CN116790428A - 一种庆笙红球菌syf及其在降解有机污染物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种庆笙红球菌SYF及其在降解有机污染物中的应用，本发明庆笙红球菌SYF对于脂肪族酯类污染物特别是醋酸叔丁酯具有高效的降解能力，可以把污染物降解为CO₂、H₂O等无害物质，因而在工业废气废水的生物净化中具有广阔的应用前景。庆笙红球菌SYF能将醋酸叔丁酯完全降解为无机物和细胞生物质，对于浓度低于260mg/L的醋酸叔丁酯去除率达到100％。

Description

一种庆笙红球菌SYF及其在降解有机污染物中的应用

(一)技术领域

本发明涉及一种庆笙红球菌(Rhodococcus qingshengii)SYF及其在降解醋酸叔丁酯等有机污染物中的应用。

(二)背景技术

醋酸叔丁酯是一种有机化合物，属于脂肪族酯类。醋酸叔丁酯又称乙酸叔丁酯，其合成一般采用叔丁醇与乙酸或乙酸酐反应而得，为无色透明有酯类气味的容易燃烧的液体。其具有挥发性，与水不溶，能与醇、醚混合，易溶于乙酸等一些有机溶剂。乙酸叔丁酯是硝化纤维的优良溶剂,也是汽油的防震添加剂,用途较为广泛。

醋酸叔丁酯虽属低毒类，但由于其具有高挥发性和高脂溶性，可在体内蓄积并产生神经毒性，而被认为高危险性毒物。醋酸叔丁酯是一种可导致神经纤维变性的神经类毒物。急性吸入高浓度的醋酸叔丁酯鼻出血、声音嘶哑、咳嗽、胸闷、头痛、头晕等症状，眼及皮肤接触有刺激性，反复长期接触可能引发皮疹。经口摄入可出现恶心、呕吐、支气管和胃肠道刺激症状，严重者发生中枢性呼吸抑制；人摄入约50g可致死。

因此研究环境中醋酸叔丁酯的高效降解对人类健康很有必要，通过文献检索，未发现有关庆笙红球菌以醋酸叔丁酯为唯一碳源来实现高效降解的报道。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种庆笙红球菌SYF及其在降解有机污染物中的应用，庆笙红球菌SYF能以醋酸叔丁酯等脂肪族酯类污染物为唯一碳源实现降解，特别是具有高效、较强的醋酸叔丁酯降解能力，并且生长环境温和，易扩大培养。该降解菌的发现对于工业废水废气中脂肪族酯类污染物的高效净化具有重要意义。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种新的醋酸叔丁酯降解菌——庆笙红球菌(Rhodococcusqingshengii)SYF，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2023年05月10日，保藏编号：CCTCC NO:M 2023726，地址：中国，武汉，武汉大学，430072。

本发明庆笙红球菌SYF的基本特征为：菌落呈橙色、圆盘状、无芽孢、无鞭毛；边缘整齐，不透光，易挑取，菌苔沿划线生长；好氧，革兰氏染色阳性。

本发明还提供一种庆笙红球菌SYF在降解有机污染物中的应用，具体所述的应用是将庆笙红球菌SYF经扩大培养获得的菌液或菌液离心获得的静息细胞加入pH＝4-9、含有机污染物的无机盐培养液中，在10-35℃、100-200rpm条件下进行培养，实现有机污染物的降解。

进一步，所述有机污染物包括醋酸叔丁酯、乙酸乙酯。

进一步，所述无机盐培养液中，静息细胞或菌液加入量以菌体干重计为20-100mg/L，优选50mg/L。

进一步，所述无机盐培养液中有机污染物的初始浓度为52-260mg/L，优选104mg/L。

进一步，所述无机盐培养液组成为：K₂HPO₄·3H₂O 0.942g/L、KH₂PO₄ 0.234g/L、NaNO₃ 1.7g/L、NH₄Cl 0.98g/L、MgCl₂·6H₂O 0.2033g/L、CaCl₂·2H₂O 0.011g/L、FeCl₃0.0162g/L，微量元素母液5ml/L，溶剂为去离子水，pH 7.0；其中微量元素母液组成：CuSO₄·5H₂O 0.02g/L、FeSO₄·7H₂O 1.0g/L、MnSO₄·4H₂O 0.1g/L、NaMoO₄·2H₂O 0.02g/L、CoCl₂·6H₂O 0.02g/L、H₃BO₃ 0.014g/L、ZnSO₄·7H₂O 0.10g/L，溶剂为去离子水。

