BR112020001938A2 - nova psicose-6-fosfato fosfatase, composição para a produção de psicose, incluindo a referida enzima, método para a produção de psicose usando a enzima - Google Patents
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Abstract
O presente pedido se refere a: uma psicose-6-fosfato fosfatase compreendendo o motivo A e o motivo B, uma composição para a produção de D-psicose e inclui a dita enzima; e um método para produção de D-psicose usando a enzima.
Description
"NOVA PSICOSE-6-FOSFATO FOSFATASE, COMPOSIÇÃO PARA A PRODUÇÃO DE PSICOSE, INCLUINDO A REFERIDA ENZIMA, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE PSICOSE USANDO A ENZIMA"
[0001] O presente pedido se refere a uma nova psicose-6-fosfato fosfatase, uma composição para a produção de D-psicose incluindo a enzima e a métodos para a produção de D-psicose usando a enzima.
[0002] D-psicose-3-epimerase (EC 5.1.3.30) e D- tagatose-3-epimerase (EC 5.1.3.31) são conhecidas como enzimas que catalisam a 3-epimerização da D-frutose para produzir D-psicose. Quando a D-psicose é produzida através de uma única reação enzimática usando a enzima, o equilíbrio da reação entre o substrato (isto é, D-frutose) e o produto (isto é, D-psicose) existe em um nível constante (produto/substrato = ~ 20-35%). Assim, a produção de D-psicose de alta pureza requer um processo adicional para separar e remover uma concentração relativamente alta de D-frutose do produto da reação enzimática.
[0003] Por outro lado, Chan e outros, (2008. Biochemistry. 47:9608-9617) relataram D-ribulose-5-fosfato- 3-epimerase (EC 5.1.3.1) derivada de Streptococcus pyogenes e D-psicose 6-fosfato-3-epimerase (EC 5.1.3.-) derivada de E. coli são capazes de catalisar a 3-epimerização de D- frutose-6-fosfato e D-psicose-6-fosfato. No entanto, essas enzimas não são aplicáveis industrialmente devido à sua baixa resistência térmica.
[0004] De acordo com tais circunstâncias, os presentes inventores realizaram seriamente pesquisas para desenvolver um método para aumentar a taxa de conversão de D-psicose em escala industrial de maneira econômica. Como resultado, os presentes inventores descobriram que, após sacarose ou amido (por exemplo, maltodextrina) como matéria-prima barata ser convertido em D-psicose-6-fosfato, o uso de uma psicose-6-fosfato fosfatase específica para D -psicose-6-fosfato e a participação na via irreversível da reação permitem a produção de D-psicose por meio de conversões enzimáticas de um pote com duas ou mais enzimas envolvidas nas vias de produção da D-psicose e podem aumentar significativamente a taxa de conversão em D- psicose. O presente pedido foi realizado com base nessa descoberta.
DESCRIÇÃO Problema Técnico
[0005] É um objetivo do presente pedido fornecer uma nova 6-psicose-6-fosfato fosfatase compreendendo o motivo A e o motivo B.
[0006] É outro objetivo do presente pedido fornecer um ácido nucleico que codifica a psicose-6-fosfato fosfatasE descrita no presente documento e um transformante compreendendo o ácido nucleico.
[0007] É um objetivo adicional do presente pedido fornecer uma composição para a produção de D-psicose compreendendo uma inositol-monofosfatase, um microrganismo que expressa a inositol-monofosfatase ou uma cultura do microrganismo.
[0008] É ainda outro objetivo do presente pedido fornecer um método para a produção de D-psicose compreendendo o contato de uma inositol-monofosfatase, um microrganismo que expressa a inositol-monofosfatase ou uma cultura do microrganismo com D-psicose-6-fosfato para converter D-psicose-6-fosfato em D-psicose. Solução Técnica
[0009] O presente pedido será descrito agora em detalhes. Enquanto isso, as explicações de aspectos e modalidades divulgadas no presente pedido também podem ser aplicadas a explicações de outros aspectos e modalidades. Também, todas as combinações de vários elementos divulgados no presente pedido se enquadram no escopo do presente pedido. Além disso, não se considera que o escopo do presente pedido seja limitado pela descrição detalhada que se segue.
[0010] De modo a alcançar os objetivos acima e outros do presente pedido, um aspecto do presente pedido fornece uma psicose-6-fosfato fosfatase compreendendo o motivo A representado por Xa1-Xa2-Xa3-DPLDG-Xa4 em que Xa1 é W, F, V, I ou A, Xa2 é I, F, V, A ou uma lacuna, Xa3 é V, I ou L, e Xa4 é T ou S e o motivo B representado por Ya1-D-Ya2- Wa1-Ya3-Wa2-Ya4-Wa3 em que Ya1 é W, Y, T, L ou V, Ya2 é V, I, C, F ou A, Wa1 é AAG, AAS, SAG, APG, APF, AGG, APL ou AGA, Ya3 é W, I, P, M, V, Y, F, R, L, T ou S, Wa2 é LLV, LIV, LLI, LII, ILI, FIA, ALV, IIA, VLV, VIL, TIG, NFC ou PIF, Ya4 é E, R, S, T, L, K ou P, e Wa3 é EAGG, EGGG, EAKG, KAGG, AAGG, YVDG, EAGA ou RLGV.
[0011] Especificamente, no motivo A, Xa1 pode ser W ou F, Xa2 pode ser I ou V, Xa3 pode ser V ou I, e Xa4 pode ser T. Especificamente, no motivo B, Ya1 pode ser W, Ya2 pode ser V ou I, Wa1 pode ser AAG, Ya3 pode ser W, I ou V, Wa2 pode ser LLV, LIV, LII ou LLI, Ya4 pode ser E, R ou S, e
Wa3 pode ser EAGG ou EGGG.
[0012] Um ou mais aminoácidos podem estar presentes entre o motivo A e o motivo B, em uma extremidade do motivo A ou em uma extremidade do motivo B. As sequências de aminoácidos que não são o motivo A e o motivo B podem ser definidas a partir das sequências de inositol- mono-fosfatases conhecidas (por exemplo, as sequências que não são o motivo A e o motivo B nas sequências apresentadas nas SEQ ID NOS: 1 a 20).
[0013] O motivo A e/ou motivo B constituem um sítio ativo na sequência da inositol-mono-fosfatase. O motivo A e/ou motivo B também são conhecidos como um local de ligação do fosfato de inositol como um substrato da enzima (vide Federation of European Biochemical Societies, Volume 294, número 1,2, 16-18, dezembro de 1991). Os presentes inventores descobriram que a inositol- monofosfatase exibe uma atividade de psicose-6-fosfato fosfatase. Os presentes inventores também descobriram que o motivo A e/ou motivo B da inositol-monofosfatase podem ser um sítio de ligação ao substrato da fosfatase.
[0014] A psicose-6-fosfato fosfatase pode compreender, por exemplo, qualquer uma das sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NOS: 1 a 20.
[0015] A psicose-6-fosfato fosfatase do presente pedido pode ser uma enzima que tem as funções de inositol- monofosfatases conhecidas.
[0016] A psicose-6-fosfato fosfatase do presente pedido catalisa seletivamente a desfosforilação de D- psicose-6-fosfato e pode ser inespecífica para D-glicose-1- fosfato, D-glicose-6-fosfato ou D-frutose-6-fosfato.
[0017] A psicose-6-fosfato fosfatase do presente pedido pode ser produzida através da transformação de uma cepa com a enzima como ela é ou de DNA que expressa a enzima (por exemplo, SEQ ID NOS: 21 a 40), cultivando a cepa transformada, interrupção da cultura, em seguida purificação. A purificação pode ser realizada por cromatografia em coluna. A cepa pode ser, por exemplo, Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Aspergillus oryzae ou Bacillus subtilis.
[0018] De acordo com uma modalidade do presente pedido, a psicose-6-fosfato fosfatase do presente pedido pode incluir uma enzima que possui uma homologia, semelhança ou identidade de pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% em relação à sequência do motivo A e/ou motivo B e exibe atividade de psicose-6-fosfato fosfatase. Alternativamente, a psicose-6- fosfato fosfatase do presente pedido pode ser uma enzima que tem uma homologia, similaridade ou identidade de pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% em relação às sequências diferentes do motivo A e/ou motivo B. Em uma modalidade, a psicose-6-fosfato fosfatase do presente pedido pode incluir uma proteína consistindo em uma sequência que tem uma homologia, semelhança ou identidade de pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% com a sequência do motivo A e/ou motivo B nas sequências definidas nas SEQ ID NOS: 1 a 20 e tem uma homologia, similaridade ou identidade de pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%,
pelo menos 99% ou 100% em relação à uma sequência de aminoácidos que não seja o motivo A e/ou motivo B nas sequências estabelecidas nas SEQ ID NOS: 1 a 20 ou uma homologia, semelhança ou identidade na faixa definida por qualquer dois dos acima e valores. Por exemplo, qualquer sequência de aminoácidos que tenha a homologia, semelhança ou identidade definida acima e exiba uma eficácia correspondente à da proteína psicose-6-fosfato fosfatase, por exemplo, uma proteína que consiste em qualquer uma das sequências estabelecidas nas SEQ IDS NOS: 1 a 20 e é parcialmente excluída, modificada, substituída ou adicionada também faz parte do escopo do presente pedido.
[0019] As proteínas nas quais sequências irrelevantes são adicionadas a montante e a jusante das sequências do motivo A e do motivo B estão dentro do escopo do presente pedido, e mutações que ocorrem naturalmente ou mutações silenciosas não são excluídas do escopo do presente pedido, desde que, como eles têm uma atividade correspondente à da psicose-6-fosfato fosfatase compreendendo o motivo A e o motivo B. Particularmente, proteínas nas quais sequências irrelevantes são adicionadas a montante e a jusante de qualquer uma das sequências de aminoácidos estabelecidas na SEQ ID NOS: 1 a 20, mutações que ocorrem naturalmente e mutações silenciosas não são excluídas do escopo do presente pedido, desde que tenham uma atividade correspondente à da psicose-6-fosfato fosfatase compreendendo o motivo A e o motivo B. Proteínas que compreendem o motivo A e o motivo B ou proteínas compreendendo as sequências de aminoácidos estabelecidas na SEQ ID NOS: 1 a 20 também estão dentro do escopo do presente pedido, desde que uma vez que possuam uma atividade correspondente à da psicose-6-fosfato fosfatase compreendendo o motivo A e o motivo B.
[0020] Outro aspecto do presente pedido fornece um ácido nucleico que codifica a psicose-6-fosfato fosfatase.
[0021] Como empregado no presente documento, o termo "ácido nucleico" abrange moléculas de DNA e RNA, e um nucleotídeo como uma unidade básica do ácido nucleico inclui um nucleotídeo natural, bem como um análogo com açúcar ou base modificada (vide Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman e Peyman, Chemical Reviews, 90: 543-584 (1990)).
