BRPI0613714B1 - A method for producing 1,3-propanediol and 2,3-butanediol from natural starch materials - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE 1,3-PROPANODIOL E 2,3-BUTANODIOL A PARTIR DE MATERIAIS DE AMIDO NATURAL".

CAMPO DA TÉCNICA

[001] A presente invenção refere-se a um método para produção de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol, particularmente um método para produção de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol a partir de materiais de amido natural.

ANTECEDENTES DAS TÉCNICAS

[002] 1,3-Propanodiol (PDO), como uma matéria-prima importante para a indústria química, pode ser usado como um solvente orgânico em tintas, corantes e impressão, revestimentos, lubrificantes ou indústria anticongelante e similares. 1,3-Propanodiol pode agir como um monômero na síntese de poliésteres e poliuretano, especialmente para polimerizar com ácido tereftálico para formar politrimetileno tereftalato (PTT), que exibe melhores desempenhos comparado com aqueles polímeros sintetizados a partir de 1,2-propanodiol, butanodiol e monômero de glicol. Agora, dezenas de milhões de toneladas de polietileno te-reftalatos (PET) são consumidas a cada ano em todo o mundo. PTT é comparável a PET em estabilidade química, biodegradabilidade e similar, no entanto mais excelente em resistência à poluição, dureza, resi-liência elástica, resistência à UV e similar. Ainda, PTT também tem outras vantagens, tal como resistência à abrasão ou capacidade de desgaste, baixa absorção de água, eletricidade estática baixa, etc, capaz de competir com náilon no mercado de tapete. Ele pode ser também usado em tecidos não-tecidos, plásticos de engenharia, roupas, enfeites domésticos, materiais de revestimento, tecidos e similar. PTT foi avaliado como um dos seis melhores petroquímicos novos nos USA em 1998, e considerado como o produto atual ao invés de PET.

[003] O excelente desempenho e potencial de mercado de PTT foram reconhecidos 50 anos atrás. É muito difícil produzir PTT em uma escala industrial grande devido à dificuldade técnica grande e custo na produção de sua matéria-prima, 1,3-propanodiol. Até agora, apenas duas corporações internacionais, Dupont e Shell, produzem 1,3-propanodiol para uso próprio para sua síntese de PTT a partir de oxido de etileno ou propileno como matérias-primas através de uma via de síntese química convencional. Existe várias deficiências nos processos de síntese química, incluindo subprodutos excessivos: seletividade pobre; requer condições de operação especiais, tal como temperatura e pressão altas; enormes custos com equipamento; suas matérias-primas sendo fontes não-reproduzíveis; e oxido de etileno e o produto intermediário acroleína produzidos em uma outra via sendo matérias perigosas combustíveis, explosivas ou virulentas, respectivamente. O processo de fermentação para produção de 1,3-propanodiol foi focado nos últimos anos devido à alta seletividade e condições de operação suaves.

[004] Como um subproduto na fermentação de 1,3-propanodiol, 2,3-butanodiol também é uma matéria-prima importante na indústria química. Ele é um líquido incolor e insípido, e pode ser usado como combustíveis, e usado para preparar polímeros, tintas, perfumes, anticongelantes, fumigantes, umidificantes, agente de amaciamento, plas-tificante, explosivos, veículos quirais para agentes farmacêuticos e similar. Também, 2,3-butanodiol pode servir como uma matéria-prima muito valiosa na indústria química para sintetizar outros agentes químicos, por exemplo, desidratar 2,3-butanodiol para formar metil etil ce-tona com aplicações bastante extensivas, e desidratar mais para formar 1,3-butadieno. 2,3-Butanodiol pode ser polimerizado para produzir estireno através de reação Diels-Alder. 2,3-Butanodiol e metil etil ceto-na podem condensar e então se submeter a uma reação de hidroge-nação para formar octano, que pode ser usado para produzir materiais de alta qualidade para aviação. 2,3-Butanodiol reage com ácido acéti-co para formar diacetato de 2,3-butanodiol, que pode ser adicionado a manteigas para melhorar o sabor. Em geral, 2,3-butanodiol, não entanto, não deve ser separado e purificado como um produto devido a seus baixos rendimentos na fermentação de 1,3-propanodiol.

[005] Atualmente, existe dois métodos principais para produção de 1,3-propanodiol, métodos químico e biológico. Comparado com métodos de síntese química, métodos de fermentação de micróbio para produção de 1,3-propanodiol possuem muitas vantagens significantes, incluindo condições de produção suaves, boa seletividade, menos subprodutos, facilidade de separar e purificar, sem poluição ambiental, etc, e mais e mais atenção deve ser dada a tais métodos.

[006] Atualmente, existe vários cursos para produção de 1,3-propanodiol através de métodos biológicos: [007] 1. Bactérias intestinais são utilizadas para converter glicerol em 1,3-propanodiol sob condições anaeróbicas (vide US5254467, EP0373230 A1).

[008] 2. Fermentação anaeróbica com bactérias tal como Klebsiella sob condições anaeróbicas para produzir 1,3-propanodiol (Ruch e outros, Regulation of glycerol catabolism in Klebsiella aerogenes, J. Bacteriol. 1974, 119(1):50-56; Streekstra e outros, Overflow metabolismo during anaeric growth of Klebsiella pneumoniae NCT418 on glycerol and dihydroxyacetone in chemostat culture. Arch. Microbiol., 1987, 147:268-275; Zeng e outros, Pathways analysis of glycerol fermentation by Klebsiella pneumonia: Regulation of reducing equivalent balance and product formation. Enzyme Microbiol Technol. 1993, 15:770-779).

[009] 3. Klebsiella são utilizadas sob condições microaeróbicas para produzir 1,3-propanodiol através de fermentação (vide Wang Jianfang, etc, Study on microaerobic conversion of glycerin to 1,3- propanodiol by Klebsiella pneumoniae, Modem Chemical Industry, 2001, 21 (5):28-31; e Publicação de Patente Chinesa No. CN1348007, A method for microaerobic fermentive production of 1,3-propanodiol, expedida para Xiu Zhilong, etc).

[0010] 4. Klebsiella são utilizadas sob condições anaeróbicas para produzir 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol através de fermentação (Bi-ebl e outros, Fermentation of glycerol to 1,3-propanodiol and 2,3-butanodiol. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1998, 50:24-29).

