。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】本発明はリン、窒素等の栄養塩濃度が低い
低栄養条件で生育し、芳香族化合物を含有する排水を分
解することのできる低栄養性微生物Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅ
ｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ １Ａの生育促進法、該微生物
を用いた芳香族化合物、例えばフェノール含有排水処理
用エアリフト型バイオリアクター、および該エアリフト
型バイオリアクターを用いた排水処理技術に関するもの
である。

【０００２】

【従来技術】自然環境は一般的に低栄養条件であると考
えられており、また製油所や化学工場などの排水は、リ
ンや窒素に乏しい低栄養排水であるので、通常知られて
いる微生物は生育できないので、従来の環境浄化技術で
は、汚染環境に（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、Ｎａ
_３ＰＯ_４、Ｎａ_２ＨＰＯ_４等の栄養塩類を添加し、微生
物の活性を高める方法が行われている[（Ｄ．Ａ．Ｇｒ
ａｖｅｓら、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２
８，Ｐ８１３（１９９１）：原山 重明、「地球をまも
る小さな生き物たち」、技報堂出版、Ｐ１０９（１９９
５）：西村 実、土と微生物、Ｎｏ４６、Ｐ１９（１９
９５）：Ｃ．Ｈ．Ｎｅｌｓｏｎら、「Ｈｙｄｒｏｃａｒ
ｂｏｎＢｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ」、ＣＲＣ Ｐｒ
ｅｓｓ、Ｐ１２５（１９９４）]。

【０００３】また排水処理においても、微生物の生育と
活性を保つために炭素：リン：窒素の割合を制御するこ
とが必要であると考えられている。炭素：リン：窒素の
割合を制御するためには、排水に栄養塩を添加する方法
が一般的である[「廃水処理技術指導書」、石油連盟、
Ｐ１２９（１９７５）:「公害防止の技術と法規」、財
団法人産業公害防止協会、Ｐ２１５（１９９２）]。さ
らに特開平６−５００４９５では汚染環境に栄養塩を効
率よく持続的に与えるための方法が記されており、また
特開平７−５０７２０８ではリン酸エステルを添加する
ことにより、栄養物質の供給と同時に汚染物質を乳化さ
せる方法が記されている。

【０００４】前記のように自然環境は一般的に低栄養条
件であると考えられており、また製油所や化学工場など
の排水もリンや窒素に乏しい低栄養排水である。この様
な条件では通常知られている微生物は生育できないの
で、環境浄化や低栄養排水の処理には栄養塩類を添加し
て微生物の活性を高めることが必要である。しかし汚染
環境や排水に添加する栄養塩類は、環境浄化や排水処理
にかかるコストの１つである。特に浄化しようとする汚
染場所が広い範囲であったり、あるいは処理をしようと
する排水量が多い場合には添加する栄養塩類にかかる費
用は莫大なものとなる。さらに過剰に添加した栄養塩類
は、地下水の硝酸汚染や環境の富栄養化等の二次汚染の
原因となるので、添加方法や添加量の制御は重要であ
る。

【０００５】すなわち、窒素源は、土壌微生物の作用に
より酸化されて硝酸体となる。したがって窒素源を過剰
に与えると土壌や地下水中の硝酸イオン濃度が高くな
る。硝酸イオンは、発ガン性が指摘されており、飲料水
への混入が問題となっている［鶴巻 道二、「地下水汚
染・土壌汚染の現状と浄化対策」、工業技術会、Ｐ９８
（１９９３）］。また、過剰に添加した栄養塩類、特に
リンおよび窒素源が雨水や地下水によって河川や湖沼に
流入すると環境の富栄養化を引き起こす。環境の富栄養
化はアオコの異常発生や飲料水のカビ臭の原因となるた
め、生活排水中のリンや窒素を除去する方法が数多く提
案されている[中村 和憲、「微生物の生態１７」、学
会出版センター、Ｐ３１（１９９１）:深瀬 哲朗、
「地球をまもる小さな生き物たち」、技報堂出版、Ｐ１
３３（１９９５）]。Ｐ．Ｍｏｒｇａｎらは土壌環境に
栄養塩類を添加することが土着微生物の有機物質の分解
活性を阻害することを指摘している［Ｗａｔ．Ｓｃｉ．
Ｔｅｃｈ．，ｖｏｌ．６，Ｐ６３（１９９０）］。

【０００６】添加した栄養塩類による二次汚染を回避す
るには、栄養塩類をコントロールしながら添加すること
が必要である。しかしこの様な制御装置を排水処理設備
に設置することは、設備をより高価なものとし、排水の
処理コストを増大させる。さらに汚染土壌や地下水等の
汚染環境は解放系であるため、栄養塩類をコントロール
しながら効率よく添加するには、何らかの方法で汚染環
境を閉鎖する必要がある。しかし汚染環境を土木的方法
によって閉鎖するには、多額な資金が必要であり、特に
汚染環境が広い場合には技術的に困難である。したがっ
て汚染環境において、添加した栄養塩類による二次汚染
を防ぐことは事実上不可能と言わざるを得ない。

