BRPI0613714A2

BRPI0613714A2 - método para produção de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol a partir de material de amido natural

Info

Publication number: BRPI0613714A2
Application number: BRPI0613714-8A
Authority: BR
Inventors: Dehua Liu; Keke Cheng; Hongjuan Liu; Rihui Lin; Jian Hao
Original assignee: Univ Tsinghua
Priority date: 2005-06-17
Filing date: 2006-06-13
Publication date: 2011-02-01
Also published as: CN100427605C; ATE538207T1; EP1897955A1; AU2006257543B2; US20090081745A1; US7968319B2; EP1897955A4; EP1897955B1; WO2006133637A1; CN1710086A; AU2006257543A1

Abstract

MéTODO PARA PRODUçãO DE 1,3-PROPANODIOL E 2,3-BUTANODIOL A PARTIR DE MATERIAL DE AMIDO NATURAL. A presente invenção refere-se a um método para produção de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol a partir de materiais de amido natural, incluindo as etapas que seguem: 1) Candida krusei ou Hansenula Arabitolgens Fang são inoculadas em um meio de fermentação com o líquido de sacarificação dos amidos naturais como uma fonte de carbono; as células de levedura são culturadas em uma condição aeróbica até que a taxa de consumo de glicose seja significantemente reduzida, e então fermentadas anaerobicamente para uma concentração de glicose de 5 a 10 g/L; o caldo de fermentação é coletado e filtrado para remover as células de levedura no caldo, e o filtrado resultante é caldo de fermentação de glicerina; 2) KIebsieIIa, Clostridium butyricum ou Clostridium pasteurianum são inoculadas em um meio de fermentação no qual o caldo de fermentação de glicerina obtido a partir da etapa 1) serve como uma fonte de carbono; as bactérias são fermentadas anaerobicamente por 30-32 horas, e então fermentadas aerobiamente quando a taxa de produção de 1 ,3-propanodiol diminuiu obviamente, e a fermentação foi parada quando a concentração de glicerina é reduzida para um nível abaixo de 10 g/L, e finalmente 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol são obtidos. O método da presente invenção pode reduzir eficazmente o custo de produção e aumentar a produtividade.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOPARA PRODUÇÃO DE 1,3-PROPANODIOL E 2,3-BUTANODIOL A PAR-TIR DE MATERIAL DE AMIDO NATURAL".

CAMPO DA TÉCNICA

A presente invenção refere-se a um método para produção de1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol, particularmente um método para produçãode 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol a partir de materiais de amido natural.

ANTECEDENTES DAS TÉCNICAS

1,3-Propanodiol (PDO), como uma matéria-prima importante pa-ra a indústria química, pode ser usado como um solvente orgânico em tintas,corantes e impressão, revestimentos, lubrificantes ou indústria anticongelan-te e similares. 1,3-Propanodiol pode agir como um monômero na síntese depoliésteres e poliuretano, especialmente para pcümerizar ccm ácido tereítáii-co para formar politrimetileno tereftalato (PTT), que exibe melhores desem-penhos comparado com aqueles polímeros sintetizados a partir de 1,2-propanodiol, butanodiol e monômero de glicol. Agora, dezenas de milhõesde toneladas de polietileno tereftalatos (PET) são consumidas a cada anoem todo o mundo. PTT é comparável a PET em estabilidade química, biode-gradabilidade e similar, no entanto mais excelente em resistência à poluição,dureza, resiliência elástica, resistência à UV e similar. Ainda, PTT tambémtem outras vantagens, tal como resistência à abrasão ou capacidade dedesgaste, baixa absorção de água, eletricidade estática baixa, etc, capaz decompetir com náilon no mercado de tapete. Ele pode ser também usado emtecidos não-tecidos, plásticos de engenharia, roupas, enfeites domésticos,materiais de revestimento, tecidos e similar. PTT foi avaliado como um dosseis melhores petroquímicos novos nos USA em 1998, e considerado comoo produto atual ao invés de PET.

O excelente desempenho e potencial de mercado de PTT foramreconhecidos 50 anos atrás. É muito difícil produzir PTT em uma escala in-dustrial grande devido à dificuldade técnica grande e custo na produção desua matéria-prima, 1,3-propanodiol. Até agora, apenas duas corporaçõesinternacionais, Dupont e Shell, produzem 1,3-propanodiol para uso própriopara sua síntese de PTT a partir de oxido de etileno ou propileno como ma-térias-primas através de uma via de síntese química convencional. Existevárias deficiências nos processos de síntese química, incluindo subprodutosexcessivos: seletividade pobre; requer condições de operação especiais, talcomo temperatura e pressão altas; enormes custos com equipamento; suasmatérias-primas sendo fontes não-reproduzíveis; e oxido de etileno e o pro-duto intermediário acroleína produzidos em uma outra via sendo matériasperigosas combustíveis, explosivas ou virulentas, respectivamente. O pro-cesso de fermentação para produção de 1,3-propanodiol foi focado nos últi-mos anos devido à alta seletividade e condições de operação suaves.

Como um subproduto na fermentação de 1,3-propanodiol, 2,3-butanodiol também é uma matéria-prima importante na indústria química. Eleé um líquido incolcr e insípido, G pcds ser usado corno combustíveis, e usa-do para preparar polímeros, tintas, perfumes, anticongelantes, fumigantes,umidificantes, agente de amaciamento, plastificante, explosivos, veículosquirais para agentes farmacêuticos e similar. Também, 2,3-butanodiol podeservir como uma matéria-prima muito valiosa na indústria química para sinte-tizar outros agentes químicos, por exemplo, desidratar 2,3-butanodiol paraformar metil etil cetona com aplicações bastante extensivas, e desidratarmais para formar 1,3-butadieno. 2,3-Butanodiol pode ser polimerizado paraproduzir estireno através de reação Diels-Alder. 2,3-Butanodiol e metil etilcetona podem condensar e então se submeter a uma reação de hidrogena-ção para formar octano, que pode ser usado para produzir materiais de altaqualidade para aviação. 2,3-Butanodiol reage com ácido acético para formardiacetato de 2,3-butanodiol, que pode ser adicionado a manteigas para me-lhorar o sabor. Em geral, 2,3-butanodiol, não entanto, não deve ser separadoe purificado como um produto devido a seus baixos rendimentos na fermen-tação de 1,3-propanodiol.

Atualmente, existe dois métodos principais para produção de1,3-propanodiol, métodos químico e biológico. Comparado com métodos desíntese química, métodos de fermentação de micróbio para produção de 1,3-propanodiol possuem muitas vantagens significantes, incluindo condições deprodução suaves, boa seletividade, menos subprodutos, facilidade de sepa-rar e purificar, sem poluição ambiental, etc, e mais e mais atenção deve serdada a tais métodos.