[0022] Especificamente, o ácido nucleico que codifica a psicose-6-fosfato fosfatase pode incluir sequências incluindo nucleotídeos que podem ser traduzidos em motivo A e motivo B. Em uma forma de realização, o ácido nucleico do presente pedido pode consistir em qualquer uma das sequências nucleotídicas estabelecidas nas SEQ ID NOS: 21 a 40. Mais especificamente, o ácido nucleico do presente pedido pode incluir um ácido nucleico que tem uma homologia, semelhança ou identidade de pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99% ou 100% com nucleotídeos que podem ser traduzidos nos motivos A e B e podem exibir a atividade enzimática desejada após a tradução. Especificamente, o ácido nucleico do presente pedido pode incluir um ácido nucleico que tenha uma homologia, similaridade ou identidade de pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99% ou 100% com nucleotídeos que podem ser traduzidos no motivo A e motivo B nas sequências apresentadas na SEQ ID NOS: 21 a 40. Alternativamente, o ácido nucleico do presente pedido pode ser um ácido nucleico que tenha uma homologia, semelhança ou identidade de pelo menos 80%, pelo menos 90%, em pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% a nucleotídeos que podem ser traduzidos em motivos diferentes do motivo A e do motivo B nas sequências estabelecidas na SEQ ID NOS: 21 a 40. Proteínas que podem ser traduzidas em proteínas, incluindo motivo A e motivo B devido à degeneração do códon, especificamente proteínas que consistem em qualquer uma das sequências de aminoácidos estabelecidas na SEQ ID NOS: 1 a 20 ou polinucleotídeos que podem ser traduzidos em proteínas com homologia, semelhança ou identidade com as proteínas consistindo em qualquer uma das sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NOS: 1 a 20 também estão dentro do escopo do presente pedido.
[0023] A enzima compreendendo o motivo A e o motivo B de acordo com o presente pedido pode ser derivada de uma tensão termorresistente ou termofílica. Especificamente, a enzima que consiste em qualquer uma das sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NOS: 1 a 20 pode ser uma enzima derivada de Rhodothermus marinus, Thermotoga lettingae, Meiothermus ruber, Dictyoglomus turgidum, Pyrobaculum ferrireducens, Thermoanaerobacter wiegelii, Thermus thermophilus, Thermococcus litoralis, Geobacillus stearothermophilus, Anaerolinea thermophila, Sulfolobus acidocaldarius, Thermosulfidibacter takaii, Pyrococcus furiosus, Archaeoglobus fulgidus, Alicyclobacillus acidocaldarius, Meiothermus silvanus, Meiothermus rufus, Meiothermus taiwanensis, Meiothermus chliarophilus ou Meiothermus cerbereus.
[0024] Como empregado no presente documento, o termo "homologia" ou "identidade" indica o grau de relação entre duas sequências de aminoácidos ou sequências nucleotídicas fornecidas, que podem ser expressas como uma porcentagem.
[0025] Os termos "homologia" e "identidade" são frequentemente usados de forma intercambiável.
[0026] A homologia ou identidade de sequência de polinucleotídeos ou polipeptídeos conservados é determinada por algoritmos de alinhamento padrão e pode ser usada com penalidades de lacuna padrão estabelecidas pelos programas utilizados. Substancialmente, uma sequência homóloga ou idêntica hibridizaria tipicamente com rigor moderado ou com alto rigor ao longo de pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% do polinucleotídeo ou polipeptídeo de interesse completo. Também são contemplados polinucleotídeos que contêm códons degenerados no lugar de códons nos polinucleotídeos hibridantes.
[0027] No caso de quaisquer duas sequências polinucleotídicas ou polipeptídicas serem homólogas, similares ou idênticas isso pode ser determinado usando algoritmos de computador conhecidos como o programa "FASTA", usando, por exemplo, os parâmetros padrão como em Pearson e outros, (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:
2444. Alternativamente, a homologia, similaridade ou identidade da sequência pode ser determinada usando o algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), conforme implementado no programa Needle do Pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular
Biology Open Software Suite, Rice e outros, 2000, Trends Genet. 16: 276-277), versão n 5.0.0 ou posterior. Outros programas incluem o pacote de programas GCG (Devereux, J. e outros, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.]] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego, 1994, e [CARILLO e outros] (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073). Por exemplo, a ferramenta BLAST do banco de dados NCBI pode ser usada para determinar homologia, similaridade ou identidade. Outros programas disponíveis comercial ou publicamente, como o ClustalW, também podem ser usados.
[0028] A porcentagem de homologia, similaridade ou identidade de polinucleotídeos ou polipeptídeos pode ser determinada, por exemplo, comparando informações da sequência usando um programa de computador GAP (por exemplo, Needleman e outros, (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, como revisado por Smith e Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2: 482). Resumidamente, o programa GAP define similaridade como o número de símbolos alinhados (isto é, nucleotídeos ou aminoácidos) que são semelhantes, dividido pelo número total de símbolos na menor das duas sequências. Os parâmetros padrão para o programa GAP podem incluir: (1) uma matriz de comparação unária (contendo um valor de 1 para identidades e 0 para não identidades) e a matriz de comparação ponderada de Gribskov e outros, (1986) Nucl. Acids Res.14: 6745, como descrito por Schwartz e Dayhoff, orgs., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979); (2) uma penalidade de 3,0 para cada lacuna e uma penalidade adicional de 0,10 para cada símbolo em cada lacuna (ou penalidade de lacuna aberta 10.0, penalidade de extensão da lacuna 0,5); e (3) nenhuma penalidade por lacunas de extremidade. Portanto, os termos "homologia" ou "identidade", conforme empregados no presente documento, indicam comparação entre polipeptídeos ou polinucleotídeos
[0029] Outro aspecto do presente pedido fornece um vetor compreendendo o ácido nucleico que codifica a psicose-6-fosfato fosfatase descrita no presente documento ou um transformante compreendendo o ácido nucleico que codifica a psicose-6-fosfato fosfatase ou o vetor que compreende o ácido nucleico codificando a psicose-6-fosfato fosfatase.
[0030] Como empregado no presente documento, o termo "vetor" se refere a qualquer veículo para a clonagem e/ou transferência de ácido nucleico de bases para uma célula hospedeira. Um vetor pode ser um replicon ao qual outro segmento de DNA pode estar anexado, de modo a provocar a replicação do segmento anexado . Um "replicon" se refere a qualquer elemento genético (por exemplo, plasmídeo, fago, cosmídeo, cromossomo ou vírus) que funciona como uma unidade autônoma de replicação de DNA in vivo, ou seja, capaz de replicação sob seu próprio controle. O termo "vetor" pode incluir veículos virais e não virais para a introdução de ácido nucleico em uma célula hospedeira in vitro, ex vivo ou in vivo. O termo "vetor" também pode incluir DNAs de minicírculos. Especificamente, o vetor compreendendo o ácido nucleico que codifica a psicose-6-fosfato fosfatase de acordo com o presente pedido pode ser pET21a-CJ_Rma, pET21a-CJ_Tle,
pET21a-CJ_Mrub, pET21a-CJ_Dtu, pET21a-CJ_Msi, pET21a- CJ_Mruf, pET21a-CJ_Mta, pET21a-CJ_Mch, pET21a-CJ_Mce, pBT7- C-His-CJ_Pfe, pBT7-C-His-CJ_Twi, pBT7-C-His-CJ_Tth, pBT7-C- His-CJ_Tli, pBT7-C-His-CJ_Gst, pBT7-C-His-CJ_Ath, pBT7-C- His-CJ_Sac, pBT7-C-His-CJ_Tta, pBT7-C-His-CJ_Pfu, pBT7-C- His-CJ_Afu or pBT7-C-His-CJ_Aac.
[0031] Como empregado no presente documento, o termo "transformação" se refere à introdução de um vetor que inclui um ácido nucleico que codifica uma proteína alvo em uma célula hospedeira para expressar a proteína codificada pelo ácido nucleico na célula hospedeira. O ácido nucleico transformado pode ser inserido e localizado no cromossomo da célula hospedeira ou pode existir de modo extracromossômico, desde que possa ser expresso na célula hospedeira. O ácido nucleico inclui DNA e RNA que codificam a proteína alvo. O ácido nucleico pode ser introduzido de qualquer forma, desde que possa ser introduzido e expresso na célula hospedeira. Por exemplo, o ácido nucleico pode ser introduzido na célula hospedeira na forma de um cassete de expressão, que é uma construção genética que inclui todos os elementos necessários para sua expressão autônoma, mas sua forma não é limitada a ela. Tipicamente, a cassete de expressão inclui um promotor operacionalmente anexado ao ácido nucleico, um sinal de terminação de transcrição, um domínio de ligação ao ribossomo e um sinal de terminação de tradução. O cassete de expressão pode estar na forma de um vetor de expressão autorreplicável. O ácido nucleico, tal como é, pode ser introduzido na célula hospedeira e operacionalmente anexado à sequência necessária para expressão na célula hospedeira.
[0032] Como empregado no presente documento, o termo "operacionalmente anexado" se refere a uma ligação funcional entre uma sequência promotora que inicia e é mediadora da transcrição do ácido nucleico que codifica a proteína alvo do presente pedido e uma sequência genética.
[0033] As abreviações e nomes a seguir são utilizados para os aminoácidos mencionados no presente pedido.
[0034] Tabela 1 Tipo de aminoácido Abreviatura Alanina A Arginina R Asparagina N Ácido aspártico D Cisteína C Ácido glutâmico E Glutamina Q Glicina G Histidina H Isoleucina I Leucina L Lisina K Metionina M Fenilalanina F Prolina P Serina S Treonina T Triptofano W Tirosina Y Valina V
[0035] Qualquer método de transformação para introduzir o ácido nucleico em uma célula pode ser usado. O método de transformação pode ser realizado por uma técnica padrão adequada e conhecida na arte, dependendo do tipo de célula hospedeira. Exemplos de tais métodos de transformação incluem, entre outros, eletroporação, precipitação com fosfato de cálcio (CaPO4), precipitação com cloreto de cálcio (CaCl2), infecção retroviral, microinjeção, método do polietilenoglicol (PEG), método DEAE-dextrano, método de lipossoma catiônico e método de acetato de lítio-DMSO.
[0036] As células hospedeiras são preferencialmente células hospedeiras nas quais o DNA é introduzido com alta eficiência e no qual o DNA introduzido é expresso em um nível alto. Exemplos de células hospedeiras incluem, entre outras, células de microrganismos pertencentes aos gêneros Corynebacterium, Escherichia e Serratia. Especificamente, as células hospedeiras podem ser células E. coli.