【０００７】低栄養性微生物の存在は古くから知られて
おり、多くの研究がなされている。これまで低栄養性微
生物は生育条件の中の有機炭素量でのみ論じられてお
り、有機炭素濃度が１から１５ｐｐｍ以下で生育可能な
微生物が低栄養性微生物と称されて研究されている
[（畝本 力、「特殊環境に生きる細菌の巧みなライフ
スタイル」、共立出版、Ｐ７（１９９３）:江口 充、
「海洋微生物とバイオテクノロジー」、技報堂出版、Ｐ
６８（１９９１）:諏訪 裕一ら、「微生物の分離
法」、Ｒ＆Ｄプランニング、Ｐ５４５（１９９０）]。
しかしながら自然汚染環境あるいは製油所や化学工場の
排水は、汚染物質である有機炭素の濃度が高く、その他
のリン、窒素等の栄養塩濃度のみが低い状態にある。こ
の様な有機炭素の濃度が高く、その他のリン、窒素等の
栄養塩濃度のみが低い条件で生育し汚染物質を分解する
微生物は、従来の低栄養性微生物の概念に当てはまらな
いものであり、これまでに報告がない。

【０００８】一方、菌体の固定化法については、従来か
ら多く研究がなされており、アルギン酸、ポリビニール
アルコール、κ−カラギーナン、ゲランガム、アガロー
ス、セルロース、デキストラン等のゲル状物質に包括固
定する方法や、ガラス、活性炭、ポリスチレン、ポリエ
チレン、ポリプロピレン、木材、シリカゲル等の表面に
吸着固定する方法を挙げることができる［扇元 敬司、
「バイオテクノロジーテキストシリーズ 微生物学」、
講談社、Ｐ１６８（１９９４）、相田 浩ら、「新版
応用微生物学II」、朝倉書店、Ｐ１１６（１９９
５）］。

【０００９】また、フェノールの排水処理に於いてもＲ
ｈｃｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌［Ｓ−Ｌ．Ｐａｉ外ら、Ｂ
ｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈ．，５１，Ｐ３７（１
９９５）］やＰｓｅｎｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ
［渡辺一哉ら、水処理技術、３６，Ｐ７７（１９９
４）、Ａ．Ｍｏｒｓｅｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，３３，Ｐ２０６（１９９
０）］等の細菌、Ｃａｎｄiｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ
［Ｈ．Ｗｅｎｈｕａ外ら、Ｗａｔｅｒ Ｔｒｅｎｔ，
８，Ｐ１１９（１９９３）］やＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｅｌｉｎｏｖｉｒ［Ａ．Ｍｏｒｓｅｎら、Ａｐｐ
ｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，３３，Ｐ
２０６（１９９０）］等の酵母及び活性汚泥［Ｆ．Ｓ．
Ｌａｋｈｗａｌａ ら、Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇ
ｉ．，８，Ｐ９（１９９２）］をアルギン酸やポリビニ
ルアルコール等による包括法及び活性炭や粘土鉱物によ
る吸着法にて固定化して用いる例が報告されている。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、栄養
塩類を添加することなしに、低栄養条件で生育し、芳香
族化合物を分解することのできる低栄養性微生物Ｂｕｒ
ｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ １Ａの生育促進
方法、該微生物を用いた芳香族化合物、例えばフェノー
ル含有排水処理用エアリフト型バイオリアクター、およ
び該エアリフト型バイオリアクターを用いた排水処理技
術、例えば製油所や化学工場などのフェノール含有排水
処理技術を提供することにある。なお、本発明で言う低
栄養条件とは、前記のように有機炭素の濃度が高く、例
えば、１５ｐｐｍ以上で、かつリン、窒素等の栄養塩濃
度が低い、例えば、リン５ｐｐｍ以下でかつ窒素５０ｐ
ｐｍ以下のような条件を指す。

【００１１】

【課題を解決するための手段】普通の自然環境は低栄養
状態と考えられているが、本発明者らは、微生物の生育
に特に重要なリンと窒素に注目し、自然環境中のリンと
窒素の濃度を測定した。その結果、土壌や地下水では次
表１に示すように窒素濃度が約６０ｐｐｍ以下、リン濃
度が約３ｐｐｍ以下である。海洋では更に栄養成分濃度
は低く、窒素濃度が約１．０ｐｐｍ以下、リン濃度が約
０．１ｐｐｍ以下である。

【００１２】

【表１】 １ 発明者の測定による ２ 微生物の生態１２、Ｐ１０、学会出版センター
（１９８９）より ３ 西村実、土と微生物、Ｎｏ．４６、Ｐ１９（１９
９５）より ４ 微生物の生態３、Ｐ４、学会出版センター（１９
８７）より

【００１３】前記自然環境中のリンと窒素の濃度の測定
値に基づき、本発明者らは目的とする有機炭素の濃度が
高く、その他のリンと窒素の栄養塩濃度のみが低い条件
で生育し、汚染物質を分解することのできる微生物を得
るための培地は、リン濃度が約５ｐｐｍ以下で、かつ窒
素濃度が約５０ｐｐｍ以下のものであることを見出し、
この知見に基づき、低栄養条件下で芳香族化合物を分解
する微生物としてＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａ
ｃｉａ １Ａ（ＦＥＲＭ Ｐ−１５５６６）を先に提案
している。