Atualmente, existe vários cursos para produção de 1,3-propanodiol através de métodos biológicos:

1. Bactérias intestinais são utilizadas para converter glicerol em1,3-propanodiol sob condições anaeróbicas (vide US5254467, EP0373230A1).

2. Fermentação anaeróbica com bactérias tal como Klebsiellasob condições anaeróbicas para produzir 1,3-propanodiol (Ruch e outros,Regulation of glycerol catabolism in Klebsiella aerogenes, J. Bacteriol. 1974,119(1):50-56; Streekstra e outros, Overflow metabolismo during anaericgrowth of Klebsiella pneumoniae NCT418 on glycerol and dihydroxyacetonein chemostat culture. Arch. Microbiol., 1987, 147:268-275; Zeng e outros,Pathways analysis of glycerol fermentation by Klebsiella pneumonia: Regula-tion of reducing equivalent balance and product formation. Enzyme MicrobiolTechnoL 1993, 15:770-779).

3. Klebsiella são utilizadas sob condições microaeróbicas paraproduzir 1,3-propanodiol através de fermentação (vide Wang Jianfang, etc,Study on microaerobic conversion of glycerin to 1,3-propanodiol by Klebsiellapneumoniae, Modern Chemical Industry, 2001, 21(5):28-31; e Publicação dePatente Chinesa No. CN1348007, A method for microaerobic fermentiveproduction of 1,3-propanodiol, expedida para Xiu Zhilong, etc).

4. Klebsiella são utilizadas sob condições anaeróbicas para pro-duzir 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol através de fermentação (Biebl e ou-tros, Fermentation of glycerol to 1,3-propanodiol and 2,3-butanodiol. AppiMicrobiol. Biotechnol., 1998, 50:24-29).

5. 1,3-Propanodiol e 2,3-butanodiol são produzidos a partir deglicerol através de um método de fermentação microbiano de dois estágios(Liu Dehua, etc., Pedido de Patente No. 200410037692.3).

6. Um método para produção de 1,3-propanodiol através de umafermentação microbiana de duas etapas (Xiu Zhilong, etc., Patente ChinesaNo. ZL01138769.6).

Os métodos 1-3 acima utilizam todos glicerol como substratospara produzir um produto único 1,3-propanodiol, e a concentração de 1,3-propanodiol no caldo é muito baixa, então seus custos de produção são mui-to altos. O método 4 propõe uma fermentação para produzir simultaneamen-te 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol, no entanto, seu nível de fermentação émuito baixo devido às limitações de condições técnicas. O método 5 adotaum novo processo usando condições anaeróbicas em estágio inicial e umcondição aeróbica em estádio final, o que aumenta significantemente a con-centração dos produtos de fermentação 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol, e,até certo ponto, diminui os custos de produção; mas os custos de produçãosão ainda relativamente altos porque este método também utiliza glicerolcomo substratos. O método 6 provê um método de fermentação de duasetapas para produzir 1,3-propanodiol a partir de matérias-primas tal comoamidos, que, teoricamente, pode diminuir acentuadamente os custo de pro-dução; mas, devido às limitações de condições técnicas, a concentração deglicerol é apenas 49,9 g/L com um rendimento de apenas 39,1% em mol, e aconcentração de 1,3-propanodiol é também muito baixa e apenas 13,18 g/Lcom um rendimento de 22,8% em mol e suas modalidades mais preferidas.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Um objetivo da presente invenção é prover um método para pro-dução de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol a partir de materiais de amidonatural.

Um método para produção de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol apartir de materiais de amido natural provido pela invenção inclui as etapasque seguem:

1) Candida krusei ou Hansenula arabitolgens fang são inocula-das em um meio de fermentação com o líquido de sacarificação de amidosnaturais como uma fonte de carbono, usando uma condição aeróbica emestágio inicial e uma condição anaeróbica em estágio posterior, isto é, ascélulas de levedura são culturadas na condição aeróbica até a taxa de con-sumo de glicose ser significantemente reduzida, e então fermentadas anae-robicamente para uma concentração de glicose de a partir de 5 a 10 g/L. Ocaldo de fermentação é coletado e filtrado para remover as células de leve-dura no caldo de fermentação, e o filtrado resultante é caldo de fermentaçãode glicerina.

2) Klebsiellal Clostridium butyricum ou Clostridium pasteurianumsão inoculadas em um meio de fermentação onde o caldo de fermentaçãode glicerina obtido da etapa 1) serve como uma fonte de carbono. As bacté-rias são fermentadas anaerobiamente por 30-32 horas, e então fermentadasaerobicamente quando a taxa de produção de 1,3-propanodiol diminuiu ob-viamente, e a fermentação foi parada quando a concentração de glicerina éreduzida para um nível abaixo de 10 g/L, e finalmente 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol são obtidos.

Onde as células de levedura removidas através de filtragem naetapa 1) podem ser recuperadas diretamente para a próxima batelada defermentação; a recuperação de célula pode diminuir o período de cultura dasemente da próxima batelada.

As Candida krusei ou Hansenula arabitolgens fans são de umasemente primária ou secundária; a semente primária é preparada de acordocom os procedimentos que seguem: as Candida krusei ou Hansenula arabi-tolgens fans são inoculadas em um meio de semente contendo o líquido desacarificação de amidos naturais, e culturadas em um frasco de agitaçãocom uma carga de líquido de 1/5 do volume do frasco a 30-35Q C por 18-20horas, usando um raio de giro de 25 mm e uma velocidade de rotação de apartir de 200 a 250 rpm. A semente secundária é preparada como segue: asemente primária é inoculada em um meio de semente com o líquido de sa-carificação de amidos naturais como uma fonte de carbono em um fermen-tador, e cultura a 30-35° C por 5-7 horas, usando uma velocidade de misturade a partir de 300 a 500 rpm e uma quantidade de aeração de 0,2-0,5 wm.

O meio de fermentação com o líquido de sacarificação de ami-dos naturais como uma fonte de carbono tem um pH de 4-5, e contém aindapasta fluida de amido e uréia; o teor do líquido de sacarificação de amidosnaturais é calculado com base em que todos os açúcares de redução no Ii-quido de sacarificação de amidos naturais são considerados como glicose, eé até 260-350 g/L de glicose no meio; o teor de pasta fluida de amido é 2-3g/L; e o teor de uréia é 2,5-4 g/L.