[0011] 5. 1,3-Propanodiol e 2,3-butanodiol são produzidos a partir de glicerol através de um método de fermentação microbiano de dois estágios (Liu Dehua, etc., Pedido de Patente No. 200410037692.3).

[0012] 6. Um método para produção de 1,3-propanodiol através de uma fermentação microbiana de duas etapas (Xiu Zhilong, etc., Patente Chinesa No. ZL01138769.6).

[0013] Os métodos 1-3 acima utilizam todos glicerol como substratos para produzir um produto único 1,3-propanodiol, e a concentração de 1,3-propanodiol no caldo é muito baixa, então seus custos de produção são muito altos. O método 4 propõe uma fermentação para produzir simultaneamente 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol, no entanto, seu nível de fermentação é muito baixo devido às limitações de condições técnicas. O método 5 adota um novo processo usando condições anaeróbicas em estágio inicial e um condição aeróbica em estádio final, o que aumenta significantemente a concentração dos produtos de fermentação 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol, e, até certo ponto, diminui os custos de produção; mas os custos de produção são ainda relativamente altos porque este método também utiliza glicerol como substratos. O método 6 provê um método de fermentação de duas etapas para produzir 1,3-propanodiol a partir de matérias-primas tal como amidos, que, teoricamente, pode diminuir acentuadamente os custo de produção; mas, devido às limitações de condições técnicas, a concen- tração de glicerol é apenas 49,9 g/L com um rendimento de apenas 39,1% em mol, e a concentração de 1,3-propanodiol é também muito baixa e apenas 13,18 g/L com um rendimento de 22,8% em mol e suas modalidades mais preferidas.

DESCRiCÂO DA INVENÇÃO

[0014] Um objetivo da presente invenção é prover um método para produção de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol a partir de materiais de amido natural.

[0015] Um método para produção de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol a partir de materiais de amido natural provido pela invenção inclui as etapas que seguem: [0016] 1) C and ida krusei ou Hansenuia arabitolgens fang são ino-culadas em um meio de fermentação com o líquido de sacarificação de amidos naturais como uma fonte de carbono, usando uma condição aeróbica em estágio inicial e uma condição anaeróbica em estágio posterior, isto é, as células de levedura são cultivadas na condição aeróbica até a taxa de consumo de glicose ser significantemente reduzida, e então fermentadas anaerobicamente para uma concentração de glicose de a partir de 5 a 10 g/L. O caldo de fermentação é coletado e filtrado para remover as células de levedura no caldo de fermentação, e o filtrado resultante é caldo de fermentação de glicerina.

[0017] 2) Klebsielia, Ciostridium butyrícum ou Ciostridium pasteuri-anum são inoculadas em um meio de fermentação onde o caldo de fermentação de glicerina obtido da etapa 1) serve como uma fonte de carbono. As bactérias são fermentadas anaerobiamente por 30-32 horas, e então fermentadas aeróbica mente quando a taxa de produção de 1,3-propanodiol diminuiu obviamente, e a fermentação foi parada quando a concentração de glicerina é reduzida para um nível abaixo de 10 g/L, e finalmente 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol são obtidos.

[0018] Onde as células de levedura removidas através de filtragem na etapa 1) podem ser recuperadas diretamente para a próxima bate-lada de fermentação; a recuperação de célula pode diminuir o período de cultura da semente da próxima batelada.

[0019] As Candida krusei ou Hansenula arabitolgens fans são de uma semente primária ou secundária; a semente primária é preparada de acordo com os procedimentos que seguem: as Candida krusei ou Hansenula arabitolgens fans são inoculadas em um meio de semente contendo o líquido de sacarificação de amidos naturais, e cultivadas em um frasco de agitação com uma carga de líquido de 1/5 do volume do frasco a 30-35° C por 18-20 horas, usando um raio de giro de 25 mm e uma velocidade de rotação de a partir de 200 a 250 rpm. A semente secundária é preparada como segue: a semente primária é ino-culada em um meio de semente com o líquido de sacarificação de amidos naturais como uma fonte de carbono em um fermentador, e cultura a 30-35° C por 5-7 horas, usando uma velocidade de mistura de a partir de 300 a 500 rpm e uma quantidade de aeração de 0,2-0,5 vvm.

[0020] O meio de fermentação com o líquido de sacarificação de amidos naturais como uma fonte de carbono tem um pH de 4-5, e contém ainda pasta fluida de amido e uréia; o teor do líquido de sacarificação de amidos naturais é calculado com base em que todos os açúcares de redução no líquido de sacarificação de amidos naturais são considerados como glicose, e é até 260-350 g/L de glicose no meio; o teor de pasta fluida de amido é 2-3 g/L; e o teor de uréia é 2,5-4 g/L.

[0021] O meio de semente contendo o líquido de sacarificação de amidos naturais tem um pH de 4-5, e contém ainda pasta fluida de amido e uréia; o teor do líquido de sacarificação de amidos naturais é calculado com base em que todos os açúcares de redução no líquido de sacarificação de amidos naturais são considerados como glicose, e é até 80-100 g/L de glicose no meio; o teor da pasta fluida de amido é 2-3 g/L; e o teor de uréia é 2-3 g/L.

[0022] Os amidos naturais na etapa 1) podem ser materiais de amidos tal como amido de batata doce, amido de milho ou tapioca; e o valor de DE do líquido de sacarificação de amidos naturais é 90-110.

[0023] O líquido de sacarificação de amidos naturais pode ser preparado de acordo com os procedimentos que seguem: formulação de uma emulsão de amido a partir de amidos naturais e água em uma razão de massa de 1:1800-2000; adição de uma enzima de liquefação duas vezes a 80-85° C e 90-95° C, respectivamente, e para cada vez usar 3-5 U/grama de amido natural; liquefazer por 40-50 minutos; então aumentar a temperatura para 110-120° C para inativar a enzima; resfriar; adicionar uma enzima de sacarificação de 150-200 U/grama de amido; sacarificar a 50-60° C por 8-12 horas; e obter um líquido de sacarificação de amidos naturais tendo um valor DE de 90-110.

