JP5654457B2

JP5654457B2 - 還元型グルタチオンの製造法

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Publication number: JP5654457B2
Application number: JP2011518476A
Authority: JP
Inventors: 一成福本
Original assignee: KYOUWA HAKKO BIO CO.,LTD
Current assignee: KYOUWA HAKKO BIO CO.,LTD
Priority date: 2009-06-03
Filing date: 2010-06-02
Publication date: 2015-01-14
Anticipated expiration: 2030-06-02
Also published as: US20120118756A1; CN102803567B; EP2439312A4; WO2010140625A1; EP2439312A1; CN102803567A; EP2439312B1; JPWO2010140625A1; US9249517B2

Description

本発明は、酸化型グルタチオンを電解還元することにより還元型グルタチオンを製造する方法に関する。

ジスルフィド化合物の電解還元方法としては、陰極に特定の２種以上の金属からなる合金を用いる方法が知られている（特許文献１）。またジスルフィド化合物の一種であるL-シスチンを電解還元することによりL-システインを製造する方法としては、隔膜にカチオン交換膜を用い、陰極側電解槽に塩酸などの鉱酸を加えて酸性にしたL-シスチン溶液を用いる方法が知られている（特許文献２）。酸化型グルタチオンを電解還元することにより還元型グルタチオンを製造する方法としても、陰極側電解槽に濃塩酸などの鉱酸を加えて酸性にした酸化型グルタチオン水溶液を用いる方法が知られている（特許文献３）。

しかしながら、上記のジスルフィド化合物の電解還元法では、高価な電極を用いなければならず、特許文献２に記載のL-シスチンの電解還元条件で酸化型グルタチオンを電解還元する場合、還元型グルタチオンはL-システインに比べ強酸性、高温下では不安定なため、十分な収率で還元型グルタチオンを製造することはできない。特許文献３記載の方法も特許文献２記載の方法と同様、鉱酸を加えてpH0.6〜1.0の強酸性にした酸化型グルタチオン水溶液を用いる方法であるため、陰極が腐食する、還元型グルタチオンが分解するという問題がある。強酸性下での還元型グルタチオンの分解を最小限にするためには電流密度を低くする必要があるが、そうすると電極面積当たりの還元効率が悪くなるため、その分電極面積を大きくしなければ還元型グルタチオンを効率よく製造することはできない。すなわち、鉱酸で強酸性にした酸化型グルタチオン水溶液を電解還元して還元型グルタチオンを工業的規模で製造するには、イオン交換膜と電極の大きさに応じた巨大な電解還元設備と腐食に耐えうる特殊な電極が必要となる。従って、従来の電解還元による還元型グルタチオンの製造法は、生産効率と設備の面において現実的な方法とは言い難いものであった。

特開平８−４１６７１特開昭５９−９１８４特開昭５２−１３１５２８

酸化型グルタチオンを電解還元して還元型グルタチオンを製造する方法においては、陰極の腐食と還元型グルタチオンの分解を抑制しつつ、電極およびイオン交換膜の必要面積を現実的な大きさに縮小させるために、還元効率を向上させることが要求されている。

本発明は、以下の（１）〜（７）に記載の方法に関する。
（１）隔膜で隔てられた陰極槽および陽極槽を用いた酸化型グルタチオンの電解還元による還元型グルタチオンの製造法において、陰極槽内の溶液に酸以外の導電剤を含有するpH2.0〜3.0の酸化型グルタチオン水溶液を用いることを特徴とする還元型グルタチオンの製造方法。
（２）酸以外の導電剤が中性塩である上記（１）の製造方法。
（３）中性塩が硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸カリウムまたは塩化カリウムである上記（２）の製造方法。
（４）酸以外の導電剤の濃度が0.05mol/L以上、5.0mol/L以下である上記（１）〜（３）のいずれか１つの製造方法。
（５）酸化型グルタチオン水溶液の濃度が50g/L以上である上記（１）〜（４）のいずれか１つの製造方法。
（６）電解還元が電流密度0.1〜30A/dm²で行われることを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれか１つの製造方法。
（７）上記（１）〜（６）のいずれか１つの製造方法で製造された還元型グルタチオンをイオン交換カラムに通塔して脱塩された還元型グルタチオン水溶液を取得し、その後還元型グルタチオンを結晶化させることを特徴とする還元型グルタチオン結晶の製造方法。

本発明によれば、工業的規模で効率よく還元型グルタチオンを製造することができる。

図１Aは、各pHにおける還元型グルタチオンの残存率の経時変化を示す図である。図１Bは、各pHにおける還元型グルタチオン水溶液中の不純物増加量の経時変化を示す図である。図１Aの縦軸は還元型グルタチオンの残存率、横軸は経時時間（時間）を表す。図１Bの縦軸は還元型グルタチオン水溶液中の不純物の含有量（ｇ/Ｌ）、横軸は経時時間（時間）を表す。図２は陰極槽溶液の酸化型グルタチオン濃度と電解還元速度の関係を示す図である。縦軸は電解還元速度（ｇ/ｍ^２/ｈ）、横軸は酸化型グルタチオン濃度（ｇ/L）を表す。