O meio de semente contendo o líquido de sacarificação de ami-dos naturais tem um pH de 4-5, e contém ainda pasta fluida de amido e uréi-a; o teor do líquido de sacarificação de amidos naturais é calculado com ba-se em que todos os açúcares de redução no líquido de sacarificação de a-midos naturais são considerados como glicose, e é até 80-100 g/L de glicoseno meio; o teor da pasta fluida de amido é 2-3 g/L; e o teor de uréia é 2-3g/L.

Os amidos naturais na etapa 1) podem ser materiais de amidostal como amido de batata doce, amido de milho ou tapioca; e o valor de DEdo líquido de sacarificação de amidos naturais é 90-110.

O líquido de sacarificação de amidos naturais pode ser prepara-do de acordo com os procedimentos que seguem: formulação de uma emul-são de amido a partir de amidos naturais e água em uma razão de massa de1:1800-2000; adição de uma enzima de liquefação duas vezes a 80-85° C e90-95° C, respectivamente, e para cada vez usar 3-5 U/grama de amido na-tural; liqüefazer por 40-50 minutos; então aumentar a temperatura para 110-120° C para inativar a enzima; resfriar; adicionar uma enzima de sacarifica-ção de 150-200 U/grama de amido; sacarificar a 50-60Q C por 8-12 horas; eobter um líquido de sacarificação de amidos naturais tendo um valor DE de90-110.

Klebsiellal Clostridium butyricum ou Clostridium pasteurianumsão de uma semente primária ou secundária; a semente primária é prepara-da de acordo com os procedimentos que seguem: Klebsiella, Clostridiumbutyricum ou Clostridium pasteurianum são inoculadas em um meio de se-mente formulado a partir do caldo de fermentação de glicerina obtido na eta-pa 1) e culturadas sob condições aeróbicas em um frasco de agitação comuma carga de líquido de 1/5 do volume de frasco a 30-33Q C por 18-20 ho-ras, usando um raio de rotação de 25 mm e uma velocidade de rotação de130 a 150 rpm. A semente secundária é preparada como segue: uma se-mente primária é inoculada em um meio de semente formulado a partir docaldo de fermentação de glicerina na etapa 1) em um fermentador e cultura-da a 30-33° C por 5-10 horas, usando uma velocidade de mistura de 60 a150 rpm e uma quantidade de aeração de 0,2-0,5 wm.

O meio de fermentação com o caldo de fermentação de glicerinaobtido na etapa 1) como uma fonte de carbono tem um pH de 6,8-8,0, o teordo caldo de fermentação de glicerina é até 20-80 g/L de glicerina no meioconforme calculado em uma base de glicerina; o meio de fermentação com ocaldo de fermentação de glicerina como uma fonte de carbono contém ainda2,225-3,5 g/L de K2HPO4 3H20, 2,0-4,0 g/L (NH4)2SO4, 0,65-1,2 g/L deKH2PO4, 0,1-0,2 g/L de MgSO4 7H20, 1-1,5 g/L de pó de levedura, uma so-lução de elementos traço de 2-3 mLVL e 0,1 mL/L de agente antiespumante.A solução de elementos traço consiste em 70 mg/L de ZnCI2, 100 mg/L deMnCI2 4H20, 60 mg/L de H3BO3, 200 mg/L de CoCI2 6H20, 25 mg/L deNiCI2 6H20, 27,64 m/L de NiCI2 H2O, 35 mg/L de Na2MoO4 . 2H20, 20mg/L de CuCI2 . H2O1 29,28 mg/L de CuSO4 . 5H20 e 0,9 ml/L de HCI con-centrado.

O meio de fermentação com o caldo de fermentação de glicerinaobtido na etapa 1) como uma fonte de carbono tem um pH de 6,8-8,0, o teordo caldo de fermentação de glicerina é até 20 g/L de glicerina no meio con-forme calculado em uma base de glicerina; o meio de fermentação com ocaldo de fermentação de glicerina como uma fonte de carbono contém ainda4,45-5,6 g/L de K2HPO4 · 3H20, 2,0-4,0 g/L (NH4)2SO4, 1,3-2,6 g/L deKH2PO4, 0,1-0,2 g/L de MgSO4 7H20, 1,0-2,0 g/L de pó de levedura, 1,0-2,0g/L de CaCO3 e uma solução de elementos traço de 2-3 ml/L. A solução deelementos traço consiste em 70 mg/L de ZnCI2, 100 mg/L de MnCI2 · 4H20,60 mg/L de H3BO3, 200 mg/L de CoCI2 6H20, 25 mg/L de NiCI2 · 6H20,27,64 mg/L de NiCI2 H2O1 35 mg/L de Na2MoO4 2H20, 20 mg/L de CuCI2H2O, 29,28 mg/L de CuSO4 5H20 e 0,9 mLA de HCI concentrado.

A temperatura de fermentação no processo de fermentação daetapa 1)é 30-35° C.

A condição aeróbica na etapa 1) é aerar o ar durante o processode fermentação, com uma quantidade de aeração de 0,5-2 wm (L/L/min,uma razão do volume de aeração de ar em um fermentador por minuto parao volume do caldo de fermentação no fermentador); a condição anaeróbicana etapa 1) é aerar gás nitrogênio durante o processo de fermentação, comuma quantidade de aeração de 0,2-2 wm (L/L/min, uma razão do volume degás nitrogênio aerando para um fermentador por minuto para o volume docaldo de fermentação no fermentador).

O caldo de fermentação de glicerina obtido na etapa 1) é adicio-nado semicontínuo (fed-batch) durante o processo de fermentação da etapa2), permitindo que o teor de glicerina no meio seja mantido em 20-80 g/L.

Fonte de nitrogênio é suplementada duas vezes durante o pro-cesso de fermentação da etapa 2), cada uma adicionando pó de levedura e(NH4)2SO4 em uma quantidade de 0,8 g de pó de levedura/L de meio e 1 gde (NH4)2SO4ZL de meio, respectivamente.

O pH é 6,8-8,0 e a temperatura de fermentação é 30-37° C du-rante o processo de fermentação da etapa 2).

O método inclui ainda uma etapa de purificação de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol, isto é, coleta do caldo de fermentação, filtra-gem para remover a massa bacteriana e acúmulo do filtrado para permitirque ele dessalinize, destile e retifique sob vácuo.

AS MODALIDADES PREFERIDAS PARA IMPLEMENTAR A INVENÇÃO

Os métodos experimentais que seguem são todos métodos con-vencionais a menos que de outro modo especificado.

