CN108779147A - 还原型谷胱甘肽的晶体及其制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供减少了杂质、特别是L‑半胱氨酰基‑L‑甘氨酸的含量的还原型谷胱甘肽的晶体及其制造方法。本发明涉及一种还原型谷胱甘肽的晶体，其中，在高效液相色谱(HPLC)分析中，相对于还原型谷胱甘肽的峰面积100，L‑半胱氨酰基‑L‑甘氨酸的峰面积为0.02以下。

Description

还原型谷胱甘肽的晶体及其制造方法
技术领域
本发明涉及减少了杂质、特别是L-半胱氨酰基-L-甘氨酸的含量的还原型谷胱甘肽的晶体及其制造方法。
背景技术
谷胱甘肽(γ-L-谷氨酰基-L-半胱氨酰基-L-甘氨酸)是生物中广泛存在的还原性化合物，已知在肝脏中具有解毒作用。因此，谷胱甘肽被广泛用作药品、健康食品以及化妆品等的产品、原料或中间体。
作为谷胱甘肽的制造方法，已知有使用酵母等微生物的发酵法、以及酶法(非专利文献1)等，但存在生成具有类似结构的类似杂质作为副产物的问题。
作为谷胱甘肽的纯化法，已知有与氧化亚铜形成铜盐的方法、吸附于强酸性离子交换树脂并利用酸或碱洗脱的方法(专利文献1～3)、从弱碱性阴离子交换树脂中通过的方法(专利文献4)，但谷胱甘肽因加热、氧化、pH变动等容易发生反应或分解而生成大量杂质。
这些杂质中，已知特别是L-半胱氨酰基-L-甘氨酸会产生导致各种各样疾病的自由基(非专利文献2、3)。另外，在日本厚生劳动省的关于药品原药的杂质的指南中，根据原药的最大一天给药量，要求将谷胱甘肽中所含的各杂质减少至最小0.05％以下。
如此，对于作为药品、食品原料的谷胱甘肽而言，从安全性的方面出发，强烈期望减少杂质。作为谷胱甘肽的纯化法，在专利文献5中公开了除去半胱氨酸、γ-谷氨酰基半胱氨酸这样的特定杂质的方法。但是，迄今为止，对于除去L-半胱氨酰基-L-甘氨酸的方法还没有报道。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特公昭44-239号公报
专利文献2：日本特公昭45-4755号公报
专利文献3：日本特公昭46-2838号公报
专利文献4：日本特公昭45-27797号公报
专利文献5：日本特开昭61-282397号公报
非专利文献
非专利文献1：Appl.Microbiol.Biotechnol.，66，233(2004)
非专利文献2：J Investig Med.，Vol 47，No.3，151-160(1999)
非专利文献3：Bio Factors.，17，187-198(2003)
发明内容
发明所要解决的问题
如上所述，在现有方法中，难以减少L-半胱氨酰基-L-甘氨酸。因此，本发明的目的在于提供减少了杂质、特别是L-半胱氨酰基-L-甘氨酸的含量的还原型谷胱甘肽的晶体及其制造方法。
用于解决问题的方法
本发明涉及下述(1)～(7)。
(1)一种还原型谷胱甘肽的晶体，其中，在高效液相色谱(HPLC)分析中，相对于还原型谷胱甘肽的峰面积100，L-半胱氨酰基-L-甘氨酸的峰面积为0.02以下。
(2)如(1)所述的还原型谷胱甘肽的晶体，其中，在HPLC分析中，相对于还原型谷胱甘肽的峰面积100，氧化型谷胱甘肽的峰面积为0.7以下。
(3)如(1)或(2)所述的还原型谷胱甘肽的晶体，其中，在HPLC分析中，相对于还原型谷胱甘肽的峰面积100，其它的峰的总面积为1.0以下。