[0024] Klebsiella, Clostridium butyricum ou Clostridium pasteuria-num são de uma semente primária ou secundária; a semente primária é preparada de acordo com os procedimentos que seguem: Klebsiella, Clostridium butyricum ou Clostridium pasteurianum são inoculadas em um meio de semente formulado a partir do caldo de fermentação de glicerina obtido na etapa 1) e cultivadas sob condições aeróbicas em um frasco de agitação com uma carga de líquido de 1/5 do volume de frasco a 30-33° C por 18-20 horas, usando um raio de rotação de 25 mm e uma velocidade de rotação de 130 a 150 rpm. A semente secundária é preparada como segue: uma semente primária é inoculada em um meio de semente formulado a partir do caldo de fermentação de glicerina na etapa 1) em um fermentador e cultivada a 30-33° C por 5-10 horas, usando uma velocidade de mistura de 60 a 150 rpm e uma quantidade de aeração de 0,2-0,5 wm.

[0025] O meio de fermentação com o caldo de fermentação de glicerina obtido na etapa 1) como uma fonte de carbono tem um pH de 6.8- 8,0, o teor do caldo de fermentação de glicerina é até 20-80 g/L de glicerina no meio conforme calculado em uma base de glicerina; o meio de fermentação com o caldo de fermentação de glicerina como uma fonte de carbono contém ainda 2,225-3,5 g/L de K2HP04 3H20, 2.0- 4,0 g/L (NH4)2S04, 0,65-1,2 g/L de KH2P04, 0,1-0,2 g/L de MgS04 7H20, 1-1,5 g/L de pó de levedura, uma solução de elementos traço de 2-3 mL/L e 0,1 mL/L de agente antiespumante. A solução de elementos traço consiste em 70 mg/L de ZnCI2, 100 mg/L de MnCI2 4H20, 60 mg/L de H3B03, 200 mg/L de CoCI2 6H20, 25 mg/L de NiCI2 6H20, 27,64 m/L de NiCI2 H20, 35 mg/L de Na2Mo04.2H20, 20 mg/L de CuCI2 . H20, 29,28 mg/L de CuS04.5H20 e 0,9 ml/L de HCI concentrado.

[0026] O meio de fermentação com o caldo de fermentação de glicerina obtido na etapa 1) como uma fonte de carbono tem um pH de 6.8- 8,0, o teor do caldo de fermentação de glicerina é até 20 g/L de glicerina no meio conforme calculado em uma base de glicerina; o meio de fermentação com o caldo de fermentação de glicerina como uma fonte de carbono contém ainda 4,45-5,6 g/L de K2HP04 3H20, 2.0- 4,0 g/L (NH4)2S04, 1,3-2,6 g/L de KH2P04, 0,1-0,2 g/L de MgS04 7H20, 1,0-2,0 g/L de pó de levedura, 1,0-2,0 g/L de CaC03 e uma solução de elementos traço de 2-3 ml/L. A solução de elementos traço consiste em 70 mg/L de ZnCI2, 100 mg/L de MnCI2 4H20, 60 mg/L de H3B03, 200 mg/L de CoCI2 6H20, 25 mg/L de NiCI2 6H20, 27,64 mg/L de NiCI2 H20, 35 mg/L de Na2Mo04 2H20, 20 mg/L de CuCI2 H20, 29,28 mg/L de CuS04 5H20 e 0,9 mL/L de HCI concentrado.

[0027] A temperatura de fermentação no processo de fermentação da etapa 1) é 30-35° C.

[0028] A condição aeróbica na etapa 1) é aerar o ar durante o processo de fermentação, com uma quantidade de aeração de 0,5-2 wm (L/L/min, uma razão do volume de aeração de ar em um fermentador por minuto para o volume do caldo de fermentação no fermentador); a condição anaeróbica na etapa 1) é aerar gás nitrogênio durante o processo de fermentação, com uma quantidade de aeração de 0,2-2 vvm (L/L/min, uma razão do volume de gás nitrogênio aerando para um fermentador por minuto para o volume do caldo de fermentação no fermentador), [0029] O caldo de fermentação de glicerina obtido na etapa 1) é adicionado semicontínuo (fed-batch) durante o processo de fermentação da etapa 2), permitindo que o teor de glicerina no meio seja mantido em 20-80 g/L.

[0030] Fonte de nitrogênio é suplementada duas vezes durante o processo de fermentação da etapa 2), cada uma adicionando pó de levedura e (NH4)2SG4 em uma quantidade de 0,8 g de pó de levedu-ra/L de meio e 1 g de (NH^SCVL de meio, respectivamente.

[0031] O pH é 6,8-8,0 e a temperatura de fermentação é 30-37° C durante o processo de fermentação da etapa 2).

[0032] O método inclui ainda uma etapa de purificação de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol, isto é, coleta do caldo de fermentação, filtragem para remover a massa bacteriana e acúmulo do filtrado para permitir que ele dessalinize, destile e retifique sob vácuo.

AS MODALIDADES PREFERIDAS PARA IMFLEMENTAR A INVENÇÃO

[0033] Os métodos experimentais que seguem são todos métodos convencionais a menos que de outro modo especificado.

[0034] Exemplo 1. Produção de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol a partir de amidos de milho naturais [0035] 1. A liquefação e sacarificação dos materiais de amido natural.

[0036] 1475 g de amidos de milho naturais e 2722 L de água foram formulados como emulsão de amido. A emulsão foi aquecida, adi- cionada enzima de liquefação (5 U/grama de amido) duas vezes a 80° C e 95° C e liquefeita por 50 minutos. E então a temperatura foi aumentada para 110° C para inativar a enzima. A mistura foi esfriada e adicionada enzima de sacarificação (200 U/grama de amido), então sacarificada a 60° C por 9 horas. Os resultados medidos mostram que o valor de glicose (valor de DE (equivalente de dextrose), com referência à porcentagem de glicose em massas secas, conforme calculado com base em que todos os açúcares de redução em líquido de sacarificação são considerados como glicoses) do líquido de sacarificação é 103,46 e a concentração de dextrose no líquido de sacarificação é 31,55%.

[0037] 2. Produção de glicerina através da fermentação do líquido de sacarificação [0038] (1) Cepas: Candida krusei 2.1048 (comercialmente disponível do Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences) [0039] (2) Meios: [0040] Meio "Slant" (g/L): glicose (preparada com o líquido de sacarificação da etapa 1), 200; pasta fluida de amido, 3, uréia, 3; e ágar, 20.

[0041] Meio de semente: glicose (preparada com o líquido de sacarificação da etapa 1), 100; pasta fluida de amido, 3, e uréia, 3.

[0042] Meio de fermentação: glicose (preparada com o líquido de sacarificação da etapa 1), 315; pasta fluida de amido, 3, e uréia, 2,5.

