TW201920667A - 阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶、對所述酶進行編碼的核酸、用於生產d-阿洛酮糖的包括所述酶的組成物以及使用所述酶生產d-阿洛酮糖的方法 - Google Patents

阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶、對所述酶進行編碼的核酸、用於生產d-阿洛酮糖的包括所述酶的組成物以及使用所述酶生產d-阿洛酮糖的方法 Download PDF

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Abstract

本發明是有關於一種包括模體A及模體B的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶、用於生產D-阿洛酮糖的包括所述酶的組成物以及使用所述酶生產D-阿洛酮糖的方法。

Description

新的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶、用於生產D-阿洛酮糖的包括所述酶的組成物以及使用所述酶生產D-阿洛酮糖的方法
本發明是有關於一種新的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶、用於生產D-阿洛酮糖的包括所述酶的組成物以及使用所述酶生產D-阿洛酮糖的方法。
D-阿洛酮糖-3-差向異構酶（EC 5.1.3.30）及D-塔格糖-3-差向異構酶（EC 5.1.3.31）被視為催化D-果糖的3-差向異構化以生產D-阿洛酮糖的酶。當藉由使用所述酶的單一酵素反應來生產D-阿洛酮糖時，底物（即，D-果糖）與產物（即，D-阿洛酮糖）之間的反應均衡存在於恆定不變的水平（產物/底物=~20%至35%）下。因此，生產高純度D-阿洛酮糖需要額外的製程來自酵素反應產物分離及移除相對高濃度的D-果糖。
另一方面，詹（Chan）等人（2008年，生物化學（Biochemistry）47：9608-9617）報導了能夠催化D-果糖-6-磷酸及D-阿洛酮糖-6-磷酸的3-差向異構化的自釀膿鏈球菌 衍生的 D-核酮糖-5-磷酸-3-差向異構酶（EC 5.1.3.1）以及自大腸桿菌 衍生的D-阿洛酮糖6-磷酸-3-差向異構酶（EC 5.1.3.-）。然而，該些酶因其耐熱性差而在工業上並不適用。
在該些情況下，本發明人已認真地進行了研究以開發一種在工業規模上以經濟的方式提高D-阿洛酮糖的轉化率的方法。結果，本發明人發現了，在將作為廉價原材料的蔗糖或澱粉（例如，麥芽糖糊精）轉化成D-阿洛酮糖-6-磷酸之後，使用特定於D-阿洛酮糖-6-磷酸並參與不可逆反應途徑的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶能夠藉由利用D-阿洛酮糖生產途徑中所涉及的二或更多種酶進行一鍋酵素轉化（one-pot enzymatic conversion）來生產D-阿洛酮糖，且可顯著地提高向D-阿洛酮糖的轉化率。基於此發現達成了本發明。
[技術問題]
本發明的一個目的是提供一種包括模體（motif）A及模體B的新的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶。
本發明的另一目的是提供一種對本文所述的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶進行編碼的核酸以及一種包含所述核酸的轉化體。
本發明的再一目的是提供一種用於生產D-阿洛酮糖的組成物，所述組成物包括肌醇-單-磷酸酶、表達肌醇-單-磷酸酶的微生物或所述微生物的培養物。
本發明的又一目的是提供一種用於生產D-阿洛酮糖的方法，所述方法包括：使肌醇-單-磷酸酶、表達肌醇-單-磷酸酶的微生物或所述微生物的培養物接觸D-阿洛酮糖-6-磷酸，以將D-阿洛酮糖-6-磷酸轉化成D-阿洛酮糖。
[技術解決方案]
現在將詳細闡述本發明。同時，對本發明中所揭露的態樣及實施例的解釋亦可應用於對其他態樣及實施例的解釋。另外，本發明中所揭露的各種元素的所有組合皆落在本發明的範圍內。此外，認為本發明的範圍不受以下詳細說明限制。
為了達成本發明的以上及其他目的，本發明的一個態樣提供一種阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶，所述阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶包括由Xa1 -Xa2 -Xa3 -DPLDG-Xa4 表示的模體A，其中Xa1 為W、F、V、I或A，Xa2 為I、F、V、A或間隙，Xa3 為V、I或L，且Xa4 為T或S；以及由Ya1 -D-Ya2 -Wa1 -Ya3 -Wa2 -Ya4 -Wa3 表示的模體B，其中Ya1 為W、Y、T、L或V，Ya2 為V、I、C、F或A，Wa1 為AAG、AAS、SAG、APG、APF、AGG、APL或AGA，Ya3 為W、I、P、M、V、Y、F、R、L、T或S，Wa2 為LLV、LIV、LLI、LII、ILI、FIA、ALV、IIA、VLV、VIL、TIG、NFC或PIF，Ya4 為E、R、S、T、L、K或P，且Wa3 為EAGG、EGGG、EAKG、KAGG、AAGG、YVDG、EAGA或RLGV。
具體而言，在模體A中，Xa1 可為W或F，Xa2 可為I或V，Xa3 可為V或I，且Xa4 可為T。具體而言，在模體B中，Ya1 可為W，Ya2 可為V或I，Wa1 可為AAG，Ya3 可為W、I或V，Wa2 可為LLV、LIV、LII或LLI，Ya4 可為E、R或S，且Wa3 可為EAGG或EGGG。
一或多種胺基酸可存在於模體A與模體B之間、模體A的一端或模體B的一端。除模體A及模體B外的胺基酸序列可由已知肌醇-單-磷酸酶的序列（例如，在SEQ ID NO：1至20陳述的序列中除模體A及模體B外的序列）。
模體A及/或模體B是肌醇-單-磷酸酶的序列中的活性位點。模體A及/或模體B亦被視為作為酶的底物的磷酸肌醇的結合位點（參見歐洲生物化學協會聯合會，第294卷，第1、2期，第16至18頁，1991年12月）。本發明人發現了肌醇-單-磷酸酶表現出阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶活性。本發明人亦發現了肌醇-單-磷酸酶的模體A及/或模體B可為磷酸酶的底物結合位點。
阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶可包括例如以SEQ ID NO：1至20陳述的胺基酸序列中的任一者。
本發明的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶可為具有已知肌醇-單-磷酸酶的功能的酶。
本發明的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶更選擇性地催化D-阿洛酮糖-6-磷酸的去磷酸化，且可對D-葡萄糖-1-磷酸、D-葡萄糖-6-磷酸或D-果糖-6-磷酸具有非特異性。
本發明的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶可藉由以下方式來生產：利用酶本身或表達酶的去氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）（例如，SEQ ID NO：21至40）對菌株進行轉化、對經轉化的菌株進行培養、破壞培養物、然後進行純化。純化可例如藉由管柱層析法來執行。菌株可包括但不限於屬於棒狀桿菌 屬、麯黴 屬、桿菌 屬、埃希氏菌 屬或沙雷氏菌 屬的微生物的細胞。具體而言，寄主細胞可為大腸桿菌 （Escherichia coli ）、麩胺酸棒狀 桿菌 （Corynebacterium glutamicum ）、米麯黴 （Aspergillus oryzae ）或枯草桿菌 （Bacillus subtilis ）。更具體而言，所述菌株可為大腸桿菌 BL21，其被視為用於高水平重組蛋白生產的菌株且亦為市售的。任何市售的菌株可用於生產本發明的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶，但並非僅限於此。在生產阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶時所需要的轉化方法、培養方法或純化方法是此項技術中已知的，且因此熟習此項技術者可利用已知的方法來生產阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶，而無需任何詳細資訊。舉例而言，轉化方法可依據寄主細胞的類型藉由此項技術中已知的合適的標準技術來實施。此類轉化方法的實例包括但不限於電穿孔、磷酸鈣（CaPO4 ）沈澱、氯化鈣（CaCl2 ）沈澱、逆轉錄病毒感染、顯微注射、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）方法、二乙胺乙基（diethylamineethyl，DEAE）-聚葡糖方法、陽離子脂質體方法及乙酸鋰-二甲基亞碸（dimethyl sulfoxide，DMSO）方法。培養視需要隨著攪拌培養物可在25℃至40℃、尤其是30℃至38℃的條件下進行一小時至24小時。
根據本發明的一個實施例，本發明的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶可包括與模體A及/或模體B的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%的同源性、相似性或同一性且表現出阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶活性的酶。作為另一選擇，本發明的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶可為與除模體A及/或模體B外的序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%的同源性、相似性或同一性。在一個實施例中，本發明的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶可包括由以下序列組成的蛋白質：所述蛋白質與以SEQ ID NO：1至20陳述的序列中的模體A及/或模體B的序列具有至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%的同源性、相似性或同一性，且與以SEQ ID NOS：1至20陳述的序列中除模體A及/或模體B外的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%的同源性、相似性或同一性，或具有處於由上述值中的任何兩者界定的範圍內的同源性、相似性或同一性。舉例而言，具有以上所界定的同源性、相似性或同一性且表現出與阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶蛋白質（例如，由以SEQ ID NO：1至20陳述的序列中的任一者組成的蛋白質）的效力對應的效力並且進行部分刪除、修改、取代或添加的任何胺基酸序列亦處於本發明的範圍內。
其中在模體A及模體B的序列的上游及下游添加無關序列的蛋白質處於本發明的範圍內，且不會自本發明的範圍排除蛋白質的自然發生的突變或沉默突變（silent mutation），只要所述蛋白質具有與包括模體A及模體B的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶的活性對應的活性即可。具體而言，不會自本發明的範圍排除在以SEQ ID NO：1至20陳述的胺基酸序列中的任一者的上游及下游添加無關序列的蛋白質、其自然發生的突變及沉默突變，只要所述蛋白質具有與包括模體A及模體B的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶的活性對應的活性即可。包括模體A及模體B的蛋白質或包括以SEQ ID NO：1至20陳述的胺基酸序列的蛋白質亦處於本發明的範圍內，只要所述蛋白質具有與包括模體A及模體B的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶的活性對應的活性即可。
本發明的另一態樣提供一種對阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶進行編碼的核酸。
本文所使用的用語「核酸」囊括DNA分子及核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA）分子，且作為核酸的基本單元的核苷酸包括天然核苷酸及具有經改質糖或鹼基的類似物（參見夏伊（Scheit）的核苷酸類似物（Nucleotide Analogs），紐約州約翰威利出版社（John Wiley, New York）（1980）；阿爾曼及佩伊曼（Uhlman and Peyman），化學評論，90：543-584（1990年））。
具體而言，對阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶進行編碼的核酸可包括包含可被轉譯成模體A及模體B的核苷酸的序列。在一個實施例中，本發明的核酸可由以SEQ ID NO：21至40陳述的核苷酸序列中的任一者組成。更具體而言，本發明的核酸可包括與可被轉譯成模體A及模體B且可在轉譯之後表現出期望的酶活性的核苷酸具有至少90%、至少95%、至少99%或100%的同源性、相似性或同一性的核酸。具體而言，本發明的核酸可包括與在以SEQ ID NO：21至40陳述的序列中可被轉譯成模體A及模體B的核苷酸具有至少90%、至少95%、至少99%或100%的同源性、相似性或同一性的核酸。作為另一選擇，本發明的核酸可為與在以SEQ ID NO：21至40陳述的序列中可被轉譯成除模體A及模體B外的模體的核苷酸具有至少80%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%的同源性、相似性或同一性的核酸。以下亦處於本發明的範圍內：可因密碼子簡併性（codon degeneracy）而被轉譯成包括模體A及模體B的蛋白質的蛋白質，尤其是由以SEQ ID NO：1至20陳述的胺基酸序列中的任一者組成的蛋白質或可被轉譯成與由以SEQ ID NO：1至20陳述的胺基酸序列中的任一者組成的蛋白質具有同源性、相似性或同一性的蛋白質的多核苷酸。
根據本發明的包括模體A及模體B的酶可自耐熱或嗜熱菌株衍生出。具體而言，由以SEQ ID NO：1至20陳述的胺基酸序列中的任一者組成的酶可為自以下衍生的酶：海洋紅嗜熱鹽菌（ Rhodothermus marinus ）、萊廷格熱袍菌（ Thermotoga lettingae ）、紅色亞棲熱菌（ Meiothermus ruber ）、嗜熱圓錐網團菌 （Dictyoglomus turgidum ）、鐵還原熱棒菌（ Pyrobaculum ferrireducens ）、威吉利熱厭氧桿菌 （Thermoanaerobacter wiegelii ）、嗜熱棲熱菌 （Thermus thermophilus ）、海濱棲熱 高溫球菌 （Thermococcus litoralis ）、嗜熱脂肪 土芽孢桿菌 （Geobacillus stearothermophilus ）、四膜蟲厭氧繩菌（ Anaerolinea thermophila ）、酸熱硫化葉菌 （Sulfolobus acidocaldarius ）、塔卡伊熱硫化物桿菌 （Thermosulfidibacter takaii ）、強烈火球菌 （Pyrococcus furiosus ）、 閃爍古生球菌 （Archaeoglobus fulgidus ）、酸熱脂環酸 芽孢桿菌 （Alicyclobacillus acidocaldarius ）、西爾瓦諾斯亞棲熱菌（ Meiothermus silvanus ）、魯弗斯亞棲熱菌（ Meiothermus rufus ）、台灣本土亞棲熱菌（ Meiothermus taiwanensis ）、克裡羅費魯斯 亞棲熱菌（ Meiothermus chliarophilus ）或刻耳柏洛斯亞棲熱菌 （Meiothermus cerbereus ）。
本文所使用的用語「同源性」或「同一性」指示兩種給定胺基酸序列或核苷酸序列之間的關聯程度，其可表達為百分比。
用語「同源性」及「同一性」常互換使用。
保守的多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性是藉由標準對齊演算法來確定，且可與由所使用的程式建立的缺設間隙罰分（default gap penalty）一起使用。實質上，同源序列或相同序列通常將在中等嚴格條件下或高嚴格條件下一直沿著所關注的多核苷酸或多肽的整個長度的至少約50%、60%、70%、80%或90%進行雜交。亦設想到在對多核苷酸進行雜交時含有簡併密碼子來代替密碼子的多核苷酸。
任何兩種多核苷酸或多肽序列是否為同源的、相似的或相同的可利用例如「法斯塔（FASTA）」程式等已知的電腦演算法使用例如如在皮爾森（Pearson）等人（1988年）的美國國家科學院院刊85：2444中一樣的缺設參數來確定。作為另一選擇，序列同源性、相似性或同一性可利用在版本5.0.0或更新版本的EMBOSS程式包（EMBOSS：歐洲分子生物學開放軟體套組（European Molecular Biology Open Software Suite），裡斯（Rice）等人，2000年，遺傳學趨勢16：276-277）的尼德（Needle）程式中實施的尼德曼-翁施演算法（Needleman-Wunsch algorithm）（尼德曼及翁施，1970年，分子生物學雜誌 （J. Mol. Biol. ）48：443-453）來確定。其他程式包括GCG程式包（德弗羅J.（Devereux, J.）等人的核酸研究12：387（1984年））、布萊斯特（BLASTP）、布萊斯汀（BLASTN）、FASTA（阿提斯庫爾（Atschul）[S.] [F.][等人的分子生物學雜誌215]：403（1990年）；巨型電腦指南（Guide to Huge Computers），馬丁J.（Martin J.）主教，[ED.]學術出版社，聖地亞哥，1994年及[卡裡洛（CARILLO）等人]（1988年）工業及應用數學學會（Society for Industrial and Applied Mathematics，SIAM ）應用數學雜誌48：1073）。舉例而言，可使用國家生物技術資訊中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）資料庫的BLAST工具來確定同源性、相似性或同一性。亦可使用其他市售程式或公開可用的程式，例如克拉斯特瓦（ClustalW）。