【００１４】さらに本発明者らは、栄養塩類を添加する
ことなしに、低栄養状態の排水を効率よく処理するため
には、低栄養性微生物は、菌体生育量が少ないため、菌
体量を高めたバイオリアクターを構築する必要があると
考え、低栄養条件である製油所や化学工場などの低栄養
排水について低栄養性微生物Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ
ｃｅｐａｃｉａ １Ａを用いたバイオリアクターにつ
いて菌体濃度を高めるため実験を多く行った結果、培養
液中にポリスチレンを添加することによって、低栄養性
微生物Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ １
Ａの生育とこれに伴うフェノールの分解活性が著しく向
上することを見出し、先に提案している。

【００１５】培地にプラスチック製品を添加して微生物
を生育させる研究は、本発明前に服部らの報告があり
〔森崎久雄ら、界面と微生物、学会出版センター（１９
８８）〕、服部らは、培養液にプラスチック製の陰イオ
ン交換樹脂を添加して、微生物の生育至適ｐＨがイオン
交換樹脂を添加しない場合と比べてアルカリ側に移動す
ることを見い出し、この現象は陰イオン交換樹脂の表面
近傍における培養液のｐＨが陰イオン交換樹脂から遠く
に存在する培養液のｐＨと異なることに起因するものと
考察している。しかしポリスチレンには、イオン交換能
と言ったような特別な機能はなく、陰イオン交換樹脂の
添加効果と本発明で使用するポリスチレンの作用とは、
まったく異なるものである。しかしながら、前記ポリス
チレンの効果は、その効果からみて、担体としての菌体
固定化のための効果のみではなく、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅ
ｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ １Ａ培養液中の浮遊菌体の量
をも高める他の素材には見られない増殖触媒作用である
と考えられる。前記ポリスチレンの増殖触媒作用は、ポ
リスチレンが水に不溶なプラスチックであること、低栄
養性微生物Ｂｕｒｋｈｏｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ
１Ａがポリスチレン製のビーズを炭素源として利用でき
ないこと、培養液中に加えるポリスチレン製のビーズの
数に比例することより、ポリスチレンの表面積に依存す
るものと考えられる。

【００１６】培養液中に加える前記ポリスチレンの形状
は、ビーズ状のものが最も好ましいが、必ずしもビーズ
状のものに限られるものではなく、シート状、ハニカム
状、パイプ状等種々の形状のものを用いることができ、
特に前記のようにその表面積の大きいものが好ましい。
さらにポリスチレンは、他のプラスチック、ガラス、シ
リカゲル、アルミナ、金属等の表面にポリスチレンをコ
ーティングした形でも用いることができる。

【００１７】さらに、本発明者らは培養液中に加えるポ
リスチレンの使用態様について検討し、ポリスチレンに
物理的な力を加え、該ポリスチレン表面に保持されて増
殖した菌体の少なくとも一部を積極的に剥離させ、浮遊
菌体とすることにより、ポリスチレンの増殖作用が向上
することを見出し、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐ
ａｃｉａ １Ａの生育中にポリスチレンに物理的な力を
加え、該ポリスチレン表面に保持されて増殖した菌体の
少なくとも一部を積極的に剥離させ、菌体の増殖作用を
向上させることも提案している。

【００１８】前記増殖作用の向上の原因としては、図１
に示すように、ポリスチレン表面から菌体剥離され、該
剥離された浮遊菌体もフェノール分解活性を有する菌体
であり、さらに菌体が剥離されたポリスチレン表面に
は、また菌体が形成されるので、リアクター全体として
はフェノール分解活性が向上すると考えられる。

【００１９】前記ポリスチレンは耐水性に優れた半永久
的な材質であり、長期間使用することが可能である。長
期間使用すれば、ポリスチレンそのものは廃棄物となら
ないので、総合的な観点からは環境負荷が少ない、と言
う利点を有する。なお、ここで言うポリスチレンとは、
スチレンの単独重合体のみを指すのではなく、意図する
増殖触媒作用を奏する限り、スチレン以外に他のモノマ
ー成分を含有するものであっても良い。

【００２０】本発明は、前記説明した本出願人の先の出
願をさらに改良したものであって、以下の特徴を有する
ものである。すなわち、本発明の特徴の第１は、前記ポ
リスチレンの存在下でＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅ
ｐａｃｉａ １Ａ（ＦＥＲＭ Ｐ−１５５６６）の生育
を行う生育促進法において、リアクター内にドラフトチ
ューブおよび菌体剥離手段を具備したエアリフト型バイ
オリアクターを用いることを特徴とするＢｕｒｋｈｏｌ
ｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ １Ａの生育促進法にあ
る。

【００２１】本発明の特徴の第２は、前記Ｂｕｒｋｈｏ
ｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ １Ａ（ＦＥＲＭ Ｐ−
１５５６６）の生育促進法に用いる、リアクター内にド
ラフトチューブおよび菌体剥離手段を具備したエアリフ
ト型バイオリアクターにある。

【００２２】以下、本発明の特徴点を図に基づいて具体
的に説明する。本発明で用いるエアリフト型バイオリア
クターとは、リアクターの下部より酸素や空気を吹き込
み、これら気体の力で処理液を攪拌反応させるものであ
る。図２はエアリフト型バイオリアクター内に設置され
る菌体剥離型ドラフトチューブおよび菌体剥離の概念図
を示す。該チューブはその内壁にその内部方向に突出し
たステンレス製突起物を有するものであり、該チューブ
の中を空気等が上方に流れることにより、その速度を高
める機能を奏するものである。すなわち、エアリフト型
バイオリアクターの断面積をＡ、ドラフトチューブの断
面積をａとすると、リアクターとドラフトチューブに同
じ体積の空気、例えばＶｌ／分を吹きこんだ場合、