Exemplo 1. Produção de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol a par-tir de amidos de milho naturais

1. A liquefação e sacarificação dos materiais de amido natural.

1475 g de amidos de milho naturais e 2722 L de água foram formulados co-mo emulsão de amido. A emulsão foi aquecida, adicionada enzima de lique-fação (5 U/grama de amido) duas vezes a 80° C e 95° C e liqüefeita por 50minutos. E então a temperatura foi aumentada para 11 Og C para inativar aenzima. A mistura foi esfriada e adicionada enzima de sacarificação (200U/grama de amido), então sacarificada a 60° C por 9 horas. Os resultadosmedidos mostram que o valor de glicose (valor de DE (equivalente de dex-trose), com referência à porcentagem de glicose em massas secas, confor-me calculado com base em que todos os açúcares de redução em líquido desacarificação são considerados como glicoses) do líquido de sacarificação é103,46 e a concentração de dextrose no líquido de sacarificação é 31,55%.

2. Produção de glicerina através da fermentação do líquido de sa-carificação

(1) Cepas: Candida krusei 2.1048 (comercialmente disponível doInstitute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences)

(2) Meios:

Meio "Slant" (g/L): glicose (preparada com o líquido de sacarifi-cação da etapa 1), 200; pasta fluida de amido, 3, uréia, 3; e ágar, 20.

Meio de semente: glicose (preparada com o líquido de sacarifi-cação da etapa 1), 100; pasta fluida de amido, 3, e uréia, 3.

Meio de fermentação: glicose (preparada com o líquido de saca-rificação da etapa 1), 315; pasta fluida de amido, 3, e uréia, 2,5.

Os meios acima são todos ajustados para um pH de 4-4,5 e es-terilizados a 110Q C por 15 minutos.

(3) Cultura de semente

Candida krusei 2.1048 são inoculadas em meio "slant" e cultura-das a 35Q C por 24 horas para ativar a cepa.

As Candida krusei 2.1048 ativadas são inoculadas em meio desemente contendo líquido de sacarificação de amido natural, e sementesprimárias são obtidas através de cultura em um frasco de agitação (um fras-co cônico de 500 mL, com uma carga de líquido de 100 ml_) a 35Q C, 200rpm (um raio de rotação de 25 mm) por 20 horas.

Segundas sementes são obtidas através de inoculação das se-mentes primárias em meio de semente contendo líquido de sacarificação deamido natural e cultura em uma velocidade de mistura de 300-500 rpm a 35QC por 5-7 horas, com uma quantidade de aeração de 0,2-0,5 vvm.

(4) Fermentação

Fermentação foi realizada através de qualquer um dos três pro-cedimentos que seguem:

A. Fermentação foi realizada com um fermentador de 5 L e se-mentes primárias. As sementes primárias foram inoculadas em um meio defermentação em uma razão de volume de 10% e a fermentação foi realizadano fermentador de 5 L1 aerando ar em uma quantidade de 2,0 wm duranteas primeiras 60 horas e gás nitrogênio em uma quantidade de 0,5 vvm após60 horas em uma velocidade de mistura de 500 rpm e cultura por 70 horas.

A temperatura de fermentação permaneceu em 30° C durante o processo defermentação. O rendimento da glicerina foi medido e os resultados mostra-ram que a glicerina estava em uma concentração de 165 g/L, os açúcaresrestantes estavam em uma concentração de 5 g/L e o rendimento de gliceri-na versus glicose era 52,4% em massa.

B. Fermentação foi realizada com um fermentador de 500 L esementes secundárias. As sementes secundárias foram inoculadas em ummeio de fermentação em um razão de volume de 10% e a fermentação foirealizada no fermentador de 500 L1 aerando ar em uma quantidade de 0,8vvm durante as primeiras 60 horas e gás nitrogênio em uma quantidade de0,2 vvm após 60 horas em uma velocidade de mistura de 300 rpm e culturapor 72 horas. A temperatura de fermentação permaneceu em 33Q C durantetodo o processo de fermentação. O rendimento da glicerina foi medido e osresultados mostraram que a glicerina estava em uma concentração de 179g/L, os açúcares restantes estavam em uma concentração de 5 g/L e o ren-dimento de glicerina versus glicose era 55,38% em massa;

C. Fermentação foi realizada com um fermentador de 75000L esementes secundárias. As sementes secundárias foram inoculadas em ummeio de fermentação em uma razão em volume de 10% e a fermentação foirealizada no fermentador de 75000L, aeração de ar em uma quantidade de0,5 vvm durante as primeiras 60 horas e gás nitrogênio em uma quantidadede 0,2 wm após 60 horas em uma velocidade de mistura de 300 rpm e cul-tura por 72 horas. A temperatura de fermentação permaneceu a 35° C du-rante todo o processo de fermentação. O rendimento da glicerina foi medidoe os resultados mostraram que a glicerina estava em uma concentração de258 g/L, os açúcares restantes estavam em uma concentração de 5 g/L e orendimento da glicerina versus glicose era 53,3% em massa.

3. Produção de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol através de fer-mentação do caldo de fermentação de glicerina

(1) O caldo de fermentação de glicerina da etapa anterior foi fil-trado para remover Candida krusei 2.1048. As células filtradas foram usadasdiretamente na batelada seguinte de fermentação de glicerina sob as mes-mas condições de fermentação com a primeira batelada. O filtrado resultanteé usado para fermentar 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol.

(2) Cepas: Klebsiella pneumoniae 1.1734 (comercialmente dis-ponível do Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences)

(3) Os ingredientes de meio de semente e de fermentação para1,3-propanodiol são listados na Tabela 1 abaixo, onde as composições dasolução de elementos traço são listadas na Tabela 2 abaixo.

Tabela 1. Os ingredientes de meio de semente e de fermentação

<table>table see original document page 12</column></row><table>Tabela 2. Ingredientes de Solução de Elemento Traço

<table>table see original document page 13</column></row><table>

O pH do meio acima é 6,8-8,0.

(4) Cultura de semente: Klebsiella pneumoniae 1.1734 foi inocu-

Iada no meio de semente formulado com o caldo de fermentação de glicerinada etapa 2 (um frasco cônico de 500 mL com uma carga de líquido de 100ml_) e cultura a 309 C em uma velocidade de agitador de 150 rpm (com umraio de rotação de 25 mm). Sementes primárias foram obtidas através deuma cultura aeróbica por 18 horas; e então o caldo de fermentação nestefrasco de agitação foi inoculado em uma razão de volume de 2% para o fer-mentador carregado como meio de semente e culturado em uma velocidadede mistura de 60-150 rpm a 30e C com uma quantidade de aeração de 0,2-0,5 wm por 5-10 horas para se obter sementes secundárias.