本発明の方法は、隔膜で隔てられた陰極槽と陽極槽を用いた酸化型グルタチオンの電解還元による還元型グルタチオンの製造法において、陰極槽溶液に酸以外の導電剤を含むpH2.0〜3.0の酸化型グルタチオン水溶液を用いることを特徴とする還元型グルタチオンの製造法である。
酸以外の導電剤は、塩酸、硫酸などの無機酸、酢酸、プロピオン酸などの有機酸のように酸化型グルタチオン水溶液に加えたときに該水溶液のpHを下げる作用を有する酸以外の物質であり、該水溶液の電導性を向上させる導電剤であれば特に制限されない。そのような導電剤としては、好ましくは中性塩をあげることができる。中性塩としては、硫酸塩、硝酸塩、塩素塩、リン酸塩などの無機塩、酢酸塩、プロピオン酸塩などの有機塩などをあげることができる。中性塩を構成する塩としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウムなどの金属塩およびアンモニウム塩などをあげることができる。特に好ましい導電剤としては硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸カリウムおよび塩化カリウムをあげることができ、最も好ましくは硫酸ナトリウムをあげることができる。

中性塩を含有する酸化型グルタチオン水溶液は、直接中性塩を該溶液に溶解させることにより調製してもよいし、酸とアルカリを混合して中和塩を該水溶液中で形成させることにより調製してもよい。
酸化型グルタチオン水溶液のpHは、強酸性下では電解還元により生成した還元型グルタチオンが分解し、中性付近では電解還元が進行しないので、pH2.0〜3.0が好ましく、pH2.5〜2.9がさらに好ましく、pH2.8〜2.9が特に好ましい。

導電剤の濃度は、酸化型グルタチオン水溶液における飽和濃度以下であれば特に制限はないが、例えば導電剤として硫酸ナトリウムを用いる場合は、0.05〜5.0mol/L 、好ましくは0.2〜3.0mol/L、より好ましくは0.4〜1.0mol/Lである。
本発明の方法では、酸以外の導電剤を酸化型グルタチオン水溶液に加えることにより、酸化型グルタチオン水溶液のpHを下げることなく該溶液の電導性を向上させることができるので、導電剤非含有の酸化型グルタチオン水溶液に同じ電流を通電した場合に比べて溶液の電気抵抗は低く、よって水溶液の温度も高くならない。すなわち、陰極槽中での還元型グルタチオンの分解を抑えることができる。

上記のとおり、酸以外の導電剤を含有する酸化型グルタチオン水溶液を陰極槽に入れて電解還元を行うことにより、還元型グルタチオンの分解を抑えつつ、その生成効率を上げることができるので、隔膜および電極の大きさを小さくでき、よって設備コストを低く抑えることができる。
本発明の製造方法は、陰極槽の酸化型グルタチオン水溶液として過飽和の酸化型グルタチオン水溶液を用いることをもう一つの特徴とする。

常温（25℃）の水に対する酸化型グルタチオンの飽和溶解度は、20g/L以下であり、pHを大きく変化させない限り、塩の共存化でも溶解度は上昇しない。しかしながら、酸化型グルタチオンは一旦溶解させると300g/Lを超える極めて大きな過飽和溶解度を有することが見出された。この過飽和状態は、常温で安定であり、起晶するまでに数日の時間を要する。この特徴を利用することで、飽和溶解度を上回る酸化型グルタチオンの溶液を調整することができ、また上記したように酸以外の導電剤を加えることにより優れた電導性を過飽和の酸化型グルタチオン水溶液に付与することができるので、さらに効率的な酸化型グルタチオンの電解還元が成立する。酸以外の電導剤を含有する過飽和の酸化型グルタチオン水溶液の濃度は、過飽和状態を維持できるかぎり制限はないが、50g/L以上、好ましくは100 g/L以上、より好ましくは150 g/L以上、さらに好ましくは200ｇ/Ｌ以上、最も好ましくは300ｇ/Ｌ以上の濃度をあげることができる。

また、上記過飽和を利用すると、酸を加えることによりpHを0.6〜1.0にした強酸性の酸化型グルタチオン水溶液を陰極槽溶液として用いた場合であっても、当該溶液が200g/L以上の過飽和酸化型グルタチオン水溶液であれば、還元速度が強酸性下での還元型グルタチオンの分解速度を大きく上回るため、陰極として強酸性下でも腐食されにくく、かつ安価な材質の電極を用いれば、効率よく経済的に還元型グルタチオンを製造することができる。