多核苷酸或多肽的同源性、相似性或同一性百分比可例如藉由使用間隙分析程式（GAP）電腦程式（例如，尼德曼等人，（1970年），分子生物學雜誌48：443，由史密斯及沃特曼校訂，高等應用數學（1981年）2:482）對序列資訊進行比較來確定。簡言之，GAP程式將相似性定義為相似的經對齊符號（即，核苷酸或胺基酸）的數目除以所述兩種序列中的較短序列中的符號的總數目。GAP程式的缺設參數可包括：（1）哥博斯科夫（Gribskov）等人（1986年）核酸研究14：6745的一元比較矩陣（包含對於同一性為1且對於非同一性為0的值）以及加權比較矩陣，如由編者施瓦茨（Schwartz）及戴霍夫（Dayhoff）所述，蛋白質序列及結構圖集，國家生物學研究基金會，第353至358頁（1979年）；（2）對於每一間隙為3.0的罰分及對於每一間隙中的每一符號的額外的0.10的罰分（或間隙開放罰分10.0，間隙延伸罰分0.5）；以及（3）對於端隙無罰分。因此，本文所使用的用語「同源性」或「同一性」指示多肽或多核苷酸之間的比較。
本發明的再一態樣提供一種包含對本文所述的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶進行編碼的核酸的載體或包含對阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶進行編碼的核酸的轉化體或者包含對阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶進行編碼的核酸的載體。
本文所使用的用語「載體」是指用於將鹼基選殖及/或轉殖至寄主細胞內的任何載體。載體可為可附連另一DNA片段以引起對所附連片段的複製的複製子。「複製子」是指充當在活體內進行DNA複製的自主單元、即能夠在其自身控制下進行複製的任何遺傳因子（genetic element）（例如，質體、噬菌體、黏接質體、染色體或病毒）。用語「載體」可包括用於在試管內、活體外或活體內將鹼基引入至寄主細胞內的病毒性載體及非病毒性載體二者。用語「載體」亦可包括微環DNA。具體而言，包含根據本發明的對阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶進行編碼的核酸的載體可為pET21a-CJ_Rma、pET21a-CJ_Tle、pET21a-CJ_Mrub、pET21a-CJ_Dtu、pET21a-CJ_Msi、pET21a-CJ_Mruf、pET21a-CJ_Mta、pET21a-CJ_Mch、pET21a-CJ_Mce、pBT7-C-His-CJ_Pfe、pBT7-C-His-CJ_Twi、pBT7-C-His-CJ_Tth、pBT7-C-His-CJ_Tli、pBT7-C-His-CJ_Gst、pBT7-C-His-CJ_Ath、pBT7-C-His-CJ_Sac、pBT7-C-His-CJ_Tta、pBT7-C-His-CJ_Pfu、pBT7-C-His-CJ_Afu或pBT7-C-His-CJ_Aac。
本文所使用的用語「轉化」是指將包含對靶蛋白質進行編碼的核酸的載體引入至寄主細胞內，以在寄主細胞內表達由核酸編碼的蛋白質。經轉化的核酸可插入並位於寄主細胞的染色體內或者可存在於染色體外，只要可在寄主細胞內表達經轉化的核酸即可。核酸包括對靶蛋白質進行編碼的DNA及RNA。核酸可以任何形式被引入，只要核酸可被引入寄主細胞內並在寄主細胞內得到表達即可。舉例而言，核酸可以表達盒（expression cassette）（其為包括核酸自主表達所需要的所有元素的基因構建體）形式被引入至寄主細胞內，但其形式並非僅限於此。通常，表達盒包括可操作地連接至核酸的啟動子（promoter）、轉錄終止訊號、核糖體結合域及轉譯終止訊號。表達盒可呈可自複製的表達載體形式。核酸本身可被引入至寄主細胞內且可操作地連接至在寄主細胞中進行表達所需要的序列。
本文所使用的用語「可操作地連接」是指起始並介導本發明的對靶蛋白質進行編碼的核酸的轉錄的啟動子序列與基因序列之間的功能性連接。
對本發明中所提及的胺基酸使用以下縮寫及名稱。
[表1]
可利用將核酸引入至細胞內的任何轉化方法。轉化方法可依據寄主細胞的類型而藉由此項技術中已知的合適的標準技術來進行。此類轉化方法的實例包括但不限於電穿孔、磷酸鈣（CaPO4 ）沈澱、氯化鈣（CaCl2 ）沈澱、逆轉錄病毒感染、顯微注射、聚乙二醇（PEG）方法、DEAE-聚葡糖方法、陽離子脂質體方法及乙酸鋰-DMSO方法。
寄主細胞較佳為高效地引入DNA且以高水平來表達所引入的DNA的寄主細胞。寄主細胞的實例包括但不限於屬於棒狀桿菌 屬、麯黴 屬、桿菌 屬、埃希氏菌 屬或沙雷氏菌 屬的微生物的細胞。具體而言，寄主細胞可為大腸桿菌 、麩胺酸棒狀 桿菌 、米麯黴 或枯草桿菌 。更具體而言，上述菌株可為大腸桿菌 BL21，其被視為用於高水平重組蛋白生產的菌株且亦為市售的。任何市售的菌株可用於生產本發明的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶，但並非僅限於此。
本發明的轉化體可為大腸桿菌 BL21(DE3)/pET21a-CJ_Rma（大腸桿菌 _P1_CJ_Rma）、大腸桿菌 BL21(DE3)/pET21a-CJ_Tle（大腸桿菌 _P2_CJ_Tle）、大腸桿菌 BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mrub（大腸桿菌 _P3_CJ_Mrub）、大腸桿菌 BL21(DE3)/pET21a-CJ_Dtu（大腸桿菌 _P4_CJ_Dtu）、大腸桿菌 BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Pfe（大腸桿菌 _P5_CJ_Pfe）、大腸桿菌 BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Twi（大腸桿菌 _P6_CJ_Twi）、大腸桿菌 BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tth（大腸桿菌 _P7_CJ_Tth）、大腸桿菌 BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tli（大腸桿菌 _P8_CJ_Tli）、大腸桿菌 BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Gst（大腸桿菌 _P9_CJ_Gst）、大腸桿菌 BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Ath（大腸桿菌 _P10_CJ_Ath）、大腸桿菌 BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Sac（大腸桿菌 _P11_CJ_Sac）、大腸桿菌 BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tta（大腸桿菌 _P12_CJ_Tta）、大腸桿菌 BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Pfu（大腸桿菌 _P13_CJ_Pfu）、大腸桿菌 BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Afu（大腸桿菌 _P14_CJ_Afu）、大腸桿菌 BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Aac（大腸桿菌 _P15_CJ_Aac）、大腸桿菌 BL21(DE3)/pET21a-CJ_Msi（大腸桿菌 _P16_CJ_Msi）、大腸桿菌 BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mruf（大腸桿菌 _P17_CJ_Mruf）、大腸桿菌 BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mta（大腸桿菌 _P18_CJ_Mta）、大腸桿菌 BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mch（大腸桿菌 _P19_CJ_Mch）或大腸桿菌 BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mce（大腸桿菌 _P20_CJ_Mce）。
本發明的另一態樣提供一種用於生產D-阿洛酮糖的組成物，所述組成物包括肌醇-單-磷酸酶、表達肌醇-單-磷酸酶的微生物或表達肌醇-單-磷酸酶的微生物的培養物。
本發明的肌醇-單-磷酸酶可包括由Xa1 -Xa2 -Xa3 -DPLDG-Xa4 表示的模體A，其中Xa1 為W、F、V、I或A，Xa2 為I、F、V、A或間隙，Xa3 為V、I或L，且Xa4 為T或S；以及由Ya1 -D-Ya2 -Wa1 -Ya3 -Wa2 -Ya4 -Wa3 表示的模體B，其中Ya1 為W、Y、T、L或V，Ya2 為V、I、C、F或A，Wa1 為AAG、AAS、SAG、APG、APF、AGG、APL或AGA，Ya3 為W、I、P、M、V、Y、F、R、L、T或S，Wa2 為LLV、LIV、LLI、LII、ILI、FIA、ALV、IIA、VLV、VIL、TIG、NFC或PIF，Ya4 為E、R、S、T、L、K或P，且Wa3 為EAGG、EGGG、EAKG、KAGG、AAGG、YVDG、EAGA或RLGV。亦即，肌醇-單-磷酸酶可與阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶互換使用。因此，阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶的解釋可應用於肌醇-單-磷酸酶。在一個實施例中，肌醇-單-磷酸酶可為由以SEQ ID NO：1至20陳述的胺基酸序列中的任一者組成的酶。
本發明的組成物可更包括D-阿洛酮糖生產途徑中所涉及的酶及/或底物（參見圖1）[（i）澱粉、麥芽糖糊精、蔗糖或其組合；（ii）磷酸鹽；（iii）D-果糖-6-磷酸-3-差向異構酶；（iv）D-葡萄糖-6-磷酸-異構酶；（v）磷酸葡萄醣變位酶或葡萄糖激酶；及/或（vi）α-葡聚糖磷酸化酶、澱粉磷酸化酶、麥芽糖糊精磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、α-澱粉酶、普魯蘭酶、異澱粉酶、葡萄糖澱粉酶或蔗糖酶]；表達D-阿洛酮糖生產途徑中所涉及的酶的微生物；或表達D-阿洛酮糖生產途徑中所涉及的酶的微生物的培養物。其他酶及底物僅為說明性的而不受限制，只要D-阿洛酮糖可使用本發明的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶生產即可。
澱粉/麥芽糖糊精磷酸化酶（EC 2.4.1.1）及α-葡聚糖磷酸化酶可包括在磷醯基轉移至葡萄糖時呈活性以自澱粉或麥芽糖糊精生產D-葡萄糖-1-磷酸的任何蛋白質。具體而言，在自澱粉或麥芽糖糊精生產D-葡萄糖-1-磷酸時呈活性的蛋白質可由以SEQ ID NO：59陳述的胺基酸序列組成。在自澱粉或麥芽糖糊精生產D-葡萄糖-1-磷酸時呈活性的蛋白質可藉由以SEQ ID NO：60陳述的序列進行編碼。
蔗糖磷酸化酶（EC 2.4.1.7）可包括在磷醯基轉移至葡萄糖時呈活性以自蔗糖生產D-葡萄糖-1-磷酸的任何蛋白質。
α-澱粉酶（EC 3.2.1.1）、普魯蘭酶（EC 3.2.1.41）、葡萄糖澱粉酶（EC 3.2.1.3）及異澱粉酶是澱粉液化酶，且可包括在將澱粉或麥芽糖糊精轉化成葡萄糖時呈活性的任何蛋白質。
蔗糖酶（EC 3.2.1.26）可包括在將蔗糖酶轉化成葡萄糖時呈活性的任何蛋白質。
磷酸葡萄糖變位酶（EC 5.4.2.2）可包括在將D-葡萄糖-1-磷酸轉化成D-葡萄糖-6-磷酸時呈活性的任何蛋白質。具體而言，在將D-葡萄糖-1-磷酸轉化成D-葡萄糖-6-磷酸時呈活性的蛋白質可包括以SEQ ID NO：61陳述的胺基酸序列。在將D-葡萄糖-1-磷酸轉化成D-葡萄糖-6-磷酸時呈活性的蛋白質可藉由以SEQ ID NO：62陳述的序列進行編碼。
葡萄糖激酶可包括在磷醯基至葡萄糖時呈活性以將葡萄糖轉化成D-葡萄糖-6-磷酸的任何蛋白質。具體而言，葡萄糖激酶可為多磷酸鹽相依性葡萄糖激酶。更具體而言，葡萄糖激酶可為由以SEQ ID NO：77或78陳述的胺基酸序列組成的蛋白質。D-葡萄糖-6-磷酸-異構酶可包括在將D-葡萄糖-6-磷酸轉化成D-果糖-6-磷酸時呈活性的任何蛋白質。具體而言，D-葡萄糖-6-磷酸-異構酶可為包括以SEQ ID NO：63陳述的胺基酸序列的蛋白質。D-葡萄糖-6-磷酸-異構酶可藉由以SEQ ID NO：64陳述的序列進行編碼。
D-果糖-6-磷酸-3-差向異構酶可包括在將D-果糖-6-磷酸轉化成D-阿洛酮糖-6-磷酸時呈活性的任何蛋白質。具體而言，D-果糖-6-磷酸-3-差向異構酶可為包括以SEQ ID NO：65陳述的胺基酸序列的蛋白質。D-果糖-6-磷酸-3-差向異構酶可藉由以SEQ ID NO：66陳述的序列進行編碼。
根據本發明的用於D-阿洛酮糖生產的組成物可更包括在將葡萄糖轉化成澱粉、麥芽糖糊精或蔗糖時呈活性的蛋白質。蛋白質可為例如4-α-葡聚糖轉移酶。在將葡萄糖轉化成澱粉、麥芽糖糊精或蔗糖時呈活性的蛋白質可為包括以SEQ ID NO：67陳述的胺基酸序列的酶。具體而言，在將葡萄糖轉化成澱粉、麥芽糖糊精或蔗糖時呈活性的蛋白質可藉由以SEQ ID NO：68陳述的核苷酸序列進行編碼。根據本發明的用於D-阿洛酮糖生產的組成物可更包括此項技術中已知的任何合適的賦形劑。此類賦形劑的實例包括但不限於防腐劑、潤濕劑、分散劑、懸浮劑、緩衝劑、穩定劑或等滲劑。
根據本發明的用於D阿洛酮糖生產的組成物可更包括金屬離子或金屬鹽。在一個實施例中，金屬離子可為二價金屬陽離子。具體而言，金屬離子可選自由Ni離子、Mg離子、Co離子、Mn離子、Fe離子及Zn離子組成的群組。更具體而言，根據本發明的用於D-阿洛酮糖生產的組成物可更包括金屬鹽。再更具體而言，金屬鹽可選自由NiSO4 、MgSO4 、MgCl2 、NiCl2 、CoSO4 、CoCl2 、MnCl2 、FeSO4 、ZnSO4 及其混合物組成的群組。
本發明的另一態樣提供一種用於生產D-阿洛酮糖的方法，所述方法包括：使肌醇-單-磷酸酶、表達此酶的微生物或所述微生物的培養物接觸D-阿洛酮糖-6-磷酸以將D-阿洛酮糖-6-磷酸轉化成D-阿洛酮糖。
肌醇-單-磷酸酶可包括由Xa1 -Xa2 -Xa3 -DPLDG-Xa4 表示的模體A及由Ya1 -D-Ya2 -Wa1 -Ya3 -Wa2 -Ya4 -Wa3 表示的模體B。本文中，肌醇-單-磷酸酶可與阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶互換使用。
本發明的方法可更包括：在將D-阿洛酮糖-6-磷酸轉化成D-阿洛酮糖之前，使D-果糖-6-磷酸-3-差向異構酶、表達D-果糖-6-磷酸-3-差向異構酶的微生物或表達D-果糖-6-磷酸-3-差向異構酶的微生物的培養物接觸D-果糖-6-磷酸以將D-果糖-6-磷酸轉化成D-阿洛酮糖-6-磷酸。
本發明的方法可更包括：在將D-果糖-6-磷酸轉化成D-阿洛酮糖-6-磷酸之前，使D-葡萄糖-6-磷酸-異構酶、表達D-葡萄糖-6-磷酸-異構酶的微生物或表達D-葡萄糖-6-磷酸-異構酶的微生物的培養物接觸D-葡萄糖-6-磷酸以將D-葡萄糖-6-磷酸轉化成D-果糖-6-磷酸。
本發明的方法可更包括：在將D-葡萄糖-6-磷酸轉化成D-果糖-6-磷酸之前，使磷酸葡萄糖變位酶、表達磷酸葡萄糖變位酶的微生物或表達磷酸葡萄糖變位酶的微生物的培養物接觸D-葡萄糖-1-磷酸以將D-葡萄糖-1-磷酸轉化成D-葡萄糖-6-磷酸。
本發明的方法可更包括：在將D-葡萄糖-6-磷酸轉化成D-果糖-6-磷酸之前，使葡萄糖激酶、表達葡萄糖激酶的微生物或表達葡萄糖激酶的微生物的培養物及磷酸鹽接觸葡萄糖以將葡萄糖轉化成D-葡萄糖-6-磷酸。
本發明的方法可更包括：在將D-葡萄糖-1-磷酸轉化成D-葡萄糖-6-磷酸之前，使α-葡聚糖磷酸化酶、澱粉磷酸化酶、麥芽糖糊精磷酸化酶或蔗糖磷酸化酶、表達上述磷酸化酶的微生物或表達上述磷酸化酶的微生物的培養物及磷酸鹽接觸澱粉、麥芽糖糊精、蔗糖或其組合以將澱粉、麥芽糖糊精、蔗糖或其組合轉化成D-葡萄糖-1-磷酸。
本發明的方法可更包括：在將葡萄糖轉化成D-葡萄糖-6-磷酸之前，使α-澱粉酶、普魯蘭酶、葡萄糖澱粉酶、蔗糖酶或異澱粉酶、表達α-澱粉酶、普魯蘭酶、葡萄糖澱粉酶、蔗糖酶或異澱粉酶的微生物或者表達α-澱粉酶、普魯蘭酶、葡萄糖澱粉酶、蔗糖酶或異澱粉酶的微生物的培養物接觸澱粉、麥芽糖糊精、蔗糖或其組合以將澱粉、麥芽糖糊精、蔗糖或其組合轉化成葡萄糖。
本發明的又一態樣提供一種用於生產D-阿洛酮糖的方法，所述方法包括：使以下物質接觸澱粉、麥芽糖糊精、蔗糖或其組合及磷酸鹽：（a）肌醇-單-磷酸酶、D-果糖-6-磷酸-3-差向異構酶、D-葡萄糖-6-磷酸-異構酶、磷酸葡萄醣變位酶或葡萄糖激酶以及α-葡聚糖磷酸化酶、澱粉磷酸化酶、麥芽糖糊精磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、α-澱粉酶、普魯蘭酶、異澱粉酶、葡萄糖澱粉酶或蔗糖酶或者（b）表達上述酶（a）的微生物或所述微生物的培養物。
在本發明的方法中，接觸反應可在5.0至9.0的pH、尤其是6.0至8.0的pH下進行。
在本發明的方法中，接觸反應可在40℃至80℃的溫度、尤其是40℃至60℃或50℃至60℃的溫度下進行。
在本發明的方法中，接觸反應可進行2小時至24小時、尤其是6小時至24小時。
在本發明的方法中，接觸反應可在5.0至9.0的pH下、在40℃至80℃的溫度下進行及/或進行2小時至24小時。具體而言，接觸反應可在6.0至8.0的pH下、在40℃至60℃或50℃至60℃的溫度下進行及/或進行6小時至24小時。
本發明的方法可更包括：對反應產物D-阿洛酮糖進行純化。D-阿洛酮糖的純化方法無特別限定。可藉由此項技術中已知的任何合適的方法對D-阿洛酮糖進行純化。此類純化方法的非限制性實例包括可單獨進行或以組合方式進行的層析、分段結晶（fractional crystallization）及離子純化。舉例而言，D-阿洛酮糖可藉由層析進行純化。在此種情形中，可基於醣類與附連至離子樹脂的金屬離子之間的結合力的小的差異來分離靶醣類。
根據本發明的方法中的每一種可更包括在純化步驟之前或之後進行漂白及/或除礦物質處理。漂白及/或除礦物質處理使得D-阿洛酮糖更純且無雜質。
[有利效果]
本發明的新的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶為耐熱肌醇-單-磷酸酶。由於其耐熱性，本發明的酶可參與將D-阿洛酮糖-6-磷酸轉化成D-阿洛酮糖的途徑，以使得能夠在工業規模上生產D-阿洛酮糖。使用根據本發明的酶能夠進行自作為廉價原材料的葡萄糖或澱粉（例如，麥芽糖糊精）合成D-阿洛酮糖的途徑。另外，當使用本發明的酶時，可藉由D-阿洛酮糖-6-磷酸的不可逆去磷酸化來生產D-阿洛酮糖。因此，使用根據本發明的酶會極大地提高向D-阿洛酮糖的轉化率。
此外，基於使用肌醇-單-磷酸酶的本發明的方法使得能夠以高的轉化率生產高濃度的D-阿洛酮糖、簡化或省略對反應產物的分離及純化。因此，本發明的方法可簡單地實施且自經濟角度看是有利的。
將參照以下實例詳細解釋本發明。然而，提供該些實例是為了幫助理解本發明而非限制本發明的範圍。
實例
實例 1 ：生產肌醇 - 單 - 磷酸酶的重組表達載體及經轉化微生物
為了提供D-阿洛酮糖生產途徑所需要的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶，篩選出耐熱肌醇-單-磷酸酶基因。具體而言，自基因庫中登記的以下者的基因組序列篩選出肌醇-單-磷酸酶基因（Rma、Tle、Mrub、Dtu、Msi、Mruf、Mta、Mch及Mce）：海洋紅嗜熱鹽菌、萊廷格熱袍菌、紅色亞棲熱菌、嗜熱圓錐網團菌、鐵還原熱棒菌、威吉利熱厭氧桿菌 、嗜熱棲熱菌 、海濱棲熱 高溫球菌 、嗜熱脂肪 土芽孢桿菌 、四膜蟲厭氧繩菌、酸熱硫化葉菌、塔卡伊熱硫化物桿菌 、強烈火球菌、 閃爍古生球菌 、酸熱脂環酸 芽孢桿菌 、西爾瓦諾斯亞棲熱菌、魯弗斯亞棲熱菌、台灣本土亞棲熱菌、克裡羅費魯斯亞棲熱菌或刻耳柏洛斯亞棲熱菌。