(5) Cultura de Fermentação:

Fermentação foi realizada através de qualquer um dos métodosC, D e E que seguem, e métodos AeB foram tomados como controle:

A. Um fermentador de 5L foi usado, a temperatura de cultura era37° Ceo valor do pH foi ajustado para 6,8 com KOH. O líquido semente foiinoculado no meio de fermentação (com uma concentração de glicerina de56 g/L) preparado com o caldo de fermentação de glicerina da etapa 2, ne-nhum caldo de fermentação de glicerina foi alimentado durante o processode fermentação. O fermentador foi girado em uma velocidade de 150 rpm.Gás nitrogênio foi aerado a 0,5 vvm. A fermentação foi realizada por 30 ho-ras e as concentrações de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol foram 21 g/L e 2g/L, respectivamente.

B. Um fermentador de 5 L, temperatura de cultura era de 37° C eo valor do pH foi ajustado para 6,8 com KOH. O líquido semente foi inocula-do no meio de fermentação (com uma concentração de glicerina de 80 g/L)preparado com o caldo de fermentação de glicerina da etapa 2, nenhum cal-do de fermentação de glicerina foi alimentado durante o processo de fermen-tação. O fermentador foi girado em uma velocidade de 150 rpm. O ar foi ae-rado a 0,5 vvm. A fermentação foi realizada por 30 horas e as concentraçõesde 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol foram 35 g/L e 6,6 g/L, respectivamente.

C. Um fermentador de 5L foi usado, a temperatura da cultura erade 37° Ceo valor do pH foi ajustado para 6,8 com KOH. O líquido sementefoi inoculado no meio de fermentação (com uma concentração de glicerinade 30 g/L) preparado com o caldo de fermentação de glicerina da etapa 2,com adição do caldo de fermentação de glicerina em um modo em semicon-tínuo durante o processo de fermentação e controle da taxa de fluxo parapermanecer a concentração de glicerina em 30 g/L. O fermentador foi giradoem uma velocidade de 150 rpm. Gás nitrogênio foi primeiro aerado e ar ae-rado após 32 horas, ambos a 0,5 vvm. Nutrição foi suplementada duas ve-zes a 16 horas e 30 horas durante o processo de fermentação (cada umaadicionando pó de levedura e (NH4)2SO4 em uma quantidade de 0,8 g de póde levedura/L de meio e 1 g de (NH4)2SO4ZL de meio, respectivamente). Afermentação estava completa após 64 horas. O caldo de fermentação foicoletado, filtrado para remover as cepas e o licor filtrado resultante foi cole-tado para dessalinizar, destilar e retificar sob vácuo para obter produtos, 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol. Os resultados medidos mostraram que no tér-mino da fermentação, as concentrações de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiolno caldo de fermentação eram 70 g/L e 16 g/L, respectivamente, e o rendi-mento de 1,3 -propanodiol era 51% em mol (a razão de mois de 1,3-propanodiol para os mois da glicerina consumida), o rendimento dos dióistotais era 71,85% em mol (a razão dos mois de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol para os mois da glicerina consumida).D. Um fermentador de 500 L foi usado. 50 L de líquido sementesecundária foram inoculados no meio de fermentação (com uma concentra-ção de glicerina de 30 g/L) preparado com o caldo de fermentação de glice-rina da etapa 2, com a rotação do fermentador em uma velocidade de 60rpm e usando uma quantidade de aeração de 0,3 wm. O caldo de fermenta-ção de glicerina foi adicionado em um modo semicontínuo durante o proces-so de fermentação e controle de sua taxa de fluxo para permanecer a con-centração de glicerina em 30 g/L. As outras condições eram as mesmas queaquelas para uma fermentação semicontínua de alimentação de 5 L. Notérmino da fermentação, as concentrações de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol no caldo de fermentação eram 72 g/L e 25,4 g/L, respectivamen-te, o rendimento de 1,3-propanodiol foi 55,38% em mol, e o rendimento dosdióis totais era 71,85% em mol.

E. Um fermentador de 5000 L foi usado. 500 L de líquido semen-te secundária foram inoculados no meio de fermentação inicial (com umaconcentração de glicerina de 30 g/L) preparado com o caldo de fermentaçãode glicerina descrito acima. O caldo de fermentação de glicerina foi adicio-nado em modo semicontínuo durante o processo de fermentação e controlede sua taxa de fluxo para permanecer a concentração de glicerina em 30g/L. As condições de fermentação eram as mesmas que aquelas para umfermentador de 500 L. No término da fermentação, as concentrações de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol no caldo de fermentação eram 66,6 g/L e 30,4g/L, respectivamente, e o rendimento do 1,3-propanodiol era 59,1% em mol,o rendimento dos dióis total era 83,2% em mol.

4. Reciclagem de célula: as células resultantes foram filtradas docaldo de fermentação de glicerina para uso direto na próxima batelada defermentação de glicerina. E as condições de fermentação eram todas asmesmas que a primeira batelada. A viabilidade celular substancialmentepermaneceu sem modificação por pelo menos 10 reciclagens, e a concen-tração de glicerina permaneceu estável.

Exemplo 2. Produção de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol a par-tir de amidos de batata doce naturais1. A liquefação e sacarificação dos materiais de amido natural1475 g de amidos de batata doce naturais e 2722 L de água fo-ram formulados como emulsão de amido. A emulsão foi aquecida, adiciona-da enzima de liquefação (5 U/grama de amido) duas vezes a 809 C e 95e C eliqüefeita por 50 minutos. E então a temperatura foi aumentada para 110Q Cpara inativar a enzima. A mistura foi esfriada e adicionada enzima de sacari-ficação (200 U/grama de amido), então sacarificada a 609 C por 9 horas. Osresultados medidos mostram que o valor de glicose (valor de DE (equivalen-te de dextrose), com referência à porcentagem de glicose em massas secas,conforme calculado com base em todos os açúcares de redução no líquidode sacarificação são considerados glicose) do líquido de sacarificação é 95,5e a concentração de dextrose no líquido de sacarificação é 26,8%.

2. Produção de glicerina através da fermentação do líquido desacarificação

(1) Cepas: Hansenula Arabitolgens Fang 2.887 comercialmentedisponível do Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences

(2) Meios:

Meio de "declivef (g/L): glicose (preparada com o líquido de sa-carificação da etapa 1), 200; pasta fluida de amido, 2; e ágar, 20.