进一步，所述培养条件为15℃、160rpm。

进一步，所述庆笙红球菌SYF的静息细胞按如下步骤制备：

(1)斜面培养：

将庆笙红球菌SYF接种于斜面LB固体培养基，30℃培养24～36h，获得斜面菌体，所述LB固体培养基终浓度组成为：NaCl 10g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L，琼脂18～20g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。

(2)扩大培养

用接种环挑取步骤(1)获得的斜面菌体接种至LB液体培养基中，15℃，160rpm培养24～36h，获得OD₆₀₀＝0.1～0.2的菌液，离心，收集湿菌体，无机盐培养液洗涤，获得庆笙红球菌SYF静息细胞；所述LB液体培养基终浓度组成为：NaCl 10g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

本发明提供的庆笙红球菌SYF取自污水厂污泥，对于脂肪族酯类污染物特别是醋酸叔丁酯具有高效的降解能力，可以较为完全地把污染物转化为CO₂、H₂O等无害物质，因而在工业废气废水的生物净化中具有广阔的应用前景。

本发明所述的庆笙红球菌SYF能将醋酸叔丁酯完全降解为无机物(CO₂、H₂O)和细胞生物质，实现完全矿化，且对于260mg/L以内的醋酸叔丁酯的去除率高达100％。

(四)附图说明

图1为菌株SYF在LB培养基上菌落形态照片。

图2为菌株SYF的透射电子显微镜照片。

图3为菌株SYF的系统发育树图。

图4为菌株SYF对于不同浓度醋酸叔丁酯的降解曲线。

图5为菌株SYF在不同pH下对于104mg/L醋酸叔丁酯的降解曲线。

图6为菌株SYF在11h时不同pH下对于104mg/L醋酸叔丁酯的降解率。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

所述无机盐培养液组成为：K₂HPO₄·3H₂O 0.942g/L、KH₂PO₄ 0.234g/L、NaNO₃1.7g/L、NH₄Cl 0.98g/L、MgCl₂·6H₂O 0.2033g/L、CaCl₂·2H₂O 0.011g/L、FeCl₃ 0.0162g/L，微量元素母液5ml/L，溶剂为去离子水，pH 7.0；其中微量元素母液组成：CuSO₄·5H₂O0.02g/L、FeSO₄·7H₂O 1.0g/L、MnSO₄·4H₂O 0.1g/L、NaMoO₄·2H₂O 0.02g/L、CoCl₂·6H₂O 0.02g/L、H₃BO₃ 0.014g/L、ZnSO₄·7H₂O 0.10g/L，溶剂为去离子水。

所述无机盐培养基是在无机盐培养液的基础上添加琼脂18～20g/L。

所述LB固体培养基终浓度组成为：NaCl 10g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L，琼脂18～20g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。

所述LB液体培养基终浓度组成为：NaCl 10g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。

实施例1：菌株SYF的分离、纯化及其鉴定。

1、菌株SYF的分离及纯化。

菌株SYF是从取自某城市污水处理厂的活性污泥中驯化、分离得到的一株革兰氏阳性菌，具体步骤如下：

在300mL摇瓶中加入50mL无机盐培养液，并加入10mL活性污泥和终浓度30mg/L的醋酸叔丁酯，摇瓶密封，15℃、160rpm进行富集培养，采用实施例3方法检测醋酸叔丁酯浓度，待醋酸叔丁酯浓度为初始的50％时，从中取出5mL富集液于50mL新鲜无机盐培养液中，加入相同量的醋酸叔丁酯(终浓度30mg/L)，重复上述富集过程5次后，将最后一次富集液用无菌水梯度稀释10^-6，涂布LB固体培养基，15℃培养36h，选择单菌落画线接种至LB固体培养基平板，15℃培养24h进行分离平板画线纯化。将得到的备选菌接种至以终浓度30mg/L的醋酸叔丁酯作为唯一的碳源及能源的无机盐液体培养基，15℃培养36h后，采用实施例3方法检测醋酸叔丁酯浓度，选择醋酸叔丁酯降解率最高的培养液对应的备选菌，记为菌株SYF。