[0043] Os meios acima são todos ajustados para um pH de 4-4,5 e esterilizados a 110° C por 15 minutos.

[0044] (3) Cultura de semente [0045] Candida krusei 2.1048 são inoculadas em meio "slant" e cultivadas a 35° C por 24 horas para ativar a cepa.

[0046] As Candida krusei 2.1048 ativadas são inoculadas em meio de semente contendo líquido de sacarificação de amido natural, e se- mentes primárias são obtidas através de cultura em um frasco de agitação (um frasco cônico de 500 mL, com uma carga de líquido de 100 ml_) a 35° C, 200 rpm (um raio de rotação de 25 mm) por 20 horas.

[0047] Segundas sementes são obtidas através de inoculação das sementes primárias em meio de semente contendo líquido de sacarifi-cação de amido natural e cultura em uma velocidade de mistura de 300-500 rpm a 35° C por 5-7 horas, com uma quantidade de aeração de 0,2-0,5 vvm.

[0048] (4) Fermentação [0049] Fermentação foi realizada através de qualquer um dos três procedimentos que seguem: [0050] A. Fermentação foi realizada com um fermentador de 5 L e sementes primárias. As sementes primárias foram inoculadas em um meio de fermentação em uma razão de volume de 10% e a fermentação foi realizada no fermentador de 5 L, aerando ar em uma quantidade de 2,0 wm durante as primeiras 60 horas e gás nitrogênio em uma quantidade de 0,5 vvm após 60 horas em uma velocidade de mistura de 500 rpm e cultura por 70 horas. A temperatura de fermentação permaneceu em 30° C durante o processo de fermentação. O rendimento da glicerina foi medido e os resultados mostraram que a glicerina estava em uma concentração de 165 g/L, os açúcares restantes estavam em uma concentração de 5 g/L e o rendimento de glicerina versus glicose era 52,4% em massa.

[0051] B. Fermentação foi realizada com um fermentador de 500 L e sementes secundárias. As sementes secundárias foram inoculadas em um meio de fermentação em um razão de volume de 10% e a fermentação foi realizada no fermentador de 500 L, aerando ar em uma quantidade de 0,8 wm durante as primeiras 60 horas e gás nitrogênio em uma quantidade de 0,2 wm após 60 horas em uma velocidade de mistura de 300 rpm e cultura por 72 horas. A temperatura de fermen- tação permaneceu em 33° C durante todo o processo de fermentação. O rendimento da glicerina foi medido e os resultados mostraram que a glicerina estava em uma concentração de 179 g/L, os açúcares restantes estavam em uma concentração de 5 g/L e o rendimento de glicerina versus glicose era 55,38% em massa;

[0052] C. Fermentação foi realizada com um fermentador de 75000L e sementes secundárias. As sementes secundárias foram ino-culadas em um meio de fermentação em uma razão em volume de 10% e a fermentação foi realizada no fermentador de 75000L, aeração de ar em uma quantidade de 0,5 wm durante as primeiras 60 horas e gás nitrogênio em uma quantidade de 0,2 wm após 60 horas em uma velocidade de mistura de 300 rpm e cultura por 72 horas. A temperatura de fermentação permaneceu a 35° C durante todo o processo de fermentação. O rendimento da glicerina foi medido e os resultados mostraram que a glicerina estava em uma concentração de 258 g/L, os açúcares restantes estavam em uma concentração de 5 g/L e o rendimento da glicerina versus glicose era 53,3% em massa.

[0053] 3. Produção de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol através de fermentação do caldo de fermentação de glicerina [0054] (1) O caldo de fermentação de glicerina da etapa anterior foi filtrado para remover Candida krusei 2.1048. As células filtradas foram usadas diretamente na batelada seguinte de fermentação de glicerina sob as mesmas condições de fermentação com a primeira batelada. O filtrado resultante é usado para fermentar 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol.

[0055] (2) Cepas: Klebsiella pneumoniae 1.1734 (comercialmente disponível do Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences) [0056] (3) Os ingredientes de meio de semente e de fermentação para 1,3-propanodiol são listados na Tabela 1 abaixo, onde as composições da solução de elementos traço são listadas na Tabela 2 abaixo.

Tabela 1. Os ingredientes de meio de semente e de fermentação Tabela 2. Ingredientes de Solução de Elemento Traço [0057] O pH do meio acima é 6,8-8,0.

[0058] (4) Cultura de semente: Klebsiella pneumoniae 1.1734 foi inoculada no meio de semente formulado com o caldo de fermentação de glicerina da etapa 2 (um frasco cônico de 500 mL com uma carga de líquido de 100 mL) e cultura a 30° C em uma velocidade de agitador de 150 rpm (com um raio de rotação de 25 mm). Sementes primárias foram obtidas através de uma cultura aeróbica por 18 horas; e então o caldo de fermentação neste frasco de agitação foi inoculado em uma razão de volume de 2% para o fermentador carregado como meio de semente e cultivado em uma velocidade de mistura de 60-150 rpm a 30° C com uma quantidade de aeração de 0,2-0,5 wm por 5-10 horas para se obter sementes secundárias.

[0059] (5) Cultura de Fermentação: [0060] Fermentação foi realizada através de qualquer um dos métodos C, D e E que seguem, e métodos A e B foram tomados como controle: [0061] A. Um fermentador de 5L foi usado, a temperatura de cultura era 37o Ceo valor do pH foi ajustado para 6,8 com KOH. O líquido semente foi inoculado no meio de fermentação (com uma concentração de glicerina de 56 g/L) preparado com o caldo de fermentação de glicerina da etapa 2, nenhum caldo de fermentação de glicerina foi alimentado durante o processo de fermentação. O fermentador foi girado em uma velocidade de 150 rpm. Gás nitrogênio foi aerado a 0,5 wm. A fermentação foi realizada por 30 horas e as concentrações de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol foram 21 g/L e 2 g/L, respectivamente.

[0062] B. Um fermentador de 5 L, temperatura de cultura era de 37° Ceo valor do pH foi ajustado para 6,8 com KOH. O líquido semente foi inoculado no meio de fermentação (com uma concentração de glicerina de 80 g/L) preparado com o caldo de fermentação de glicerina da etapa 2, nenhum caldo de fermentação de glicerina foi alimentado durante o processo de fermentação. O fermentador foi girado em uma velocidade de 150 rpm. O ar foi aerado a 0,5 wm. A fermentação foi realizada por 30 horas e as concentrações de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol foram 35 g/L e 6,6 g/L, respectivamente.

