CN107586792A - 一种生物凝油剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种生物凝油剂及其制备方法，属于凝油剂技术领域，生物凝油剂的制备方法如下：1）微生物的活化培养：将ASW‑2菌接种至LB培养基中，振荡培养；2）将活化好的种子培养液按2‑5%(v/v)接种至葡萄糖培养基中，振荡培养；3）将培养后的菌液过滤去除菌体，剩余清液用硫酸调酸性，然后用氯仿萃取，除萃取液中的氯仿得粗产物；4）将粗产物用硅胶柱进行纯化，上柱吸附后用洗脱液洗脱，得纯化产物，本发明制备的凝油剂反应速度快，产物易分离，对环境耐受性好，对石油烃的降解率高，无二次污染。
Description
技术领域
本发明属于凝油剂技术领域，具体涉及一种生物凝油剂及其制备方法。
背景技术
原油及衍生品在全球的使用和分布对海洋环境造成了极大的潜在危害。海上油田的井喷、油船的泄露等都会对海洋造成严重且持久的污染。目前，溢油中可使用的凝油剂主要是化学凝油剂，包括氨基酸基、山梨醇基、淀粉基衍生物等。赵鑫等人研究合成的改性壳聚糖水面溢油凝油剂对机油、苯、柴油、二甲苯都有不错的凝油效果，该种改性壳聚糖水面溢油凝油剂主要是由聚壳糖和油酸酰氯以及氯乙酸为主要材料合成而成的。目前糖类衍生型、氨基酸衍生型、胆甾衍生型、有机酸及其盐衍生型相选择性超分子凝油剂的研究也取得了成果。有研究指出，该类凝油剂在制备新型、高效、环保、可重复性利用凝油剂等方面具有巨大的潜力。
在新型凝油剂的研究方面，生物凝油剂对于环境友好，不造成二次污染，不必考虑回收等优点，成为人们研究的热点，新型高效的生物凝油剂则为未来发展的趋势。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种反应速度快，产物易分离，对环境耐受性好，对石油烃的降解率高，无二次污染的一种生物凝油剂。
本发明的目的在于提供一种生物凝油剂的制备方法，采用微生物制备生物凝油，采用葡萄糖培养基培养，营养丰富且无毒性，制备得到的凝油剂可处理物理和化学方法无法清除的溢油。
本发明为实现上述目的所采取的方案为：一种生物凝油剂，生物凝油剂由微生物发酵产物提取，微生物是Pseudomonas aeruginosa strain ASW-2（Genbank 登记号是KM243658），来源于中国葡萄微生物菌种保藏管理中心，微生物经活化培养后将种子培养液接种到葡萄糖培养基中，震荡培养，葡萄糖培养基由以下成分及重量份组成：葡萄糖8-11份、硝酸铵0.7-1.2份、磷酸氢二钾0.3-0.8份、酒石酸0.2-0.3份、酵母浸粉0.1-0.6份、微量元素液0.5-1.5份，酒石酸中右旋酒石酸与左旋酒石酸的质量比为：91~94：3~6，采用上述微生物制备的生物凝油可处理物理和化学方法无法清除的溢油，制备的生物凝油剂将石油烃作为碳源和能源，对烃类化合物代谢时，使底物被氧化酶氧化，制备的生物凝油成本低，环境友好且不产生二次污染，对石油烃的降解率明显，对葡萄糖培养基进行改进，在培养基中加入酵母浸粉、微量元素液和酒石酸，L-酒石酸可丰富培养基的营养成分，但用量过大会增加培养基的毒性，将L-酒石酸和D-酒石酸复配后与其他成分配置成葡萄糖培养基营养成分丰富，且无毒性，保证ASW-2菌种的品质，并且优化配方成分用量得到的葡萄糖培养基中营养成分丰富且浓度高，ASW-2菌种检出率高于常规葡萄糖培养基68.4%~69.2%。
一种生物凝油剂的制备方法，制备步骤如下：
1）微生物的活化培养：将ASW-2菌接种至LB培养基中，振荡培养；
2）将活化好的种子培养液按2-5%(v/v)接种至葡萄糖培养基中，振荡培养；
3）将培养后的菌液过滤去除菌体，剩余清液用硫酸调酸性，然后用氯仿萃取，除萃取液中的氯仿得粗产物；
4）将粗产物用硅胶柱进行纯化，上柱吸附后用洗脱液洗脱，得纯化产物。
作为优选，ASW-2菌接种至LB培养基中，在18℃-21℃条件下，振荡培养47-50h，利用LB培养基来预培养ASW-2菌种，使ASW-2菌种成倍扩增，有利于后续进一步培养基具有充足的ASW-2菌种制备凝油剂，利用震荡培养改善菌种与培养基成分的接触和氧的供应，利于提高培养效率和质量。