[0037] O transformante do presente pedido pode ser E. coli BL21 (DE3)/pET21a-CJ_Rma (E. coli_P1_CJ_Rma, KCCM12057P), E. coliBL21 (DE3)/pET21a-CJ_Tle (E. coli_P2_CJ_Tle, KCCM12058P), E. coli BL21 (DE3)/pET21a- CJ_Mrub (E. coli_P3_CJ_Mrub, KCCM12059P), E. coli BL21 (DE3)/pET21a-CJ_Dtu (E. coli_P4_CJ_Dtu, KCCM120), KCCM12058P) pBT7-C-His-CJ_Pfe (E. coli_P5_CJ_Pfe, KCCM12061P), E. coli BL21 (DE3)/pBT7-C-His-CJ_Twi (E. coli_P6_CJ_Twi, KCCM12062P), E.-coli BL21 (DE3) His-CJ_Tth (E. coli_P7_CJ_Tth, KCCM12063P), E. coli BL21 (DE3)/pBT7-C- His-CJ_Tli (E. coli_P8_CJ_Tli, KCCM12064P), E. coli BL21 (DE3)/pBT7-C-C-His E. coli_P9_CJ_Gst, KCCM12065P), E. coliBL21 (DE3)/pBT7-C-His-CJ_Ath (E. coli_P10_CJ_Ath, KCCM12066P), E. coli BL21 (DE3)/pBT7-C-His-CJ_Sac (KCCM12067P), E. coliBL21 (DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tta (E. coli_P12_CJ_Tta, KCCM12068P), E. coli BL21 (DE3)/pBT7-C-
His-CJ_Pfu (E. coli_P13_CJ1P69, KCM12067P) E. coli BL21 (DE3)/pBT7-C-His-CJ_Afu (E. coli_P14_CJ_Afu, KCCM12070P), E. coliBL21 (DE3)/pBT7-C-His-CJ_Aac (E. coli_P15_CJ_Aac, KCCMi2071P), E. coliDE3)/pET21a-CJ_Msi (E. coli_P16_CJ_Msi, KCCM12072P), E. coliBL21 (DE3)/pET21a-CJ_Mruf (E. coli_P17_CJ_Mruf, KCCM12073P), E. coliBL21 (DE3)/pET21a- CJ_Mta (E. coli_P18_CJ_Mta, KCCM12074P), E. coli BL21 (DE3)/pET21a-CJ_Mch (E. coli_P19_CJ_Mch, KCCM12075P) ou E. coli BL21 (DE3)/pET21a-CJ_Mce (E. coli_P20_C20).
[0038] Outro aspecto do presente pedido fornece uma composição para a produção de D-psicose compreendendo uma inositol-monofosfatase, um microrganismo que expressa a inositol-monofosfatase ou uma cultura do microrganismo que expressa a inositol-monofosfatase.
[0039] A inositol-monofosfatase do presente pedido pode incluir o motivo A representado por Xa1-Xa2-Xa3- DPLDG-Xa4 pelo que Xa1 é W, F, V, I ou A, Xa2 é I, F, V, A ou uma folga, Xa3 é V, I ou L, e Xa4 é T ou S e o motivo B representado por Ya1-D-Ya2-Wa1-Ya3-Wa2-Ya4-Wa3 pelo que Ya1 é W, Y, T, L ou V, Ya2 é V, I, C, F ou A, Wa1 é AAG, AAS, SAG, APG, APF, AGG, APL ou AGA, Ya3 é W, I, P, M, V, Y, F, R, L, T ou S, Wa2 é LLV, LIV, LLI, LII, ILI, FIA, ALV, IIA, VLV, VIL, TIG, NFC ou PIF, Ya4 é E, R, S, T, L, K ou P, e Wa3 é EAGG, EGGG, EAKG, KAGG, AAGG, YVDG, EAGA ou RLGV. Ou seja, a inositol-mono-fosfatase pode ser usada de forma intercambiável com a psicose-6-fosfato fosfatase. Assim, as explicações da psicose-6-fosfato fosfatase podem ser aplicadas à inositol-mono-fosfatase. Em uma modalidade, a inositol-monofosfatase pode ser uma enzima que consiste em qualquer uma das sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NOS: 1 a 20.
[0040] A composição do presente pedido pode ainda compreender uma enzima e/ou um substrato envolvido na via de produção de D-psicose (vide figura 1) [(i) amido, maltodextrina, sacarose ou uma combinação dos mesmos; (ii) um fosfato; (iii) uma D-frutose-6-fosfato-3-epimerase; (iv) uma D-glicose-6-fosfato-isomerase; (v) uma fosfoglicomutase ou uma glicocinase; e/ou (vi) uma α-glucana fosforilase, uma amido fosforilase, uma maltodextrina fosforilase, uma sacarose fosforilase, uma α-amilase, uma pululanase, uma isoamilase, uma glicoamilase ou uma sacarase]; um microrganismo que expressa a enzima envolvida na via de produção de D-psicose; ou uma cultura do microrganismo que expressa a enzima envolvida na via de produção da D- psicose. A enzima e substrato adicionais são meramente ilustrativos e não estão limitados, desde que a D-psicose possa ser produzida usando a psicose-6-fosfato fosfatase do presente pedido.
[0041] A amido/maltodextrina fosforilase (EC
2.4.1.1) e a α-glucana fosforilase podem incluir qualquer proteína que seja ativa na transferência de fosforila para glicose de modo a produzir D-glicose-1-fosfato a partir de amido ou maltodextrina. Especificamente, a proteína ativa na produção de D-glicose-1-fosfato a partir de amido ou maltodextrina pode consistir na sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 59. A proteína ativa na produção de D-glicose-1-fosfato a partir de amido ou maltodextrina pode ser codificada pela sequência estabelecida na SEQ ID NO: 60.
[0042] A sacarose fosforilase (EC 2.4.1.7) pode incluir qualquer proteína que seja ativa na transferência de fosforila para glicose de modo a produzir D-glicose-1- fosfato a partir de sacarose.
[0043] A α-amilase (EC 3.2.1.1), pululanase (EC
3.2.1.41), glicoamilase (EC 3.2.1.3) e isoamilase são enzimas de liquefação de amido e podem incluir qualquer proteína que seja ativa na conversão de amido ou maltodextrina em glicose.
[0044] A sacarase (EC 3.2.1.26) pode incluir qualquer proteína que seja ativa na conversão de sacarose em glicose.
[0045] A fosfoglicomutase (EC 5.4.2.2) pode incluir qualquer proteína que seja ativa na conversão de D- glicose-1-fosfato em D-glicose-6-fosfato. Especificamente, a proteína ativa na conversão de D-glicose-1-fosfato em D- glicose-6-fosfato pode compreender a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 61. A proteína ativa na conversão de D-glicose-1-fosfato em D-glicose-6-fosfato pode ser codificada pela sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62.
[0046] A glicocinase pode incluir qualquer proteína que seja ativa na transferência de fosforila para glicose, de modo a converter glicose em D-glicose-6- fosfato. Especificamente, a glicocinase pode ser uma glicocinase dependente de polifosfato. Mais especificamente, a glicocinase pode ser uma proteína que consiste na sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 77 ou 78. A D-glicose-6-fosfato-isomerase pode incluir qualquer proteína que seja ativa na conversão de D-glicose- 6-fosfato em D-frutose-6-fosfato. Especificamente, a D-
glicose-6-fosfato-isomerase pode ser uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 63. A D-glicose-6-fosfato-isomerase pode ser codificada pela sequência estabelecida na SEQ ID NO: 64.
[0047] A D-frutose-6-fosfato-3-epimerase pode incluir qualquer proteína que seja ativa na conversão de D- frutose-6-fosfato em D-psicose-6-fosfato. Especificamente, a D-frutose-6-fosfato-3-epimerase pode ser uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 65. A D-frutose-6-fosfato-3-epimerase pode ser codificada pela sequência estabelecido na SEQ ID NO: 66.
[0048] [48] A composição para a produção de D- psicose de acordo com o presente pedido pode incluir ainda uma proteína que é ativa na conversão de glicose em amido, maltodextrina ou sacarose. A proteína pode ser, por exemplo, uma 4-α-glicanotransferase. A proteína ativa na conversão de glicose em amido, maltodextrina ou sacarose pode ser uma enzima compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 67. Especificamente, a proteína ativa na conversão de glicose em amido, maltodextrina ou sacarose pode ser codificada pelo nucleotídeo sequência apresentada na SEQ ID NO: 68. A composição para produção de D-psicose de acordo com o presente pedido pode ainda incluir qualquer excipiente adequado conhecido na técnica. Exemplos de tais excipientes incluem, mas não estão limitados aos conservantes, agentes umectantes, dispersantes, agentes de suspensão, tampões, estabilizadores e agentes isotônicos.
[0049] A composição para a produção de D-psicose de acordo com o presente pedido pode incluir ainda um íon metálico ou um sal metálico. Em uma modalidade, o íon metálico pode ser um cátion metálico divalente. Especificamente, o íon metálico pode ser selecionado do grupo que consiste em íons Ni, Mg, Co, Mn, Fe e Zn. Mais especificamente, a composição para a produção de D-psicose de acordo com o presente pedido pode incluir ainda um sal metálico. Ainda mais especificamente, o sal metálico pode ser selecionado do grupo que consiste em NiSO4, MgSO4, MgCl2, NiCl2, CoSO4, CoCl2, MnCl2, FeSO4, ZnSO4 e suas misturas.
[0050] Outro aspecto do presente pedido fornece um método para a produção de D-psicose compreendendo o contato de uma inositol-monofosfatase, um microrganismo que expressa a enzima ou uma cultura do microrganismo com D- psicose-6-fosfato para converter o D- psicose-6-fosfato em D-psicose.
[0051] A inositol-mono-fosfatase pode incluir o motivo A representado por Xa1-xa2-xa3-DPLDG-xa4 e o motivo B representado por Ya1-D-Ya2-Wa1-Ya3-Wa2-Ya4-Wa3. No presente documento, a inositol-monofosfatase pode ser utilizada de forma intercambiável com a psicose-6-fosfato fosfatase.
[0052] O método do presente pedido pode incluir ainda, antes da conversão de D-psicose-6-fosfato em D- psicose, a introdução de uma D-frutose-6-fosfato-3- epimerase, um microrganismo que expressa a D-frutose-6- fosfato-3-epimerase ou uma cultura do microrganismo que expressa a D-frutose-6-fosfato-3-epimerase em contato com D-frutose-6-fosfato para converter a D-frutose-6-fosfato em D-psicose-6-fosfato.
[0053] O método do presente pedido pode incluir ainda, antes da conversão de D-frutose-6-fosfato em D- psicose-6-fosfato, trazendo uma D-glicose-6-fosfato- isomerase, um microrganismo que expressa a D-glicose-6- fosfato-isomerase ou uma cultura do microrganismo que expressa a D-glicose-6-fosfato-isomerase em contato com D- glicose-6-fosfato para converter o D-glicose-6-fosfato em D-frutose -6-fosfato.