【数１】Ｖ／Ａ＜Ｖ／ａ となり、断面積当たりの空気の速度は、リアクターより
ドラフトチューブの方が大きい。従って、前記菌体剥離
の手段あるいは構造（図１の場合の突起物）は、ドラフ
トチューブ内に設けるのが好ましい。ただし、前記菌体
剥離の手段あるいは構造はドラフトチューブの内と外の
双方、あるいはドラフトチューブ外のみに設けることも
できる。また、本発明のエアリフト型バイオリアクター
においては、リアクター内にドラフトチューブを設けな
い場合にはリアクター内の液流は乱流となるが、リアク
ター内にドラフトチューブを設けることで、ドラフトチ
ューブ内は下から上へ、ドラフトチューブ外は上から下
へ、と液流が分けられるので、ポリスチレンビーズの菌
体剥離をより効率的に行うことができる。なお、本図に
おいては、菌体剥離手段は突起物であるが、本発明で用
いる菌体剥離手段は菌体剥離機能を有するものであれ
ば、どのような構造であっても良い。

【００２３】菌体剥離は、菌体剥離型ドラフトチューブ
の下部開口部より該チューブ内に導入された酸素、空気
等により培養液がドラフトチューブ中を上方に移動さ
れ、その際にドラフトチューブ下部より高められた速度
で導入される酸素、空気等による攪拌、さらにはポリス
チレンビーズが菌体剥離手段（本図のものは前記ドラフ
トチューブ内の突起物）、あるいは他のポリスチレンビ
ーズと衝突することにより、ポリスチレンビーズ表面で
生育した菌体が剥離され、前記のように菌体の生育を増
進することができる。ドラフトチューブ内を乱流状態で
上方に流れた培養液は、該ドラフトチューブの上部開口
部より排出され、リアクター中を循環し、再度ドラフト
チューブの下部開口部より該チューブ内に導入され、再
度前記と同様な菌体の剥離動作が繰り返される。

【００２４】図３は菌体剥離−担持型ドラフトチューブ
内の菌体の剥離概念を示す図であり、図２の菌体剥離型
ドラフトチューブの場合と同様にして菌体の剥離を行う
ことができる。ただし、図３の菌体剥離−担持型ドラフ
トチューブは、図２の菌体剥離型ドラフトチューブに比
較してドラフトチューブの壁部が培養液を通過させる構
造で形成されているため、壁部に菌体を保持することが
できるので、図２のリアクターに比較してリアクターに
保持される菌体の見掛け上の濃度を高めることができる
ので、リアクターの単位体積当りの能力をより向上させ
ることができる。前記図３の培養液を通過させることの
できるドラフトチューブの壁部は、例えばガラス繊維、
プラスチック繊維、炭素繊維あるいは金属繊維不織布の
ような不織布、または金属あるいはプラスチックの多孔
質体で構成することができる。

【００２５】前記ドラフトチューブの壁部の外部および
／または内部に、さらに培養液を通過させる構造を設置
してリアクターに保持される菌体の見掛け上の濃度をさ
らに高めることができ、この培養液を通過させる構造
も、例えば前記のようなガラス繊維、プラスチック繊
維、炭素繊維あるいは金属繊維不織布のような不織布を
ドラフトチューブの壁部の外部および／または内部に巻
回あるいは貼着して設置することができる。また、前記
ドラフトチューブに設置した突起物の構造も培養液を通
過させる構造とし、該突起物にも菌体を保持することが
できるものとしても良い。

【００２６】リアクター中には、１本あるいは複数本の
ドラフトチューブ、例えば２本のドラフトチューブを設
けることができる。また、前記リアクターの断面積Ａと
ドラフトチューブの合計断面積ａの割合は、ａ＝１／２
Ａ、また、一個のドラフトチューブａ′の断面積とリア
クターの断面積Ａとの割合は、ａ′＝１／２Ａの場合
が、ドラフトチューブ内を下から上へと流れる液流とド
ラフトチューブ外を上から下へと流れる液量が実質的に
等しくなるので好ましい。

【００２７】本発明で使用するＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉ
ａ ｃｅｐａｃｉａ １Ａは、リン濃度５ｐｐｍ以下で
かつ窒素濃度５０ｐｐｍ以下の培地を用いて、フェノー
ル１０００ｐｐｍを炭素源とした条件で検索することに
よって得られたものである。

【００２８】リン源は実質的に微生物がリン源として利
用可能な物質であればなんでも良く、リン酸一アンモニ
ウム、リン酸一ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸
水素アンモニウムカリウム、リン酸水素二ナトリウム、
リン酸水素二カリウム、リン酸二水素アンモニウム、リ
ン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム等の無機
のリン酸塩およびこれらの塩の水和物、酵母エキス、肉
汁エキス等のリンを含む天然物やリン酸エステル等の有
機リン化合物等をあげることができる。