作为优选，步骤3中的氯仿溶液中含有0.2-0.4%wt的双硫腙，含有双硫腙的氯仿溶液在萃取速度上具有显著的加快，且粗产物的萃取率可达98.5%以上。
作为优选，活化好的种子培养液按2-5%(v/v)接种至葡萄糖培养基中，溶剂为在0.1T-0.3T磁场下煮沸用电压为2V-4V的搅拌棒进行搅拌后过滤并在-20℃至-30℃冻结后解冻的海水，在19℃-22℃条件下，振荡培养3-7d，对葡萄糖培养基的溶剂进行改进，使用改进后的海水作为溶剂，ASW-2的萌发时间取得了意想不到的效果，ASW-2菌种的萌发时间相对于采用常规葡萄萄培养基和常规溶剂培养的ASW-2菌种的萌发时间缩短了50%~65%的时间。
作为优选，培养后菌液用0.22μm的滤膜过滤去除菌体，剩余清液用硫酸调酸性至pH2-3，然后用氯仿1:1-2进行萃取，通过上述方法提取得到纯度较低的生物凝油剂，为后续纯化生物凝油剂作工艺准备。
作为优选，步骤4中洗脱步骤中的洗脱液为甲醇：乙腈=1:2-1:5，洗脱速率2-5mL/min。
作为优选，生物凝油剂在原油中的用量为每升10%~20%，凝油时间为30min-2h，凝油后的凝胶粘度可达200-250 Pa·S，制备的凝油剂效果由于市售凝油剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：采用ASW-2微生物制备的生物凝油可处理物理和化学方法无法清除的溢油，而且成本低，环境友好且不产生二次污染，对石油烃的降解率明显，在制备培养ASW-2菌种过程中使用改进的葡萄糖培养基营养丰富且无毒且培育ASW-2菌种检出率高于常规葡萄糖培养基68.4%~69.2%；采用改进后的溶剂应用于葡萄糖培养基培养的ASW-2菌种的萌发时间缩短了50%~65%，制备得到的凝油剂可处理物理和化学方法无法清除的溢油。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：
实施例1：
一种生物凝油剂，生物凝油剂由微生物发酵产物提取，微生物是Pseudomonas aeruginosa strain ASW-2（Genbank 登记号是KM243658）。
一种生物凝油剂的制备方法，制备步骤如下：
1）微生物的活化培养：将ASW-2菌接种至LB培养基中，在20℃条件下，振荡培养48h；
2）将活化好的种子培养液按3%(v/v)接种至葡萄糖培养基中，溶剂为在0.1T-0.3T磁场下煮沸用电压为2V的搅拌棒进行搅拌后过滤并在-25℃冻结后解冻的海水，在20℃条件下，振荡培养4d；
3）将培培养后菌液用0.22μm的滤膜过滤去除菌体，剩余清液用硫酸调酸性至pH2，然后用氯仿1:2进行萃取，氯仿溶液中含有0.24%wt的双硫腙，萃取液在旋转蒸发仪中50℃蒸馏去除溶剂氯仿得粗产物；
4）将粗产物用硅胶柱进行纯化，上柱吸附后用洗脱液洗脱，洗脱液为甲醇：乙腈=1:3，洗脱速率3mL/min，得纯化产物。
葡萄糖培养基由以下成分及重量份组成：葡萄糖10份、硝酸铵1份、磷酸氢二钾0.4份、酒石酸0.27份、酵母浸粉0.4份、微量元素液1份，酒石酸中右旋酒石酸与左旋酒石酸的质量比为：91：4，上述方法对葡萄糖培养基进行改进，在培养基中加入酵母浸粉、微量元素液和酒石酸，L-酒石酸可丰富培养基的营养成分，但用量过大会增加培养基的毒性，将L-酒石酸和D-酒石酸复配后与其他成分配置成葡萄糖培养基营养成分丰富，且无毒性，保证ASW-2菌种的品质，并且优化配方成分用量得到的葡萄糖培养基中营养成分丰富且浓度高，ASW-2菌种检出率高于常规葡萄糖培养基68.7%。
实施例2：
一种生物凝油剂，生物凝油剂由微生物发酵产物提取，微生物是Pseudomonas aeruginosa strain ASW-2（Genbank 登记号是KM243658）。
一种生物凝油剂的制备方法，制备步骤如下：
1）微生物的活化培养：将ASW-2菌接种至LB培养基中，在21℃条件下，振荡培养48h；