基於關於所篩選基因的核苷酸序列（按照基因的次序，SEQ ID NO：21、22、23、24、36、37、38、39及40）以及胺基酸序列（按照基因的次序，SEQ ID NO：1、2、3、4、16、17、18、19及20）的資訊，設計出正向引子（SEQ ID NO：41、43、45、47、49、51、53、55及57）及反向引子（SEQ ID NO：42、44、46、48、50、52、54、56及58）。藉由使用經合成引子的聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）自海洋紅嗜熱鹽菌 、萊廷格熱袍菌 、紅色亞棲熱菌 、嗜熱圓錐網團菌 、西爾瓦諾斯亞棲熱菌 、魯弗斯亞棲熱菌 、台灣本土亞棲熱菌 、克裡羅費魯斯 亞棲熱菌 及刻耳柏洛斯亞棲熱菌 的基因組DNA擴增上述基因。使用限制酶NdeI及XhoI或Sa1I將經擴增的肌醇-單-磷酸酶基因插入用於大腸桿菌 表達的質體載體pET21a（諾瓦金（Novagen））內，以構建重組表達載體，所述重組表達載體被命名為pET21a-CJ_Rma（Nde I/Xho I）、pET21a-CJ_Tle（Nde I/Xho I）、pET21a-CJ_Mrub（Nde I/Xho I）、pET21a-CJ_Dtu（Nde I/Xho I）、pET21a-CJ_Msi（Nde I/Sal I）、pET21a-CJ_Mruf（Nde I/Sal I）、pET21a-CJ_Mta（Nde I/Sal I）、pET21a-CJ_Mch（Nde I/Sal I）及pET21a-CJ_Mce（Nde I/Sal I）。
另外，篩選出自以下衍生的肌醇-單-磷酸酶基因（Pfe、Twi、Tth、Tli、Gst、Ath、Sac、Tta、Pfu、Afu及Aac）：鐵還原熱棒菌、威吉利熱厭氧桿菌 、嗜熱棲熱菌 、海濱棲熱 高溫球菌 、嗜熱脂肪 土芽孢桿菌 、四膜蟲厭氧繩菌、酸熱硫化葉菌、塔卡伊熱硫化物桿菌 、強烈火球菌、 閃爍古生球菌 及酸熱脂環酸 芽孢桿菌 。基於關於所篩選基因的核苷酸序列（按照基因的次序，SEQ ID NO：25、26、27、28、29、30、31、32、33、34及35）以及胺基酸序列（按照基因的次序，SEQ ID NO：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14及15）的資訊，向比昂公司（Bioneer）（韓國（Korea））請求進行DNA合成。將DNA插入載體pBT7-C-His（比昂公司）內以構建重組表達載體，所述重組表達載體被命名為pBT7-C-His-CJ_Pfe、pBT7-C-His-CJ_Twi、pBT7-C-His-CJ_Tth、pBT7-C-His-CJ_Tli、pBT7-C-His-CJ_Gst、pBT7-C-His-CJ_Ath、pBT7-C-His-CJ_Sac、pBT7-C-His-CJ_Tta、pBT7-C-His-CJ_Pfu、pBT7-C-His-CJ_Afu及pBT7-C-His-CJ_Aac。
藉由一般轉化技術（參見薩姆布魯克（Sambrook）等人，1989年）將表達載體轉化成菌株大腸桿菌 BL21(DE3)以生產經轉化微生物，所述經轉化微生物被命名為大腸桿菌 BL21(DE3)/pET21a-CJ_Rma（大腸桿菌 _P1_CJ_Rma）、大腸桿菌 BL21(DE3)/pET21a-CJ_Tle（大腸桿菌 _P2_CJ_Tle）、大腸桿菌 BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mrub（大腸桿菌 _P3_CJ_Mrub）、大腸桿菌 BL21(DE3)/pET21a-CJ_Dtu（大腸桿菌 _P4_CJ_Dtu）、大腸桿菌 BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Pfe（大腸桿菌 _P5_CJ_Pfe）、大腸桿菌 BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Twi（大腸桿菌 _P6_CJ_Twi）、大腸桿菌 BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tth（大腸桿菌 _P7_CJ_Tth）、大腸桿菌 BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tli（大腸桿菌 _P8_CJ_Tli）、大腸桿菌 BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Gst（大腸桿菌 _P9_CJ_Gst）、大腸桿菌 BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Ath（大腸桿菌 _P10_CJ_Ath）、大腸桿菌 BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Sac（大腸桿菌 _P11_CJ_Sac）、大腸桿菌 BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tta（大腸桿菌 _P12_CJ_Tta）、大腸桿菌 BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Pfu（大腸桿菌 _P13_CJ_Pfu）、大腸桿菌 BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Afu（大腸桿菌 _P14_CJ_Afu）、大腸桿菌 BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Aac（大腸桿菌 _P15_CJ_Aac）、大腸桿菌 BL21(DE3)/pET21a-CJ_Msi（大腸桿菌 _P16_CJ_Msi）、大腸桿菌 BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mruf（大腸桿菌 _P17_CJ_Mruf）、大腸桿菌 BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mta（大腸桿菌 _P18_CJ_Mta）、大腸桿菌 BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mch（大腸桿菌 _P19_CJ_Mch）及大腸桿菌 BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mce（大腸桿菌 _P20_CJ_Mce）。
實例 2 ：生產用於 D- 阿洛酮糖生產 途徑所需要的酶
為了提供自新阿波羅棲熱袍菌 衍生的α-葡聚糖磷酸化酶、磷酸葡萄糖激酶、D-葡萄糖-6-磷酸-異構酶及D-果糖-6-磷酸-3-差向異構酶作為用於D-阿洛酮糖生產途徑所需要的酶，篩選出與所述酶對應的基因（按照酶的次序，ct1、ct2、tn1及fp3e）。
基於所篩選基因的核苷酸序列（按照酶的次序，SEQ ID NO：60、62、64及66）及胺基酸序列（按照酶的次序，SEQ ID NO：59、61、63及65），設計出正向引子（SEQ ID NO：69、71、73及75）及反向引子（SEQ ID NO：70、72、74及76）。藉由使用所述引子的聚合酶鏈反應（PCR）自作為模板的新阿波羅棲熱袍菌 的基因組DNA擴增酶基因。利用以下條件將PCR執行了總計25個循環：在95℃下變性30秒、在55℃下黏合30秒以及在68℃下聚合2分鐘。使用限制酶NdeI及XhoI將經擴增的酶基因插入用於大腸桿菌 表達的質體載體pET21a（諾瓦金）內以構建重組表達載體，所述重組表達載體被命名為pET21a-CJ_ct1、pET21a-CJ_ct2、pET21a-CJ_ tn1及pET21a-CJ_ fp3e。藉由一般轉化技術（參見薩姆布魯克等人，1989年）將重組表達載體轉化成菌株大腸桿菌 BL21(DE3) 以生產經轉化微生物，所述經轉化微生物被命名為大腸桿菌 BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct1、大腸桿菌 BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct2、大腸桿菌 BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn1及大腸桿菌 BL21(DE3)/CJ_tn_fp3e。
實例 3 ：生產重組酶
在此實例中，生產了重組酶。首先，利用在實例1及實例2中生產的經轉化微生物中的每一者對含有5毫升盧利亞-貝爾塔尼（Luria-Bertani，LB）液體培養基的培養管進行了接種。將接種體在37℃下在搖床恒溫箱中進行了培養，直至達到在600奈米下為2.0的吸光度。將培養肉湯添加至培養燒瓶中的LB液體培養基中，然後進行了主要培養。當培養物在600奈米下的吸光度達到2.0時，添加了1毫莫耳異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）以誘導重組酶的表達及生產。隨著在180轉/分鐘下進行攪拌將培養溫度維持在37℃下。將培養肉湯在8,000×g及4℃下離心分離了20分鐘以收集細菌細胞。利用50毫莫耳Tris-HCl緩衝劑（pH為8.0）將所收集的細菌細胞洗滌了兩次並在同一緩衝劑中進行了懸浮。然後，使用超音波均質器對細胞進行了破壞。將細胞溶解產物在13,000×g及4℃下離心分離了20分鐘。藉由組胺酸標籤親和層析法（His-tag affinity chromatography）自上清液對重組酶進行了純化。藉由50毫莫耳Tris-HCl緩衝劑（pH為8.0）對經純化的重組酶進行了透析，然後用於隨後的反應。藉由SDS-PAGE確定了經純化重組酶的分子量。
使用經轉化微生物生產的經純化酶的名稱及分子量如下（圖2）： 30.3 kDa自大腸桿菌 BL21(DE3)/pET21a-CJ_Rma（大腸桿菌 _P1_CJ_Rma）生產的酶（RMA）； 28.5 kDa自大腸桿菌 BL21(DE3)/pET21a-CJ_Tle（大腸桿菌 _P2_CJ_Tle）生產的酶（TLE）； 28 kDa自大腸桿菌 BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mrub（大腸桿菌 _P3_CJ_Mrub）生產的酶（MRUB）； 30.2 kDa自大腸桿菌 BL21(DE3)/pET21a-CJ_Dtu（大腸桿菌 _P4_CJ_Dtu）生產的酶（DTU）； 27.2 kDa自大腸桿菌 BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Pfe（大腸桿菌 i _P5_CJ_Pfe）生產的酶（PFE）； 28.8 kDa自大腸桿菌 BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Twi（大腸桿菌 _P6_CJ_Twi）生產的酶（TWI）； 28.6 kDa自大腸桿菌 BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tth（大腸桿菌 _P7_CJ_Tth）生產的酶（TTH）； 28 kDa自大腸桿菌 BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tli（大腸桿菌 _P8_CJ_Tli）生產的酶（TLI）； 29.6 kDa自大腸桿菌 BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Gst（大腸桿菌 _P9_CJ_Gst）生產的酶（GST）； 28.7 kDa自大腸桿菌 BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Ath（大腸桿菌 _P10_CJ_Ath）生產的酶（ATH）； 29.9 kDa自大腸桿菌 BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Sac（大腸桿菌 _P11_CJ_Sac）生產的酶（SAC）； 28.6 kDa自大腸桿菌 BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tta（大腸桿菌 _P12_CJ_Tta）生產的酶（TTA）； 27.9 kDa自大腸桿菌 BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Pfu（大腸桿菌 _P13_CJ_Pfu）生產的酶（PFU）； 28 kDa自大腸桿菌 BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Afu（大腸桿菌 _P14_CJ_Afu）生產的酶（AFU）； 29 kDa自大腸桿菌 BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Aac（大腸桿菌 _P15_CJ_Aac）生產的酶（AAC）； 28.1 kDa自大腸桿菌 BL21(DE3)/pET21a-CJ_Msi（大腸桿菌 _P16_CJ_Msi）生產的酶（MSI）； 28 kDa自大腸桿菌 BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mruf（大腸桿菌 _P17_CJ_Mruf)生產的酶（MRUF）； 28.1 kDa自大腸桿菌 BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mta（大腸桿菌 _P18_CJ_Mta）生產的酶（MTA）； 28.4 kDa自大腸桿菌 BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mch（大腸桿菌 _P19_CJ_Mch）生產的酶（MCH）； 28.1 kDa自大腸桿菌 BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mce（大腸桿菌 _P20_CJ_Mce）生產的酶（MCE）； 自大腸桿菌 BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct1生產的酶（CT1）； 自大腸桿菌 BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct2生產的酶（CT2）； 自大腸桿菌 BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn1生產的酶（TN1）；以及 自大腸桿菌 BL21(DE3)/CJ_tn_fp3e生產的酶（FP3E）。
實例 4 ：分析肌醇 - 單 - 磷酸酶的活性
4-1. 分析阿洛酮糖 -6- 磷酸磷酸酶的活性
很難購買到阿洛酮糖-6-磷酸。因此，本發明人直接自D-果糖-6-磷酸生產了D-阿洛酮糖-6-磷酸，並探究了用於D-阿洛酮糖生產的肌醇-單-磷酸酶的活性。
具體而言，將50毫莫耳D-果糖-6-磷酸懸浮於50毫莫耳Tris-HCl（pH為7.0）中，然後向其中添加了在實例3中生產的D-果糖-6-磷酸-3-差向異構酶（D-fructose-6-phosphate-3-epimerase，FP3E）及0.1單位/毫升20種肌醇-單-磷酸酶中的每一者。將此混合物在70℃下反應了1小時。藉由HPLC（SP_0810層析柱（昭和公司（Shodex））、安美納斯（Aminex）HPX-87C層析柱（伯樂公司（Bio-RAD））、80℃、流動相流速0.6毫升/分鐘、折射率偵測器）對D-阿洛酮糖的生產進行了確認。
探究了用於D-阿洛酮糖-6-磷酸的全部20種肌醇-單-磷酸酶的去磷酸化效價（圖3a及圖3b）。
4-2. 分析用於 D- 阿洛酮糖 -6- 磷酸的特異性去磷酸化的肌醇 - 單 - 磷酸酶的活性
量測了D-阿洛酮糖-6-磷酸在含有D-葡萄糖-6-磷酸、D-葡萄糖-1-磷酸、D-果糖-6-磷酸及D-阿洛酮糖-6-磷酸的混合物中在肌醇-單-磷酸酶存在下的特異性去磷酸化率。
具體而言，將0.1單位/毫升肌醇-單-磷酸酶中的每一者及5毫莫耳MgCl2 添加至1%（w/v）的D-葡萄糖-6-磷酸、D-葡萄糖-1-磷酸、D-果糖-6-磷酸及D-阿洛酮糖-6-磷酸的混合物中。將反應在50℃下進行了12小時。藉由HPLC（安美納斯HPX-87C層析柱（伯樂公司）、80℃、流動相流速0.6毫升/分鐘）對反應產物進行了分析。使用折射率偵測器對D-阿洛酮糖及其他醣類（果糖及葡萄糖）的生產進行了偵測。
結果，酶MRUB顯示出D-阿洛酮糖-6-磷酸的最高特異性去磷酸化率（圖3a）。
實例 5 ：藉由多種酵素反應分析酶的活性
為了自麥芽糖糊精生產D-阿洛酮糖，使酶CT1、CT2、TN1、FP3E及MRUB同時與麥芽糖糊精反應。將5%（w/v）的麥芽糖糊精添加至0.1單位/毫升各種酶、5毫莫耳MgCl2 及20毫莫耳磷酸鈉（pH為7.0）中。將此混合物在50℃的溫度下反應了12小時。藉由HPLC（安美納斯HPX-87C層析柱（伯樂公司）、80℃、流動相流速0.6毫升/分鐘、折射率偵測器）對反應產物進行了分析。
結果，確認了藉由多種酵素反應自麥芽糖糊精生產D-阿洛酮糖（圖4a）。
儘管已詳細闡述了本發明的實施例，然而熟習此項技術者應理解，在不改變本發明的精神或本質特徵的條件下本發明可以其他具體形式來實作。因此，應注意，前述實施例就所有態樣而言僅為說明性的，且不應被視為限制本發明。本發明的範圍是由隨附申請專利範圍而非本發明的詳細說明來界定。在申請專利範圍的含義及範圍內作出的所有變化或修改或者其等效形式皆應被視為落在本發明的範圍內。
無