【００２９】同様に窒素源も実質的に微生物が窒素源と
して利用可能な物質であればなんでも良く、硫酸アンモ
ニウム、リン酸一アンモニウム、硝酸アンモニウム、リ
ン酸水素アンモニウムカリウム、塩化アンモニウム等の
アンモニウム塩およびこれらの塩の水和物、硝酸アンモ
ニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等の硝酸塩、亜
硝酸ナトリウム等の亜硝酸塩、尿素、アミノ酸、酵母エ
キス、肉汁エキス、ペプトン等の窒素を含む天然物やア
ミド化合物等の有機含窒素化合物等をあげることができ
る。

【００３０】前記Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａ
ｃｉａ １Ａは、リン５ｐｐｍ以下でかつ窒素５０ｐｐ
ｍ以下と言う低栄養条件下で生育することができるの
で、栄養塩類を添加しない環境調和型の環境浄化や排水
処理に応用することが可能である。ただし、該微生物が
リン５ｐｐｍ以下でかつ窒素５０ｐｐｍ以下と言う低栄
養条件下で生育することができると言う性質を有するこ
とは、該微生物がリン５ｐｐｍ以上あるいは窒素５０ｐ
ｐｍ以上の条件で生育できないことを意味するのではな
く、前記Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ
１Ａは、低栄養条件下のみならず、高栄養条件下でも生
育できる通性低栄養性微生物である。

【００３１】

【実施例】実施例１ 低リン濃度、低窒素濃度条件（自然環境）で生育するフ
ェノール資化性菌の検索 （検索用培地の作成）検索用培地として、下表２に示し
た培地（以下、Ｅ−培地）を１／１０に希釈したもの
（１／１０Ｅ−培地：リン約５ｐｐｍ、窒素約５０ｐｐ
ｍ）を用いた。これに、炭素源としてフェノール１，０
００ｐｐｍを加えた。また、各培地のｐＨは７．０とし
た。

【００３２】

【表２】

【００３３】（分解菌の取得方法Ａ）分離源としては、
つくば市周辺の土壌約４８０種類を用い、以下の方法で
微生物のみを抽出して培地に添加した。３００ｍｌ容の
三角フラスコに滅菌水３０ｍｌを入れ、ここに土壌サン
プル５ｇを加えた。これを１日回転振とうして、菌の抽
出を行なった。抽出後、遠心分離（２，０００ｒｐｍ、
５ｍｉｎ）して土壌を沈澱させ、上清を濾紙、およびグ
ラスフィルターにてろ過して、土壌微粒子を除いた。得
られた菌液をニトロセルロースフィルター（０．２μ
ｍ）でろ過して微生物を捕集した。このフィルターを適
宜切断して培地に加え、検索を行なった。検索は以下の
方法で行なった。３００ｍｌ容の三角フラスコに１／１
０Ｅ−培地３０ｍｌを入れ、ここに上述のニトロセルロ
ースフィルターを加え３０℃にて５日間振とう培養を行
なった。生育の見られたものについては、１／１０Ｅ−
培地８ｍｌを入れた内径２４ｍｍの大型試験管に１００
μｌ植え継ぎ５日間培養した。これを２回繰り返し、菌
の単離を行なった。菌の単離には、前述の１／１０Ｅ−
培地に１．２％のアガロース[ａｇａｒｏｓｅ（電気泳
動用ｕｌｔｒａ−ｐｕｒｅ ｇｒａｄｅ）]を加えて作
成した平板を用いた。これに、前述の培養液を適宜希釈
して塗布し、３０℃にて５日間培養して、生育してきた
コロニーを単離した。

【００３４】実施例２ （実施例１で取得した分解菌の同定）前記実施例１で得
られたフェノール資化性菌１Ａ株はグラム陰性で、運動
性を持ち、オキシダーゼ、カタラーゼ共に陽性であっ
た。また、Ｏ−Ｆテストは酸化を示した。その他の各種
生理試験の結果から、取得した菌株の１種類はＢｕｒｋ
ｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａであると同定され
た。下表に、フェノール資化性菌１Ａ株の特性を示す。

【００３５】

【表３】

【００３６】

【表４】

【００３７】実施例３ 実施例１で得られた分解菌による低リン濃度、低窒素濃
度条件下のフェノールの分解 （分解方法）１Ａ株を１／１０Ｅ−平板培地（フェノー
ル１，０００ｐｐｍ）に植菌し、３０℃にて培養した。
生育した菌体を１／１０Ｅ−培地２ｍｌを入れたプラス
チックチューブ（フェノールがチューブに吸着しないこ
とは確認済み）に植菌し、振とう培養機（ＭＢＳＳ−１
０、丸菱）にて培養して、培養後のフェノールの分解量
を、ガスクロマトグラフィーを用いて定量した。初発フ
ェノール濃度は１００ｐｐｍ、１０００ｐｐｍとし、そ
れぞれ３、６日後にサンプリングを行った。ガスクロマ
トグラフィーの条件を以下に示す。 カラム（Ｃｏｌｕｍｎ） ：ＵｎｉｓｏｌｅＦ−２００ 注入温度（Ｉｎｊ．ｔｅｍｐ） ：１８０℃ カラム温度（Ｃｏｌ．ｔｅｍｐ）：１５０℃ 検出器 （Ｄｅｔｅｃｔｏｒ） ：ＦＩＤ 注入量 （Ｉｎｊ．ｓｉｚｅ） ：２μｌ 内部標準物質（ＩＳ） ：ジエチレングリコール 分解試験の結果を下表５に示す。実験に供したＢｕｒｋ
ｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ １Ａ株は、フェノ
ール分解能を有していた。