[0054] O método do presente pedido pode incluir ainda, antes da conversão de D-glicose-6-fosfato em D- frutose-6-fosfato, trazendo uma fosfoglicomutase, um microrganismo que expressa a fosfoglicomutase ou uma cultura do microrganismo que expressa a fosfoglicomutase em contato com D-glicose-1-fosfato para converter a D-glicose- 1-fosfato em D-glicose-6-fosfato.
[0055] O método do presente pedido pode incluir ainda, antes da conversão de D-glicose-6-fosfato em D- frutose-6-fosfato, trazendo uma glicocinase, um microrganismo que expressa a glicocinase ou uma cultura do microrganismo que expressa a glicocinase e um fosfato em contato com a glicose para converter a glicose em D- glicose-6-fosfato.
[0056] O método do presente pedido pode incluir ainda, antes da conversão de D-glicose-1-fosfato em D- glicose-6-fosfato, trazendo uma α-glucana fosforilase, uma amido fosforilase, uma maltodextrina fosforilase ou uma sacarose fosforilase, um microrganismo que expressa a fosforilase ou uma cultura do microrganismo que expressa a fosforilase e um fosfato em contato com amido, maltodextrina, sacarose ou uma combinação dos mesmos para converter o amido, maltodextrina, sacarose ou sua combinação em D-glicose-1-fosfato.
[0057] O método do presente pedido pode incluir ainda, antes da conversão de glicose em D-glicose-6- fosfato, trazer uma α-amilase, uma pululanase, uma glicoamilase, uma sacarase ou uma isoamilase, um microrganismo que expressa a α-amilase, pululanase, glicoamilase, sacarase ou isoamilase ou uma cultura do microrganismo que expressa a α-amilase, pululanase, glicoamilase, sacarase ou isoamilase em contato com amido, maltodextrina, sacarose ou uma combinação dos mesmos para converter amido, maltodextrina, sacarose ou isoamilase ou sua combinação com glicose.
[0058] Ainda outro aspecto do presente pedido fornece um método para produzir D-psicose compreendendo trazer (a) uma inositol-monofosfatase, uma D-frutose-6- fosfato-3-epimerase, uma D-glicose-6-fosfato-isomerase, fosfoglicomutase ou glicocinase e α-glicano fosforilase, fosforilase de amido, fosforilase de maltodextrina, fosforilase de sacarose, α-amilase, pululanase, isoamilase, glicoamilase ou microrganismo expressando as enzimas (a) ou uma cultura do microrganismo em contato com amido, maltodextrina, sacarose ou uma combinação dos mesmos e um fosfato.
[0059] No método do presente pedido, a reação de contato pode ser realizada a um pH de 5,0 a 9,0, especificamente a um pH de 6,0 a 8,0.
[0060] No método do presente pedido, a reação de contato pode ser realizada a uma temperatura de 40ºC a 80ºC, especificamente a uma temperatura de 40ºC a 60ºC ou de 50ºC a 60ºC.
[0061] No método do presente pedido, a reação de contato pode ser realizada por 2 horas a 24 horas, especificamente 6 a 24 horas.
[0062] No método do presente pedido, a reação de contato pode ser realizada a um pH de 5,0 a 9,0, a uma temperatura de 40ºC a 80ºC e/ou por 2 horas a 24 horas. Especificamente, a reação de contato pode ser realizada a um pH de 6,0 a 8,0, a uma temperatura de 40ºC a 60ºC ou 50ºC a 60ºC e/ou por 6 horas a 24 horas.
[0063] O método do presente pedido pode ainda compreender a purificação do produto da reação D-psicose. Não existe nenhuma restrição específica ao método de purificação da D-psicose. A D-psicose pode ser purificada por qualquer método adequado conhecido na técnica. Exemplos não limitativos de tais métodos de purificação incluem cromatografia, cristalização fracionada e purificação de íons, que podem ser realizados sozinhos ou em combinação. Por exemplo, a D-psicose pode ser purificada por cromatografia. Neste caso, o sacarídeo alvo pode ser separado com base em pequenas diferenças na força de ligação entre sacarídeos e íons metálicos anexados a uma resina iônica.
[0064] Cada um dos métodos de acordo com o presente pedido pode ainda compreender branqueamento e/ou desmineralização antes ou após a etapa de purificação. O clareamento e/ou desmineralização tornam a D-psicose mais pura, sem impurezas. Efeitos Vantajosos
[0065] A nova psicose-6-fosfato fosfatase do presente pedido é uma inositol-mono-fosfatase termorresistente. Devido à sua termorresistência, a enzima do presente pedido pode participar do caminho para a conversão de D-psicose-6-fosfato em D-psicose, possibilitando a produção de D-psicose em escala industrial. A utilização da enzima de acordo com o presente pedido permite o caminho para a síntese de D-psicose a partir de glicose ou amido (por exemplo, maltodextrina) como uma matéria-prima barata. Além disso, quando é utilizada a enzima do presente pedido, a D-psicose pode ser produzida através da desfosforilação irreversível da D- psicose-6-fosfato. Portanto, o uso da enzima de acordo com o presente pedido aumenta consideravelmente a taxa de conversão em D-psicose.
[0066] Além disso, os métodos do presente pedido com base no uso da inositol-monofosfatase permitem a produção de uma alta concentração de D-psicose a uma alta taxa de conversão, simplificando ou omitindo a separação e purificação do produto da reação. Portanto, os métodos do presente pedido podem ser realizados de maneira simples e são vantajosos do ponto de vista econômico.
[0067] A figura 1 mostra esquematicamente as vias de reação enzimática para a produção de D-psicose a partir de amido (por exemplo, maltodextrina) ou glicose.
[0068] As figuras 2a, 2b e 2c mostram imagens de gel de SDS-PAGE com marcadores de tamanho (M), coenzimas expressas (S) e enzimas recombinantes purificadas (E) (pET21a-CJ_Rma, pET21a-CJ_Tle, pET21a-CJ_Mrub, pET21a- CJ_Dtu, pBT7-C-His-CJ_Pfe, pBT7-C-His-CJ_Twi, pBT7-C-His- CJ_Tth, pBT7-C-His-CJ_Tli, pBT7-C-His-CJ_Gst, pBT7-C-His-
CJ_Ath, pBT7-C-His-CJ_Sac, pBT7-C-His-CJ_Tta, pBT7-C-His- CJ_Pfu, pBT7-C-His-CJ_Afu, pBT7-C-His-CJ_Aac, pET21a- CJ_Msi, pET21a-CJ_Mruf, pET21a-CJ_Mta, pET21a-CJ_Mch, pET21a-CJ_Mce) para determinar os pesos moleculares dos mesmos, que foram obtidos após eletroforese de proteínas
[0069] A figura 3a mostra as atividades relativas de inositol-monofosfatases(pET21a-CJ_Rma, pET21a- CJ_Tle, pET21a-CJ_Mrub, pET21a-CJ_Dtu, pBT7-C-His-CJ_Pfe, pBT7-C-His-CJ_Twi, pBT7-C-His-CJ_Tth, pBT7-C-His-CJ_Tli, pBT7-C-His-CJ_Gst, pBT7-C-His-CJ_Ath, pBT7-C-His-CJ_Sac, pBT7-C-His-CJ_Tta, pBT7-C-His-CJ_Pfu, pBT7-C-His-CJ_Afu, pBT7-C-His-CJ_Aac) para desfosforilação (%, eixo Y esquerdo, histograma) e as taxas de desfosforilação seletiva pelas inositol-monofosfatases em uma mistura de desfosforilação contendo D-glicose-6-fosfato, D-glicose-1- fosfato, D-frutose-6-fosfato e D-psicose-6-fosfato (%, eixo Y direito, pontos quadrados).
[0070] A figura 3b compara as atividades relativas (%) de inositol-monofosfatases (pET21a-CJ_Mrub, pET21a-CJ_Msi, pET21a-CJ_Mruf, pET21a-CJ_Mta, pET21a- CJ_Mch, pET21a-CJ_Mce) para desfosforilação.
[0071] A figura 4a mostra os cromatogramas de HPLC que confirmam a produção de D-psicose a partir de maltodextrina por meio de múltiplas reações enzimáticas com uma α-glicanofosforilase, uma fosfoglicomutase, uma D- glicose-6-fosfato-isomerase, uma 4-α-glicanotransferase, uma D-frutose-6-fosfato-3-epimerase e uma psicose-6-fosfato fosfatase.
[0072] A figura 4b mostra cromatogramas de HPLC que confirmam a produção de D-psicose através da desfosforilação seletiva de D-psicose-6-fosfato em uma solução de reação contendo D-glicose-1-fosfato, D-glicose- 6-fosfato, D-frutose-6-fosfato e D-psicose-6-fosfato na presença de uma inositol-monofosfatase de acordo com o presente pedido.
[0073] O presente pedido será explicado em detalhes com referência aos seguintes exemplos. No entanto, esses exemplos são fornecidos para ajudar no entendimento do presente pedido e não limitam o escopo do presente pedido.
[0074] EXEMPLOS
[0075] Exemplo 1: Produção de vetores de expressão recombinante de inositol-mono-fosfatases e microrganismos transformados
[0076] Para fornecer psicose-6-fosfato fosfatase necessária para a via de produção de D-psicose, os genes inositol-mono-fosfatase termorresistentes foram classificados. Especificamente, os genes inositol- monofosfatase (Rma, Tle, Mrub, Dtu, Msi, Mruf, Mta, Mch e Mce) foram classificados a partir das sequências genômicas de Rhodothermus marinus, Thermotoga lettingae, Meiothermus ruber, Dictyoglomus turgidum, Pyrobaculum ferrireducens, Thermoanaerobacter wiegelii, Thermus thermophilus, Thermococcus litoralis, Geobacillus stearothermophilus, Anaerolinea thermophila, Sulfolobus acidocaldarius, Thermosulfidibacter takaii, Pyrococcus furiosus, Archaeoglobus fulgidus, Alicyclobacillus acidocaldarius, Meiothermus silvanus, Meiothermus rufus, Meiothermus taiwanensis, Meiothermus chliarophilus, e Meiothermus cerbereus registrado no GenBank.
[0077] Com base em informações sobre as sequências nucleotídicas (SEQ ID NOS: 21, 22, 23, 24, 36, 37, 38, 39 e 40 na ordem dos genes) e as sequências de aminoácidos (SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 16, 17, 18, 19 e 20 na ordem dos genes) dos genes classificados, iniciadores diretos (SEQ ID NOS: 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53 , 55 e 57) e iniciadores reversos (SEQ ID NOS: 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56 e 58) foram projetados. Os genes foram amplificados a partir dos DNAs genômicos de Rhodothermus marinus, Thermotoga lettingae, Meiothermus ruber, Dictyoglomus turgidum, Meiothermus silvanus, Meiothermus rufus, Meiothermus taiwanensis, Meiothermus chliarophilus, e Meiothermus cerbereus por reação da cadeia polimerase (PCR) usando os primers sintetizados. Os genes de inositol- monofosfatase amplificados foram inseridos no vetor plasmídeo pET21a (Novagen) para expressão de E. coli usando as enzimas de restrição NdeI e XhoI ou Sa1I para construir vetores de expressão recombinantes, denominados pET21a- CJ_Rma(Nde I/Xho I), pET21a-CJ_Tle(Nde I/Xho I), pET21a- CJ_Mrub(Nde I/Xho I), pET21a-CJ_Dtu(Nde I/Xho I), pET21a- CJ_Msi(Nde I/Sal I), pET21a-CJ_Mruf(Nde I/Sal I), pET21a- CJ_Mta(Nde I/Sal I), pET21a-CJ_Mch(Nde I/Sal I), and pET21a-CJ_Mce(Nde I/Sal I).