圖1示意性地示出用於自澱粉（例如，麥芽糖糊精）或葡萄糖生產D-阿洛酮糖的酵素反應途徑。 圖2示出在蛋白質電泳分析之後拍攝的大小標記物（M）、所表達的輔酶（S）及經純化的重組酶（E）（pET21a-CJ_Rma、pET21a-CJ_Tle、pET21a-CJ_Mrub、pET21a-CJ_Dtu、pBT7-C-His-CJ_Pfe、pBT7-C-His-CJ_Twi、pBT7-C-His-CJ_Tth、pBT7-C-His-CJ_Tli、pBT7-C-His-CJ_Gst、pBT7-C-His-CJ_Ath、pBT7-C-His-CJ_Sac、pBT7-C-His-CJ_Tta、pBT7-C-His-CJ_Pfu、pBT7-C-His-CJ_Afu、pBT7-C-His-CJ_Aac、pET21a-CJ_Msi、pET21a-CJ_Mruf、pET21a-CJ_Mta、pET21a-CJ_Mch、pET21a-CJ_Mce）的十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠影像，以確定其分子量。 圖3a示出用於去磷酸化的肌醇-單-磷酸酶（pET21a-CJ_Rma、pET21a-CJ_Tle、pET21a-CJ_Mrub、pET21a-CJ_Dtu、pBT7-C-His-CJ_Pfe、pBT7-C-His-CJ_Twi、pBT7-C-His-CJ_Tth、pBT7-C-His-CJ_Tli、pBT7-C-His-CJ_Gst、pBT7-C-His-CJ_Ath、pBT7-C-His-CJ_Sac、pBT7-C-His-CJ_Tta、pBT7-C-His-CJ_Pfu、pBT7-C-His-CJ_Afu、pBT7-C-His-CJ_Aac）的相對活性（%，左側Y軸，直方圖）以及肌醇-單-磷酸酶在含有D-葡萄糖-6-磷酸、D-葡萄糖-1-磷酸、D-果糖-6-磷酸及D-阿洛酮糖-6-磷酸的去磷酸化混合物中的選擇性去磷酸化率（%，右側Y軸，正方形點）。 圖3b對用於去磷酸化的肌醇-單-磷酸酶（pET21a-CJ_Mrub、pET21a-CJ_Msi、pET21a-CJ_Mruf、pET21a-CJ_Mta、pET21a-CJ_Mch、pET21a-CJ_Mce）的相對活性（%）進行比較。 圖4a示出高效液相層析（high performance liquid chromatography，HPLC）層析圖，以確認藉由利用α-葡聚糖磷酸化酶、磷酸葡萄糖變位酶、D-葡萄糖-6-磷酸-異構酶、4-α-葡聚糖酶、D-果糖-6-磷酸-3-差向異構酶及阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶進行多種酵素反應而自麥芽糖糊精生產D-阿洛酮糖。 圖4b示出根據本發明的HPLC層析圖，以確認藉由在含有D-葡萄糖-1-磷酸、D-葡萄糖-6-磷酸、D-果糖-6-磷酸及D-阿洛酮糖-6-磷酸的反應溶液中在肌醇-單-磷酸酶存在下對D-阿洛酮糖-6-磷酸進行選擇性去磷酸化來生產D-阿洛酮糖。
<110> CJ 第一製糖股份有限公司<120> 新的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶、用於生產D-阿洛酮糖的包括所述酶的組成物以及使用所述酶生產D-阿洛酮糖的方法<130> P18-6064<150> KR 2017/0097334<151> 2017-07-31<160> 78<170> KoPatentIn 3.0<210> 1<211> 272<212> PRT<213> 人工序列<220><223> RMA的胺基酸序列<400> 1Met Met Asp Ala Tyr Thr Leu Tyr Glu Glu Ala Arg Glu Val Ala Ala 1 5 10 15 Arg Leu Ala Arg Asp Ala Gly Gln Ile Ala Arg Tyr Tyr Ala Gly Arg 20 25 30 Val Thr Val Arg Glu Lys Gly Tyr Asn Glu Leu Val Thr Gln Ala Asp 35 40 45 Glu Glu Val Gln Arg Phe Leu Ile Glu Gln Ile His Arg His Phe Pro 50 55 60 Glu His Ala Ile Leu Ala Glu Glu Asn Leu Ser Asp Met Gln Asp Gly 65 70 75 80 Arg Glu Gly Ala Ser Phe Arg Trp Ile Ile Asp Pro Ile Asp Gly Thr 85 90 95 Thr Asn Phe Thr His Gly Val Pro Pro Tyr Gly Ile Ser Leu Ala Leu 100 105 110 Gln His Glu Gly Arg Thr Val Val Gly Val Val Tyr Asp Val Pro His 115 120 125 Asp Glu Leu Phe Thr Ala Val Arg Gly Gly Gly Leu Tyr Val Asn Gly 130 135 140 Val Arg Ala Arg Val Ser Gln Thr Glu Thr Leu Arg Glu Ala Leu Ile145 150 155 160 Thr Thr Gly Phe Pro Tyr Arg Glu Val Val His Leu Glu Glu Tyr Leu 165 170 175 Glu Ala Leu Gly Arg Val Ile Arg Ala Thr Arg Gly Val Arg Arg Pro 180 185 190 Gly Ala Ala Ser Val Asp Leu Ala Trp Val Ala Cys Gly Arg Phe Asp 195 200 205 Gly Phe Phe Glu Thr Gly Leu Ser Pro Trp Asp Val Ala Ala Gly Ile 210 215 220 Leu Leu Val Glu Glu Gly Gly Gly Arg Val Thr Asp Phe His Gly Arg225 230 235 240 Pro Asp Pro Ile Phe Ala Arg Gln Met Leu Ala Thr Asn Gly Arg Ile 245 250 255 His Glu Ala Leu Cys Glu Leu Val Ala Pro Leu His His Val Tyr Ala 260 265 270 <210> 2<211> 255<212> PRT<213> 人工序列<220><223> TLE的胺基酸序列<400> 2Met Asp Arg Met Asp Phe Ser Ile Lys Ile Ala Arg Lys Val Gly Leu 1 5 10 15 Tyr Leu Met Glu His Trp Gly Asn Ala Glu Asn Val Arg Gln Lys Ser 20 25 30 Ser Phe Gln Asp Leu Val Ser Asp Cys Asp Lys Gln Ala Gln Lys Met 35 40 45 Ile Val Gln Lys Ile Lys Asp His Phe Pro Asp Asp Ala Ile Leu Ala 50 55 60 Glu Glu Gly Leu Phe Glu Lys Gly Asp Arg Met Trp Ile Ile Asp Pro 65 70 75 80 Ile Asp Gly Thr Met Asn Tyr Val His Gly Leu Pro Ser Phe Ala Ile 85 90 95 Gly Ile Ala Tyr Val Glu Lys Glu Gln Val Ile Leu Gly Val Ala His 100 105 110 Asp Pro Val Leu Asn Glu Thr Tyr Tyr Ala Ile Lys Gly Gln Gly Ala 115 120 125 Tyr Lys Asn Gly Glu Arg Ile Asn Val Ser Glu Asn Ser Leu Leu Lys 130 135 140 Asp Ser Ile Gly Asn Thr Gly Phe Tyr Thr Asp Phe Thr Gly Ile Phe145 150 155 160 Ile Ser Ala Ile Glu Lys Lys Val Arg Arg Val Arg Met Thr Gly Ser 165 170 175 Ala Ile Leu Ala Gly Ala Tyr Val Ala Cys Gly Arg Phe Asp Phe Phe 180 185 190 Ile Ala Lys Arg Ala Asn Ser Trp Asp Val Ala Pro Leu Phe Val Leu 195 200 205 Val Pro Glu Ala Gly Gly Ile Val Thr Asp Leu Ser Gly Asn Gln Ala 210 215 220 His Leu Asn Thr Gly Asn Phe Leu Phe Ser Asn Gly Leu Leu His Asp225 230 235 240 Gln Val Leu Glu Val Ile Arg Glu Val Asn Lys Lys Val Arg Lys 245 250 255<210> 3<211> 258<212> PRT<213> 人工序列<220><223> MRUB的胺基酸序列<400> 3Met Asp Leu Arg Ala Tyr Leu Gln Thr Ala Leu Asp Ala Ala Tyr Leu 1 5 10 15 Ala Lys Gly Ile His Gln Tyr Tyr Gln Glu Lys Gly Phe Thr Gln Ser 20 25 30 Thr Lys Ser Thr Pro Thr Asp Leu Val Thr Gln Ala Asp His Glu Ser 35 40 45 Glu Ala Ala Ile Arg Glu Leu Ile Ala Ser Arg His Pro Asp His Val 50 55 60 Val Leu Gly Glu Glu Gln Gly Gln Asp Lys Glu Gly Ala Phe Arg Trp 65 70 75 80 Ile Val Asp Pro Leu Asp Gly Thr Val Asn Tyr Ala His Gly Phe Pro 85 90 95 Phe Tyr Ala Val Ser Ile Gly Leu Glu Ala His Gly Glu Val Val Leu 100 105 110 Gly Val Val Leu Asp Thr Ala Arg Gly Glu Leu Phe Thr Ala Thr Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Ala Tyr Leu Asn Gly Arg Pro Ile Arg Val Ser Thr Arg 130 135 140 Ser Thr Leu Val Gly Ser Leu Leu Ala Thr Gly Phe Pro Tyr Asp Val145 150 155 160 Ser Lys Asp Thr Glu Asn Leu Val Tyr Phe Gln Arg Ala Leu Thr Lys 165 170 175 Gly Leu Met Val Arg Arg Pro Gly Ala Ala Ala Leu Asp Leu Ala Tyr 180 185 190 Val Ala Ala Gly Arg Leu Asp Gly Phe Trp Glu Val Lys Leu Asn Pro 195 200 205 Trp Asp Val Ala Ala Gly Trp Leu Ile Val Ser Glu Ala Gly Gly Arg 210 215 220 Ile Thr Gly Leu Gln Gly Glu Asp Tyr Arg Leu Gly Asn Arg Tyr Leu225 230 235 240 Val Ala Ser Asn Gly Leu Ile His Gly Pro Leu Leu Asp Thr Ile His 245 250 255 Gly Arg <210> 4<211> 265<212> PRT<213> 人工序列<220><223> DTU的胺基酸序列<400> 4Met Lys Arg Ile Leu Glu Val Ala Ile Lys Thr Ile Lys Glu Ser Gly 1 5 10 15 Asn Ile Leu Leu Asn Tyr Ile Gly Glu Glu Lys Glu Ile Glu Leu Lys 20 25 30 Gly Ile Ser Asn Leu Val Thr Gln Val Asp Lys Leu Ser Glu Arg His 35 40 45 Ile Leu Lys Ser Ile Glu Glu Asn Phe Pro Asp His Ser Ile Leu Thr 50 55 60 Glu Glu Thr Gly Phe Ile Asn Lys Asn Ser Glu Tyr Thr Trp Ile Val 65 70 75 80 Asp Pro Leu Asp Gly Thr Thr Asn Tyr Ala His Asn Phe Pro Phe Phe 85 90 95 Gly Ile Ser Ile Ala Leu Ile Lys Asn Lys Glu Ile Ile Leu Gly Leu 100 105 110 Ile Tyr Asp Pro Ile Arg Asp Glu Leu Phe Tyr Ala Ile Lys Asn Glu 115 120 125 Gly Ala Tyr Leu Asn Asp Arg Arg Ile Glu Val Ser Lys Thr Glu Ser 130 135 140 Leu Glu Asn Ser Leu Ile Ser Phe Ala Phe Pro Tyr Glu Leu Ser Leu145 150 155 160 Glu Glu Lys Asn Phe Ile Pro Phe Ile Asn Phe Ser Ser Arg Thr His 165 170 175 Gly Ile Arg Arg Thr Gly Ser Ala Ala Ile Glu Ile Ala Tyr Val Gly 180 185 190 Cys Gly Arg Leu Asp Gly Phe Trp Ala Lys Lys Leu Lys Pro Trp Asp 195 200 205 Ile Ser Ala Gly Ile Leu Ile Val Glu Glu Ala Lys Gly Lys Val Thr 210 215 220 Asp Phe Ser Gly Asn Asn Ile Asp Ile His Thr Asp Asn Ile Leu Phe225 230 235 240 Ser Asn Gly Lys Ile His Gln Glu Met Ile Lys Ile Leu Asn Leu Gly 245 250 255 Lys Ile Phe Ile Arg Asn Glu Lys Phe 260 265<210> 5<211> 251<212> PRT<213> 人工序列<220><223> PFE的胺基酸序列<400> 5Met Leu Gly Val Leu Glu Ala Val Ala Val Arg Ala Ser His Phe Leu 1 5 10 15 Met Glu Tyr Phe Arg Ala Gly Arg Gly Val Asp Val Val Ser Arg Lys 20 25 30 Glu Asp Asp Val Thr Arg Glu Val Asp Ile Ala Ala Glu Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Met Leu Arg Glu Ala Phe Lys Glu Gly Gly Val Leu Tyr Ala 50 55 60 Glu Glu Gly Gly Ile Tyr Arg Trp Gly Asp Glu Arg Tyr Ile Phe Val 65 70 75 80 Leu Asp Pro Leu Asp Gly Ser Leu Asn Tyr Ala Val Gly Val Pro Phe 85 90 95 Phe Ala Val Ser Ile Ala Ala Gly Lys His Arg Glu Gly Thr Leu Ala 100 105 110 Asp Leu Glu Tyr Ala Val Val Ala Ile Pro Pro Thr Gly Asp Val Tyr 115 120 125 Thr Ala Ala Pro Gly Val Gly Ala Arg Lys Asn Gly Lys Pro Leu Arg 130 135 140 Arg Thr Pro Arg Ser Asn Ile Val Phe Val Ala Val Ser Asn Ser Phe145 150 155 160 Pro Pro Lys Thr Cys Glu Val Val Arg Arg Leu Gly Leu Arg Gly Arg 165 170 175 Ser Leu Gly Ser Ser Ala Ala Glu Leu Ala Tyr Thr Val Glu Gly Ile 180 185 190 Ala Arg Gly Phe Leu Asp Leu Arg Gly Lys Leu Arg Leu Leu Asp Val 195 200 205 Ala Gly Ala Leu Thr Ile Gly Lys Tyr Val Asp Gly Phe Arg Tyr Val 210 215 220 Val Met Gly Asp Thr Lys Pro His Ser Lys Val Ser Leu Val Ala Gly225 230 235 240 Asp Val Asp Phe Val Asn Ala Ala Thr Thr Asp 245 250 <210> 6<211> 257<212> PRT<213> 人工序列<220><223> TWI的胺基酸序列<400> 6Met Lys Asp Glu Lys Gly Ile Val Val Asp Ile Ile Lys Lys Ala Gly 1 5 10 15 Glu Ile Leu Gln Asp Gly Trp Asn Lys Lys Asn Phe Lys Ile Tyr Arg 20 25 30 Lys Gly Thr Ile Asn Leu Val Thr Glu Ile Asp Lys Lys Ile Glu Phe 35 40 45 Leu Ile Ile Gln Leu Leu Lys Gln Tyr Phe Pro Asp Tyr Gly Ile Leu 50 55 60 Thr Glu Glu Ser Lys Glu Ile Asn Ser Lys Ala Asn Val Arg Trp Ile 65 70 75 80 Ile Asp Pro Leu Asp Gly Thr Thr Asn Tyr Ile Lys Gln Tyr Pro Phe 85 90 95 Val Ala Ile Ser Ile Ala Leu Glu Lys Glu Gly Glu Leu Ile Leu Gly 100 105 110 Val Val Tyr Asn Pro Ile Leu Asn Glu Met Phe Ile Ala Gln Lys Gly 115 120 125 Cys Gly Ala Thr Tyr Asn Gly Lys Ser Ile His Val Ser Lys Ile Lys 130 135 140 Glu Leu Gly Ser Ala Val Leu Ala Ser Gly Phe Pro Tyr Asp Ala Trp145 150 155 160 Glu Asn Pro Asp Asn Asn Ala Lys Gln Trp Arg Gln Phe Leu Thr Arg 165 170 175 Ser Leu Ser Leu Arg Cys Asp Gly Ser Ala Ala Leu Asp Leu Cys Arg 180 185 190 Val Ala Cys Gly Gln Leu Asp Gly Tyr Trp Glu Lys Gly Ile Ser Pro 195 200 205 Trp Asp Val Ala Ala Gly Ile Val Ile Leu Arg Glu Ala Gly