[0063] C. Um fermentador de 5L foi usado, a temperatura da cultura era de 37° Ceo valor do pH foi ajustado para 6,8 com KOH. O líquido semente foi inoculado no meio de fermentação (com uma concentração de glicerina de 30 g/L) preparado com o caldo de fermentação de glicerina da etapa 2, com adição do caldo de fermentação de glicerina em um modo em semicontínuo durante o processo de fermentação e controle da taxa de fluxo para permanecer a concentração de glicerina em 30 g/L. O fermentador foi girado em uma velocidade de 150 rpm. Gás nitrogênio foi primeiro aerado e ar aerado após 32 horas, ambos a 0,5 vvm. Nutrição foi suplementada duas vezes a 16 horas e 30 horas durante o processo de fermentação (cada uma adicionando pó de levedura e (NH4)2S04 em uma quantidade de 0,8 g de pó de levedura/L de meio e 1 g de (NH^SCVL de meio, respectivamente). A fermentação estava completa após 64 horas. O caldo de fermentação foi coletado, filtrado para remover as cepas e o licor filtrado resultante foi coletado para dessalinizar, destilar e retificar sob vácuo para obter produtos, 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol. Os resultados medidos mostraram que no término da fermentação, as concentrações de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol no caldo de fermentação eram 70 g/L e 16 g/L, respectivamente, e o rendimento de 1,3-propanodiol era 51% em mol (a razão de rnols de 1,3-propanodiol para os rnols da glicerina consumida), o rendimento dos dióis totais era 71,85% em mol (a razão dos rnols de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol para os rnols da glicerina consumida).

[0064] D. Um fermentador de 500 L foi usado. 50 L de líquido semente secundária foram inoculados no meio de fermentação (com uma concentração de glicerina de 30 g/L) preparado com o caldo de fermentação de glicerina da etapa 2, com a rotação do fermentador em uma velocidade de 60 rpm e usando uma quantidade de aeração de 0,3 vvm. O caldo de fermentação de glicerina foi adicionado em um modo semicontínuo durante o processo de fermentação e controle de sua taxa de fluxo para permanecer a concentração de glicerina em 30 g/L. As outras condições eram as mesmas que aquelas para uma fermentação semicontínua de alimentação de 5 L. No término da fermentação, as concentrações de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol no caldo de fermentação eram 72 g/L e 25,4 g/L, respectivamente, o rendimento de 1,3-propanodiol foi 55,38% em mol, e o rendimento dos dióis totais era 71,85% em mol.

[0065] E. Um fermentador de 5000 L foi usado. 500 L de líquido semente secundária foram inoculados no meio de fermentação inicial (com uma concentração de glicerina de 30 g/L) preparado com o caldo de fermentação de glicerina descrito acima. O caldo de fermentação de glicerina foi adicionado em modo semicontínuo durante o processo de fermentação e controle de sua taxa de fluxo para permanecer a concentração de glicerina em 30 g/L. As condições de fermentação eram as mesmas que aquelas para um fermentador de 500 L. No término da fermentação, as concentrações de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol no caldo de fermentação eram 66,6 g/L e 30,4 g/L, respectivamente, e o rendimento do 1,3-propanodiol era 59,1% em mol, o rendimento dos dióis total era 83,2% em mol.

[0066] 4. Reciclagem de célula: as células resultantes foram filtradas do caldo de fermentação de glicerina para uso direto na próxima batelada de fermentação de glicerina. E as condições de fermentação eram todas as mesmas que a primeira batelada. A viabilidade celular substancialmente permaneceu sem modificação por pelo menos 10 reciclagens, e a concentração de glicerina permaneceu estável.

[0067] Exemplo 2. Produção de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol a partir de amidos de batata doce naturais [0068] 1. A liquefação e sacarificação dos materiais de amido na- tural [0069] 1475 g de amidos de batata doce naturais e 2722 L de água foram formulados como emulsão de amido. A emulsão foi aquecida, adicionada enzima de liquefação (5 U/grama de amido) duas vezes a 80° C e 95° C e liquefeita por 50 minutos. E então a temperatura foi aumentada para 110° C para inativar a enzima. A mistura foi esfriada e adicionada enzima de sacarificação (200 U/grama de amido), então sacarificada a 60° C por 9 horas. Os resultados medidos mostram que o valor de glicose (valor de DE (equivalente de dextrose), com referência à porcentagem de glicose em massas secas, conforme calculado com base em todos os açúcares de redução no líquido de sacarificação são considerados glicose) do líquido de sacarificação é 95,5 e a concentração de dextrose no líquido de sacarificação é 26,8%.

[0070] 2. Produção de glicerina através da fermentação do líquido de sacarificação [0071] (1) Cepas: Hansenula Arabitolgens Fang 2.887 comercialmente disponível do Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences [0072] (2) Meios: [0073] Meio de "declivef (g/L): glicose (preparada com o líquido de sacarificação da etapa 1), 200; pasta fluida de amido, 2; e ágar, 20.

[0074] Meio de semente (g/L): glicose (preparada com o líquido de sacarificação da etapa 1), 100; pasta fluida de amido, 2; e uréia, 2.

[0075] Meio de fermentação (g/L): glicose (preparada com o líquido de sacarificação da etapa 1), 268; pasta fluida de amido, 2, e uréia, 4.

[0076] Os meios acima são todos ajustados para um pH de 4-4,5 e esterilizados a 110° C por 15 minutos.

[0077] (3) Cultura de semente [0078] Hansenula Arabitolgens Fang 2.887 são inoculadas em meio de "declive" e cultivadas a 35° C por 24 horas para ativar a cepa.

[0079] As Hansenula Arabitolgens Fang 2.887 ativadas são inocu-ladas em meio de semente contendo líquido de sacarificação de amido natural, e sementes primárias são obtidas através de cultura em um frasco de agitação (um frasco cônico de 500 ml_, com uma carga de líquido de 100 ml_) a 30° C, 200 rpm (um raio de rotação de 25 mm) por 20 horas.

[0080] Segundas sementes são obtidas através de inoculação das sementes primárias em meio de semente contendo líquido de sacarificação de amido natural e cultura em uma velocidade de mistura de 300-500 rpm a 35° C por 5-7 horas, com uma quantidade de aeração de 0,2-0,5 vvm.