[0078] Além disso, genes de inositol- monofosfatase (Pfe, Twi, Tth, Tli, Gst, Ath, Sac, Tta, Pfu, Afu e Aac) derivados de Pyrobaculum ferrireducens, Thermoanaerobacter wiegelii, Thermus thermophilus, Thermococcus litoralis, Geobacillus stearothermophilus, Anaerolinea thermophila, Sulfolobus acidocaldarius,
Thermosulfidibacter takaii, Pyrococcus furiosus, Archaeoglobus fulgidus, e Alicyclobacillus acidocaldarius foram classificados. Com base em informações sobre as sequências nucleotídicas (SEQ ID NOS: 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 e 35 na ordem dos genes) e as sequências de aminoácidos (SEQ ID NOS: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 e 15 na ordem dos genes) dos genes classificados, a síntese de DNA foi solicitada à Bioneer (Coréia). Os DNAs foram inseridos no vetor pBT7-C-His (Bioneer) para construir vetores de expressão recombinantes, denominados pBT7-C-His-CJ_Pfe, pBT7-C-His-CJ_Twi, pBT7-C-His-CJ_Tth, pBT7-C -His-CJ_Tli, pBT7-C-His-CJ_Gst, pBT7-C-His-CJ_Ath, pBT7-C-His-CJ_Sac, pBT7-C-His-CJ_Tta, pBT7-C-His-CJ_Pfu, pBT7-C-His-CJ_Afu e pBT7-C-His-CJ_Aac.
[0079] Os vetores de expressão foram transformados na cepa E. coli BL21 (DE3) por uma técnica geral de transformação (vide Sambrook e outros, 1989) para produzir microrganismos transformados, denominados E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Rma (E. coli_P1_CJ_Rma, KCCM12057P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Tle (E. coli_P2_CJ_Tle, KCCM12058P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mrub (E. coli_P3_CJ_Mrub, KCCM12059P), E. coli BL21(DE3)/pET21a- CJ_Dtu (E. coli_P4_CJ_Dtu, KCCM12060P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Pfe (E. coli_P5_CJ_Pfe, KCCM12061P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Twi (E. coli_P6_CJ_Twi, KCCM12062P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His- CJ_Tth (E. coli_P7_CJ_Tth, KCCM12063P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tli (E. coli_P8_CJ_Tli, KCCM12064P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Gst (E. coli_P9_CJ_Gst, KCCM12065P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-
CJ_Ath (E. coli_P10_CJ_Ath, KCCM12066P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Sac (E. coli_P11_CJ_Sac, KCCM12067P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tta (E. coli_P12_CJ_Tta, KCCM12068P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His- CJ_Pfu (E. coli_P13_CJ_Pfu, KCCM12069P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Afu (E. coli_P14_CJ_Afu, KCCM12070P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Aac (E. coli_P15_CJ_Aac, KCCM12071P), E. coli BL21(DE3)/pET21a- CJ_Msi (E. coli_P16_CJ_Msi, KCCM12072P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mruf (E. coli_P17_CJ_Mruf, KCCM12073P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mta (E. coli_P18_CJ_Mta, KCCM12074P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mch (E. coli_P19_CJ_Mch, KCCM12075P), and E. coli BL21(DE3)/pET21a- CJ_Mce (E. coli_P20_CJ_Mce, KCCM12076P).
[0080] As cepas transformadas foram depositadas no Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) em 10 de julho de 2017 sob o Tratado de Budapeste (números de acesso: KCCM12057P a KCCM12076P).
[0081] Exemplo 2: Produção de enzimas necessárias para a via de produção de D-psicose
[0082] Para fornecer uma α-glucana fosforilase, uma fosfoglicomutase, uma D-glicose-6-fosfato-isomerase e uma D-frutose-6-fosfato-3-epimerase derivada de Thermotoga neapolitana como enzimas termorresistentes necessárias para a via de produção da D-psicose, os genes correspondentes às enzimas foram classificados (ct1, ct2, tn1 e fp3e na ordem das enzimas).
[0083] Com base nas sequências nucleotídicas (SEQ ID NOS: 60, 62, 64 e 66 na ordem das enzimas) e nas sequências de aminoácidos (SEQ ID NOS: 59, 61, 63 e 65 na ordem das enzimas) dos genes classificados, iniciadores diretos (SEQ ID NOS: 69, 71, 73 e 75) e iniciadores reversos (SEQ ID NOS: 70, 72, 74 e 76) foram projetados. Os genes da enzima foram amplificados a partir do DNA genômico de Thermotoga neapolitana como modelo por reação em cadeia da polimerase (PCR) usando os primers. A PCR foi realizada por um total de 25 ciclos usando as seguintes condições: desnaturação a 95ºC por 30 s, recozimento a 55ºC por 30 s e polimerização a 68ºC por 2 min. Os genes da enzima amplificada foram inseridos no vetor plasmídeo pET21a (Novagen) para a expressão de E. coli usando as enzimas de restrição NdeI e XhoI para construir vetores de expressão recombinantes, denominados pET21a-CJ_ct1, pET21a-CJ_ct2, pET21a-CJ_tn1 e pET21a-CJ_ fp3e. Os vetores de expressão recombinantes foram transformados na cepa E. coli BL21 (DE3) por uma técnica geral de transformação (vide Sambrook e outros, 1989) para produzir microrganismos transformados, denominados E. coli BL21 (DE3)/pET21a-CJ_ct1 (KCCM11990P), E. coli BL21 (DE3)/pET21a-CJ_ct2 (KCCM11991P), E. coli BL21 (DE3)/pET21a-CJ_tn1 (KCCM11992P) e E. coli BL21 (DE3)/CJ_tn_fp3e (KCCM11848P). As cepas foram depositadas no Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM)) em 23 de junho de 2016 sob o Tratado de Budapeste.
[0084] Exemplo 3: Produção de enzimas recombinantes
[0085] Neste exemplo, enzimas recombinantes foram produzidas. Primeiro, um tubo de cultura contendo 5 mL de meio líquido LB foi inoculado com cada um dos microrganismos transformados produzidos nos Exemplos 1 e 2. O inócuo foi cultivado em uma incubadora com agitação a
37ºC até atingir uma absorvância de 2,0 a 600 nm. O caldo de cultura foi adicionado ao meio líquido LB em um balão de cultura, seguido pela cultura principal. Quando a absorvância da cultura a 600 nm atingiu 2,0, foi adicionado 1 mM de IPTG para induzir a expressão e produção de uma enzima recombinante. A temperatura da cultura foi mantida a 37ºC com agitação a 180 rpm. O caldo de cultura foi centrifugado a 8.000 × g e 4ºC por 20 min. para coletar células bacterianas. As células bacterianas coletadas foram lavadas duas vezes com tampão Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) e suspensas no mesmo tampão. Em seguida, as células foram interrompidas usando um homogeneizador ultrassônico. O lisado celular foi centrifugado a 13.000 × g e a 4ºC por 20 min. A enzima recombinante foi purificada a partir do sobrenadante por cromatografia de afinidade com etiqueta His. A enzima recombinante purificada foi dialisada contra tampão Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) e foi então utilizada para a reação subsequente. O peso molecular da enzima recombinante purificada foi determinado por SDS-PAGE.
[0086] Os nomes e pesos moleculares das enzimas purificadas produzidas usando os microrganismos transformados são os seguintes (Figuras 2a, 2b e 2c):
[0087] 30,3 kDa para a enzima (RMA) produzida a partir de E. coli BL21 (DE3)/pET21a-CJ_Rma (E. coli_P1_CJ_Rma);
[0088] 28,5 kDa para a enzima (TLE) produzida a partir de E. coli BL21 (DE3)/pET21a-CJ_Tle (E. coli_P2_CJ_Tle);
[0089] 28 kDa para a enzima (MRUB) produzida a partir de E. coli BL21 (DE3)/pET21a-CJ_Mrub (E.
coli_P3_CJ_Mrub);
[0090] 30,2 kDa para a enzima (DTU) produzida a partir de E. coli BL21 (DE3)/pET21a-CJ_Dtu (E. coli_P4_CJ_Dtu);
[0091] 27,2 kDa para a enzima (PFE) produzida a partir de E. coli BL21 (DE3)/pBT7-C-His-CJ_Pfe (E. coli_P5_CJ_Pfe);
[0092] 28,8 kDa para a enzima (TWI) produzida a partir de E. coli BL21 (DE3)/pBT7-C-His-CJ_Twi (E. coli_P6_CJ_Twi);
[0093] 28,6 kDa para a enzima (TTH) produzida a partir de E. coli BL21 (DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tth (E. coli_P7_CJ_Tth);
[0094] 28 kDa para a enzima (TLI) produzida a partir de E. coli BL21 (DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tli (E. coli_P8_CJ_Tli);
[0095] 29,6 kDa para a enzima (GST) produzida a partir de E. coli BL21 (DE3)/pBT7-C-His-CJ_Gst (E. coli_P9_CJ_Gst);
[0096] 28,7 kDa para a enzima (ATH) produzida a partir de E. coliB L21 (DE3)/pBT7-C-His-CJ_Ath (E. coli_P10_CJ_Ath);
[0097] 29,9 kDa para a enzima (SAC) produzida a partir de E. coli BL21 (DE3)/pBT7-C-His-CJ_Sac (E. coli_P11_CJ_Sac);
[0098] 28,6 kDa para a enzima (TTA) produzida a partir de E. coli BL21 (DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tta (E. coli_P12_CJ_Tta);
[0099] 27,9 kDa para a enzima (PFU) produzida a partir de E. coli BL21 (DE3)/pBT7-C-His-CJ_Pfu (E.
coli_P13_CJ_Pfu);
[00100] 28 kDa para a enzima (AFU) produzida a partir de E. coli BL21 (DE3)/pBT7-C-His-CJ_Afu (E. coli_P14_CJ_Afu);
[00101] 29 kDa para a enzima (AAC) produzida a partir de E. coli BL21 (DE3)/pBT7-C-His-CJ_Aac (E. coli_P15_CJ_Aac);
[00102] 28,1 kDa para a enzima (MSI) produzida a partir de E. coli BL21 (DE3)/pET21a-CJ_Msi (E. coli_P16_CJ_Msi);
[00103] 28 kDa para a enzima (MRUF) produzida a partir de E. coli BL21 (DE3)/pET21a-CJ_Mruf (E. coli_P17_CJ_Mruf);
[00104] 28,1 kDa para a enzima (MTA) produzida a partir de E. coli BL21 (DE3)/pET21a-CJ_Mta (E. coli_P18_CJ_Mta);
[00105] 28,4 kDa para a enzima (MCH) produzida a partir de E. coli BL21 (DE3)/pET21a-CJ_Mch (E. coli_P19_CJ_Mch);
[00106] 28,1 kDa para a enzima (MCE) produzida a partir de E. coli BL21 (DE3)/pET21a-CJ_Mce (E. coli_P20_CJ_Mce);
[00107] A enzima (CT1) produzida a partir de E. coli BL21 (DE3)/pET21a-CJ_ct1 (KCCM11990P);
[00108] A enzima (CT2) produzida a partir de E. coli BL21 (DE3)/pET21a-CJ_ct2 (KCCM11991P);
[00109] A enzima (TN1) produzida a partir de E. coliBL21 (DE3)/pET21a-CJ_tn1 (KCCM11992P); e
[00110] A enzima (FP3E) produzida a partir de E. coliBL21 (DE3)/CJ_tn_fp3e (KCCM11848P).