2）将活化好的种子培养液按4%(v/v)接种至葡萄糖培养基中，溶剂为在0.1T-0.3T磁场下煮沸用电压为4V的搅拌棒进行搅拌后过滤并在-30℃冻结后解冻的海水，在22℃条件下，振荡培养5d；
3）将培培养后菌液用0.22μm的滤膜过滤去除菌体，剩余清液用硫酸调酸性至pH2，然后用氯仿1:1行萃取，氯仿溶液中含有0.34%wt的双硫腙，萃取液在旋转蒸发仪中51℃蒸馏去除溶剂氯仿得粗产物；
4）将粗产物用硅胶柱进行纯化，上柱吸附后用洗脱液洗脱，洗脱液为甲醇：乙腈=1:3，洗脱速率4mL/min，得纯化产物。
葡萄糖培养基由以下成分及重量份组成：葡萄糖10份、硝酸铵0.8份、磷酸氢二钾0.4份、酒石酸0.24份、酵母浸粉0.17份、微量元素液1份，酒石酸中右旋酒石酸与左旋酒石酸的质量比为：92：3，上述方法对葡萄糖培养基进行改进，在培养基中加入酵母浸粉、微量元素液和酒石酸，L-酒石酸可丰富培养基的营养成分，但用量过大会增加培养基的毒性，将L-酒石酸和D-酒石酸复配后与其他成分配置成葡萄糖培养基营养成分丰富，且无毒性，保证ASW-2菌种的品质，并且优化配方成分用量得到的葡萄糖培养基中营养成分丰富且浓度高，ASW-2菌种检出率高于常规葡萄糖培养基68.4%。
实施例3：
将本发明的生物凝油剂与市场购买的普通凝油剂作实验对比：将本发明实施例1制备的凝油剂（实验组1），本发明实施例2制备份凝油剂（实验组2），市场购买常规化学凝油剂（空白对照组）分别加入到含原油10g/L的海水的容器中，用量均在15%，时间为1h，检测凝油后的凝胶粘度，实验组1的凝胶粘度为235 Pa·S，实验组2的凝胶粘度为238 Pa·S，空白对照组凝胶粘度为213 Pa·S，实验结果表面本发明的凝油剂效果优于市售凝油剂。
上述实施例1-3的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种生物凝油剂，其特征在于：所述生物凝油剂由微生物发酵产物提取，所述微生物经活化培养后将种子培养液接种到葡萄糖培养基中，震荡培养，所述葡萄糖培养基由以下成分及重量份组成：葡萄糖8-11份、硝酸铵0.7-1.2份、磷酸氢二钾0.3-0.8份、酒石酸0.2-0.3份、酵母浸粉0.1-0.6份、微量元素液0.5-1.5份，酒石酸中右旋酒石酸与左旋酒石酸的质量比为：91~94：3~6。
2.一种生物凝油剂的制备方法，其特征于以下步骤：
1）微生物的活化培养：将ASW-2菌接种至LB培养基中，振荡培养；
2）将活化好的种子培养液按2-5%接种至葡萄糖培养基中，振荡培养；
3）将培养后的菌液过滤去除菌体，剩余清液用硫酸调酸性，然后用氯仿萃取，除萃取液中的氯仿得粗产物；
4）将粗产物用硅胶柱进行纯化，上柱吸附后用洗脱液洗脱，得生物凝油剂。
3.根据权利要求2所述的一种生物凝油剂的制备方法，其特征在于：ASW-2菌接种至LB培养基中，在18℃-21℃条件下，振荡培养47-50h。
4.根据权利要求2所述的一种生物凝油剂的制备方法，其特征在于：所述步骤3中的氯仿溶液中含有0.2-0.4%wt的双硫腙。
5.根据权利要求2所述的一种生物凝油剂的制备方法，其特征在于：活化好的种子培养液按2-5%接种至葡萄糖培养基中，溶剂为在0.1T-0.3T磁场下煮沸用电压为2V-4V的搅拌棒进行搅拌后过滤并在-20℃至-30℃冻结后解冻的海水，在19℃-22℃条件下，振荡培养3-7d。
6.根据权利要求2所述的一种生物凝油剂的制备方法，其特征在于：培养后菌液用0.22μm的滤膜过滤去除菌体，剩余清液用硫酸调酸性至pH2-3，然后用氯仿1:1-2进行萃取。
7.根据权利要求2所述的一种生物凝油剂的制备方法，其特征在于：所述步骤4中洗脱步骤中的洗脱液为甲醇：乙腈=1:2-1:5，洗脱速率2-5mL/min。
8.根据权利要求1所述的一种生物凝油剂，其特征在于：所述生物凝油剂在原油中的用量为每升10%~20%。
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