(4)如(1)～(3)中任一项所述的还原型谷胱甘肽的晶体，其中，在HPLC分析中，相对于还原型谷胱甘肽的峰面积100，氧化型谷胱甘肽的峰以外的其它的峰面积各自为0.08以下。
(5)一种制造方法，其是在HPLC分析中L-半胱氨酰基-L-甘氨酸的峰面积相对于还原型谷胱甘肽的峰面积100为0.02以下的还原型谷胱甘肽的晶体的制造方法，其特征在于，使含还原型谷胱甘肽的水溶液从高交联度阳离子交换树脂中通过后，回收该水溶液，使还原型谷胱甘肽的晶体在该水溶液中析出，从该水溶液中采集还原型谷胱甘肽的晶体。
(6)如(5)所述的制造方法，其中，高交联度阳离子交换树脂为具有12％以上的交联度的阳离子交换树脂。
(7)如(5)或(6)所述的制造方法，其中，阳离子交换树脂为以磺酸基作为阳离子交换基团的阳离子交换树脂。
发明效果
根据本发明，可提供减少了杂质、特别是L-半胱氨酰基-L-甘氨酸的含量的还原型谷胱甘肽的晶体及其制造方法。
附图说明
图1表示含还原型谷胱甘肽的水溶液中的L-半胱氨酰基-L-甘氨酸的增加曲线。纵轴表示该水溶液的HPLC分析中的相对于还原型谷胱甘肽的峰面积100的L-半胱氨酰基-L-甘氨酸的峰面积，横轴表示时间(小时)。图1中，白圆形表示40℃的结果，黑菱形表示25℃的结果。
具体实施方式
1.本发明的晶体
对于本发明的还原型谷胱甘肽的晶体(以下，也称为本发明的晶体)而言，在HPLC分析中，相对于还原型谷胱甘肽的峰面积100，L-半胱氨酰基-L-甘氨酸的峰面积为0.02以下、优选为0.015以下、更优选为0.01以下、最优选为0.006以下。
对于本发明的晶体而言，在HPLC分析中，相对于还原型谷胱甘肽的峰面积100，氧化型谷胱甘肽的峰面积优选为0.7以下、更优选为0.6以下、进一步优选为0.5以下。
对于本发明的晶体而言，在HPLC分析中，相对于还原型谷胱甘肽的峰面积100，其它的峰的总面积优选为1.0以下、更优选为0.9以下、进一步优选为0.8以下、最优选为0.7以下。
对于本发明的晶体而言，在HPLC分析中，相对于还原型谷胱甘肽的峰面积100，氧化型谷胱甘肽的峰以外的其它的峰面积各自优选为0.08以下、更优选为0.06以下、进一步优选为0.04以下、最优选为0.02以下。
HPLC分析是指将作为分析对象的化合物溶解在溶剂中并供于利用HPLC进行的分析。作为HPLC分析，只要是能够同时检测还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽以及L-半胱氨酰基-L-甘氨酸的分析方法，分析条件等就没有特别限定，优选可以列举对210nm的吸光度进行检测、测定的HPLC分析方法，更优选可以列举以下的HPLC分析例所记载的HPLC分析方法。
[HPLC分析例]
为了防止HPLC分析中的杂质的增加，从样品溶解到利用HPLC进行分析为止的时间设定为10分钟以内。另外，HPLC的样品架冷却至10℃以下。该条件下的定量限和检出限相对于还原型谷胱甘肽的峰面积100为0.001。
使用设备：系统控制器(CBM-20A)、检测器(SPD-20A)、泵(LC-20AD)、自动进样器(SIL-20ACHT)、柱温箱(CTO-20AC)、脱气装置(DGU-20A)(均为岛津制作所公司制造)
检测器：紫外分光光度计(测定波长210nm)
柱：Inertsil ODS-3粒径3μm 3.0×150mm(GL Sciences Inc.)