[00111] Exemplo 4: Análise de atividades das inositol-mono-fosfatases
[00112] 4-1. Análise das atividades das psicose- 6-fosfato fosfatases
[00113] Foi difícil comprar psicose-6-fosfato. Assim, os inventores produziram diretamente D-psicose-6- fosfato a partir de D-frutose-6-fosfato e investigaram as atividades das inositol-mono-fosfatases para a produção de D-psicose.
[00114] Especificamente, D-frutose-6-fosfato 50 mM foi suspenso em Tris-HCl 50 mM (pH 7,0) e, em seguida, a D-frutose-6-fosfato-3-epimerase (FP3E) produzida no exemplo 3 e 0,1 unidade/mL de cada uma das 20 inositol- monofosfatases foram adicionadas. A mistura foi deixada reagir a 70ºC por 1 h. A produção de D-psicose foi confirmada por HPLC (coluna SP_0810 (Shodex), coluna Aminex HPX-87C (Bio-RAD), 80ºC, taxa de fluxo de fase móvel 0,6 mL/min., detector de índice de refração).
[00115] A potência de desfosforilação de todas as 20 inositol-monofosfatases para D-psicose-6-fosfato foi investigada (Figuras 3a e 3b).
[00116] 4-2. Análise das atividades das inositol- mono-fosfatases para desfosforilação específica de D- psicose-6-fosfato
[00117] As taxas de desfosforilação específica de D-psicose-6-fosfato em uma mistura contendo D-glicose-6- fosfato, D-glicose-1-fosfato, D-frutose-6-fosfato e D- psicose-6-fosfato foram medidas na presença de inositol- mono-fosfatases.
[00118] Especificamente, 0,1 unidade/mL de cada uma das inositol-monofosfatases e 5 mM de MgCl2 foram adicionados a uma mistura de 1% (p/v) de D-glicose-6- fosfato, D-glicose-1-fosfato a 1% (p/v), D-frutose-6- fosfato e D-psicose-6-fosfato. A reação foi deixada prosseguir a 50ºC por 12 h. Os produtos da reação foram analisados por HPLC (coluna Aminex HPX-87C (Bio-RAD), 80ºC, taxa de fluxo da fase móvel 0,6 mL/min.). Um detector de índice de refração foi utilizado para detectar a produção de D-psicose e outros sacarídeos (frutose e glicose).
[00119] Como resultado, a enzima MRUB mostrou a maior taxa de desfosforilação específica de D-psicose-6- fosfato (Figura 3a).
[00120] Exemplo 5: Análise de atividades das enzimas através de múltiplas reações enzimáticas
[00121] Para a produção de D-psicose a partir de maltodextrina, as enzimas CT1, CT2, TN1, FP3E e MRUB foram deixadas reagir simultaneamente com maltodextrina. Adicionou-se maltodextrina a 5% (p/v) a 0,1 unidade/ml de cada enzima, MgCl2 5 mM e fosfato de sódio 20 mM (pH 7,0). A mistura foi deixada reagir a uma temperatura de 50ºC por 12 h. Os produtos da reação foram analisados por HPLC (coluna Aminex HPX-87C (Bio-RAD), 80ºC, taxa de fluxo da fase móvel 0,6 mL/min.), detector de índice de refração).
[00122] Como resultado, a produção de D-psicose a partir de maltodextrina através de múltiplas reações enzimáticas foi confirmada (Figura 4a).
[00123] Embora a modalidade do presente pedido tenha sido descrita em detalhes, será entendido pelos versados na técnica que o pedido pode ser implementado em outras formas específicas sem alterar o espírito ou os recursos essenciais do mesmo.
Portanto, deve-se notar que as modalidades anteriores são meramente ilustrativas em todos os aspectos e não devem ser interpretadas como limitantes do pedido.
O escopo do pedido é definido pelas reivindicações anexas, e não pela descrição detalhada do pedido.
Todas as alterações ou modificações ou seus equivalentes feitos dentro dos significados e escopo das reivindicações devem ser interpretados como abrangidos pelo escopo do pedido.
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B. IDENTIFICAÇÃO DO DEPÓSITO Depósitos adicionais são identificados em uma folha adicional □ Nome da instituição depositária Korean Culture Center of Microrganisms (KCCM) Endereço da instituição depositária (incluindo código postal e país) Yurim Building, Hongjenae-2ga-gil 45, Seodaemun-Gu, Seoul, 120-091, República da Coreia Data de depósito Número de acesso 10 de julho de 2017 KCCM12057P C. INDICAÇÕES ADICIONAIS (deixar em branco se não aplicável) Esta informação continua em uma folha adicional □ D. PAÍSES DESIGNADOS PARA OS QUAIS SÃO FEITAS INDICAÇÕES (se as indicações não forem para todos os Países designados) E. FORNECIMENTO DE INDICAÇÕES EM SEPARADO (deixar em branco se não aplicável) As indicações listadas a seguir serão submetidas, posteriormente, ao International Bureau (especifique a natureza geral das indicações, por exemplo, "Número de acesso do Depósito") Para uso apenas do Departamento Para uso apenas do International receptor Bureau Esta folha foi recebida com o Esta folha foi recebida pelo pedido internacional International Bureau em: Oficial autorizado Oficial autorizado Formulário PCT/RO/134 (julho de 1998; reimpressão em janeiro de 2004)
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B. IDENTIFICAÇÃO DO DEPÓSITO Depósitos adicionais são identificados em uma folha adicional □ Nome da instituição depositária Korean Culture Center of Microrganisms (KCCM) Endereço da instituição depositária (incluindo código postal e país) Yurim Building, Hongjenae-2ga-gil 45, Seodaemun-Gu, Seoul, 120-091, República da Coreia Data de depósito Número de acesso 10 de julho de 2017 KCCM12069P C. INDICAÇÕES ADICIONAIS (deixar em branco se não aplicável) Esta informação continua em uma folha adicional □ D. PAÍSES DESIGNADOS PARA OS QUAIS SÃO FEITAS INDICAÇÕES (se as indicações não forem para todos os Países designados) E. FORNECIMENTO DE INDICAÇÕES EM SEPARADO (deixar em branco se não aplicável) As indicações listadas a seguir serão submetidas, posteriormente, ao International Bureau (especifique a natureza geral das indicações, por exemplo, "Número de acesso do Depósito") Para uso apenas do Departamento Para uso apenas do International receptor Bureau Esta folha foi recebida com o Esta folha foi recebida pelo pedido internacional International Bureau em: Oficial autorizado Oficial autorizado Formulário PCT/RO/134 (julho de 1998; reimpressão em janeiro de 2004)
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OU OUTRO MATERIAL BIOLÓGICO (Norma PCT 13bis) A. As indicações abaixo se referem ao microrganismo depositado ou outro material biológico referido na descrição, página __9__, linha ___16 (Relatório do PCT). B. IDENTIFICAÇÃO DO DEPÓSITO Depósitos adicionais são identificados em uma folha adicional □ Nome da instituição depositária Korean Culture Center of Microrganisms (KCCM) Endereço da instituição depositária (incluindo código postal e país) Yurim Building, Hongjenae-2ga-gil 45, Seodaemun-Gu, Seoul, 120-091, República da Coreia Data de depósito Número de acesso 10 de julho de 2017 KCCM12070P C. INDICAÇÕES ADICIONAIS (deixar em branco se não aplicável) Esta informação continua em uma folha adicional □ D. PAÍSES DESIGNADOS PARA OS QUAIS SÃO FEITAS INDICAÇÕES (se as indicações não forem para todos os Países designados) E. FORNECIMENTO DE INDICAÇÕES EM SEPARADO (deixar em branco se não aplicável) As indicações listadas a seguir serão submetidas, posteriormente, ao International Bureau (especifique a natureza geral das indicações, por exemplo, "Número de acesso do Depósito") Para uso apenas do Departamento Para uso apenas do International receptor Bureau Esta folha foi recebida com o Esta folha foi recebida pelo pedido internacional International Bureau em: Oficial autorizado Oficial autorizado Formulário PCT/RO/134 (julho de 1998; reimpressão em janeiro de 2004)
Referência do depósito do requerente Número do Pedido Internacional ou agente P18-6064
OU OUTRO MATERIAL BIOLÓGICO (Norma PCT 13bis) A. As indicações abaixo se referem ao microrganismo depositado ou outro material biológico referido na descrição, página __9__, linha __17_ (Relatório do PCT).
B. IDENTIFICAÇÃO DO DEPÓSITO Depósitos adicionais são identificados em uma folha adicional □ Nome da instituição depositária Korean Culture Center of Microrganisms (KCCM) Endereço da instituição depositária (incluindo código postal e país) Yurim Building, Hongjenae-2ga-gil 45, Seodaemun-Gu, Seoul, 120-091, República da Coreia Data de depósito Número de acesso 10 de julho de 2017 KCCM12071P C. INDICAÇÕES ADICIONAIS (deixar em branco se não aplicável) Esta informação continua em uma folha adicional □ D. PAÍSES DESIGNADOS PARA OS QUAIS SÃO FEITAS INDICAÇÕES (se as indicações não forem para todos os Países designados) E. FORNECIMENTO DE INDICAÇÕES EM SEPARADO (deixar em branco se não aplicável) As indicações listadas a seguir serão submetidas, posteriormente, ao International Bureau (especifique a natureza geral das indicações, por exemplo, "Número de acesso do Depósito") Para uso apenas do Departamento Para uso apenas do International receptor Bureau Esta folha foi recebida com o Esta folha foi recebida pelo pedido internacional International Bureau em: Oficial autorizado Oficial autorizado Formulário PCT/RO/134 (julho de 1998; reimpressão em janeiro de 2004)
Referência do depósito do requerente Número do Pedido Internacional ou agente P18-6064
OU OUTRO MATERIAL BIOLÓGICO (Norma PCT 13bis) A. As indicações abaixo se referem ao microrganismo depositado ou outro material biológico referido na descrição, página __9__, linha_18__ (Relatório do PCT).