Gly Ile 210 215 220 Ile Thr Asp Tyr Leu Gly Glu Glu Asn Phe Phe Lys Arg Gly Glu Val225 230 235 240 Val Ala Ala Asn Pro Val Leu His Ala Gln Met Leu Lys Val Leu Asn 245 250 255 Asn <210> 7<211> 264<212> PRT<213> 人工序列<220><223> TTH的胺基酸序列<400> 7Met Ile Gly Arg Arg His Pro Tyr Tyr Pro Tyr Leu Glu Ala Ala Leu 1 5 10 15 Glu Ala Ala Ser Leu Ala Arg Gly Ile His Leu Tyr Tyr Leu Glu Lys 20 25 30 Gly Phe Thr Glu Gly Thr Lys Ser Gly Pro Thr Asp Leu Val Thr Gln 35 40 45 Ala Asp Arg Glu Ala Glu Glu Ala Val Lys Gly Leu Leu Leu Ser Arg 50 55 60 Phe Pro Glu Ala Gly Phe Leu Gly Glu Glu Gly Gly Ser Glu Gly Gly 65 70 75 80 Lys Ala Leu Arg Phe Ile Val Asp Pro Leu Asp Gly Thr Val Asn Tyr 85 90 95 Ala His Gly Phe Pro Phe Phe Ala Val Ser Ile Ala Leu Glu Ala Glu 100 105 110 Gly Ala Ile Gln Met Gly Val Val Met Asp Thr Ala Arg Gly Glu Val 115 120 125 Phe Tyr Ala Leu Arg Gly Glu Gly Ala Tyr Leu Asn Gly Arg Pro Ile 130 135 140 Arg Val Thr Gly Arg Glu Ser Leu Val Gly Ser Leu Leu Ala Thr Gly145 150 155 160 Phe Pro Tyr Asp Val Ala Lys Asp Pro Glu Asn Leu Thr Tyr Phe Glu 165 170 175 Arg Ala Leu Gly Lys Gly Leu Leu Val Arg Arg Pro Gly Ala Ala Ala 180 185 190 Leu Asp Leu Ala Tyr Val Ala Ala Gly Arg Leu Glu Gly Phe Trp Glu 195 200 205 Val Lys Leu Asn Pro Trp Asp Val Ala Ala Gly Trp Leu Leu Val Glu 210 215 220 Glu Ala Gly Gly Arg Val Thr Asp Leu Glu Gly Asn Pro Tyr Arg Leu225 230 235 240 Gly Ser Arg Tyr Ile Leu Ala Thr Asn Gly Arg Val His Glu Ala Leu 245 250 255 Arg Arg Thr Leu Leu Gly Leu Asp 260 <210> 8<211> 251<212> PRT<213> 人工序列<220><223> TLI的胺基酸序列<400> 8Met Tyr Glu Trp Asn Glu Ile Ala Leu Asn Leu Ala Lys Asp Ile Glu 1 5 10 15 Arg Glu Val Met Pro Leu Phe Gly Thr Lys Lys Ala Gly Glu Phe Ile 20 25 30 Gly Phe Ser Pro Ser Gly Asp Lys Thr Lys Leu Val Asp Lys Val Ala 35 40 45 Glu Asp Val Val Leu Glu Tyr Leu Arg Pro Leu Gly Val Asn Val Val 50 55 60 Ser Glu Glu Ile Gly Asn Ile Glu Ala Gly Ser Glu Tyr Thr Ile Val 65 70 75 80 Val Asp Pro Ile Asp Gly Ser Phe Asn Phe Ile Gln Gly Ile Pro Ile 85 90 95 Phe Gly Phe Ser Phe Ala Val Phe Lys Asn Glu Lys Pro Val Tyr Ala 100 105 110 Met Ile Tyr Glu Phe Ile Thr Lys Asn Val Tyr Glu Gly Ile Pro Gly 115 120 125 Glu Gly Ala Tyr Leu Asn Gly Glu Arg Ile Arg Val Arg His Leu Asn 130 135 140 Glu Lys Ser Ile Ser Ile Ser Phe Tyr Thr Arg Gly Arg Gly Ala Arg145 150 155 160 Leu Val Glu Lys Val Lys Arg Thr Arg Val Leu Gly Ala Ile Ala Val 165 170 175 Glu Leu Ala Tyr Leu Ala Arg Gly Ser Leu Asp Gly Val Ile Asp Ile 180 185 190 Arg Asn Tyr Val Arg Pro Thr Asp Ile Ala Ala Gly Tyr Ile Ile Ala 195 200 205 Lys Glu Ala Gly Ala Ile Ile Thr Asp Asp Ser Gly Glu Glu Ile Lys 210 215 220 Phe Arg Leu Asp Ala Arg Glu Lys Leu Asn Ile Ile Ala Val Asn Asp225 230 235 240 Lys Arg Leu Leu Lys Leu Ile Leu Glu Val Ile 245 250 <210> 9<211> 264<212> PRT<213> 人工序列<220><223> GST的胺基酸序列<400> 9Met Ala Glu Lys Trp Glu Glu Ile Asp Arg Tyr Ala Arg Gln Trp Ile 1 5 10 15 Asp Glu Ala Gly Lys Arg Ile Arg Ala Ser Phe Ala Lys Gln Leu Thr 20 25 30 Val Glu Ala Lys Glu Asn Pro Asn Asp Leu Val Thr Asn Val Asp Arg 35 40 45 Ala Ile Glu Gln Phe Phe Ala Glu His Ile Arg Arg Gln Phe Pro Ser 50 55 60 His Arg Leu Leu Gly Glu Glu Gly Phe Gly Asp Arg Ile Asp Ala Leu 65 70 75 80 Asp Gly Val Val Trp Val Ile Asp Pro Ile Asp Gly Thr Met Asn Phe 85 90 95 Val His Gln Arg Arg His Phe Ala Val Ser Ile Gly Ile Phe Glu Asp 100 105 110 Gly Ile Gly Gln Leu Gly Tyr Val Tyr Asp Val Val Phe Asp Glu Leu 115 120 125 Tyr Ala Ala Gln Lys Gly Arg Gly Val Phe Leu Asn Gly Glu Pro Leu 130 135 140 Gly Leu Leu Gln Pro Ala Pro Val Ala Glu Ser Ile Ile Ala Ile Asn145 150 155 160 Gly Thr Trp Leu Met Glu Asn Lys Arg Leu Asp His Arg Pro Leu Met 165 170 175 Arg Leu Ala Lys Glu Ala Arg Gly Thr Arg Ser Tyr Gly Ser Ala Ala 180 185 190 Leu Glu Leu Ala Tyr Val Ala Ala Gly Arg Leu Asp Ala Tyr Ile Ser 195 200 205 Pro Arg Leu Ser Pro Trp Asp Phe Ala Gly Gly Met Ile Leu Ile Glu 210 215 220 Glu Ala Gly Gly Met Val Thr Thr Leu Asp Gly Lys Pro Leu Asp Leu225 230 235 240 Leu Gly Arg Asn Ser Val Leu Ala Ala Lys Pro Gly Val His Glu Glu 245 250 255 Ile Leu Arg Arg Tyr Leu His Asp 260 <210> 10<211> 259<212> PRT<213> 人工序列<220><223> ATH的胺基酸序列<400> 10Met Thr Thr Ser Leu Arg Asp Leu Leu Asp Phe Ala Val Glu Thr Ala 1 5 10 15 Tyr Leu Ala Gly Arg Thr Thr Leu Ala Tyr Phe Gln Thr Gly Val Gln 20 25 30 Ala Glu Phe Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Thr Leu Ala Asp Arg Ala 35 40 45 Ala Glu Gln Leu Ile Arg Gln Arg Ile Glu Lys Arg Phe Pro His His 50 55 60 Ala Ile Val Gly Glu Glu Phe Gly Val Gln Gly Ser Ala Asp Ala Thr 65 70 75 80 His Arg Trp Phe Ile Asp Pro Ile Asp Gly Thr Lys Ser Phe Leu Arg 85 90 95 Gly Ile Pro Leu Tyr Ala Val Leu Leu Gly Leu Glu Ile Glu Gly Arg 100 105 110 Val Gln Val Gly Val Ala Tyr Tyr Pro Ala Met Asp Glu Met Leu Ser 115 120 125 Ala Ala Asp Gly Glu Gly Cys Trp Trp Asn Gly Arg Arg Ala Arg Val 130 135 140 Ser Thr Ala Ser Arg Leu Ala Glu Ala Trp Val Thr Ser Thr Asp Pro145 150 155 160 Tyr Asn Phe Gln Lys Thr Gly Lys Asp Ala Ala Trp Gln Arg Ile Gln 165 170 175 Ala Val Ser Tyr His Arg Gly Gly Trp Gly Asp Ala Tyr Gly Tyr Leu 180 185 190 Leu Val Ala Thr Gly Arg Ala Glu Val Met Leu Asp Pro Ile Met Asn 195 200 205 Glu Trp Asp Cys Ala Pro Phe Pro Pro Ile Phe Arg Glu Ala Gly Gly 210 215 220 Phe Phe Gly Asp Trp Gln Gly Asn Glu Thr Ile Tyr Gly Gly Glu Ala225 230 235 240 Leu Ala Thr Thr Gln Val Leu Leu Pro Glu Val Leu Glu Cys Leu His 245 250 255 Ser Ser Leu <210> 11<211> 267<212> PRT<213> 人工序列<220><223> SAC的胺基酸序列<400> 11Met Lys Arg Glu Asp Val Glu Lys Val Ala Ser Glu Ala Ser Lys Tyr 1 5 10 15 Ile Tyr Glu Glu Arg Glu Asn Lys Asp Val Asp Arg Val Ile Asn Val 20 25 30 His Gly Asn Asp Val Thr Arg Ile Ile Asp Lys Arg Ser Glu Asp Phe 35 40 45 Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Gly Tyr Asn Ile Leu Ile Val Thr 50 55 60 Glu Glu Ser Gly Val Ile Asp Ser Tyr Gly Lys Asn Tyr Asp Tyr Ile 65 70 75 80 Ala Ile Val Asp Pro Leu Asp Gly Ser Thr Asn Phe Val Ser Gly Ile 85 90 95 Pro Trp Ser Ser Val Ser Ile Ala Ile Tyr Asn Arg Asp Glu Glu Asp 100 105 110 Ile Leu Ser Ser Asn Val Gly Ala Val Ser Ser Ile Phe Thr Pro Tyr 115 120 125 Thr Phe Ser Tyr Asp Glu Gly Ser Ala Tyr Val Asn Gly Val Lys Ile 130 135 140 Ala Glu Ile Lys Lys Pro Glu Lys Ile Leu Leu Leu Ala Tyr Phe Ser145 150 155 160 Arg Ser Lys Leu Pro Asn Leu Lys Leu Phe Phe Glu Lys Ile Gly Gln 165 170 175 Gly Tyr Lys Ile Arg Ser Leu Gly Ser Ala Ser Leu Asp Met Ile Leu 180 185 190 Val Cys Thr Gly Arg Ala Thr Met Phe Phe Asp Ile Arg Gly Lys Leu 195 200 205 Arg Asn Val Asp Ile Ala Ala Ser Ser Asn Phe Cys Ser Arg Leu Gly 210 215 220 Val Ile Pro Tyr Asp Ile Gly Leu Arg Lys Ile Lys Ser Ser Leu Thr225 230 235 240 Glu Val Ser Val Val Lys Asp Leu Val Ile Ser Leu Asp Glu Ser Leu 245 250 255 Leu Arg Ser Phe Ser Leu Ala Leu Gln Thr Val 260 265 <210> 12<211> 258<212> PRT<213> 人工序列<220><223> TTA的胺基酸序列<400> 12Met Leu Glu Leu Leu Lys Asp Thr Ala Lys Lys Ala Gly Arg Leu Leu 1 5 10 15 Lys Ile Arg Phe Leu Glu Leu Leu Asn Gly Met Glu Thr Glu Val Arg 20 25 30 Glu Lys Gly Lys Ser Asp Phe Val Thr Arg Val Asp Val Glu Val Glu 35 40 45 Asn Tyr Ile Lys Glu Leu Leu Ala Asn Thr Asn Ile Ser Val Val Gly 50 55 60 Glu Glu Ser Phe Lys Gly Glu Ile Pro Gly Thr Cys Ile Phe Ile Asp 65 70 75 80 Pro Ile Asp Gly Thr Arg Asn Phe Met Arg Lys Asn Pro His Phe Ala 85 90 95 Ile Asn Leu Ala Tyr Gln Glu Lys Gly Lys Leu Leu Ala Gly Val Thr 100 105 110 Tyr Asp Pro Met Lys Asn Glu Met Phe Ser Ala Ala Phe Ser Lys Gly 115 120 125 Ala Phe Leu Asn Gly Glu Arg Ile Tyr Ala Ser Thr Asn Lys Asp Ile 130 135 140 Gly Lys Ala Ile Ile Ala Ile Gly Leu Pro Tyr Arg Gly Arg Glu Leu145 150 155 160 Ile Asp Ile Gln Thr Asn Leu Tyr Arg Asn Ile Phe Leu Asn Gly Ala 165 170 175 Ala Thr Arg His Thr Gly Ser Ala Ala Leu Asp Leu Ala Tyr Ile Ser 180 185 190 Cys Gly Arg Tyr Asp Ala Ala Ile Tyr Phe Tyr Leu Ser Pro Trp Asp 195 200 205 Val Ala Pro Gly Ile Leu Leu Val Glu Glu Ala Gly Gly Glu Val Glu 210 215 220 Gly Thr Met Gly Arg Glu Pro Ile Gln Gly Trp Ile Ile Ala Ser Asn225 230 235 240 Lys Val Ile His Pro Glu Val Lys Asp Ile Leu Glu Gly Ser Leu Lys 245 250 255 Ala Val <210> 13<211> 254<212> PRT<213> 人工序列<220><223> PFU的胺基酸序列<400> 13Met Lys Leu Lys Phe Trp Arg Glu Val Ala Ile Asp Ile Ile Ser Asp 1 5 10 15 Phe Glu Thr Thr Ile Met Pro Phe Phe Gly Asn Pro Asp Gly Gly Lys 20 25 30 Leu Val Lys Ile Ser Pro Ser Gly Asp Glu Thr Lys Leu Val Asp Lys 35 40 45 Leu Ala Glu Asp Leu Ile Leu Ser Arg Ile Thr Glu Leu Gly Val Asn 50 55 60 Val Val Ser Glu Glu Val Gly Val Ile Asp Asn Glu Ser Glu Tyr Thr 65 70 75 80 Val Ile Val Asp Pro Leu Asp Gly Ser Tyr Asn Phe Ile Ala Gly Ile 