【００３８】

【表５】

【００３９】実施例４ （実施例１で得られた菌株と既存の菌株のフェノール分
解能の比較実験）供試菌株としては実施例１で得た分離
株１Ａ株を用いた。また、比較のために、これまでにフ
ェノール分解菌として報告されているＡＴＣＣ（Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ）保存菌株も用いた。このＡＴＣＣ保存のフェ
ノール分解菌は、下記の４株である。 ・Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＡＴＣＣ １１１７２ ・Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ ＡＴＣＣ １４３４７ ・Ｖｉｂｒｉｏ ｃｙｃｌｏｓｉｅｓ ＡＴＣＣ １４６３５ ・Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｐｆｉｉ ＡＴＣＣ ５１３４９ 前記供試菌株を下表６に示す培地を１／１００に希釈し
た１／１００Ｆ−培地（リン約１ｐｐｍ、窒素約２０ｐ
ｐｍ）、または１／１００Ｆ−培地のリン、窒素濃度を
それぞれ約５００ｐｐｍに高めた培地２ｍｌを入れたプ
ラスチックチューブに植菌し、振とう培養機（ＭＢＳＳ
−１０、丸菱）にて３０℃、４日間培養した。培養後の
フェノールの分解量を、ガスクロマトグラフィーを用い
て定量した。また、生育量は６６０ｎｍにおける吸光度
（Ａ６６０）として測定した。

【００４０】

【表６】

【００４１】なお、表６中の微量金属（ｔｒａｃｅ ｍ
ｅｔａｌ）の組成は下表７の通りである。

【表７】

【００４２】（結果と考察）分解試験の結果を下表８〜
９に示した。表８に示すように、取得した分解菌は１／
１００Ｆ−培地に良好に生育し、添加した１００ｐｐｍ
のフェノールはほとんどが４日以内に完全に分解されて
いた。また、培地中のリン、窒素濃度を高めても、生
育、フェノール分解共に阻害は全く見られなかった。一
方、ＡＴＣＣ保存株の方は、全ての菌株が基本培地には
全く生育が見られなかった。表中でフェノールのわずか
な減少が見られるのは、植菌した菌体への吸着であると
思われる。なお、培地中のリン、窒素濃度をそれぞれ５
００ｐｐｍに高めた培地を用いた表９の場合にも、表８
に示すように、フェノールの分解が観察された。この結
果から、前記実施例１のフェノール分解菌は、これまで
に知られているフェノール分解菌が全く生育できないよ
うな低リン低窒素条件下で生育し、良好なフェノール分
解能を有する新規な菌であると考えられる。

【００４３】

【表８】

【００４４】

【表９】

【００４５】実施例５ 低リン濃度、低窒素濃度条件で生育するフェノール資化
性菌を用いた各種芳香族化合物の分解 供試菌株としては実施例１で得た分離株１Ａを用いてフ
ェノール、ベンゼン、トルエン、キシレン（異性体混合
物）の資化性を確認した。基質である各種芳香族化合物
の量は１００ｐｐｍとし、培地は１／１００Ｆ−培地を
用い、３０℃で４日間培養を行った。その結果を下表１
０に示す。

【００４６】

【表１０】 前表の結果より、何れの基質（炭素源）も炭素源が無い
場合より、微生物の生育が高いことが確認できた。

【００４７】実施例６ 低栄養性微生物Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃ
ｉａ １Ａの固定化担体の材質を検討するため、ポリス
チレン、テフロン、アルミナ、ナイロン、デルリン、ポ
リエチレン、エポキシ樹脂、ポリプロピレンを用いてφ
６．３ｍｍのビーズを作成した。種母培養した１Ａ株は
他の培養実験と同様に滅菌水で懸濁し、５８０ｎｍ吸光
度（Ａ５８０）で０．０１になるように植菌した。培地
１ｍｌとビーズ４個をネジ付ガラス試験管に入れ、３０
℃、６００ｒｐｍの回転振盪下で１日間培養を行い、フ
ェノールの分解能を検討した。結果は図８に示した。ナ
イロンとデルリンはフェノールの吸着或いは吸収量が高
かったため、以降の実験には供しなかった。培養時には
ポリスチレンビーズを添加した時に、最もフェノールは
速く分解された。他の材質ビーズはビーズ無添加（浮遊
菌体）に比べフェノール分解を僅かしか促進せず、その
程度にはほとんど差がなかった。

【００４８】実施例７ 低栄養性微生物Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃ
ｉａ １Ａの生育に及ぼすポリスチレンビーズの表面積
の影響について検討した。直径の異なるポリスチレンビ
ーズ（φ３．２ｍｍおよびφ６．３５ｍｍ）の０〜３５
個を栄養系に添加して、その生育に及ぼす影響を検討し
た。培養は３０℃、６００ｒｐｍで一日間行った。ポリ
スチレンビーズ表面に吸着している菌体はアルカリ加水
分解してタンパク質量として測定した。その結果を図９
に示した。ポリスチレンビーズの大小に関わらず、浮遊
菌体量と吸着菌体量は共にポリスチレンビーズの実面積
に依存して増加した。また、浮遊菌体量は表面積３００
ｍｍ ^２付近、吸着菌体量は表面積６００ｍｍ^２付近で飽
和に達した。前記結果より、低栄養性微生物Ｂｕｒｋｈ
ｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ １Ａの生育促進効果
はビーズの大小ではなくビーズの表面積に依存すること
が解る。