酸化型グルタチオンの過飽和溶液の調製法に制限はなく、酸化型グルタチオンをアルカリ溶液に高濃度に溶解してから脱塩する方法、酸化型グルタチオンをイオン交換樹脂に吸着させた後、高濃度溶液として溶出させる方法、および飽和溶解度以下の溶液を濃縮する方法などをあげることができる。
本発明における陽極槽の溶液は、導電性がある水溶液であれば特に制限はなく、塩酸、硫酸などの無機酸溶液、酢酸、プロピオン酸などの有機酸溶液、酸以外の導電剤を溶解した溶液などをあげることができる。無機酸、有機酸の濃度は、低濃度だと導電性が悪く、高濃度だとイオン交換膜が劣化し易くなるので、0.5〜3mol/L、好ましくは1〜2mol/Lの濃度で用いられる。酸以外の導電剤としては、上記した陰極槽内の酸化型グルタチオン水溶液に含まれる導電剤をあげることができ、好ましくは酸化型グルタチオン水溶液に含まれる導電剤と同じ導電剤をあげることができる。

陽極槽内の溶液の導電剤の濃度は、陰極槽内の溶液の導電剤濃度と同程度の濃度が好ましく、例えば硫酸ナトリウムを導電剤として用いる場合の濃度としては、0.05〜5.0mol/L、好ましくは0.2〜3.0mol/L、より好ましくは0.4〜1.0mol/Lをあげることができる。
本発明の方法で用いられる陰極には、水素過電圧が炭素以上の金属を用いることが好ましく、そのような金属としては例えば亜鉛、鉛および炭素、多孔性炭素をあげることができ、より好ましくは亜鉛をあげることができる。

本発明の方法で用いられる陽極には、不溶性の金属であればいずれの金属でも用いることができるが、耐腐食性に優れた金属が好ましく、例えば白金メッキしたチタン、白金−イリジウム、鉛、鉛合金、二酸化鉛、およびチタン酸化物をあげることができ、好ましくは白金メッキしたチタンをあげることができる。
本発明の方法で用いられる隔膜としては、陰極槽内で生成する還元型グルタチオンの陽極槽への漏出を低減できる膜であればいずれの膜でもよく、好ましくはイオン交換膜、より好ましくはカチオン交換膜をあげることができ、具体的にはセレミオンCMT（旭硝子社製）をあげることができる。

本発明の方法では、電流密度、電圧、温度などは特に限定されないが、生成した還元型グルタチオンの分解を抑制しつつ、還元効率を向上させるための条件としては、電流密度は好ましくは0.1〜30A/dm²、より好ましくは0.5〜20A/dm²、さらに好ましくは1〜10A/dm²、電圧は好ましくは1〜20V、より好ましくは2〜15V、さらに好ましくは3〜10V、温度は好ましくは4〜50℃、より好ましくは10〜30℃、さらに好ましくは10〜25℃をあげることができる。

電解還元終了後、生成した還元型グルタチオンを含有する陰極槽内の溶液をイオン交換カラムに通塔することにより脱塩し、脱塩された還元型グルタチオン水溶液はそのまま結晶化に用いることができる。イオン交換樹脂としては、SK-116、SK-104に代表される強酸性陽イオン交換樹脂（いずれもダイヤイオン、三菱化学社製）、およびWA-30、WA-21に代表される弱塩基性イオン交換樹脂（いずれもダイヤイオン、三菱化学社製）をあげることができ、脱塩した還元型グルタチオンは濃縮後、適宜溶媒または種晶を添加して冷却することにより結晶化させることができる。

還元型グルタチオンのpH安定性
100g/Lの還元型グルタチオン水溶液（pH2.90）、および硫酸を用いてpH0.6、1.2、2.0に調整した100g/Lの還元型グルタチオン水溶液をそれぞれ作製した。
それぞれの溶液を、25℃、24〜36時間保存した後、以下の条件での高速液体クロマトグラフィー（HPLC）で還元型グルタチオンの残存量を定量した。図１Aに示すように、pH2.0以下の溶液では、pH2.90の溶液に比べ還元型グルタチオンの残存率が低下することがわかった。さらに、図１Bに示すように、pH2.0以下の溶液では、pH2.90の溶液に比べ、加水分解による不純物の増加量が大きいことがわかった。なお、不純物は下記のHPLC条件で還元型グルタチオン、酸化型グルタチオン以外の物質の総量を定量し、還元型グルタチオンに換算した濃度（g/L）を算出した。
HPLC条件
カラム：Nucleosil 100-5 C18 φ4.6×150mm
カラム温度：40℃
緩衝液：0.405%の1-ヘプタンスルホン酸ナトリウムを含む、10%アセトニトリル溶液（燐酸でpH2.0に調整）
流速：1.0mL/min
検出器：UV検出器（波長210nm）