85 90 95 Pro Phe Phe Ala Leu Ser Leu Ala Val Phe Lys Lys Asp Lys Pro Ile 100 105 110 Tyr Ala Ile Ile Tyr Glu Pro Met Thr Glu Arg Phe Phe Glu Gly Ile 115 120 125 Pro Gly Glu Gly Ala Phe Leu Asn Gly Lys Arg Ile Lys Val Arg Lys 130 135 140 Thr Pro Asp Glu Lys Pro Ser Ile Ser Phe Tyr Ser Arg Gly Lys Gly145 150 155 160 His Glu Ile Val Lys His Val Lys Arg Thr Arg Thr Leu Gly Ala Ile 165 170 175 Ala Leu Glu Leu Ala Tyr Leu Ala Met Gly Ala Leu Asp Gly Val Val 180 185 190 Asp Val Arg Lys Tyr Val Arg Pro Thr Asp Ile Ala Ala Gly Thr Ile 195 200 205 Ile Ala Lys Glu Ala Gly Ala Leu Ile Lys Asp Ser Ala Gly Lys Asp 210 215 220 Ile Asp Ile Ser Phe Asn Ala Thr Asp Arg Leu Asp Val Ile Ala Val225 230 235 240 Asn Ser Glu Glu Leu Leu Lys Thr Ile Leu Ser Leu Leu Glu 245 250 <210> 14<211> 252<212> PRT<213> 人工序列<220><223> AFU的胺基酸序列<400> 14Met Asp Glu Arg Asp Ala Leu Arg Ile Ser Arg Glu Ile Ala Gly Glu 1 5 10 15 Val Arg Lys Ala Ile Ala Ser Met Pro Leu Arg Glu Arg Val Lys Asp 20 25 30 Val Gly Met Gly Lys Asp Gly Thr Pro Thr Lys Ala Ala Asp Arg Val 35 40 45 Ala Glu Asp Ala Ala Leu Glu Ile Leu Arg Lys Glu Arg Val Thr Val 50 55 60 Val Thr Glu Glu Ser Gly Val Leu Gly Glu Gly Asp Val Phe Val Ala 65 70 75 80 Leu Asp Pro Leu Asp Gly Thr Phe Asn Ala Thr Arg Gly Ile Pro Val 85 90 95 Tyr Ser Val Ser Leu Cys Phe Ser Tyr Ser Asp Lys Leu Lys Asp Ala 100 105 110 Phe Phe Gly Tyr Val Tyr Asn Leu Ala Thr Gly Asp Glu Tyr Tyr Ala 115 120 125 Asp Ser Ser Gly Ala Tyr Arg Asn Gly Glu Arg Ile Glu Val Ser Asp 130 135 140 Ala Glu Glu Leu Tyr Cys Asn Ala Ile Ile Tyr Tyr Pro Asp Arg Lys145 150 155 160 Phe Pro Phe Lys Arg Met Arg Ile Phe Gly Ser Ala Ala Thr Glu Leu 165 170 175 Cys Phe Phe Ala Asp Gly Ser Phe Asp Cys Phe Leu Asp Ile Arg Pro 180 185 190 Gly Lys Met Leu Arg Ile Tyr Asp Ala Ala Ala Gly Val Phe Ile Ala 195 200 205 Glu Lys Ala Gly Gly Lys Val Thr Glu Leu Asp Gly Glu Ser Leu Gly 210 215 220 Asn Lys Lys Phe Asp Met Gln Glu Arg Leu Asn Ile Val Ala Ala Asn225 230 235 240 Glu Lys Leu His Pro Lys Leu Leu Glu Leu Ile Lys 245 250 <210> 15<211> 265<212> PRT<213> 人工序列<220><223> AAC的胺基酸序列<400> 15Met Asp Lys Ala Trp Leu Asp Gly Leu Ala Glu Val Val Arg Glu Ala 1 5 10 15 Gly Arg Leu Val Glu Glu Ile Ala Arg Gln Gly Phe Asp Thr Gln Phe 20 25 30 Lys His Pro Glu Glu Arg Arg Asp Pro Val Thr Thr Ala Asp Leu Ala 35 40 45 Cys Asp Ala Phe Leu Lys Glu Arg Leu Leu Thr Leu Leu Pro Glu Ala 50 55 60 Gly Trp Leu Ser Glu Glu Thr Lys Asp Arg Pro Asp Arg Leu Glu Lys 65 70 75 80 Arg Trp Val Trp Ile Val Asp Pro Ile Asp Gly Thr Arg Glu Phe Val 85 90 95 Arg Arg Ile Pro Glu Tyr Ala Ile Ser Val Ala Leu Ala Arg Asp Gly 100 105 110 Glu Pro Val Ala Gly Ala Val Val Asn Pro Ala Thr Gly Asp Leu Phe 115 120 125 Leu Gly Ala Val Gly Val Gly Ala Trp Arg Asn Gly Thr Pro Met Val 130 135 140 Cys Ser Arg Ile Arg Gly Glu Arg Leu Thr Ile Leu Gly Ser Arg Ser145 150 155 160 Glu Met Asn Arg Gly Glu Phe Glu Pro Phe Ala Gly Ile Leu Glu Val 165 170 175 Arg Ala Val Gly Ser Ile Ala Tyr Lys Leu Ala Leu Val Ala Ala Gly 180 185 190 Glu Ala Asp Gly Thr Phe Ser Leu Gly Pro Lys His Glu Trp Asp Ile 195 200 205 Ala Ala Gly Val Ala Leu Val Leu Ala Ala Gly Gly Arg Val His Asp 210 215 220 Gly Ala Gly Arg Pro Phe Arg Phe Asn Gln Pro His Thr Leu Thr Arg225 230 235 240 Gly Ile Val Ala Ala Thr Arg Glu Ala Tyr Gly Asp Leu Ala Leu Leu 245 250 255 Ile Glu Arg His Ala Pro Arg Arg Ala 260 265<210> 16<211> 258<212> PRT<213> 人工序列<220><223> MSI的胺基酸序列<400> 16Met Asp Leu Gln Arg Tyr Leu Glu Ala Ala Leu Asp Ala Ala Tyr Leu 1 5 10 15 Ala Arg Gly Ile His Leu Tyr Tyr Arg Glu Lys Gly Phe Ala Leu Glu 20 25 30 Ser Lys Thr Ser Pro Thr Asp Leu Val Thr Gln Ala Asp Arg Glu Ser 35 40 45 Glu Glu Ala Ile Arg Ser Leu Leu Leu Glu Arg Phe Pro Asp His Val 50 55 60 Val Leu Gly Glu Glu Gly Gly Gln Glu Gly His Ser Asp Phe Arg Trp 65 70 75 80 Ile Val Asp Pro Leu Asp Gly Thr Val Asn Tyr Ala His Gly Phe Pro 85 90 95 Phe Tyr Ala Val Ser Ile Ala Leu Glu Val Gly Gly Glu Val Val Val 100 105 110 Gly Ala Val Leu Asp Thr Ala Arg Gly Glu Leu Phe Thr Ala Leu Lys 115 120 125 Gly Glu Gly Ala Phe Gln Asn Gly Arg Pro Ile Arg Val Ser Ser Thr 130 135 140 Ala Thr Leu Ile Gly Ser Leu Leu Ala Thr Gly Phe Pro Tyr Asp Val145 150 155 160 Ala Lys Asp Ala Glu Asn Leu Thr Tyr Phe Gln Arg Ala Leu Ala Lys 165 170 175 Gly Leu Thr Val Arg Arg Pro Gly Ala Ala Ala Leu Asp Leu Ala Tyr 180 185 190 Val Ala Ala Gly Arg Leu Glu Gly Phe Trp Glu Val Lys Leu Asn Pro 195 200 205 Trp Asp Val Ala Ala Gly Trp Leu Leu Ile Thr Glu Ala Gly Gly Thr 210 215 220 Val Ser Gly Ile Gln Gly Glu Pro Tyr Arg Leu Gly Asn Arg Tyr Leu225 230 235 240 Val Ala Ser Asn Gly Lys Ile His Glu Gln Leu Leu Asp Thr Leu His 245 250 255 Gly Arg <210> 17<211> 258<212> PRT<213> 人工序列<220><223> MRUF的胺基酸序列<400> 17Met Asp Leu Arg Pro Tyr Leu Glu Ala Ala Leu Asp Ala Ala Tyr Leu 1 5 10 15 Ala Lys Gly Ile His Gln Tyr Tyr Gln Glu Lys Gly Phe Thr His Ser 20 25 30 Thr Lys Ser Thr Pro Thr Asp Val Val Thr Gln Ala Asp His Glu Ala 35 40 45 Glu Ala Ala Ile Arg Ala Leu Ile Ala Glu Arg Phe Pro Asp His Val 50 55 60 Val Leu Gly Glu Glu Gln Gly Gln Glu Gly Glu Gly Glu Phe Arg Trp 65 70 75 80 Ile Val Asp Pro Leu Asp Gly Thr Val Asn Tyr Ala His Gly Phe Pro 85 90 95 Phe Tyr Gly Val Ser Ile Gly Leu Glu Val Arg Gly Glu Val Val Leu 100 105 110 Gly Val Val Leu Asp Thr Ala Arg Gly Asp Leu Phe Thr Ala Thr Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Ala Tyr Leu Asn Gly Arg Pro Leu Arg Val Ser Gln Arg 130 135 140 Thr Thr Leu Val Gly Ser Leu Leu Ala Thr Gly Phe Pro Tyr Asp Val145 150 155 160 Ala Arg Asp Pro Glu Asn Leu Thr Tyr Phe Gln Arg Ala Leu Ala Lys 165 170 175 Gly Leu Thr Val Arg Arg Pro Gly Ala Ala Ala Leu Asp Leu Ala Asn 180 185 190 Val Ala Ala Gly Arg Leu Asp Gly Phe Trp Glu Val Lys Leu Asn Pro 195 200 205 Trp Asp Val Ala Ala Gly Trp Leu Leu Ile Thr Glu Ala Gly Gly Gln 210 215 220 Val Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ala Tyr Arg Leu Gly Asn Arg Tyr Leu225 230 235 240 Val Ala Ser Asn Gly Arg Ile His Gln Ala Leu Leu Glu Ala Leu Gln 245 250 255 Gly Arg <210> 18<211> 258<212> PRT<213> 人工序列<220><223> MTA的胺基酸序列<400> 18Met Asp Leu Arg Ala Tyr Leu Gln Thr Ala Leu Asp Ala Ala Tyr Leu 1 5 10 15 Ala Lys Gly Ile His Gln Tyr Tyr Gln Glu Lys Gly Phe Thr Gln Ser 20 25 30 Ser Lys Ser Thr Pro Thr Asp Leu Val Thr Gln Ala Asp His Glu Ser 35 40 45 Glu Ala Ala Ile Arg Glu Leu Ile Ala Ala Arg His Pro Asp His Val 50 55 60 Val Leu Gly Glu Glu Gln Gly Gln Asp Lys Glu Gly Ala Phe Arg Trp 65 70 75 80 Ile Val Asp Pro Leu Asp Gly Thr Val Asn Tyr Ala His Gly Phe Pro 85 90 95 Phe Tyr Ala Val Ser Ile Gly Leu Glu Ala His Gly Glu Val Val Leu 100 105 110 Gly Val Val Leu Asp Thr Ala Arg Gly Glu Leu Phe Thr Ala Thr Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Ala Tyr Leu Asn Gly Arg Pro Ile Arg Val Ser Thr Arg 130 135 140 Ser Thr Leu Val Gly Ser Leu Leu Ala Thr Gly Phe Pro Tyr Asp Val145 150 155 160 Ser Lys Asp Thr Glu Asn Leu Thr Tyr Phe Gln Arg Ala Leu Thr Lys 165 170 175 Gly Leu Met Val Arg Arg Pro Gly Ala Ala Ala Leu Asp Leu Ala Tyr 180 185 190 Val Ala Ala Gly Arg Leu Asp Gly Phe Trp Glu Val Lys Leu Asn Pro 195 200 205 Trp Asp Val Ala Ala Gly Trp Leu Ile Val Ser Glu Ala Gly Gly Arg 210 215 220 Val Ser Gly Leu Gln Gly Glu Asp Tyr Arg Leu Gly Asn Arg Tyr Leu225 230 235 240 Val Ala Ser Asn Gly Leu Ile His Gln Pro Leu Leu Asp Thr Leu His 245 250 255 Gly Arg <210> 19<211> 258<212> PRT<213> 人工序列<220><223> MCH的胺基酸序列<400> 19Met Asp Leu Arg Pro Phe Leu Glu Thr Ala Leu Ala Ala Ala Tyr Val 1 5 10 15 Ala Arg Gly Ile His Gln Leu Tyr Gln Asp Lys Gly Phe Thr Gln Ser 20 25 30 Thr Lys Ser Thr Pro Thr Asp Val Val Thr Gln Ala Asp Lys Glu Ala 35 40 45 Glu Ala Ala Ile Arg Ala Leu Ile Glu Gln Arg His Pro Gly His Val 50 55 60 Val Leu Gly Glu Glu Glu Gly Gln Gln Gly Glu Gly Glu Tyr Arg Trp 65 70 75 80 Ile Val Asp Pro Leu Asp Gly Thr Val Asn Tyr Ala His Gly Phe Pro 85 90 95 Phe Tyr Cys Val Ser Ile Gly Leu Glu Val Arg Gly Glu Val Met Val 100 105 110 Gly Val Val Leu Asp Thr Ala Arg Gly Asp Leu Phe Thr Ala Thr Arg 115 120 125 Gly Gly Gly Ala Tyr Phe Asn Gly Arg Pro Met Arg Val Ser Arg Ser 130 135 140 Pro Lys Leu Leu Gly Ser Leu Ile Ala Thr Gly Phe Pro Tyr Asp Val145 150 155 160 Ala Arg Asp Arg Glu Asn Leu Thr Tyr Leu Glu Arg Val Leu Phe Lys 165 170 175 Gly Ile Thr Val Arg Arg Pro Gly Ala Ala Ala Leu Asp Leu Ala Tyr 180 185 190 Val Ala Cys Gly Arg Leu Asp Gly Phe Trp Glu Val Lys Leu Asn Pro 195 200 205 Trp Asp Val Ala Ala Gly Trp Leu Leu Val Glu Glu Ala Gly Gly Arg 210 215 220 Ile Thr Gly Ile His Gly Glu Pro Tyr Arg Met Gly Asn Arg Tyr Leu225 230 235 240 Met Ala Ser Asn Gly