Meio de semente (g/L): glicose (preparada com o líquido de sa-carificação da etapa 1), 100; pasta fluida de amido, 2; e uréia, 2.

Meio de fermentação (g/L): glicose (preparada com o líquido desacarificação da etapa 1), 268; pasta fluida de amido, 2, e uréia, 4.

Os meios acima são todos ajustados para um pH de 4-4,5 e es-terilizados a 110e C por 15 minutos.

(3) Cultura de semente

Hansenula Arabitolgens Fang 2.887 são inoculadas em meio de"declive" e culturadas a 35° C por 24 horas para ativar a cepa.

As Hansenula Arabitolgens Fang 2.887 ativadas são inoculadasem meio de semente contendo líquido de sacarificação de amido natural, esementes primárias são obtidas através de cultura em um frasco de agitação(um frasco cônico de 500 mL, com uma carga de líquido de 100 mL) a 30° C,200 rpm (um raio de rotação de 25 mm) por 20 horas.

Segundas sementes são obtidas através de inoculação das se-mentes primárias em meio de semente contendo líquido de sacarificação deamido natural e cultura em uma velocidade de mistura de 300-500 rpm a 35°C por 5-7 horas, com uma quantidade de aeração de 0,2-0,5 wm.

(4) Fermentação

Fermentação foi realizada através de qualquer um dos três pro-cedimentos que seguem A, B, C:

A. Fermentação foi realizada com um fermentador de 5 L e se-mentes primárias. As sementes primárias foram inoculadas em um meio defermentação em uma razão em volume de 10% e fermentadas no fermenta-dor de 5 L, aerando ar em uma quantidade de 2,0 wm durante as primeiras60 horas e gás nitrogênio em uma quantidade de 0,5 wm após 60 horas emuma velocidade de mistura de 500 rpm e cultura por 70 horas. A temperaturade fermentação permaneceu em 30° C durante o processo de fermentação.

O rendimento da glicerina foi medido e os resultados mostraram que a glice-rina estava em uma concentração de 140 g/L, os açúcares restantes esta-vam em uma concentração de 4,8 g/L e o rendimento de glicerina versusglicose era 53% em massa.

B. Fermentação foi realizada com um fermentador de 500 L esementes secundárias. As sementes secundárias foram inoculadas em ummeio de fermentação em um razão em volume de 10% e fermentadas nofermentador de 500 L, aerando ar em uma quantidade de 0,8 wm durante asprimeiras 60 horas e gás nitrogênio em uma quantidade de 0,2 wm após 60horas em uma velocidade de mistura de 300 rpm e cultura por 72 horas. Atemperatura de fermentação permaneceu em 339 C durante todo o processode fermentação. O rendimento da glicerina foi medido e os resultados mos-traram que a glicerina estava em uma concentração de 146 g/L, os açúcaresrestantes estavam em uma concentração de 4,7 g/L e o rendimento de glice-rina versus glicose era 55,7% em massa.

C. Fermentação foi realizada com um fermentador de 75000L esementes secundárias. As sementes secundárias foram inoculadas em ummeio de fermentação em uma razão em volume de 10% e fermentadas nofermentador de 75000L, aerando ar em uma quantidade de 0,5 wm duranteas primeiras 60 horas e gás nitrogênio em uma quantidade de 0,2 vvm após60 horas em uma velocidade de mistura de 300 rpm e cultura por 72 horas.

A temperatura de fermentação permaneceu a 35° C durante todo o processode fermentação. O rendimento da glicerina foi medido e os resultados mos-traram que a glicerina estava em uma concentração de 142 g/L, os açúcaresrestantes estavam em uma concentração de 4 g/L e o rendimento da gliceri-na versus glicose era 54,1% em massa.

(1) O caldo de fermentação de glicerina da etapa anterior foi fil-trado para remover células de Hansenula Arabitolgens Fang 2.887. As célu-las filtradas foram usadas diretamente na batelada seguinte de fermentaçãode glicerina sob as mesmas condições de fermentação com a primeira bate-lada. O filtrado resultante é usado para fermentar 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol.

(2) Cepas: Clostridium pasteurianum 1.208, comercialmente dis-ponível do Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences.

Tabela 1. Os ingredientes de meio de semente e de fermentação

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Tabela 2. Ingredientes de Solução de Elemento Traço

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O pH do meio acima é 6,8-8,0.

(4) Cultura de semente: Clostridium pasteurianum 1.208 foi ino-culada no meio de semente formulado com o caldo de fermentação de glice-rina da etapa 2 (um frasco cônico de 500 mL com uma carga de líquido de100 mL) e cultura a 30° C em uma velocidade de agitador de 150 rpm (comum raio de rotação de 25 mm). Sementes primárias foram obtidas através deuma cultura aeróbica por 18 horas; e então o caldo de fermentação nestefrasco de agitação foi inoculado em uma razão em volume de 2% para ofermentador carregado como meio de semente e culturado em uma veloci-dade de mistura de 60-150 rpm a 30° C com uma quantidade de aeração de0,2-0,5 vvm por 5-10 horas para se obter sementes secundárias.

(5) Cultura de Fermentação:

Fermentacao foi realizada através de qualquer um dos métodosC, D e E que seguem, e métodos AeB foram tomados como controle:

A. Um fermentador de 5L foi usado, a temperatura de cultura era37° Ceo valor do pH foi ajustado para 6,8 com KOH. O líquido semente foiinoculado no meio de fermentação (com uma concentração de glicerina de50 g/L) preparado com o caldo de fermentação de glicerina da etapa 2, ne-nhum caldo de fermentação de glicerina foi alimentado durante o processode fermentação. O fermentador foi girado em uma velocidade de 150 rpm.Gás nitrogênio foi aerado a 0,5 vvm. A fermentação foi realizada por 30 ho-ras, e as concentrações de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol foram 24 g/L e1,7 g/L, respectivamente;

B. Um fermentador de 5 L, temperatura de cultura era de 37° C eo valor do pH foi ajustado para 6,8 com KOH. O líquido semente foi inocula-do no meio de fermentação (com uma concentração de glicerina de 80 g/L)preparado com o caldo de fermentação de glicerina da etapa 2, nenhum cal-do dé fermentação de glicerina foi alimentado durante o processo de fermen-tação. O fermentador foi girado em uma velocidade de 150 rpm. O ar foi ae-rado a 0,5 wm. A fermentação foi realizada por 30 horas, e as concentra-ções de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol foram 38 g/L e 5,6 g/L, respectiva-mente;