流动相：含有0.20W/V％的1-庚烷磺酸钠、0.66W/V％的磷酸二氢钾的、3W/V％甲醇溶液(利用磷酸调整为pH3.0)
将磷酸二氢钾6.8g、1-庚烷磺酸钠2.02g溶解于PFW 1000mL中，添加磷酸而调整为pH3.0，在该溶液970mL中添加甲醇30mL，由此制备流动相。
柱温：35℃
流速：0.4～0.7mL/分钟(以使还原型谷胱甘肽的保留时间为约5分钟的方式进行调整)
试样注入量：30μL
试样制备方法：称量样品约0.05g，溶解于流动相100mL中，将由此得到的物质作为试样。
峰面积是指进行HPLC分析时由基线和峰线围成的部分的面积，可以对利用HPLC分析检测到的每种化合物求出。
作为本发明的晶体，可以列举如下所述的还原型谷胱甘肽的晶体：在HPLC分析中，相对于还原型谷胱甘肽的峰面积100，L-半胱氨酰基-L-甘氨酸的峰面积为0.02以下，并且氧化型谷胱甘肽的峰面积优选为0.7以下、更优选为0.6以下、进一步优选为0.5以下。
另外，作为本发明的晶体，可以列举如下所述的还原型谷胱甘肽的晶体：在HPLC分析中，相对于还原型谷胱甘肽的峰面积100，L-半胱氨酰基-L-甘氨酸的峰面积为0.02以下，并且其它的峰的总面积优选为1.0以下、更优选为0.9以下、进一步优选为0.8以下、最优选为0.7以下。
另外，作为本发明的晶体，可以列举如下所述的还原型谷胱甘肽的晶体：在HPLC分析中，相对于还原型谷胱甘肽的峰面积100，L-半胱氨酰基-L-甘氨酸的峰面积为0.02以下，并且氧化型谷胱甘肽的峰以外的其它的峰面积各自优选为0.08以下、更优选为0.06以下、进一步优选为0.04以下、最优选为0.02以下。
作为本发明的晶体，具体而言，例如可以列举HPLC分析中的各化合物的保留时间和峰面积以表3(实施例3和4)所示的数值表示的还原型谷胱甘肽的晶体。
2.本发明的晶体的制造方法
本发明的晶体的制造方法是一种还原型谷胱甘肽的晶体的制造方法，其特征在于，使含还原型谷胱甘肽的水溶液从高交联度阳离子交换树脂中通过后，回收该水溶液，使还原型谷胱甘肽的晶体在该水溶液中析出，从该水溶液中采集还原型谷胱甘肽的晶体。
本发明的制造方法中使用的含还原型谷胱甘肽的水溶液可以为通过发酵法、酶法、从天然物提取的方法、化学合成法等中的任一种制造方法制造的含还原型谷胱甘肽的水溶液，例如可以列举：从对具有生产谷胱甘肽的能力的微生物进行培养而得到的含有还原型谷胱甘肽的培养物(国际公开第2008/126784号)以及利用酶法得到的含还原型谷胱甘肽的水溶液[Appl.Microbiol.Biotechnol.，66，233(2004)、日本特开昭60-105499号公报等]等中除去不溶物等而得到的溶液。
另外，含还原型谷胱甘肽的水溶液也可以是含有将氧化型谷胱甘肽六水合物进行还原而得到的还原型谷胱甘肽的水溶液。氧化型谷胱甘肽六水合物可以按照国际公开第2011/132724号所记载的方法获得。
将氧化型谷胱甘肽六水合物溶解于水溶液中，按照国际公开第2012/137824号、国际公开第2010/140625号或国际公开第2014/133129号所记载的方法对含氧化型谷胱甘肽的水溶液进行电解还原，由此能够获得含还原型谷胱甘肽的水溶液。氧化型谷胱甘肽通过以氧化型谷胱甘肽六水合物的晶体的形式获得，由此能够更高效地除去杂质(国际公开第2011/132724号)。
本说明书中，杂质是指还原型谷胱甘肽的晶体中所含的还原型谷胱甘肽以外的全部化合物。
作为使含还原型谷胱甘肽的水溶液从高交联度阳离子交换树脂中通过的方法，例如可以列举使含还原型谷胱甘肽的水溶液从填充有高交联度离子交换树脂的柱中通过的方法。
在含还原型谷胱甘肽的水溶液中含有从高交联度阳离子交换树脂中通过时成为障碍的固体物质的情况下，可以预先使用离心分离、过滤或陶瓷过滤器等除去该固体物质。
另外，在含还原型谷胱甘肽的水溶液中含有从高交联度阳离子交换树脂中通过时成为障碍的水溶性的杂质的情况下，可以通过使含还原型谷胱甘肽的水溶液从填充有离子交换树脂等的柱中通过等而除去该杂质。
另外，在含还原型谷胱甘肽的水溶液中含有从高交联度阳离子交换树脂中通过时成为障碍的疏水性的杂质的情况下，可以通过使含还原型谷胱甘肽的水溶液从填充有合成吸附树脂或活性炭等的柱中通过等而除去该杂质。