[0081] (4) Fermentação [0082] Fermentação foi realizada através de qualquer um dos três procedimentos que seguem A, B, C: [0083] A. Fermentação foi realizada com um fermentador de 5 L e sementes primárias. As sementes primárias foram inoculadas em um meio de fermentação em uma razão em volume de 10% e fermentadas no fermentador de 5 L, aerando ar em uma quantidade de 2,0 wm durante as primeiras 60 horas e gás nitrogênio em uma quantidade de 0,5 wm após 60 horas em uma velocidade de mistura de 500 rpm e cultura por 70 horas. A temperatura de fermentação permaneceu em 30° C durante o processo de fermentação. O rendimento da glicerina foi medido e os resultados mostraram que a glicerina estava em uma concentração de 140 g/L, os açúcares restantes estavam em uma concentração de 4,8 g/L e o rendimento de glicerina versus glicose era 53% em massa.

[0084] B. Fermentação foi realizada com um fermentador de 500 L e sementes secundárias. As sementes secundárias foram inoculadas em um meio de fermentação em um razão em volume de 10% e fermentadas no fermentador de 500 L, aerando ar em uma quantidade de 0,8 wm durante as primeiras 60 horas e gás nitrogênio em uma quantidade de 0,2 wm após 60 horas em uma velocidade de mistura de 300 rpm e cultura por 72 horas. A temperatura de fermentação permaneceu em 33° C durante todo o processo de fermentação. O rendimento da glicerina foi medido e os resultados mostraram que a glicerina estava em uma concentração de 146 g/L, os açúcares restantes estavam em uma concentração de 4,7 g/L e o rendimento de glicerina versus glicose era 55,7% em massa.

[0085] C. Fermentação foi realizada com um fermentador de 75000L e sementes secundárias. As sementes secundárias foram ino-culadas em um meio de fermentação em uma razão em volume de 10% e fermentadas no fermentador de 75000L, aerando ar em uma quantidade de 0,5 wm durante as primeiras 60 horas e gás nitrogênio em uma quantidade de 0,2 wm após 60 horas em uma velocidade de mistura de 300 rpm e cultura por 72 horas. A temperatura de fermentação permaneceu a 35° C durante todo o processo de fermentação. O rendimento da glicerina foi medido e os resultados mostraram que a glicerina estava em uma concentração de 142 g/L, os açúcares restantes estavam em uma concentração de 4 g/L e o rendimento da glicerina versus glicose era 54,1% em massa.

[0086] 3. Produção de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol através de fermentação do caldo de fermentação de glicerina [0087] (1) O caldo de fermentação de glicerina da etapa anterior foi filtrado para remover células de Hansenula Arabitolgens Fang 2.887. As células filtradas foram usadas diretamente na batelada seguinte de fermentação de glicerina sob as mesmas condições de fermentação com a primeira batelada. O filtrado resultante é usado para fermentar 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol.

[0088] (2) Cepas: Clostridium pasteurianum 1.208, comercialmente disponível do Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences.

[0089] (3) Os ingredientes de meio de semente e de fermentação para 1,3-propanodiol são listados na Tabela 1 abaixo» onde as composições da solução de elementos traço são listadas na Tabela 2 abaixo. Tabela 1. Os ingredientes de meio de semente e de fermentação Tabela 2. Ingredientes de Solução de Elemento Traço [0090] Ο ρΗ do meio acima é 6,8-8,0.

[0091] (4) Cultura de semente: Clostridium pasteurianum 1.208 foi inoculada no meio de semente formulado com o caldo de fermentação de glicerina da etapa 2 (um frasco cônico de 500 mL com uma carga de líquido de 100 mL) e cultura a 30° C em uma velocidade de agitador de 150 rpm (com um raio de rotação de 25 mm). Sementes primárias foram obtidas através de uma cultura aeróbica por 18 horas; e então o caldo de fermentação neste frasco de agitação foi inoculado em uma razão em volume de 2% para o fermentador carregado como meio de semente e cultivado em uma velocidade de mistura de 60-150 rpm a 30° C com uma quantidade de aeração de 0,2-0,5 wm por 5-10 horas para se obter sementes secundárias.

[0092] (5) Cultura de Fermentação: [0093] Fermentacao foi realizada através de qualquer um dos métodos C, D e E que seguem, e métodos A e B foram tomados como controle: [0094] A. Um fermentador de 5L foi usado, a temperatura de cultura era 37° Ceo valor do pH foi ajustado para 6,8 com KOH. O líquido semente foi inoculado no meio de fermentação (com uma concentração de glicerina de 50 g/L) preparado com o caldo de fermentação de glicerina da etapa 2, nenhum caldo de fermentação de glicerina foi alimentado durante o processo de fermentação. O fermentador foi girado em uma velocidade de 150 rpm. Gás nitrogênio foi aerado a 0,5 wm. A fermentação foi realizada por 30 horas, e as concentrações de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol foram 24 g/L e 1,7 g/L, respectivamente;

[0095] B. Um fermentador de 5 L, temperatura de cultura era de 37° Ceo valor do pH foi ajustado para 6,8 com KOH. O líquido semente foi inoculado no meio de fermentação (com uma concentração de glicerina de 80 g/L) preparado com o caldo de fermentação de gli- cerina da etapa 2, nenhum caldo de fermentação de glicerina foi alimentado durante o processo de fermentação. O fermentador foi girado em uma velocidade de 150 rpm. O ar foi aerado a 0,5 wm. A fermentação foi realizada por 30 horas, e as concentrações de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol foram 38 g/L e 5,6 g/L, respectivamente;

[0096] C. Um fermentador de 5L foi usado, a temperatura da cultura era de 37° Ceo valor do pH foi ajustado para 6,8 com KOH. O líquido semente foi inoculado no meio de fermentação (com uma concentração de glicerina de 30 g/L) preparado com o caldo de fermentação de glicerina da etapa 2, com adição do caldo de fermentação de glicerina em um modo semicontínuo durante o processo de fermentação e controle da sua taxa de fluxo para permanecer a concentração de glicerina em 30 g/L. O fermentador foi girado em uma velocidade de 150 rpm. Gás nitrogênio foi primeiro aerado e ar aerado após 32 horas, ambos a 0,5 wm. Nutrição foi suplementada duas vezes a 16 horas e 30 horas durante o processo de fermentação (cada uma adicionando pó de levedura e (NH4)2S04 em uma quantidade de 0,8 g de pó de levedura/L de meio e 1 g de (NH4)2S04/L de meio, respectivamente). A fermentação estava completa após 64 horas. O caldo de fermentação foi coletado, filtrado para remover as cepas e o licor filtrado resultante foi coletado para dessalinizar, destilar e retificar sob vácuo para obter produtos, 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol. Os resultados medidos mostraram que no término da fermentação, as concentrações de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol no caldo de fermentação eram 50 g/L e 18 g/L, respectivamente, e o rendimento de 1,3-propanodiol era 54% em mol (a razão de rnols de 1,3-propanodiol para os rnols da glicerina consumida), o rendimento dos dióis totais era 70% em mol (a razão dos rnols de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol para os rnols da glicerina consumida).