C. Um fermentador de 5L foi usado, a temperatura da cultura erade 37° Ceo valor do pH foi ajustado para 6,8 com KOH. O líquido sementefoi inoculado no meio de fermentação (com uma concentração de glicerinade 30 g/L) preparado com o caldo de fermentação de glicerina da etapa 2,com adição do caldo de fermentação de glicerina em um modo semicontínuodurante o processo de fermentação e controle da sua taxa de fluxo parapermanecer a concentração de glicerina em 30 g/L. O fermentador foi giradoem uma velocidade de 150 rpm. Gás nitrogênio foi primeiro aerado e ar ae-rado após 32 horas, ambos a 0,5 wm. Nutrição foi suplementada duas ve-zes a 16 horas e 30 horas durante o processo de fermentação (cada umaadicionando pó de levedura e (NH4)2SO4 em uma quantidade de 0,8 g de póde levedura/L de meio e 1 g de (NH4)2SO4ZL de meio, respectivamente). Afermentação estava completa após 64 horas. O caldo de fermentação foicoletado, filtrado para remover as cepas e o licor filtrado resultante foi cole-tado para dessalinizar, destilar e retificar sob vácuo para obter produtos, 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol. Os resultados medidos mostraram que no tér-mino da fermentação, as concentrações de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiolno caldo de fermentação eram 50 g/L e 18 g/L, respectivamente, e o rendi-mento de 1,3-propanodiol era 54% em mol (a razão de mois de 1,3-propanodiol para os mois da glicerina consumida), o rendimento dos dióistotais era 70% em mol (a razão dos mois de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiolpara os mois da glicerina consumida).

D. Um fermentador de 500 L foi usado. 50 L de líquido de se-mente secundária foram inoculados no meio de fermentação (com uma con-centração de glicerina de 30 g/L) preparado com o caldo de fermentação deglicerina da etapa 2, com o fermentador girando em uma velocidade de 60rpm e usando uma quantidade de aeração de 0,3 vvm. O caldo de fermenta-ção de glicerina foi adicionado em um modo semicontínuo durante o proces-so de fermentação e controle de sua taxa de fluxo para permanecer a con-centração de glicerina em 30 g/L. As outras condições eram as mesmas queaquelas para uma fermentação semicontínua de 5 L. No término da fermen-tação, as concentrações de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol no caldo defermentação eram 54 g/L e 22 g/L, respectivamente, o rendimento de 1,3-propanodiol foi 55% em mol, e o rendimento dos dióis totais era 73% emmol.

E. Um fermentador de 5000 L foi usado. 500 L de líquido semen-te secundária foram inoculados no meio de fermentação inicial (com umaconcentração de glicerina de 30 g/L) preparado com o caldo de fermentaçãode glicerina descrito acima. O caldo de fermentação de glicerina foi adicio-nado em modo semicontínuo durante o processo de fermentação e controlede sua taxa de fluxo para permanecer a concentração de glicerina em 30g/L. As condições de fermentação eram as mesmas que aquelas para umfermentador de 500 L. No término da fermentação, as concentrações de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol no caldo de fermentação eram 57,6 g/L e 27,3g/L, respectivamente, e o rendimento do 1,3-propanodiol era 56% em mol, orendimento dos dióis total era 76,2% em mol.

APLICAÇÕES INDUSTRIAIS

Os experimentos mostram que os métodos da presente inven-ção podem significantemente aumentar a concentração e rendimento de gli-cerina e 1,3-propanodiol durante a produção de 1,3-propanodiol através deum método de fermentação de duas etapas, enquanto obtendo-se 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol com alto valor adicionado, deste modo aumen-tando eficazmente a razão de disponibilidade de matérias-primas e reduzin-do os custos de produção. O presente método obtém bons efeitos quandoaplicado a fermentador de 5L, 500 L e 5000 L, onde a concentração de glice-rina obtida através de fermentação é até 158-179 g/L, a concentração de1,3-propanodiol obtido através de fermentação é até 66-72 g/L, e a concen-tração de 2,3-butanodiol é até 16-30,4 g/L.

Claims

1. Método para produção de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol apartir de materiais de amido natural, incluindo as etapas que seguem:1) Candida krusei ou Hansenula Arabitolgens Fang são inocula-das em um meio de fermentação com o líquido de sacarificação dos amidosnaturais como uma fonte de carbono; culturadas em uma condição aeróbicaaté que a taxa de consumo de glicose seja significantemente reduzida, eentão fermentada anaerobicamente para uma concentração de glicose de 4a 0 g/L; o caldo de fermentação é coletado e filtrado para remover as célulasde levedura no caldo de fermentação, e o filtrado resultante é caldo de fer-mentação de glicerina;2) Klebsiella, Clostridium butyricum ou Clostridium pasteurianumsão inoculadas em um meio de fermentação no qual o caldo de fermentaçãode glicerina obtido a partir da etapa 1) serve como uma fonte de carbono; asbactérias são fermentadas anaerobicamente por 30-32 horas, e então fer-mentadas aerobicamente quando a taxa de produção de 1,3-propanodioldiminuiu obviamente, e a fermentação foi parada quando a concentração deglicerina é reduzida para um nível abaixo de 10 g/L, e finalmente 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol são obtidos.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que as célulasde levedura removidas através de filtragem na etapa 1) são recuperadasdiretamente para a batelada de fermentação seguinte.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a Candidakrusei ou Hansenula Arabitolgens Fang é de uma semente primária ou se-cundária; a semente primária é preparada de acordo com os procedimentosque seguem: a Candida krusei ou HansenuIaArabitoIgens Fang é inoculadaem um meio de semente contendo o líquido de sacarificação de amidos na-turais, e culturada em um frasco de agitação com uma carga de líquido de 1/5 do volume do frasco a 30-35° C por 20 horas, usando um raio de rotaçãode 25 mm e uma velocidade de rotação de a partir de 200 a 250 rpm; e asemente secundária é preparada como segue: uma semente primária é ino-culada em um meio de semente com o líquido de sacarificação de amidosnaturais como uma fonte de carbono no fermentador, e culturada a 30-359 Cpor 5-7 horas, usando uma velocidade de mistura de a partir de 300 a 500rpm e uma quantidade de aeração de 0,2-0,5 vvm.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o meio defermentação com o líquido de sacarificação de amidos naturais como umafonte de carbono tem um pH de 4-5, e contém ainda pasta fluida de amido euréia; o teor do líquido de sacarificação de amidos naturais é calculado combase em que todos os açúcares de redução no líquido de sacarificação deamidos naturais são considerados como glicose, e é até 260-350 g/L de gli-cose no meio; o teor de pasta fluida de amido é 2-3 g/L; e o teor de uréia é-2,5-4 g/L.

5. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o meio desemente contendo o líquido de sacarificação de amidos naturais tem um pHde 4-5, e contém ainda pasta fluida de amido e uréia; o teor do líquido desacarificação de amidos naturais é calculado com base em que todos os a-çúcares de redução no líquido de sacarificação de amidos naturais são con-siderados como glicose, e é até 80-100 g/L de glicose no meio; o teor dapasta fluida de amido é 2-3 g/L; e o teor de uréia é 2-3 g/L.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, em que Klebsiella,Clostridium butyricum ou Ciostridium pasteurianum são de uma sementeprimária ou secundária; a semente primária é preparada de acordo com osprocedimentos que seguem: Klebsiella, Clostridium butyricum ou Clostridiumpasteurianum são inoculadas em um meio de semente formulado a partir docaldo de fermentação de glicerina obtido na etapa 1) e culturadas são condi-ções aeróbicas em um frasco de agitação com uma carga de líquido de 1/5do volume de frasco a 30-33° C por 18-20 horas, usando um raio de rotaçãode 25 mm e uma velocidade de rotação de 130 a 150 rpm, para se obter asemente primária; e a semente secundária é preparada como segue: umasemente primária é inoculada em um meio de semente formulado a partir docaldo de fermentação de glicerina obtido na etapa 1) em um fermentador, eculturada a 30-33° C por 5-10 horas, usando uma velocidade de mistura de-60 a 150 rpm e uma quantidade de aeração de 0,2-0,5 wm, para se obter asemente secundária.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o meio defermentação com o caldo de fermentação de glicerina obtido na etapa 1)como uma fonte de carbono tem um pH de 6,8-8,0, o teor do caldo de fer-mentação de glicerina é até 20-80 g/L de glicerina no meio conforme calcu-lado em uma base de glicerina; o meio de fermentação com o caldo de fer-mentação de glicerina como uma fonte de carbono contém ainda 2,225-3,5g/L de K2HPO4^H2O, 2,0-4,0 g/L de (NH4)2SO4, 0,65-1,2 g/L de KH2PO4, - 0,1-0,2 g/L de MgS04*7H20, 1-1,5 g/L de pó de levedura, uma solução deelementos traço de 2-3 mL/L e 0,1 mL/L de agente antiespumante. A soluçãode elementos traço consiste em 70 mg/L de ZnCI2, 100 mg/L de MnCI2 *- 4H20, 60 mg/L de H3BO3, 200 mg/L de CoCI2 *6H20, 25 mg/L de NiCI2 *- 6H20, 27,64 m/L de NiCI2 * H2O, 35 mg/L de Na2MoO4 ' 2H20, 20 mg/L deCuCI2 * H2O, 29,28 mg/L de CuSO4 * 5H20 e 0,9 ml/L de HCI concentrado.

8. Método de acordo com a reivindicação 6, em que o meio defermentação com o caldo de fermentação de glicerina obtido na etapa 1)como uma fonte de carbono tem um pH de 6,8-8,0, o teor do caldo de fer-mentação de glicerina é até 20-25 g/L de glicerina no meio conforme calcu-lado em uma base em glicerina; o meio de fermentação com o caldo de fer-mentação de glicerina como uma fonte de carbono contém ainda 4,45,5,6g/L de K2HPO4 3H20, 2,0-4,0 g/L de (NH4)2SO4, 1,3-2,6 g/L de KH2PO4, 0,Ι-Ο,2 g/L de MgSO4 7H20, 1,0-2,0 g/L de pó de levedura, 1,0-2,0 g/L de Ca-CO3 e uma solução de elementos traço de 2-3 mL/L: a solução de elementostraço consiste em 70 mg/L de ZnCI2, 100 mg/L de MnCI2 * 4H20, 60 mg/L deH3BO3, 200 mg/L de CoCI2 ' 6H20, 25 mg/L de NiCI2 *6H20, 27,64 m/L deNiCI2 * H2O, 35 mg/L de Na2MoO4 * 2H20, 20 mg/L de CuCI2 'H2O, 29,28mg/L de CuSO4 * 5H20 e 0,9 ml/L de HCI concentrado.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8,em que os amidos naturais na etapa 1) são amido de batata doce, amido demilho ou tapioca; e o valor de DE do líquido de sacarificação de amidos na-turais é 90-110.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o líquidode sacarificação de amidos naturais é preparado de acordo com os procedi-mentos que seguem: formulação dos amidos naturais e água em uma razãode massa de 1:1800-2000 para se obter uma emulsão de amido; adição deuma enzima de liquefação duas vezes a 80-85° C e 90-95° C1 respectiva-mente, cada uma de 3-5 U/grama de amido natural; liqüefazer por 40-50 mi-nutos; então aumentar a temperatura para 110-120° C para inativar a enzi-ma; resfriar; adicionar uma enzima de sacarificação de 150-200 U/grama deamido; sacarificar a 50-60° C por 8-12 horas; e obter um líquido de sacarifi-cação de amidos naturais tendo um valor DE de 100-110.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 -8,em que a temperatura de fermentação no processo de fermentação da etapa-1) é 30-35° C; a condição aeróbica na etapa 1) é aerar ar durante o processode fermentação, com uma quantidade de aeração de 0,5-2 vvm; e a condi-ção anaeróbica na etapa 1) é aerar gás nitrogênio durante o processo defermentação, com uma quantidade de aeração de 0,2-2 vvm.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8,em que o caldo de fermentação de glicerina obtido na etapa 1) é adicionadoem de modo semicontínuo durante o processo de fermentação da etapa 2),permitindo que o teor de glicerina no meio seja mantido em 20-80 g/L.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8,em que nutrição é suplementada duas vezes com o processo de fermenta-ção da etapa 2), cada uma adicionando pó de levedura de (NH4)2SO4 emuma quantidade de 0,8 g de pó de levedura/L de meio e 1 g de (NH4)2SO4ZLde meio, respectivamente.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8,em que o pH é 6,8-8,0 e a temperatura de fermentação é 30-37Q C durante oprocesso de fermentação da etapa 2); a condição anaeróbica na etapa 2) éaerar gás nitrogênio durante o processo de fermentação, com uma quanti-dade de aeração de 0,1-0,5 wm; e a condição aeróbica na etapa 2) é aerarar durante o processo de fermentação, com uma quantidade de aeração de-0,1-0,5 wm.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8,incluindo ainda uma etapa de purificação de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol, isto é, coleta do caldo de fermentação, filtragem para remover asbactérias e acúmulo do filtrado para dessalinizar, destilar e retificar sob vá-cuo.