作为含还原型谷胱甘肽的水溶液的还原型谷胱甘肽的浓度，可以列举通常为25g/L以上、优选为50g/L以上、更优选为100g/L以上。
上述浓度的含还原型谷胱甘肽的水溶液可以通过将该水溶液利用加热浓缩法或减压浓缩法等一般的浓缩方法进行浓缩而获得。
含还原型谷胱甘肽的水溶液的pH通常为pH2.0～10.0、优选为pH2.0～7.0，可以根据需要利用盐酸、硫酸、乙酸、苹果酸等无机酸或有机酸、氢氧化钠等碱溶液、尿素、碳酸钙、氨等将该水溶液的pH调整为上述范围。
已知谷胱甘肽相对于水的饱和溶解度在10℃下为83g/L、在25℃下为130g/L，随着pH提高而升高(国际公开第2011/137824)。因此，通过在含谷胱甘肽的水溶液中添加碱而使pH升高，由此能够进一步提高谷胱甘肽浓度。
作为本发明的制造方法中使用的高交联度阳离子交换树脂的交联度，例如可以列举通常为12％以上、优选为14％以上、更优选为15％以上、最优选为16％以上。交联度是指在离子交换树脂中交联剂在构成该树脂的全部原料中所占的重量比率。
作为高交联度阳离子交换树脂的交联剂，例如可以列举二乙烯基苯。作为高交联度阳离子交换树脂的阳离子交换基团，例如可以列举磺酸基。
作为高交联度阳离子交换树脂的离子型，只要具有吸附L-半胱氨酰基-L-甘氨酸的能力就没有特别限定，例如可以列举氢离子型。作为高交联度阳离子交换树脂的粒径，例如可以列举通常为300～900μm、优选为400～800μm、最优选为500～700μm。
作为本发明的制造方法中使用的高交联度阳离子交换树脂，具体而言，例如可以列举选自UBK12、UBKN1U、UBK16、SK110、SK112、PK220、PK228(均为三菱化学公司制造)、C100×16MBH、C100×12、C100×10(均为Puroite公司制造)、Amberlite(商标)200CT、Amberlite(商标)252(均为罗门哈斯公司制造)组成的组中的高交联度阳离子交换树脂，优选可以列举UBK12、UBKN1U、UBK16(均为三菱化学公司制造)。
在本发明的制造方法中，对于本领域技术人员而言，高交联度阳离子交换树脂的量可以根据从高交联度阳离子交换树脂中通过的含还原型谷胱甘肽的水溶液的pH、量而容易地设定，例如可以列举该水溶液的通常0.1～5倍量。
作为使含还原型谷胱甘肽的水溶液从高交联度阳离子交换树脂中通过时的温度，可以列举通常为5～40℃、优选为10～35℃、最优选为15～30℃。
作为使含还原型谷胱甘肽的水溶液从高交联度阳离子交换树脂中通过时的速度，只要L-半胱氨酰基-L-甘氨酸的除去能力不降低就没有特别限制，以液体空间速度(SV)计，可以列举通常为0.1～10.0、优选为0.2～9.0、更优选为0.3～8.0、最优选为0.5～5.0。液体空间速度(SV)是指通液量(L/h)除以树脂填充量(L)而得到的值。
使从高交联度阳离子交换树脂中通过而得到的含有还原型谷胱甘肽的水溶液从离子交换树脂中通过来进行脱盐，能够将脱盐后的含有还原型谷胱甘肽的水溶液直接用于还原型谷胱甘肽的晶体的析出。
作为脱盐中使用的离子交换树脂，例如可以列举以WA-30、WA-21为代表的弱碱性离子交换树脂[均为DIAION(商标)、三菱化学公司制造]。
作为使还原型谷胱甘肽的晶体析出的方法，只要是能够使还原型谷胱甘肽以晶体的形式析出的方法则可以为任一种方法，例如可以列举日本专利第5243963号说明书中记载的、在含还原型谷胱甘肽的水溶液中添加还原型谷胱甘肽的籽晶和溶剂的方法。
另外，可以使用如下方法：在含还原型谷胱甘肽的水溶液中选择性地引发谷胱甘肽的α晶的晶体结晶(日本专利第5243963号说明书)，向该含有谷胱甘肽的α晶的晶体的水溶液中连续或分开地添加将谷胱甘肽的浓度提高至饱和溶解度以上的水溶液而使还原型谷胱甘肽的晶体析出。
作为采集还原型谷胱甘肽的晶体的方法，没有特别限定，可以列举：过滤、加压过滤、抽滤、离心分离等。为了进一步减少母液在晶体上的附着、提高晶体的品质，采集晶体后，可以适当对该晶体进行清洗。
清洗中使用的溶液没有特别限制，可以使用水、甲醇、乙醇、丙酮、正丙醇、异丙醇以及选自它们中的一种溶液或以任意比例混合多种而得到的溶液。