[0097] D. Um fermentador de 500 L foi usado. 50 L de líquido de semente secundária foram inoculados no meio de fermentação (com uma concentração de glicerina de 30 g/L) preparado com o caldo de fermentação de glicerina da etapa 2, com o fermentador girando em uma velocidade de 60 rpm e usando uma quantidade de aeração de 0,3 vvm. O caldo de fermentação de glicerina foi adicionado em um modo semicontínuo durante o processo de fermentação e controle de sua taxa de fluxo para permanecer a concentração de glicerina em 30 g/L. As outras condições eram as mesmas que aquelas para uma fermentação semicontínua de 5 L. No término da fermentação, as concentrações de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol no caldo de fermentação eram 54 g/L e 22 g/L, respectivamente, o rendimento de 1,3-propanodiol foi 55% em mol, e o rendimento dos dióis totais era 73% em mol.

[0098] E. Um fermentador de 5000 L foi usado. 500 L de líquido semente secundária foram inoculados no meio de fermentação inicial (com uma concentração de glicerina de 30 g/L) preparado com o caldo de fermentação de glicerina descrito acima. O caldo de fermentação de glicerina foi adicionado em modo semicontínuo durante o processo de fermentação e controle de sua taxa de fluxo para permanecer a concentração de glicerina em 30 g/L. As condições de fermentação eram as mesmas que aquelas para um fermentador de 500 L. No término da fermentação, as concentrações de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol no caldo de fermentação eram 57,6 g/L e 27,3 g/L, respectivamente, e o rendimento do 1,3-propanodiol era 56% em mol, o rendimento dos dióis total era 76,2% em mol.

[0099] 4. Reciclagem de célula: as células resultantes foram filtradas do caldo de fermentação de glicerina para uso direto na próxima batelada de fermentação de glicerina. E as condições de fermentação eram todas as mesmas que a primeira batelada. A viabilidade celular substancialmente permaneceu sem modificação por pelo menos 10 reciclagens, e a concentração de glicerina permaneceu estável. APLICAÇÕES INDUSTRIAIS

[00100] Os experimentos mostram que os métodos da presente invenção podem significantemente aumentar a concentração e rendimento de glicerina e 1,3-propanodiol durante a produção de 1,3-propanodiol através de um método de fermentação de duas etapas, enquanto obtendo-se 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol com alto valor adicionado, deste modo aumentando eficazmente a razão de disponibilidade de matérias-primas e reduzindo os custos de produção. O presente método obtém bons efeitos quando aplicado a fermenta dor de 5L, 500 L e 5000 L, onde a concentração de glicerina obtida através de fermentação é até 158-179 g/L, a concentração de 1,3-propanodiol obtido através de fermentação é até 66-72 g/L, e a concentração de 2,3-butanodiol é até 16-30,4 g/L.

REIVINDICAÇÕES

Claims (15)

1. Método para produção de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol a partir de materiais de amido natural caracterizado pelo fato de aue compreende as etapas que seguem: 1) inocular Candida krusei ou Hansenula Arabitolgens Fang em um meio de fermentação com o líquido de sacarificação dos amidos naturais como uma fonte de carbono; cultivar células de levedura em uma condição aeróbica até que a taxa de consumo de glicose seja significantemente reduzida, e então fermentar anaerobicamente as células de levedura para obter uma concentração de glicose de 5 a 10 g/L; coletar e filtrar o caldo de fermentação para remover as células de levedura no caldo de fermentação, o filtrado resultante sendo caldo de fermentação de glicerina; 2) inocular Klebsiella, Cfostridium butyricum ou Clostridium pasteurianum em um meio de fermentação no qual o caldo de fermentação de glicerina obtido a partir da etapa 1) serve como uma fonte de carbono; fermentar anaerobicamente as bactérias por 30-32 horas, então fermentar aerobicamente as bactérias quando a taxa de produção de 1,3-propanodiol diminuiu obviamente, parar a fermentação quando a concentração de glicerina é reduzida para um nível abaixo de 10 g/L, e finalmente obter 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de aue as células de levedura removidas através de filtragem na etapa 1) são recuperadas direta mente para a batei ada de fermentação seguinte.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de aue a Candida krusei ou Hansenula Arabitolgens Fang é de uma semente primária ou secundária; a semente primária é preparada de acordo com os procedimentos que seguem: inocular a Candida krusei ou Hansenula Arabitolgens Fang em um meio de semente contendo o líquido de sacarificação de amidos naturais, e cultivar as células de levedura em um frasco de agitação com uma carga de líquido de 1/5 do volume do frasco a 30-35° C por 20 horas, usando um raio de rotação de 25 mm e uma velocidade de rotação de a partir de 200 a 250 rpm; e a semente secundária é preparada como segue: ino-cular uma semente primária em um meio de semente com o líquido de sacarificação de amidos naturais como uma fonte de carbono no fer-mentador, e cultivar as células de levedura a 30-35° C por 5-7 horas, usando uma velocidade de mistura de a partir de 300 a 500 rpm e uma quantidade de aeração de 0,2-0,5 vvm.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio de fermentação com o líquido de sacarificação de amidos naturais como uma fonte de carbono tem um pH de 4-5, e contém ainda pasta fluida de amido e uréia; o teor do líquido de sacarificação de amidos naturais é calculado com base em que todos os açúcares de redução no líquido de sacarificação de amidos naturais são considerados como glicose, e é até 260-350 g/L de glicose no meio; o teor de pasta fluida de amido é 2-3 g/L; e o teor de uréia é 2,5-4 g/L

5. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o meio de semente contendo o líquido de sacarificação de amidos naturais tem um pH de 4-5, e contém ainda pasta fluida de amido e uréia; o teor do líquido de sacarificação de amidos naturais é calculado com base em que todos os açúcares de redução no líquido de sacarificação de amidos naturais são considerados como glicose, e é até 80-100 g/L de glicose no meio; o teor da pasta fluida de amido é 2-3 g/L; e o teor de uréia é 2-3 g/L.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que Kfebsiella, Ciostridium butyricum ou Clostridium pas-teurianum são de uma semente primária ou secundária; a semente primária é preparada de acordo com os procedimentos que seguem: inocular Klebsieiia, Clostrídium butyricum ou Clostridium pasteurianum em um meio de semente formulado a partir do caldo de fermentação de glicerina obtido na etapa 1) e cultivar as bactérias em condições aeróbicas em um frasco de agitação com uma carga de líquido de 1/5 do volume de frasco a 30-33° C por 18-20 horas, usando um raio de rotação de 25 mm e uma velocidade de rotação de 130 a 150 rpm, para se obter a semente primária; e a semente secundária é preparada como segue: inocular uma semente primária em um meio de semente formulado a partir do caldo de fermentação de glicerina obtido na etapa 1) em um fermentador, e cultivar as bactérias a 30-33° C por 5-10 horas, usando uma velocidade de mistura de 60 a 150 rpm e uma quantidade de aeraçao de 0,2-0,5 vvm, para se obter a semente secundária.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de aue o meio de fermentação com o caldo de fermentação de glicerina obtido na etapa 1) como uma fonte de carbono tem um pH de 6,8-8,0, o teor do caldo de fermentação de glicerina é até 20-80 g/L de glicerina no meio conforme calculado em uma base de glicerina; o meio de fermentação com o caldo de fermentação de glicerina como uma fonte de carbono contém ainda 2,225-3,5 g/L de K2HP04*3H20, 2,0-4,0 g/L de (NH4)2S04, 0,65-1,2 g/L de KH2P04, 0,1-0,2 g/L de MgS04*7H20, 1-1,5 g/L de pó de levedura, uma solução de elementos traço de 2-3 mL/L e 0,1 mL/L de agente antiespumante, A solução de elementos traço consiste em 70 mg/L de ZnCI2, 100 mg/L de MnCI2 * 4H20, 60 mg/L de H3BO3, 200 mg/L de CoCI2 *6H20, 25 mg/L de NiCI2 * 6H20, 27,64 m/L de NiCI2 * H20, 35 mg/L de Na2Mo04 * 2H20, 20 mg/L de CuCI2 * H20, 29,28 mg/L de CuS04 ' 5H20 e 0,9 ml/L de HCI concentrado.

8. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o meio de fermentação com o caldo de fermentação de glicerina obtido na etapa 1) como uma fonte de carbono tem um pH de 6,8-8,0, o teor do caldo de fermentação de glicerina é até 20-25 g/L de glicerina no meio conforme calculado em uma base em glicerina; o meio de fermentação com o caldo de fermentação de glicerina como uma fonte de carbono contém ainda 4,45,5,6 g/L de K2HP04 3H20, 2,0-4,0 g/L de (NH4)2S04, 1,3-2,6 g/L de KH2P04, 0,1-0,2 g/L de MgS04 7H20, 1,0-2,0 g/L de pó de levedura, 1,0-2,0 g/L de CaC03e uma solução de elementos traço de 2-3 mL/L: a solução de elementos traço consiste em 70 mg/L de ZnCI2, 100 mg/L de MnCI2 * 4H20, 60 mg/L de H3B03, 200 mg/L de CoCI2 * 6H20, 25 mg/L de NiCI2 ’6H20, 27,64 m/L de NiCI2' H20, 35 mg/L de Na2Mo04 ’ 2H20, 20 mg/L de CuCI2 'H20, 29,28 mg/L de CuS04 * 5H20 e 0,9 ml/L de HCI concentrado.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, caracterizado pelo fato de aue os amidos naturais na etapa 1) são amido de batata doce, amido de milho ou tapioca; e o valor de DE do líquido de saca ri fi cação de amidos naturais é 90-110.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o líquido de saca ri fi cação de amidos naturais é preparado de acordo com os procedimentos que seguem: formulação dos amidos naturais e água em uma razão de massa de 1:1800-2000 para se obter uma emulsão de amido; adição de uma enzima de liquefaçâo duas vezes a 80-85° Ce 90-95° C, respectiva mente, cada uma de 3-5 U/grama de amido natural; liquefazer por 40-50 minutos; então aumentar a temperatura para 110-120° C para inativar a enzima; resfriar; adicionar uma enzima de sacarificação de 150-200 U/grama de amido; sacarificar a 50-60° C por 8-12 horas; e obter um líquido de sacarificação de amidos naturais tendo um valor DE de 100-110.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1-8, caracterizado pelo fato de que a temperatura de fermentação no processo de fermentação da etapa 1) é 30-35° C; a condição aeró-bica na etapa 1) é aerar ar durante o processo de fermentação, com uma quantidade de aeração de 0,5-2 wm; e a condição anaeróbica na etapa 1) é aerar gás nitrogênio durante o processo de fermentação, com uma quantidade de aeração de 0,2-2 wm.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, caracterizado oelo fato de aue o caldo de fermentação de glicerina obtido na etapa 1) é adicionado em de modo semicontínuo durante o processo de fermentação da etapa 2), permitindo que o teor de glicerina no meio seja mantido em 20-80 g/L.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, caracterizado oelo fato de aue nutrição é suplementada duas vezes com o processo de fermentação da etapa 2), cada uma adicionando pó de levedura de (NH4)2S04 em uma quantidade de 0,8 g de pó de levedura/L de meio e 1 g de (NhU^SCVL de meio, respectivamente.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, caracterizado pelo fato de que o pH é 6,8-8,0 e a temperatura de fermentação é 30-37° C durante o processo de fermentação da etapa 2); a condição anaeróbica na etapa 2) é aerar gás nitrogênio durante o processo de fermentação, com uma quantidade de aeração de 0,1-0,5 wm; e a condição aeróbica na etapa 2) é aerar ar durante o processo de fermentação, com uma quantidade de aeração de 0,1-0,5 wm,

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, caracterizado pelo fato de que ainda inclui uma etapa de purificação de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol, isto é, coletar o caldo de fermentação, filtrar para remover as bactérias e acumular o filtrado para dessalinizar, destilar e retificar sob vácuo.