His Ile His Glu Glu Leu Leu Ala Thr Ile His 245 250 255 Gly Arg <210> 20<211> 258<212> PRT<213> 人工序列<220><223> MCE的胺基酸序列<400> 20Met Asp Leu Arg Val Tyr Leu Gln Thr Ala Leu Asp Ala Ala Tyr Leu 1 5 10 15 Ala Lys Gly Ile His Gln Tyr Tyr Gln Glu Lys Gly Phe Thr Leu Ser 20 25 30 Ser Lys Ser Thr Pro Thr Asp Leu Val Thr Gln Ala Asp His Glu Ser 35 40 45 Glu Ala Ala Ile Arg Glu Leu Ile Ala Ala Arg His Pro Asp His Val 50 55 60 Val Leu Gly Glu Glu Gln Gly Gln Asp Arg Glu Gly Ala Phe Arg Trp 65 70 75 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agatcgcccg ctactatgcc ggtcgggtga ccgtccgcga aaaaggctat 120aacgagctgg tcacgcaggc cgacgaagaa gtacagcgct tcctgatcga gcagatccac 180cggcatttcc ccgagcacgc gattctggcc gaggagaacc tgtccgacat gcaggacggc 240agggaagggg cgtcgtttcg atggatcatc gatccgatcg acggcacgac gaacttcacg 300cacggtgtgc cgccctatgg catcagtctg gcactccagc atgaaggccg gacggtcgtg 360ggggtcgtct acgacgtgcc ccacgacgag ctgttcaccg cagtgcgggg cggcgggctg 420tacgtcaacg gggtgcgcgc ccgggttagc cagaccgaaa cgctccggga ggcgctcatc 480acgaccggct tcccctaccg ggaagtcgtg catctggaag aatatctgga ggcgctcggg 540cgtgtgattc gagcgacgcg aggggtgcgt cggccgggcg cggcttcggt cgatctggcc 600tgggtggcct gcggacgctt cgacggattc ttcgagacgg gcctgagtcc ctgggatgta 660gcggccggca tcctgctggt cgaagaaggc ggaggacggg tgacggactt tcacgggcgg 720cccgatccga tctttgcccg ccagatgctg gccacgaacg ggcgcatcca cgaggcgctc 780tgcgagctgg tcgcgccgct gcaccacgtc tacgcctga 819<210> 22<211> 768<212> DNA<213> 人工序列<220><223> TLE的核苷酸序列<400> 22atggacagaa tggatttttc aataaagatc gccagaaaag tcggtctcta cctgatggaa 60cactggggca atgcagaaaa tgttcggcaa aaaagctctt ttcaggacct ggtaagtgac 120tgcgacaagc aagcacagaa aatgattgtt cagaagataa aagaccattt tccagatgac 180gctattttag ccgaggaagg gctattcgaa aaaggagaca gaatgtggat aattgaccca 240atagatggca caatgaacta cgtccatggt ctaccttctt ttgcgattgg aatcgcctac 300gttgaaaaag agcaagttat ccttggcgta gcacacgatc cagttctcaa cgagacatac 360tatgcaatca aagggcaggg tgcgtataaa aatggggaaa gaataaatgt ttcagaaaat 420tcgcttttga aagactctat tggaaatact ggcttttata cagattttac agggatcttc 480atcagcgcaa tcgaaaagaa agtcaggcgg gtgagaatga caggcagtgc tatacttgct 540ggcgcttatg ttgcctgtgg aaggtttgat ttctttatag caaaaagagc caattcttgg 600gatgtagctc ctttattcgt cctcgtccca gaagctggtg gaatcgtaac ggacctgtcc 660ggaaaccagg cacatctcaa caccggtaat tttcttttca gtaacggtct attacacgat 720caggtcttag aagtcataag agaggtgaat aaaaaagtaa gaaaatga 768<210> 23<211> 777<212> DNA<213> 人工序列<220><223> MRUB的核苷酸序列<400> 23atggacttgc gtgcctatct gcaaaccgcc ctcgacgccg cctatttagc caaaggcatc 60caccagtact accaggaaaa aggctttacc cagagcacca agtccacccc caccgatcta 120gtcacccagg ccgaccacga gtcggaggcg gccatccgag aactcattgc ttcgcgccac 180cccgaccacg tggtgctggg cgaggaacaa ggccaggaca aagagggggc cttccgctgg 240attgtagacc ccctggacgg caccgtaaac tacgcccatg gcttcccttt ttatgcggtg 300agcatcggcc tggaagccca cggcgaggtg gtgctggggg tggttctgga taccgcccgg 360ggcgagctat ttaccgctac caaggggggc ggggcctacc tgaatggtcg tcccattcgg 420gtatccaccc gttcaaccct ggtgggcagc cttctagcca ccggattccc ctacgatgtg 480agcaaggaca ccgaaaacct ggtctacttt cagcgggccc tgaccaaggg gctcatggtg 540cggcgaccgg gcgcggcagc cctcgacctg gcttatgtgg ccgctgggcg cctggacggc 600ttctgggaag tgaagctcaa cccctgggat gtggccgcgg gctggctcat cgttagcgag 660gccggagggc ggataaccgg ccttcaaggg gaggattacc ggctgggcaa ccgctaccta 720gtggcctcca acggcctgat ccacgggccg ctgctggaca ccatccacgg gcgatag 777<210> 24<211> 798<212> DNA<213> 人工序列<220><223> DTU的核苷酸序列<400> 24atgaagagaa tacttgaagt agctataaaa acaattaaag aatctggtaa tatacttttg 60aactacatag gcgaggaaaa agaaatagaa cttaaaggaa tttccaattt agtcactcaa 120gtagataaac tctcagaaag acatatacta aaatccatag aagaaaattt tccggatcat 180tcaatcttga cagaagaaac aggctttata aataaaaatt ctgaatatac ctggattgta 240gatcccttag atggaaccac aaattatgcc cataatttcc ctttttttgg aattagtatt 300gccctcataa aaaataaaga aataatactt ggattaatct atgatcccat aagagacgag 360ttattttatg ccataaaaaa tgaaggtgca tacctaaatg ataggagaat agaggtatca 420aaaacagaaa gtcttgaaaa ttctctcatt agttttgcct ttccttacga attaagtctt 480gaggagaaaa attttattcc ttttataaat ttttcctcta gaactcatgg tataagaagg 540acaggttcgg cagcaataga aatagcctat gtagggtgtg gaagacttga tggattttgg 600gcaaagaaac taaaaccatg ggatattagt gcaggcattc taatagtgga agaggcaaaa 660ggtaaagtta cagattttag tggaaacaat attgatattc atacagacaa tattttgttt 720tcaaacggta aaatacacca agagatgata aaaatcttaa atttaggtaa aatattcatt 780agaaatgaaa aattttga 798<210> 25<211> 756<212> DNA<213> 人工序列<220><223> PFE的核苷酸序列<400> 25atgctcggcg tcttggaggc cgtggcggtc cgcgcctcgc attttttaat ggagtacttc 60agagccggca gaggcgtaga cgtcgtgtcg cgtaaagagg acgacgtcac cagggaggtg 120gacatcgccg cggagacgct catatacaaa atgctcagag aggcctttaa agaaggcggc 180gtcctatacg cagaggaagg cggcatctac aggtggggag acgagcgcta catcttcgtc 240ctagacccac tcgacgggtc gctgaactac gccgtgggcg tgcccttctt cgccgtatct 300atcgcggcag ggaaacatag agagggcacc ctggccgatt tagaatacgc cgtcgtggcg 360atacccccca cgggagacgt ctacacggcg gcccccggcg tcggcgcccg caaaaacgga 420aagccgttga ggaggacccc gaggagcaat atagtattcg tagcggtgag caacagcttc 480cccccaaaga cctgcgaagt cgtgaggcgg ctggggctca gggggaggag cctcggcagc 540tccgccgccg agctggcgta cacggtggaa ggcatagccc gcggcttcct agacctccgg 600ggcaagctca gactgctcga cgtggcgggg gcattgacga taggcaaata cgtagacggc 660ttccggtacg tggtgatggg cgacaccaag ccgcactcca aggtgtctct agtggcgggc 720gacgtagatt tcgtaaatgc cgcaaccaca gattga 756<210> 26<211> 774<212> DNA<213> 人工序列<220><223> TWI的核苷酸序列<400> 26atgaaagatg agaaaggaat tgtagtagat attataaaaa aagcaggaga gattcttcaa 60gatgggtgga ataaaaaaaa ttttaaaatt tatcggaaag gaacaattaa tttagttaca 120gaaatagata agaaaattga atttcttata atacaacttt taaaacaata ttttcctgat 180tatggtattc ttacagaaga aagcaaagaa attaacagca aagcaaacgt gcgatggatt 240atagatcccc tagatggtac tactaattat ataaaacaat atccgtttgt agccatatca 300attgctttag agaaagaagg agaattaatt ttgggagttg tttataatcc gattttaaat 360gaaatgttta tagctcaaaa aggatgtggt gcgacttata atgggaagtc aattcatgtt 420tctaaaataa aagaattggg atcggcagtt ctagcatcgg gctttcctta tgatgcgtgg 480gaaaatcctg ataataatgc taaacaatgg aggcaatttc ttactcgtag tttatctctt 540cgatgcgatg gatcagcagc tctcgatctt tgtagagtag cttgtggaca attggatggt 600tattgggaaa agggaattag cccgtgggat gttgcagctg gtattgtaat attgcgcgaa 660gcaggaggaa taattactga ttatttgggt gaggaaaatt tctttaaacg tggagaagtt 720gttgctgcaa atcctgttct ccacgcacaa atgttgaaag ttttaaataa ttag 774<210> 27<211> 795<212> DNA<213> 人工序列<220><223> TTH的核苷酸序列<400> 27atgatcggga ggcgccaccc ctactacccg tacctggagg cggccctgga ggcggcgagc 60ctcgcccggg gcatccacct ctactacctg gaaaagggct tcaccgaggg gaccaagtcc 120ggccccaccg acctggtgac ccaggcggac cgggaggcgg aagaggcggt gaagggcctc 180ctcctctccc gcttccccga ggcggggttt ctgggggagg aagggggaag cgagggcggg 240aaggccctcc gcttcatcgt ggacccgctg gacgggacgg tgaactacgc ccacggcttc 300cccttcttcg ccgtatccat cgccctcgag gccgagggcg ccatccagat gggcgtggtg 360atggacaccg cccgggggga ggtcttctac gccctgaggg gggaaggggc ctacctcaac 420ggccgcccca tccgggtcac ggggcgggag agcctcgtgg ggagcctcct cgccacgggc 480ttcccctacg acgtggccaa ggacccggaa aacctcacct actttgaacg ggccctgggc 540aagggcctgc tcgtccgcag gcctggggcg gcggccctgg acctggccta cgtggccgcg 600gggcggctgg agggcttctg ggaggtgaag ctgaacccct gggacgtggc ggcggggtgg 660ctcctcgtgg aagaggcggg aggaagggtg acggacctcg aggggaaccc ctaccgcctg 720ggcagccgct acatcctcgc caccaacggg cgggtccacg aggccctgcg ccggaccctc 780ctgggcctgg actga 795<210> 28<211> 756<212> DNA<213> 人工序列<220><223> TLI的核苷酸序列<400> 28atgtatgaat ggaatgaaat agccctaaat ctcgcaaagg atattgaaag agaagtaatg 60cctctctttg gaacaaagaa ggctggagaa ttcatcgggt ttagcccgag cggggacaaa 120actaaactcg tagataaagt tgcagaagac gttgttctgg agtatctcag accccttggc 180gtaaacgtag taagtgagga gattgggaac atagaggctg gaagtgaata cactattgtt 240gtcgacccca tcgatggttc tttcaacttt atccaaggca tccctatctt tggattcagc 300tttgcagttt tcaaaaatga aaaacccgtc tatgctatga tttacgagtt catcacaaag 360aacgtttatg aaggaattcc cggtgaggga gcctatctaa acggggagag aatacgagtt 420aggcatttaa atgaaaagtc catctcaata agcttctaca caagaggtag gggagcgagg 480cttgttgaaa aagttaagag aacgagggtt ttaggtgcta tagcagttga gcttgcttat 540ctcgctagag gttctctaga cggtgtaata gacataagga actatgtaag gccgacagac 600atagcagcag gttacataat cgcaaaagaa gctggagcta ttataaccga cgatagcgga 660gaggaaataa agtttagatt agatgcaagg gaaaagctca acataatagc ggtaaatgat 720aagagactcc ttaagctcat acttgaagtt atttaa 756<210> 29<211> 795<212> DNA<213> 人工序列<220><223> GST的核苷酸序列<400> 29atggcagaaa aatgggaaga aatcgaccga tacgcccggc aatggatcga cgaagcagga 60aagcgcatcc gcgcctcgtt tgccaaacag ctgacggtgg aagcgaaaga gaacccgaac 120gacttagtga cgaatgttga ccgcgccatt gagcagtttt tcgccgagca catccgtcgc 180cagttcccta gccaccgcct gttgggggaa gaaggatttg gcgaccggat cgatgccttg 240gacggcgttg tttgggtgat tgacccgatc