通过上述方法，可以获得本发明的还原型谷胱甘肽的晶体，在所得到的晶体为湿晶的情况下，可以通过进行干燥而获得容易操作的晶体。作为干燥条件，只要是能够保持还原型谷胱甘肽的晶体的形态的方法则可以为任一种方法，例如可以列举减压干燥、真空干燥、流动床干燥、通风干燥等。
作为干燥温度，只要是能够除去附着水分、溶液且还原型谷胱甘肽的晶体不发生分解的范围则可以为任一种温度，可以列举通常为70℃以下、优选为60℃以下、更优选为50℃以下。
实施例
以下示出实施例，但本发明并不限定于下述实施例。
[参考例]
将还原型谷胱甘肽的α晶的晶体(兴人公司制造)溶解于水后调整至100g/L，并密闭，一边搅拌一边设置于25℃和40℃的恒温槽中。随时间推移采集这些还原型谷胱甘肽水溶液，进行HPLC分析。由图1所示的结果可知，还原型谷胱甘肽随时间推移而呈温度依赖性地发生分解，生成L-半胱氨酰基-L-甘氨酸。
[比较例]
按照日本专利第5243963号说明书的实施例1中记载的方法，制备以183g/L的浓度含有还原型谷胱甘肽的水溶液。将该水溶液直接在加热减压下浓缩至539g/L，将所得到的浓缩溶液保持于25℃，同时向该浓缩液中添加还原型谷胱甘肽的α晶的晶体(兴人公司制造)作为籽晶。添加籽晶后，在25℃下搅拌10小时，由此得到引发了还原型谷胱甘肽的α晶的晶体结晶的水溶液。
将所得到的水溶液冷却至10℃后，向该水溶液中添加0.3倍等量的乙醇，由此使还原型谷胱甘肽的α晶的晶体析出。对所得到的浆料进行离心分离而除去水溶液层后，利用60v/v％乙醇对晶体进行清洗，然后，在40℃下进行减压干燥，获得还原型谷胱甘肽的α晶的晶体。
[实施例1]
将通过日本专利第5243963号说明书所记载的方法获得的还原型谷胱甘肽的晶体溶解于水中后，在60℃下加热1小时，由此使L-半胱氨酰基-L-甘氨酸的含量增加后，制备出以100g/L、50g/L、25g/L的浓度含有还原型谷胱甘肽的各水溶液。
将分别为670mL、1340mL、2680mL的这些水溶液在室温下以液体空间速度为SV1.0(100mL/h)的流速从填充有再生为氢离子型的100mL的UBK16(三菱化学公司制造)的直径2cm的玻璃柱中通过。使还原型谷胱甘肽水溶液通过后，进行UBK16的水洗直至糖度(Brix)为1％以下，回收还原型谷胱甘肽级分。将还原型谷胱甘肽的收率、L-半胱氨酰基-L-甘氨酸的除去率以及液量增加率的结果示于表1中。
[表1]
如表1所示，通过使用高交联度阳离子交换树脂，含还原型谷胱甘肽的水溶液的还原型谷胱甘肽浓度为任意一种浓度都能够抑制使含还原型谷胱甘肽的水溶液通过后的液量的增加，并且不会使还原型谷胱甘肽的收率大幅下降，能够选择性地吸附、除去L-半胱氨酰基-L-甘氨酸。
[实施例2]
将通过日本专利第5243963号说明书所记载的方法获得的还原型谷胱甘肽的晶体溶解在水中，在60℃下加热1小时而使L-半胱氨酰基-L-甘氨酸的含量增加后，制备出以100g/L的浓度含有还原型谷胱甘肽的水溶液。
准备填充有再生为氢离子型的UBKN1U(交联度14％)、UBK12(交联度12％)、UBK08(交联度8％)、UBK06(交联度6％)(均为三菱化学公司制造)各100mL的直径2cm的玻璃柱，在室温下以SV1.0(100mL/h)的流速使643mL的该水溶液从UBKN1U中通过、使616mL的该水溶液从UBK12中通过、使536mL的该水溶液从UBK08中通过、使482mL的该水溶液从UBK06中通过。所通过的含还原型谷胱甘肽的水溶液的量根据各树脂所具有的总交换容量来调整。
使含还原型谷胱甘肽的水溶液通过后，进行各树脂的水洗直至糖度(Brix)低于1％为止，回收还原型谷胱甘肽级分。将还原型谷胱甘肽的收率、L-半胱氨酰基-L-甘氨酸的除去率以及液量增加率的结果示于表2中。
[表2]
如表2所示，可知：通过使用具有12％以上的交联度的高交联度阳离子交换树脂，能够抑制使含还原型谷胱甘肽的水溶液通过后的液量增加，并且不会使还原型谷胱甘肽的收率大幅下降，能够选择性地吸附、除去L-半胱氨酰基-L-甘氨酸。
[实施例3]
本发明的晶体的制造-1