硫酸ナトリウムを導電剤に用いた酸化型グルタチオンの電解還元
水酸化ナトリウムを加えてpHを7.0にすることで約400g/Lの酸化型グルタチオン水溶液を調製し、これをカチオン交換樹脂に通塔して脱塩することで約350g/Lの過飽和の酸化型グルタチオン水溶液を作製した。該溶液を希釈するとともに硫酸ナトリウムを加え、0.75mol/Lの硫酸ナトリウムを含む310g/Lの酸化型グルタチオン水溶液を作製した。該溶液のpHは2.91であった。

電解槽は、陽極側150mL、陰極側300mLのものを用い、両極槽を50cm²のカチオン交換膜セレミオンCMT（旭硝子社製）で隔てた。陽極には50cm²の白金メッキしたチタン板、陰極には50cm²の亜鉛板を用いた。陽極槽には0.50mol/Lの硫酸溶液140mL、陰極槽には上記で作製した酸化型グルタチオン水溶液280mLを入れた。
電解電圧5〜6V、電解電流3.0A、室温下で10時間、電解還元反応を行った。実施例１と同条件のHPLCで陰極槽内の生成物を定量し、79.7gの還元型グルタチオンが生成していることを確認した（転換率91.8%）。

上記電解還元の条件下では、陰極の腐食はほとんど見られなかったが、上記電解還元条件において、陰極槽溶液として0.75mol/Lの硫酸ナトリウムを含む酸化型グルタチオン水溶液の代わりに、硫酸でpH0.68に調製した150g/Lの酸化型グルタチオン水溶液を用いた場合は、陰極に用いた亜鉛が陰極槽溶液中に溶出している様子が観察された。

過飽和の酸化型グルタチオン水溶液を用いたときの電解還元率
実施例２で調整した約350g/Lの過飽和の酸化型グルタチオン水溶液を希釈して、0.75mol/Lの硫酸ナトリウムを含む、300g/L、200g/L、150g/Lおよび100g/Lの酸化型グルタチオン水溶液を作製した。それぞれの溶液のpHは、いずれも2.89であった。
電解槽、カチオン交換膜、および両極は実施例２と同じものを用いた。陽極槽には0.50mol/Lの硫酸溶液140mL、陰極槽には上記で作製した酸化型グルタチオン水溶液をそれぞれ280mL入れた。

電解電圧5〜7V、電解電流3.0A、室温下で電解還元反応を行った。実施例１と同条件のHPLCで陰極槽内の生成物を定量し、陰極槽に入れる酸化型グルタチオン水溶液の濃度が高いほど電解還元速度は高く、特に150g/L以上で高い電解還元速度が得られることがわかった（図２）。

還元型グルタチオン結晶の製造
実施例２で得られた還元型グルタチオン水溶液を、強酸性陽イオン交換樹脂SK-116（H+）（三菱化学社製）、次いで弱塩基性陰イオン交換樹脂WA-21（OH-）（三菱化学社製）に通過させることで、共存する塩を除去した。得られた還元型グルタチオン含有画分を減圧濃縮し、種晶を添加して晶析させることにより、還元型グルタチオンの結晶を取得した。

本発明の方法により、酸化型グルタチオンの電解還元による還元型グルタチオンの製造が工業的規模で可能となった。

図１において、◇はpH0.6、◆はpH1.2、□はpH2.0、■はpH2.9の還元型グルタチオン水溶液を表す。

Claims

隔膜で隔てられた陰極槽および陽極槽を用いた酸化型グルタチオンの電解還元による還元型グルタチオンの製造法において、陰極槽内の溶液に硫酸塩、硝酸塩、塩素塩、リン酸塩、酢酸塩、及びプロピオン酸塩からなる群より選ばれる中性塩を含有するpH2.0〜3.0の酸化型グルタチオン水溶液を用いること、かつ、当該水溶液を陰極に接触させて電解液として用いることを特徴とする還元型グルタチオンの製造方法。
硫酸塩、硝酸塩、塩素塩、リン酸塩、酢酸塩、及びプロピオン酸塩からなる群より選ばれる中性塩が硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸カリウムまたは塩化カリウムである請求項１記載の製造方法。
硫酸塩、硝酸塩、塩素塩、リン酸塩、酢酸塩、及びプロピオン酸塩からなる群より選ばれる中性塩の濃度が0.05mol/L以上、5.0mol/L以下である請求項１又は２に記載の製造方法。
酸化型グルタチオン水溶液の濃度が50g/L以上である請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
電解還元が電流密度0.1〜30A/dm²で行われることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法で製造された還元型グルタチオンをイオン交換カラムに通塔して脱塩された還元型グルタチオン水溶液を取得し、その後還元型グルタチオンを結晶化させることを特徴とする還元型グルタチオン結晶の製造方法。