【００４９】Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉ
ａ １Ａ株の場合、乾燥菌体の約４５％がタンパク質で
あり、１細胞の乾燥重量は８．１×１０^−８μｇであ
る。また、図９に示したデータよりビーズの表面積に吸
着している菌体量はタンパク質として０．０５μｇ／ｍ
ｍ^２と算出される。前記１Ａ株の設置面積を０．５×
１．５μｍと仮定すると、１ｍｍ^２に１．３×１０６ｃ
ｅｌｌが吸着し得ることになり、この値は先に求めた
１．３７×１０６ｃｅｌｌ／ｍｍ^２にほぼ等しい。従っ
て、ポリスチレンの表面積には１Ａ株がほぼ飽和に近い
状態で吸着しているものと考えられる。

【００５０】ポリスチレンビース表面に吸着した菌体量
は、アルカリ加水分解した後にタンパク質量として測定
した。培養後のポリスチレンビーズを超純水で１回洗
い、０．１ＮのＮａＯＨを加えて８０℃で一晩加熱して
菌体を加水分解した。加水分解後の溶液に含まれるタン
パク質はローリー法によりウシ血清アルブミンを標準と
して定量した〔Ｒ．Ｆ．Ｓｃｈｌｅｉｆら（川上正也ら
監訳）、『分子生物学マニュアル』講談社サイエンティ
フィック、ｐ９０（１９８３）〕。

【００５１】実施例１０ 各種ビースの表面親水性と低栄養性微生物Ｂｕｒｋｈｏ
ｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ １Ａの生育に及ぼす影
響 φ６．３〜６．４ｍｍのガラス、テフロン及びポリスチ
レン製の各種ビースを用いて表面親水性と１Ａ株の生育
に及ぼす影響を検討した。培養は３０℃、６００ｒｐｍ
で１日間行った。各種ビーズの表面親水性はＭ−Ｏ、Ｓ
ａｍｕｅｌｓｓｏｎらの方法に従いビース表面に滴下し
た水滴とビーズ表面の接触角より求めた。親水性（ＷＡ
値）は、

【数２】ＷＡ＝Ｙ_ＬＶ０（１＋ｃｏｓθ） （θは接触角、Ｙ_ＬＶ０は飽和蒸気内での水の表面張力
であり、７２．８ｍＮｍ^−１である）で与えられる〔Ｍ
−Ｏ、Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎら、Ｅｎｖｉｒｏｎ.Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ.、５６、ｐ３６４３(１９９０)〕。各
種ビース表面に吸着した菌体量は、アルカリ加水分解し
た後にタンパク質量として測定した。前記の実験結果と
各種ビーズの親水性を下表１１に示した。テフロンビー
ズが最も疎水性であり、ガラスビースは親水性であっ
た。ポリスチレンビースの親水性はテフロンビーズとガ
ラスビーズの中間の値を示した。

【００５２】

【表１１】 前記１Ａ株はポリスチレンビーズの表面に最も良く吸着
し、テフロンビーズ表面に吸着した菌体量はポリスチレ
ンビーズの約１／４であった。またガラスビーズ表面に
は全く吸着を示さなかった。

【００５３】実施例１１ 菌体剥離ドラフトチューブの作製 エアーリフト型バイオリアクター（丸菱バイオエンジ社
製のエアーリフト型バイオリアクターＭＤＰ型５Ｌ）に
付属のドラフトチューブの内側にステンレス製の突起物
を設置し、ドラフトチューブ内でポリスチレンビーズが
突起物あるいは他のビーズと衝突できる構造とした。５
Ｌ容エアーリフト型バイオリアクター内に前記の菌体剥
離型ドラフトチューブを設置して１Ａ株を培養した。１
６時間の回分培養を行い、その後に流下培養を行いフェ
ノール分解速度を求めた。その結果は図５に示した。菌
体剥離型ドラフトチューブを用いた場合では、通常のド
ラフトチューブ（コントロール）に比べてフェノール分
解速度は約１．５倍に向上した。

【００５４】実施例１２ 菌体剥離担持型ドラフトチューブの作製 バイオリアクター（丸菱バイオエンジ社製のエアーリフ
ト型バイオリアクターＭＤＰ型５Ｌ）に付属のドラフト
チューブの本体をステンレス型の金網で作製した。さら
に本体側面をポリエチレンとポリプロピレンの混合不織
布（ケーフォーマット、九州フィルター工業型）で包
み、ドラフトチューブ内の溶液が一部混合不織布を通し
てドラフトチューブの外側に流れ出るような構造にし
た。５Ｌ容エアーリフト型バイオリアクター内に菌体剥
離−担持型ドラフトチューブを設置して１Ａ株を培養し
た。

【００５５】培地はフェノール１００ｍｇ／１を含む基
本培地とし、１Ａ株をＡ５８０で０．００１になるよう
に植菌した。１６時間の回分培養を行い、その後に流下
培養を行いフェノール分解速度を求めた。その結果は図
６に示した。菌体剥離−担持型ドラフトチューブを用い
た場合では、コントロールに比べて約１．９倍、菌体剥
離型ドラフトチューブを用いた場合に比べても約１．２
倍高いフェノール分解速度を示した。