2、菌株SYF的鉴定

(1)菌株SYF特征：将菌株SYF接种至LB固体培养基，15℃培养24h，菌落照片见图1。菌落呈橙色、圆盘状；边缘整齐，不透光，易挑取。透射电镜(图2)下观察该菌体的形态为椭圆杆菌，无鞭毛，大小为700×2600nm，革兰氏染色阳性。

(2)16S rRNA序列分析

采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取和纯化菌株SYF的DNA，4℃保存。用细菌的通用引物对纯化的DNA进行PCR扩增，引物分别为27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT)，PCR反应程序设定为94℃预变性4min，然后94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，循环30个周期，最后72℃修复延伸10min。将PCR产物纯化回收后进行测序(浙江天科高新技术发展有限公司(原浙江省微生物研究所))，16S rRNA测序结果(SEQ ID NO.1所示)上传至NCBI，获得登录号OQ954759，同时将该序列同NCBI数据库中的基因序列进行Blast对比。发现其属于Rhodococcus属，与Rhodococcuscerastii strain C5、Rhodococcusbaikonurensis strain A1-22和Rhodococcuserythropolis strain ATCC4277具有99％的同源性。从结果中选取10株Pseudomonas具有代表性的菌株，以16S rRNA基因序列同源性为基础，采用MEGA7.0软件构建系统发育树，如图3。通过遗传距离及16S rRNA序列对比，鉴定为Rhodococcus qingshengii。

16S rRNA序列

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(3)菌株SYF对梅里埃CBC卡上41种碳源的利用能力。

利用梅里埃全自动鉴定仪考察菌株对41种不同碳源的代谢情况(委托给浙江天科高新技术发展有限公司(原浙江省微生物研究所))。鉴定结果如表1所示。经梅里埃全自动鉴定仪VITEK生化反应，菌株SYF可较强利用10种碳源，对其他31种碳源不能利用。

表1菌株SYF梅里埃全自动鉴定仪VITEK生化反应结果(CBC卡)

表注：+，阳性反应；-：阴性反应

通过菌落形态、16S rRNA序列分析和生理生化实验鉴定，确定菌株SYF为Rhodococcus qingshengii，命名为庆笙红球菌(Rhodococcus qingshengii)SYF，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M 2023726，保藏日期：2023年05月10日，地址：中国，武汉，武汉大学，430072。

实施例2:庆笙红球菌SYF静息细胞的获得

1、斜面培养：

将庆笙红球菌SYF接种至LB液体培养基中，在15℃，160rpm下培养24～36h，再将活化的细菌画线于固体LB平板30℃培养箱培养24～36h，取单菌落继续平板画线以检测细菌的纯度，进行LB试管斜面常规(4℃)保存。

2、扩大培养

将步骤1中斜面菌体接种至LB液体培养基中，在15℃，160rpm下培养24～36h，获得OD₆₀₀＝0.1～0.2的菌液，离心，收集湿菌体，无机盐培养液洗涤，获得庆笙红球菌SYF静息细胞。

实施例3：庆笙红球菌SYF对不同浓度醋酸叔丁酯的降解性能检测。

将无机盐培养液分装于体积均为300mL的摇瓶中，每瓶50mL，110℃灭菌40min。灭菌结束后室温放置2d，确定无杂菌生长。加入终浓度达到50mg/L(以细胞干重计)实施例2方法获得的静息细胞，然后加入醋酸叔丁酯作为唯一碳源使其终浓度分别为52、104、156、208、260mg/L，摇瓶密封后，15℃，160rpm摇床培养，并做不加细菌的空白对照。采用安捷伦气相色谱测定摇瓶上方气相中醋酸叔丁酯的浓度，分析条件如下：色谱柱为HP-INNOWaxPolyethylene Glycol(30m×320μm×0.50μm)，柱温180℃，柱内流量：0.5mL·min^-1，进样口温度250℃，分流比40:1，检测器为氢火焰离子化检测器(FID)，温度250℃，氢气流量40mL·min^-1，空气流量450mL·min^-1，进样量0.8mL。定时测定摇瓶中残留的醋酸叔丁酯浓度，绘制菌株不同初始浓度醋酸叔丁酯随着时间变化的去除率曲线，结果见图4所示。结果表明，当醋酸叔丁酯浓度低于260mg/L时，菌株SYF可以快速地降解所有添加的底物。