B. IDENTIFICAÇÃO DO DEPÓSITO Depósitos adicionais são identificados em uma folha adicional □ Nome da instituição depositária Korean Culture Center of Microrganisms (KCCM) Endereço da instituição depositária (incluindo código postal e país) Yurim Building, Hongjenae-2ga-gil 45, Seodaemun-Gu, Seoul, 120-091, República da Coreia Data de depósito Número de acesso 10 de julho de 2017 KCCM12072P C. INDICAÇÕES ADICIONAIS (deixar em branco se não aplicável) Esta informação continua em uma folha adicional □ D. PAÍSES DESIGNADOS PARA OS QUAIS SÃO FEITAS INDICAÇÕES (se as indicações não forem para todos os Países designados) E. FORNECIMENTO DE INDICAÇÕES EM SEPARADO (deixar em branco se não aplicável) As indicações listadas a seguir serão submetidas, posteriormente, ao International Bureau (especifique a natureza geral das indicações, por exemplo, "Número de acesso do Depósito") Para uso apenas do Departamento Para uso apenas do International receptor Bureau Esta folha foi recebida com o Esta folha foi recebida pelo pedido internacional International Bureau em: Oficial autorizado Oficial autorizado Formulário PCT/RO/134 (julho de 1998; reimpressão em janeiro de 2004)
Referência do depósito do requerente Número do Pedido Internacional ou agente P18-6064
OU OUTRO MATERIAL BIOLÓGICO (Norma PCT 13bis) A. As indicações abaixo se referem ao microrganismo depositado ou outro material biológico referido na descrição, página __9_, linha ____19_ (Relatório do PCT). B. IDENTIFICAÇÃO DO DEPÓSITO Depósitos adicionais são identificados em uma folha adicional □ Nome da instituição depositária Korean Culture Center of Microrganisms (KCCM) Endereço da instituição depositária (incluindo código postal e país) Yurim Building, Hongjenae-2ga-gil 45, Seodaemun-Gu, Seoul, 120-091, República da Coreia Data de depósito Número de acesso 10 de julho de 2017 KCCM12073P C. INDICAÇÕES ADICIONAIS (deixar em branco se não aplicável) Esta informação continua em uma folha adicional □ D. PAÍSES DESIGNADOS PARA OS QUAIS SÃO FEITAS INDICAÇÕES (se as indicações não forem para todos os Países designados) E. FORNECIMENTO DE INDICAÇÕES EM SEPARADO (deixar em branco se não aplicável) As indicações listadas a seguir serão submetidas, posteriormente, ao International Bureau (especifique a natureza geral das indicações, por exemplo, "Número de acesso do Depósito") Para uso apenas do Departamento Para uso apenas do International receptor Bureau Esta folha foi recebida com o Esta folha foi recebida pelo pedido internacional International Bureau em: Oficial autorizado Oficial autorizado Formulário PCT/RO/134 (julho de 1998; reimpressão em janeiro de 2004)
Referência do depósito do requerente Número do Pedido Internacional ou agente P18-6064
OU OUTRO MATERIAL BIOLÓGICO (Norma PCT 13bis) A. As indicações abaixo se referem ao microrganismo depositado ou outro material biológico referido na descrição, página __9__, linha __20. (Relatório do PCT) B. IDENTIFICAÇÃO DO DEPÓSITO Depósitos adicionais são identificados em uma folha adicional □ Nome da instituição depositária Korean Culture Center of Microrganisms (KCCM) Endereço da instituição depositária (incluindo código postal e país) Yurim Building, Hongjenae-2ga-gil 45, Seodaemun-Gu, Seoul, 120-091, República da Coreia Data de depósito Número de acesso 10 de julho de 2017 KCCM12074P C. INDICAÇÕES ADICIONAIS (deixar em branco se não aplicável) Esta informação continua em uma folha adicional □ D. PAÍSES DESIGNADOS PARA OS QUAIS SÃO FEITAS INDICAÇÕES (se as indicações não forem para todos os Países designados) E. FORNECIMENTO DE INDICAÇÕES EM SEPARADO (deixar em branco se não aplicável) As indicações listadas a seguir serão submetidas, posteriormente, ao International Bureau (especifique a natureza geral das indicações, por exemplo, "Número de acesso do Depósito") Para uso apenas do Departamento Para uso apenas do International receptor Bureau Esta folha foi recebida com o Esta folha foi recebida pelo pedido internacional International Bureau em: Oficial autorizado Oficial autorizado Formulário PCT/RO/134 (julho de 1998; reimpressão em janeiro de 2004)
Referência do depósito do requerente Número do Pedido Internacional ou agente P18-6064
OU OUTRO MATERIAL BIOLÓGICO (Norma PCT 13bis) A. As indicações abaixo se referem ao microrganismo depositado ou outro material biológico referido na descrição, página __9_, linha _21_ (Relatório do PCT). B. IDENTIFICAÇÃO DO DEPÓSITO Depósitos adicionais são identificados em uma folha adicional □ Nome da instituição depositária Korean Culture Center of Microrganisms (KCCM) Endereço da instituição depositária (incluindo código postal e país) Yurim Building, Hongjenae-2ga-gil 45, Seodaemun-Gu, Seoul, 120-091, República da Coreia Data de depósito Número de acesso 10 de julho de 2017 KCCM12075P C. INDICAÇÕES ADICIONAIS (deixar em branco se não aplicável) Esta informação continua em uma folha adicional □ D. PAÍSES DESIGNADOS PARA OS QUAIS SÃO FEITAS INDICAÇÕES (se as indicações não forem para todos os Países designados) E. FORNECIMENTO DE INDICAÇÕES EM SEPARADO (deixar em branco se não aplicável) As indicações listadas a seguir serão submetidas, posteriormente, ao International Bureau (especifique a natureza geral das indicações, por exemplo, "Número de acesso do Depósito") Para uso apenas do Departamento Para uso apenas do International receptor Bureau Esta folha foi recebida com o Esta folha foi recebida pelo pedido internacional International Bureau em: Oficial autorizado Oficial autorizado Formulário PCT/RO/134 (julho de 1998; reimpressão em janeiro de 2004)
Referência do depósito do requerente Número do Pedido Internacional ou agente P18-6064
OU OUTRO MATERIAL BIOLÓGICO (Norma PCT 13bis) A. As indicações abaixo se referem ao microrganismo depositado ou outro material biológico referido na descrição, página __9__, linha __22__ (Relatório do PCT).
B. IDENTIFICAÇÃO DO DEPÓSITO Depósitos adicionais são identificados em uma folha adicional □ Nome da instituição depositária Korean Culture Center of Microrganisms (KCCM) Endereço da instituição depositária (incluindo código postal e país) Yurim Building, Hongjenae-2ga-gil 45, Seodaemun-Gu, Seoul, 120-091, República da Coreia Data de depósito Número de acesso 10 de julho de 2017 KCCM12076P C. INDICAÇÕES ADICIONAIS (deixar em branco se não aplicável) Esta informação continua em uma folha adicional □ D. PAÍSES DESIGNADOS PARA OS QUAIS SÃO FEITAS INDICAÇÕES (se as indicações não forem para todos os Países designados) E. FORNECIMENTO DE INDICAÇÕES EM SEPARADO (deixar em branco se não aplicável) As indicações listadas a seguir serão submetidas, posteriormente, ao International Bureau (especifique a natureza geral das indicações, por exemplo, "Número de acesso do Depósito") Para uso apenas do Departamento Para uso apenas do International receptor Bureau Esta folha foi recebida com o Esta folha foi recebida pelo pedido internacional International Bureau em: Oficial autorizado Oficial autorizado Formulário PCT/RO/134 (julho de 1998; reimpressão em janeiro de 2004)
Referência do depósito do requerente Número do Pedido Internacional ou agente P18-6064
OU OUTRO MATERIAL BIOLÓGICO (Norma PCT 13bis) A. As indicações abaixo se referem ao microrganismo depositado ou outro material biológico referido na descrição, página __18, linha __2__ (Relatório do PCT).
B. IDENTIFICAÇÃO DO DEPÓSITO Depósitos adicionais são identificados em uma folha adicional □ Nome da instituição depositária Korean Culture Center of Microrganisms (KCCM) Endereço da instituição depositária (incluindo código postal e país) Yurim Building, Hongjenae-2ga-gil 45, Seodaemun-Gu, Seoul, 120-091, República da Coreia Data de depósito Número de acesso 20 de março de 2017 KCCM11990P C. INDICAÇÕES ADICIONAIS (deixar em branco se não aplicável) Esta informação continua em uma folha adicional □ D. PAÍSES DESIGNADOS PARA OS QUAIS SÃO FEITAS INDICAÇÕES (se as indicações não forem para todos os Países designados) E. FORNECIMENTO DE INDICAÇÕES EM SEPARADO (deixar em branco se não aplicável) As indicações listadas a seguir serão submetidas, posteriormente, ao International Bureau (especifique a natureza geral das indicações, por exemplo, "Número de acesso do Depósito") Para uso apenas do Departamento Para uso apenas do International receptor Bureau Esta folha foi recebida com o Esta folha foi recebida pelo pedido internacional International Bureau em: Oficial autorizado Oficial autorizado Formulário PCT/RO/134 (julho de 1998; reimpressão em janeiro de 2004)
Referência do depósito do requerente Número do Pedido Internacional ou agente P18-6064
OU OUTRO MATERIAL BIOLÓGICO (Norma PCT 13bis) A. As indicações abaixo se referem ao microrganismo depositado ou outro material biológico referido na descrição na página __18__________________________ , linha ____3_____________________ (Relatório do PCT). B. IDENTIFICAÇÃO DO DEPÓSITO Depósitos adicionais são identificados em uma folha adicional □ Nome da instituição depositária Korean Culture Center of Microrganisms (KCCM) Endereço da instituição depositária (incluindo código postal e país) Yurim Building, Hongjenae-2ga-gil 45, Seodaemun-Gu, Seoul, 120-091, República da Coreia Data de depósito Número de acesso 20 de março de 2017 KCCM11991P C. INDICAÇÕES ADICIONAIS (deixar em branco se não aplicável) Esta informação continua em uma folha adicional □ D. PAÍSES DESIGNADOS PARA OS QUAIS SÃO FEITAS INDICAÇÕES (se as indicações não forem para todos os Países designados) E. FORNECIMENTO DE INDICAÇÕES EM SEPARADO (deixar em branco se não aplicável) As indicações listadas a seguir serão submetidas, posteriormente, ao International Bureau (especifique a natureza geral das indicações, por exemplo, "Número de acesso do Depósito") Para uso apenas do Departamento Para uso apenas do International receptor Bureau Esta folha foi recebida com o Esta folha foi recebida pelo pedido internacional International Bureau em: Oficial autorizado Oficial autorizado Formulário PCT/RO/134 (julho de 1998; reimpressão em janeiro de 2004)
Referência do depósito do requerente Número do Pedido Internacional ou agente P18-6064
OU OUTRO MATERIAL BIOLÓGICO (Norma PCT 13bis) A. As indicações abaixo se referem ao microrganismo depositado ou outro material biológico referido na descrição, página __18_, linha ____4_ (Relatório do PCT).