将通过国际公开第2011/132724号中记载的方法获得的氧化型谷胱甘肽利用国际公开第2012/137824号中记载的方法进行还原，得到以164g/L的浓度含有还原型谷胱甘肽的水溶液。将所得到的含还原型谷胱甘肽的水溶液保持于25℃，同时使其以液体空间速度SV2.5从填充有再生为氢离子型的UBK16(三菱化学公司制造)的柱中通过，从而得到含有还原型谷胱甘肽的级分。
将该级分在加热减压下浓缩至530g/L，将所得到的浓缩溶液保持于25℃，同时向其中添加还原型谷胱甘肽的α晶的晶体(兴人公司制造)作为籽晶。添加籽晶后，在25℃下搅拌17小时，由此得到引发了还原型谷胱甘肽的α晶的晶体结晶的水溶液。将所得到的水溶液冷却至10℃后，向该水溶液中添加0.3倍等量的乙醇，由此使还原型谷胱甘肽的α晶的晶体析出。
通过对所得到的浆料进行离心分离而除去水溶液层后，利用30v/v％乙醇对晶体进行清洗，使40℃的空气通风，由此进行干燥，获得作为本发明的晶体的还原型谷胱甘肽的α晶的晶体。
[实施例4]
本发明的晶体的制造-2
将通过国际公开第2011/132724号记载的方法获得的氧化型谷胱甘肽利用国际公开第2012/137824号中记载的方法进行还原，得到以173g/L的浓度含有还原型谷胱甘肽的水溶液。
将所得到的含还原型谷胱甘肽的水溶液保持于25℃，同时使其以液体空间速度SV2.5从填充有再生为氢离子型的UBK16(三菱化学公司制造)的柱中通过，从而得到含有还原型谷胱甘肽的级分。将该级分在加热减压下浓缩至426g/L，将所得到的浓缩溶液保持于25℃，同时向其中添加还原型谷胱甘肽的α晶的晶体(兴人公司制造)作为籽晶。添加籽晶后，在25℃下搅拌19小时，由此得到引发了还原型谷胱甘肽的α晶的晶体结晶的水溶液。
将所得到的水溶液冷却至10℃后，向该水溶液中添加0.3倍等量的乙醇，由此使还原型谷胱甘肽的α晶的晶体析出。通过对所得到的浆料进行离心分离而除去水溶液层后，利用30v/v％乙醇对晶体进行清洗，使40℃的空气通风，由此进行干燥，获得作为本发明的晶体的还原型谷胱甘肽的α晶的晶体。
利用HPLC对市售的还原型谷胱甘肽的晶体(市售品A和B)、比较例中得到的还原型谷胱甘肽的晶体、以及实施例3和4中得到的本发明的晶体进行分析，测定该晶体中所含有的杂质。将HPLC分析的结果示于表3中。表3中，示出将还原型谷胱甘肽的峰面积设为100时的各峰的面积。
另外，在表3中，分别地，“N.D”表示检出限以下，“谷胱甘肽”表示还原型谷胱甘肽，“γGC-Ala”表示γ-L-谷氨酰基-L-半胱氨酰基-L-丙氨酸，“CysGly”表示L-半胱氨酰基-L-甘氨酸，“GSSG”表示氧化型谷胱甘肽。
[表3]
如表3所示，可知：本发明的晶体与市售品A和B以及比较例中得到的还原型谷胱甘肽的晶体相比，L-半胱氨酰基-L-甘氨酸的含量显著低，并且氧化型谷胱甘肽和γ-L-谷氨酰基-L-半胱氨酰基-L-丙氨酸等其它杂质的含量也显著低。
使用特定的方式对本发明详细地进行了说明，但对于本领域技术人员明显可知的是，可以在不脱离本发明的意图和范围的情况下进行各种变更和变形。需要说明的是，本申请基于2016年3月17日提出的日本专利申请(日本特愿2016-53844号)，通过引用而援引其整体。
产业上的可利用性
根据本发明，可提供减少了杂质、特别是L-半胱氨酰基-L-甘氨酸的含量的还原型谷胱甘肽的晶体及其制造方法。

Claims (7)

1.一种还原型谷胱甘肽的晶体，其中，在高效液相色谱(HPLC)分析中，相对于还原型谷胱甘肽的峰面积100，L-半胱氨酰基-L-甘氨酸的峰面积为0.02以下。
2.如权利要求1所述的还原型谷胱甘肽的晶体，其中，在HPLC分析中，相对于还原型谷胱甘肽的峰面积100，氧化型谷胱甘肽的峰面积为0.7以下。
3.如权利要求1或2所述的还原型谷胱甘肽的晶体，其中，在HPLC分析中，相对于还原型谷胱甘肽的峰面积100，其它的峰的总面积为1.0以下。
4.如权利要求1～3中任一项所述的还原型谷胱甘肽的晶体，其中，在HPLC分析中，相对于还原型谷胱甘肽的峰面积100，氧化型谷胱甘肽的峰以外的其它的峰面积各自为0.08以下。