实施例4：庆笙红球菌SYF在不同初始pH环境下对104mg/L的醋酸叔丁酯的降解性能检测。

用1mol/L NaOH水溶液或1mol/L H₂SO₄水溶液调节无机盐培养液为不同pH值(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)，在初始醋酸叔丁酯浓度为104mg/L的条件下接入实施例2方法制备的菌液，加入终浓度达到50mg/L(以细胞干重计)。将样品于15℃，160rpm恒温摇床里振荡培养，并做不加细菌的空白对照。采用实施例3方法定时测定摇瓶中残留的醋酸叔丁酯浓度，绘制菌株不同pH环境下醋酸叔丁酯随着时间变化的去除率曲线以及在11h时不同pH下对于104mg/L的醋酸叔丁酯的降解率，结果见图5和图6所示。结果表明，在各pH下，庆笙红球菌SYF均能降解醋酸叔丁酯，且在pH为7和8时对醋酸叔丁酯的降解效果最好。

实施例5：庆笙红球菌SYF对不同底物的降解性能检测。

将无机盐培养液分装于体积均为300mL的摇瓶中，每瓶50mL，110℃灭菌40min。灭菌结束后室温放置2d，确定无杂菌生长。加入终浓度达到50mg/L(以细胞干重计)实施例2方法获得的静息细胞，然后分别加入醋酸叔丁酯、苯、乙酸乙酯、三氯甲烷作为唯一碳源，使其终浓度均为90mg/L，摇瓶密封后，15℃，160rpm摇床培养，并做不加细菌的空白对照。采用实施例3所述气相色谱分别对摇瓶上方气相中的底物测定浓度。

结果如下表2所示。结果表明，菌株SYF对于酯类有较好的降解效果(均在84％以上)，而对于苯只有23％的降解效果，对于三氯甲烷，几乎没有降解效果。

表2各种底物测试效果

虽然本发明已以实施例公开如上，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何熟悉该技术的技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内所作的更改与润饰，均应属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.庆笙红球菌(Rhodococcus qingshengii)SYF，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2023年05月10日，保藏编号：CCTCC NO:M 2023726，地址：中国，武汉，武汉大学，430072。

2.一种权利要求1所述庆笙红球菌SYF在降解有机污染物中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的应用是将庆笙红球菌SYF经扩大培养获得的菌液或静息细胞加入pH＝4-9、含有机污染物的无机盐培养液中，在10-35℃、100-200rpm条件下进行培养，实现有机污染物的降解。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述有机污染物包括醋酸叔丁酯、乙酸乙酯。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述无机盐培养液中，静息细胞或菌液加入量以菌体干重计为20-100mg/L。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述无机盐培养液中有机污染物的初始浓度为52-260mg/L。

7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述无机盐培养液组成为：K₂HPO₄·3H₂O0.942g/L、KH₂PO₄ 0.234g/L、NaNO₃ 1.7g/L、NH₄Cl 0.98g/L、MgCl₂·6H₂O 0.2033g/L、CaCl₂·2H₂O 0.011g/L、FeCl₃ 0.0162g/L，微量元素母液5ml/L，溶剂为去离子水，pH 7.0；其中微量元素母液组成：CuSO₄·5H₂O 0.02g/L、FeSO₄·7H₂O 1.0g/L、MnSO₄·4H₂O 0.1g/L、NaMoO₄·2H₂O 0.02g/L、CoCl₂·6H₂O 0.02g/L、H₃BO₃ 0.014g/L、ZnSO₄·7H₂O 0.10g/L，溶剂为去离子水。

8.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述培养条件为15℃、160rpm。

9.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述庆笙红球菌SYF的静息细胞按如下步骤制备：

(1)斜面培养：

将庆笙红球菌SYF接种于斜面LB固体培养基，30℃培养24～36h，获得斜面菌体，所述LB固体培养基终浓度组成为：NaCl 10g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L，琼脂18～20g/L，溶剂为去离子水，pH值自然；

(2)扩大培养

用接种环挑取步骤(1)获得的斜面菌体接种至LB液体培养基中，15℃，160rpm培养24～36h，获得OD₆₀₀＝0.1～0.2的菌液，离心，收集湿菌体，无机盐培养液洗涤，获得庆笙红球菌SYF静息细胞；所述LB液体培养基终浓度组成为：NaCl 10g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。