B. IDENTIFICAÇÃO DO DEPÓSITO Depósitos adicionais são identificados em uma folha adicional □ Nome da instituição depositária Korean Culture Center of Microrganisms (KCCM) Endereço da instituição depositária (incluindo código postal e país) Yurim Building, Hongjenae-2ga-gil 45, Seodaemun-Gu, Seoul, 120-091, República da Coreia Data de depósito Número de acesso 20 de março de 2017 KCCM11992P C. INDICAÇÕES ADICIONAIS (deixar em branco se não aplicável) Esta informação continua em uma folha adicional □ D. PAÍSES DESIGNADOS PARA OS QUAIS SÃO FEITAS INDICAÇÕES (se as indicações não forem para todos os Países designados) E. FORNECIMENTO DE INDICAÇÕES EM SEPARADO (deixar em branco se não aplicável) As indicações listadas a seguir serão submetidas, posteriormente, ao International Bureau (especifique a natureza geral das indicações, por exemplo, "Número de acesso do Depósito") Para uso apenas do Departamento Para uso apenas do International receptor Bureau Esta folha foi recebida com o Esta folha foi recebida pelo pedido internacional International Bureau em: Oficial autorizado Oficial autorizado Formulário PCT/RO/134 (julho de 1998; reimpressão em janeiro de 2004)
Referência do depósito do requerente Número do Pedido Internacional ou agente P18-6064
OU OUTRO MATERIAL BIOLÓGICO (Norma PCT 13bis) A. As indicações abaixo se referem ao microrganismo depositado ou outro material biológico referido na descrição, página __18_ , linha_5__ (Relatório do PCT).
B. IDENTIFICAÇÃO DO DEPÓSITO Depósitos adicionais são identificados em uma folha adicional □ Nome da instituição depositária Korean Culture Center of Microrganisms (KCCM) Endereço da instituição depositária (incluindo código postal e país) Yurim Building, Hongjenae-2ga-gil 45, Seodaemun-Gu, Seoul, 120-091, República da Coreia Data de depósito Número de acesso 23 de junho de 2016 KCCM11848P C. INDICAÇÕES ADICIONAIS (deixar em branco se não aplicável) Esta informação continua em uma folha adicional □ D. PAÍSES DESIGNADOS PARA OS QUAIS SÃO FEITAS INDICAÇÕES (se as indicações não forem para todos os Países designados) E. FORNECIMENTO DE INDICAÇÕES EM SEPARADO (deixar em branco se não aplicável) As indicações listadas a seguir serão submetidas, posteriormente, ao International Bureau (especifique a natureza geral das indicações, por exemplo, "Número de acesso do Depósito") Para uso apenas do Departamento Para uso apenas do International receptor Bureau Esta folha foi recebida com o Esta folha foi recebida pelo pedido internacional International Bureau em: Oficial autorizado Oficial autorizado Formulário PCT/RO/134 (julho de 1998; reimpressão em janeiro de 2004)
Claims (19)
1. Psicose-6-fosfato fosfatase compreendendo o motivo A representado por Xa1-Xa2-Xa3-DPLDG-Xa4 em que Xa1 é W, F, V, I ou A, Xa2 é I, F, V, A ou ausente, Xa3 é V, I ou L, e Xa4 é T ou S e o motivo B representado por Ya1-D-Ya2- Wa1-Ya3-Wa2-Ya4-Wa3 em que Ya1 é W, Y, T, L ou V, Ya2 é V, I, C, F ou A, Wa1 é AAG, AAS, SAG, APG, APF, AGG, APL ou AGA, Ya3 é W, I, P, M, V, Y, F, R, L, T ou S, Wa2 é LLV, LIV, LLI, LII, ILI, FIA, ALV, IIA, VLV, VIL, TIG, NFC ou PIF, Ya4 é E, R, S, T, L, K ou P, e Wa3 é EAGG, EGGG, EAKG, KAGG, AAGG, YVDG, EAGA ou RLGV.
2. Psicose-6-fosfato fosfatase de acordo com a reivindicação 1, em que, no motivo A, Xa1 é W ou F, Xa2 é I ou V, Xa3 é V ou I e Xa4 é T; e no motivo B, Ya1 é W, Ya2 é V ou I, Wa1 é AAG, Ya3 é W, I ou V, Wa2 é LLV, LIV, LII ou LLI, Ya4 é E, R ou S e Wa3 é EAGG ou EGGG.
3. A psicose-6-fosfato fosfatase de acordo com a reivindicação 1, em que a psicose-6-fosfato fosfatase compreende qualquer uma das sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 e 20 ou uma sequência com uma identidade de pelo menos 85% a uma sequência de aminoácidos diferente do motivo A e do motivo B no sequências estabelecidas na SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 e 20.
4. Psicose-6-fosfato fosfatase, de acordo com a reivindicação 3, em que a psicose-6-fosfato fosfatase consiste na sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 é codificada pela sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 , 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40, respectivamente.
5. Ácido nucleico que codifica a psicose-6- fosfato fosfatase de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
6. Transformante compreendendo o ácido nucleico de acordo com a reivindicação 5.
7. Composição para a produção de D-psicose compreendendo uma inositol-mono-fosfatase, um microrganismo que expressa a enzima ou uma cultura do microrganismo.
8. Composição, de acordo com a reivindicação 7, em que a inositol-mono-fosfatase é a psicose-6-fosfato fosfatase de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a
4.
9. Composição, de acordo com a reivindicação 8, compreendendo ainda: (a) amido, maltodextrina, sacarose ou uma combinação dos mesmos, (ii) um fosfato, (iii) uma D- frutose-6-fosfato-3-epimerase, (iv) uma D-glicose-6- fosfato-isomerase, (v) uma fosfoglicomutase ou uma glicocinase, e (vi) uma α-glucana fosforilase, uma fosforilase de amido, uma fosforilase de maltodextrina, uma fosforilase de sacarose, uma α-amilase, uma pululanase, uma isoamilase, uma glicoamilase ou uma sacarase; ou (b) um microrganismo que expressa as enzimas (a) ou uma cultura do microrganismo.
10. Método para produzir D-psicose compreendendo o contato da enzima de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou uma inositol-monofosfatase, um microrganismo que expressa a enzima ou uma cultura do microrganismo com D-psicose-6-fosfato para converter a D- psicose-6-fosfato para D-psicose.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a inositol-mono-fosfatase é a psicose-6-fosfato fosfatase de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a
4.】
12. Método de acordo com a reivindicação 10, compreendendo ainda, antes da conversão de D-psicose-6- fosfato em D-psicose, promover o contato de uma D-frutose- 6-fosfato-3-epimerase, um microrganismo que expressa a D- frutose-6-fosfato-3-epimerase ou uma cultura do microrganismo com D-frutose-6-fosfato para converter a D- frutose-6-fosfato em D-psicose-6-fosfato.
13. Método, de acordo com a reivindicação 11, compreendendo ainda, antes da conversão de D-frutose-6- fosfato em D-psicose-6-fosfato, promoção do contato de D- glicose-6-fosfato-isomerase, um microrganismo que expressa a D-glicose-6-fosfato-isomerase ou uma cultura do microrganismo com D-glicose-6-fosfato para converter a D- glicose-6-fosfato em D-frutose-6-fosfato.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, compreendendo ainda, antes da conversão de D-glicose-6- fosfato em D-frutose-6-fosfato, promoção do cotato de uma fosfoglicomutase, um microrganismo que expressa a fosfoglicomutase ou uma cultura do microrganismo com D - glicose-1-fosfato para converter a D-glicose-1-fosfato em D-glicose-6-fosfato.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, compreendendo ainda, antes da conversão de D-glicose-6- fosfato em D-frutose-6-fosfato, promoção do contato de glicocinase, um microrganismo que expressa a glicocinase ou uma cultura do microrganismo e um fosfato com glicose para converter a glicose em D-glicose-6-fosfato.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, compreendendo ainda, antes da conversão de D-glicose-1- fosfato em D-glicose-6-fosfato, promoção do contato de α- glucana fosforilase, uma amido fosforilase, uma maltodextrina fosforilase ou uma sacarose fosforilase, um microrganismo que expressa a fosforilase ou uma cultura do microrganismo e um fosfato com amido, maltodextrina, sacarose ou uma combinação dos mesmos para converter o amido, maltodextrina, sacarose ou combinação dos mesmos em D-glicose-1-fosfato.
17. Método de acordo com a reivindicação 15, compreendendo ainda, antes da conversão de glicose em D- glicose-6-fosfato, promoção do contato de α-amilase, uma pululanase, uma glicoamilase, uma sacarase ou uma isoamilase, um microrganismo que expressa a α-amilase, pululanase, glicoamilase, sacarase ou isoamilase ou uma cultura do microrganismo com amido, maltodextrina, sacarose ou uma combinação dos mesmos para converter amido, maltodextrina, sacarose ou combinação dos mesmos em glicose.
18. Método para produzir D-psicose compreendendo promoção do contato (a) da psicose-6-fosfato fosfatase, de acordo com a reivindicação 1, uma D-frutose-6-fosfato-3- epimerase, uma D-glicose-6-fosfato-isomerase, uma fosfoglicomutase ou uma glicocinase e uma α-glucana fosforilase, um amido fosforilase, uma fosforilase de maltodextrina, uma fosforilase de sacarose, uma α-amilase,
uma pululanase, uma isoamilase, uma glicoamilase ou uma sacarase ou (b) um microrganismo que expresse as enzimas (a) ou uma cultura do microrganismo com amido, maltodextrina, sacarose ou uma combinação dos mesmos e um fosfato.
19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 e 12 a 18, em que a reação de contato é realizada a um pH de 5,0 a 9,0, a uma temperatura de 40ºC a 80ºC e/ou por 2 a 24 horas.
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| JP3333969B2 (ja) * | 1992-10-08 | 2002-10-15 | 株式会社林原生物化学研究所 | Ｄ−ケトヘキソース・３−エピメラーゼとその製造方法並びに用途 |
| FR2878850B1 (fr) * | 2004-12-02 | 2008-10-31 | Cis Bio Internat Sa | Derives de l'inositol-1-phosphate |
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