5.一种制造方法，其是在HPLC分析中L-半胱氨酰基-L-甘氨酸的峰面积相对于还原型谷胱甘肽的峰面积100为0.02以下的还原型谷胱甘肽的晶体的制造方法，其特征在于，使含还原型谷胱甘肽的水溶液从高交联度阳离子交换树脂中通过后，回收该水溶液，使还原型谷胱甘肽的晶体在该水溶液中析出，从该水溶液中采集还原型谷胱甘肽的晶体。
6.如权利要求5所述的制造方法，其中，高交联度阳离子交换树脂为具有12％以上的交联度的阳离子交换树脂。
7.如权利要求5或6所述的制造方法，其中，高交联度阳离子交换树脂为以磺酸基作为阳离子交换基团的阳离子交换树脂。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110494553A (zh) * 2017-04-13 2019-11-22 协和发酵生化株式会社 茶氨酸的制造方法
CN112341520A (zh) * 2020-12-02 2021-02-09 大连医诺生物股份有限公司 一种还原型谷胱甘肽的清洁生产工艺

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014112641A1 (ja) * 2013-01-21 2014-07-24 協和発酵バイオ株式会社 一酸化窒素濃度上昇剤
CN108129550B (zh) * 2017-12-21 2021-07-02 广州白云山天心制药股份有限公司 一种还原型谷胱甘肽的晶型及其制备方法
CN117377454A (zh) * 2021-12-28 2024-01-09 考司美德制药株式会社 护肤用皮肤适用组合物
WO2024204747A1 (ja) * 2023-03-31 2024-10-03 コスメディ製薬株式会社 高分子有用成分包含微細針を含有した皮膚外用剤組成物

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS52131528A (en) * 1976-04-28 1977-11-04 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Production of glutathione of reduced type
JPS60258199A (ja) * 1984-06-01 1985-12-20 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd システイニルグリシンの分離法
JPS62283994A (ja) * 1986-06-02 1987-12-09 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd グルタチオンの精製法
CN103459409A (zh) * 2011-04-06 2013-12-18 协和发酵生化株式会社 制造还原型谷胱甘肽的方法
CN104693269A (zh) * 2006-10-16 2015-06-10 协和发酵生化株式会社 谷胱甘肽的结晶及其制造方法

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS454755Y1 (zh) 1965-06-11 1970-03-05
JPS44239Y1 (zh) 1965-06-25 1969-01-08
JPS4527797Y1 (zh) 1966-12-03 1970-10-27
JPS462838Y1 (zh) 1967-12-28 1971-02-01
US3750395A (en) 1971-10-22 1973-08-07 Westinghouse Electric Corp Overspeed protection system for a turbo-generator unit
JPS60105499A (ja) 1983-11-15 1985-06-10 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd グルタチオンの製造方法
JPS6127999A (ja) 1984-07-16 1986-02-07 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd グルタチオンの精製方法