【００５６】実施例１３ ５Ｌ容エアーリフト型バイオリアクターに菌体剥離−担
持型ドラフトチューブを設置し、更にポリエチレンとポ
リプロピレンの混合不織布をバイオリアクターの内部に
設置した（図４）。この改造バイオリアクターを用いて
１Ａ株を培養した。培地はフェノール１００ｍｇ／ｌを
含む基本培地とし、１Ａ株をＡ５８０で０．００１にな
るように植菌した。１６時間の回分培養を行い、その後
に流下培養を行いフェノール分解速度を求めた。その結
果を図７に示した。

【００５７】菌体剥離−担持型ドラフトチューブ以外に
もバイオリアクターの内部に混合不織布を設置すること
により、コントロールに比べて約４倍、菌体剥離−担持
型ドラフトチューブのみを用いた場合に比べても約２倍
高いフェノール分解速度を示した。

【００５８】

【効果】栄養塩類を添加することなしに、低栄養条件で
生育し、芳香族化合物を分解することのできる低栄養性
微生物Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ １
Ａの生育促進方法、該微生物を用いた芳香族化合物、例
えばフェノール含有排水処理用エアリフト型バイオリア
クター、および該バイオリアクターを用いた排水処理技
術、例えば製油所や化学工場などのフェノール含有排水
処理技術を提供することができた。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の菌体剥離の概念を説明した図である。

【図２】本発明のエアリフト型バイオリアクターで用い
る菌体剥離型ドラフトチューブの概念図である。

【図３】本発明のエアリフト型バイオリアクターで用い
る菌体剥離型−担持型ドラフトチューブの概念図であ
る。

【図４】本発明のエアリフト型バイオリアクターで用い
る菌体剥離型−担持型＋不織布で構成されるドラフトチ
ューブの概念図である。

【図５】図２のドラフトチューブを用いたエアリフト型
バイオリアクターの性能を示す図である。

【図６】図３のドラフトチューブを用いたエアリフト型
バイオリアクターの性能を示す図である。

【図７】図４のドラフトチューブを用いたエアリフト型
バイオリアクターの性能を示す図である。

【図８】実施例６の結果を示す図である。

【図９】実施例７の結果を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 穂積 豊治 東京都港区台場２丁目３番２号 昭和シェ ル石油株式会社内 Ｆターム(参考） 4B029 AA02 BB02 CC02 CC13 DA07 DB05 DC03 4B033 NA12 NB34 NB62 NC04 ND03 ND20 NE02 4B065 AA01X AC20 BA22 BB06 BC11 BC24 BC41 CA56

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃ
   ｉａ １Ａ（ＦＥＲＭ Ｐ−１５５６６）の生育をポリ
   スチレンの存在下で、リアクター内にドラフトチューブ
   および菌体剥離手段を具備したエアリフト型バイオリア
   クターを用いて行うことを特徴とするＢｕｒｋｈｏｌｄ
   ｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ １Ａの生育促進法。
2. 【請求項２】 菌体剥離手段がＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉ
   ａ ｃｅｐａｃｉａ１Ａの生育中にポリスチレンに物理
   的な力を加え、該ポリスチレン表面に保持されて増殖し
   た菌体の少なくとも一部を積極的に剥離させる請求項１
   記載のＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ １
   Ａの生育促進法。
3. 【請求項３】 菌体剥離手段がドラフトチューブ内に設
   けられている請求項１〜２のいずれかに記載のＢｕｒｋ
   ｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ １Ａの生育促進
   法。
4. 【請求項４】 リアクター内にドラフトチューブおよび
   菌体剥離手段を具備したＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃ
   ｅｐａｃｉａ １Ａ生育促進用エアリフト型バイオリア
   クター。
5. 【請求項５】 菌体剥離手段がＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉ
   ａ ｃｅｐａｃｉａ１Ａの生育中にポリスチレンに物理
   的な力を加え、該ポリスチレン表面に保持されて増殖し
   た菌体の少なくとも一部を積極的に剥離させる手段であ
   る請求項４記載のＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａ
   ｃｉａ １Ａ生育促進用エアリフト型バイオリアクタ
   ー。
6. 【請求項６】 菌体剥離手段がドラフトチューブ内に設
   けられた請求項４〜５のいずれかに記載のＢｕｒｋｈｏ
   ｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ １Ａ生育促進用エアリ
   フト型バイオリアクター。
7. 【請求項７】 菌体剥離手段がドラフトチューブの壁部
   に設けられた突起物である請求項４〜６のいずれかに記
   載のＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ １Ａ
   生育促進用エアリフト型バイオリアクター。
8. 【請求項８】 ドラフトチューブの壁部が培養液を通過
   させる構造で形成されている請求項４〜７のいずれかに
   記載のＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ １
   Ａ生育促進用エアリフト型バイオリアクター。
9. 【請求項９】 ドラフトチューブの壁部の外および／ま
   たは外に、さらに培養液を通過させる構造を設置した請
   求項８記載のＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉ
   ａ １Ａ生育促進用エアリフト型バイオリアクター。
10. 【請求項１０】 排水処理用である請求項４〜８のいず
    れかに記載のＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉ
    ａ １Ａ生育促進用エアリフト型バイオリアクター。
11. 【請求項１１】 排水がフェノールを含有するものであ
    る請求項１０記載のエアリフト型バイオリアクター。