JPS61282397A (ja) 1985-06-07 1986-12-12 Kohjin Co Ltd グルタチオン及びγ−グルタミルシステインの精製法
US6835811B1 (en) * 2001-03-13 2004-12-28 Kromar Medical Corporation Extended storage of reduced glutathione solutions
WO2008126784A1 (ja) 2007-04-06 2008-10-23 Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. グルタチオンおよびγ-グルタミルシステインの製造法
JP5654457B2 (ja) 2009-06-03 2015-01-14 協和発酵バイオ株式会社 還元型グルタチオンの製造法
KR101893621B1 (ko) 2010-04-21 2018-08-30 교와 핫꼬 바이오 가부시키가이샤 산화형 글루타티온의 결정 및 이의 제조 방법
WO2011137824A1 (zh) 2010-09-30 2011-11-10 华为技术有限公司 一种密钥管理方法、检查授权方法和装置
WO2014133129A1 (ja) 2013-02-28 2014-09-04 協和発酵バイオ株式会社 還元型グルタチオンの製造法
JP6868556B2 (ja) 2015-06-05 2021-05-12 協和発酵バイオ株式会社 還元型グルタチオンのα型結晶の製造方法及び当該結晶の保存方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS52131528A (en) * 1976-04-28 1977-11-04 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Production of glutathione of reduced type
JPS60258199A (ja) * 1984-06-01 1985-12-20 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd システイニルグリシンの分離法
JPS62283994A (ja) * 1986-06-02 1987-12-09 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd グルタチオンの精製法
CN104693269A (zh) * 2006-10-16 2015-06-10 协和发酵生化株式会社 谷胱甘肽的结晶及其制造方法
CN103459409A (zh) * 2011-04-06 2013-12-18 协和发酵生化株式会社 制造还原型谷胱甘肽的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张均田 等: "《现代药理实验方法》", 30 July 2012, 中国协和医科大学出版社 *
杨红 等: "《天然药物化学基础》", 30 June 2008, 中国医科科技出版社 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110494553A (zh) * 2017-04-13 2019-11-22 协和发酵生化株式会社 茶氨酸的制造方法
CN110494553B (zh) * 2017-04-13 2023-07-04 协和发酵生化株式会社 茶氨酸的制造方法
CN112341520A (zh) * 2020-12-02 2021-02-09 大连医诺生物股份有限公司 一种还原型谷胱甘肽的清洁生产工艺

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Publication number Publication date
JP2021191805A (ja) 2021-12-16
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