gacggcacga tgaatttcgt tcatcagcgg 300cgccattttg ctgtatcgat cggcattttt gaagatggca tcgggcagct cggctacgtg 360tatgacgtcg tgtttgacga actgtatgcg gcgcaaaaag ggcggggggt gtttttgaac 420ggggagccgc tcggcctcct gcagcccgcg ccagtggcgg agtcgatcat cgccatcaac 480gggacatggc tcatggaaaa caagcgcctc gaccatcgcc cgctcatgag gctggcgaaa 540gaggcgcgcg gcacgcgctc gtatggttca gcggcgcttg agctcgcgta tgttgccgcc 600ggccgtttgg acgcctacat ttcgccgcgc ctgtcgccgt gggatttcgc cggcgggatg 660attttgattg aagaagcggg cggaatggtg acgacccttg acgggaagcc gctggatctg 720cttggccgca attcggtgct tgccgcgaaa cctggggtgc acgaagaaat tttgcggcgc 780tatcttcacg attga 795<210> 30<211> 780<212> DNA<213> 人工序列<220><223> ATH的核苷酸序列<400> 30atgaccactt cccttcgcga tttgctcgat tttgctgtgg aaacggcgta tctggcagga 60cgaaccaccc tggcgtattt tcagacgggt gttcaggcgg agttcaaagc cgattcttcc 120cccgtgactc ttgccgaccg cgccgccgag caattgattc gtcaacgcat tgaaaaacgc 180ttccctcatc atgccattgt gggtgaggaa tttggtgttc agggaagcgc tgatgctacc 240caccgctggt tcattgaccc gattgacggc accaaatcct tcctgcgcgg cattcccctg 300tacgctgtgc tgttgggctt ggagattgaa ggcagggtgc aggtgggagt ggcttattac 360cccgctatgg acgagatgct gtctgccgcc gatggcgagg gatgctggtg gaacgggcgg 420cgggcgcgtg tctccacggc gagccgcctg gcagaagcct gggtgaccag caccgacccc 480tacaatttcc agaaaaccgg caaagatgcc gcctggcagc gcattcaggc ggtgtcttat 540caccgcggcg gctgggggga tgcctacggc tatctgctgg ttgctactgg gagagccgaa 600gtgatgctcg atcccatcat gaacgagtgg gattgcgcgc cgttcccgcc catcttccgc 660gaagccggtg gttttttcgg agactggcag ggtaacgaaa ccatctatgg cggcgaggcg 720ctggcaacaa ctcaggttct tctccctgag gtgctggagt gtttacattc ttccctttga 780 780<210> 31<211> 804<212> DNA<213> 人工序列<220><223> SAC的核苷酸序列<400> 31atgaaaagag aagatgtaga gaaggtagct agcgaagctt ctaaatatat atatgaagag 60agagaaaaca aggacgtcga cagagtaatt aatgtacatg gtaatgacgt gactagaatt 120atagataaga gatctgaaga ctttattgtg gacaggttaa aaagtctagg atataatata 180ctcatagtta cagaagaatc aggtgtaatt gacagttatg ggaaaaatta cgattacatt 240gcaattgtag atccactgga tggaagtaca aattttgtat caggaatacc atggtcttca 300gtatctattg ctatatacaa tagggacgaa gaagatatac tcagttcaaa tgtaggtgct 360gtaagcagta ttttcactcc ttacacattt tcctacgatg aaggaagcgc ttacgtaaat 420ggcgtaaaga tagcagagat aaaaaagcct gaaaaaatac tattattagc ctatttctcc 480aggtcaaagc tacctaatct gaaattattt tttgagaaga ttggtcaggg ttataaaata 540agaagtttag gaagtgcatc cttagatatg atattagtgt gtacaggcag ggcaacaatg 600ttttttgata taaggggaaa actgagaaat gtggatattg cagcctcatc taacttctgt 660tccagattag gggtaattcc atacgacata ggtttaagaa aaattaaaag tagtttgacg 720gaagtaagtg ttgtaaaaga tttagttata agtcttgacg aaagtcttct aagatctttc 780tctcttgctt tacagacggt ttaa 804<210> 32<211> 777<212> DNA<213> 人工序列<220><223> TTA的核苷酸序列<400> 32atgctagaac tgctaaagga tacagcaaaa aaagcaggac gactgctaaa aataagattc 60ttggaacttt tgaacggcat ggaaaccgag gtaagagaaa agggaaaaag cgattttgta 120acaagggtag atgttgaagt ggaaaactac ataaaggaac tgcttgctaa cacaaatata 180tcggtggtgg gagaagaaag ctttaaaggc gagataccgg gcacctgcat cttcatagac 240cccatagatg gcacaagaaa cttcatgaga aagaaccccc acttcgccat taaccttgct 300tatcaggaga agggaaagct tttggctgga gtgacctatg accctatgaa gaatgaaatg 360ttttctgctg catttagcaa aggtgcattt ttaaacggag agcgcatcta cgcttccaca 420aacaaggata ttggcaaagc catcatcgct ataggacttc catacagagg aagagaactc 480atagatattc aaaccaacct ttacaggaac atcttcctaa acggcgctgc tacccgccac 540acaggctcag cagcccttga tctggcctac atatcctgcg gaagatacga tgctgctatc 600tatttttatc tttccccctg ggacgtagct ccgggcatac tgctggtaga agaggcaggc 660ggagaagttg aaggcaccat gggacgagaa cccatccagg ggtggataat agcatctaac 720aaagtcatcc accccgaagt taaagacatc cttgaaggct ctttaaaagc ggtataa 777<210> 33<211> 765<212> DNA<213> 人工序列<220><223> PFU的核苷酸序列<400> 33atgaagctta agttctggag ggaagtagcc attgacataa tctcagattt cgaaactaca 60ataatgcctt tctttggaaa ccctgatggg ggaaagctcg taaagataag ccccagtgga 120gatgagacaa agctggttga taagctcgcc gaggatttaa tactttcaag aatcacagag 180cttggagtca acgttgtgag cgaggaagtt ggtgttattg ataacgagag tgaatacacc 240gttatagtag acccactaga tggttcatat aacttcattg ctggaattcc tttttttgct 300ttgagtctag cagtatttaa aaaagataag ccaatatatg caattatcta tgaacctatg 360acagagagat tctttgaggg aatcccagga gagggagctt ttttaaatgg aaaaagaata 420aaggtaagaa aaaccccgga cgagaagcca tcaataagct tttattctcg aggtaaaggc 480catgaaatcg ttaaacatgt aaagagaact agaaccttag gggcaatcgc tctagaattg 540gcatacctag ctatgggtgc attagatgga gtagttgatg tgaggaaata cgtaaggcca 600acggacatag ctgctggaac gataattgca aaagaggcag gagcccttat taaggactcc 660gcgggaaagg atatagatat ttcatttaat gcaactgata ggcttgatgt gatagccgtg 720aacagcgaag agttgctaaa aacaatttta agcttactgg agtag 765<210> 34<211> 759<212> DNA<213> 人工序列<220><223> AFU的核苷酸序列<400> 34atggatgaaa gggatgcgct gagaatttcg agggagattg caggagaggt cagaaaggcc 60attgcgtcaa tgcccttgag ggagagagta aaggacgtgg gaatggggaa ggatggcact 120ccaaccaagg cagccgacag agttgcggaa gatgctgcgc ttgaaatttt gagaaaggag 180agggttacgg tggttacaga ggagtcggga gttttggggg agggagatgt ctttgttgcc 240ctcgaccccc tcgatggaac cttcaatgct acgagaggga ttccagttta ttcagtcagc 300ctctgcttct cctattcgga taaactgaaa gacgccttct ttggctacgt ttacaacctc 360gcaacagggg atgaatacta cgcggactcc agcggggctt acagaaacgg ggagaggatt 420gaggtgagcg atgctgagga gctttactgc aacgccataa tctactatcc cgacaggaag 480tttcccttta agaggatgag gatttttgga agtgctgcaa cggagctttg cttctttgct 540gacggctcct ttgactgctt cctcgacatc cgccccggaa agatgcttag aatctacgat 600gccgctgcgg gtgtttttat tgcagaaaag gcaggaggaa aggttaccga acttgatgga 660gaaagcttgg ggaataaaaa atttgatatg caggaaaggc tcaatatcgt cgccgcaaat 720gaaaaactcc atccaaagct gctggagctg attaaatga 759<210> 35<211> 798<212> DNA<213> 人工序列<220><223> AAC的核苷酸序列<400> 35atggacaagg catggctcga tggcctggcg gaggtcgtgc gggaggctgg ccgcctggtg 60gaggagatcg ccaggcaggg cttcgatacg caattcaagc atccggaaga gaggcgagat 120ccggtcacga cagccgatct cgcctgtgac gcgtttctga aagagcggct gctcacgctg 180cttccggagg cgggctggct gtccgaggag acgaaggatc ggccggatcg attggagaaa 240aggtgggtgt ggatcgtcga tcccatcgac ggcacgcggg agttcgtccg ccgcattccc 300gagtacgcca tctcggtggc gctcgcgcgg gacggcgagc cggtggcggg cgcggtggtg 360aatcccgcga cgggggatct gtttctcggc gccgtgggcg tcggcgcatg gcggaatgga 420acgcccatgg tttgttcccg catccgcggc gagcggctca cgattctcgg cagccggtcg 480gagatgaacc gcggcgagtt cgagccgttt gccggcattc tcgaggtccg ggcggtgggc 540tccatcgcgt ataagctcgc gctcgtcgcg gcgggcgagg cggatggcac gttcagcctc 600ggcccgaaac acgagtggga tatcgcggcc ggcgtcgcgc tcgtcctggc ggcgggcggc 660cgggtacacg atggcgccgg gcgcccgttt cgcttcaacc agccgcacac gctcacccgt 720ggcatcgtcg cggccacgcg cgaggcgtat ggcgatctcg ccctgctcat cgagcggcac 780gccccacggc gcgcctag 798<210> 36<211> 777<212> DNA<213> 人工序列<220><223> MSI的核苷酸序列<400> 36atggacttgc aacgctactt ggaagccgca ctcgatgctg cgtacttggc tcgaggcatc 60cacctctact accgcgaaaa aggcttcgcc ctggagagca aaaccagtcc caccgacttg 120gtcacccaag ccgaccggga gagcgaagaa gctatccgga gtttactgct cgagcgcttc 180cccgatcatg tggtgctggg tgaagaaggt gggcaggaag gccacagcga ttttcgctgg 240atcgtggacc cgctcgacgg cacggtcaac tacgcccacg gcttcccctt ctacgcggta 300agcatcgccc tcgaggtggg gggcgaggtc gtggtggggg cagtgctgga caccgcacgg 360ggcgagctgt ttaccgccct caaaggagag ggagcattcc aaaatggacg ccccattcgc 420gtttcgagca ccgcgaccct catcggaagc ctgctggcaa ccggcttccc ctacgatgtg 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cagcgggctt tggccaaggg gctgaccgtg 540cggcggcccg gggcagcggc cctcgacctg gccaatgtgg ccgcgggccg gctggacggt 600ttctgggagg ttaagctcaa cccctgggat gtggctgcgg gctggctcct catcaccgag 660gcaggcggcc aggtcaccgg gttccagggc gaggcctacc gcctgggtaa ccgctattta 720gtggcctcca atgggcggat tcaccaggcg ctgctcgagg cccttcaggg ccgatag 777<210> 38<211> 777<212> DNA<213> 人工序列<220><223> MTA的核苷酸序列<400> 38atggacttgc gtgcctacct gcaaaccgcc ctcgacgccg cctatttagc caaaggcatc 60caccagtact accaggaaaa aggctttacc cagagcagca agtccacccc caccgatctg 120gtcacccagg ccgaccacga gtcggaggcg gccatccgag aactcatcgc cgcgcgccac 180cccgaccacg tggtgctggg cgaggagcag ggccaggaca aagaaggggc cttccgctgg 240attgtagacc ccctggacgg caccgtaaac tacgcccatg gttttccttt ttatgcggtg 300agcattggcc tggaagccca cggcgaggtg gtgctggggg tggttctgga taccgctcga 360ggcgagctgt ttaccgctac caaagggggt ggggcttacc tgaacggtcg tcccatccgg 420gtttccactc gttcaaccct ggtgggcagc ctcctggcca ccggatttcc ctacgacgta 480agcaaggata ccgaaaacct gacctacttc cagcgggcat tgaccaaagg gctcatggta 540cggcgccccg gcgcggcggc cctcgacctg gcctatgtgg ccgccgggcg cctggacggc 600ttctgggagg tgaagctgaa cccctgggac gtggccgcgg gctggctcat cgtcagtgag 660gcgggggggc gggtaagcgg ccttcagggc gaggattacc ggctgggcaa ccgctacctg 720gtggcctcca acggcctaat tcatcagccc ttgctggaca ccctccacgg gcgatag 777<210> 39<211> 777<212> DNA<213> 人工序列<220><223> MCH的核苷酸序列<400> 39atggacctgc gccccttcct cgagaccgcg ctcgccgcgg cttacgtggc tcgaggcatc 60caccagctct accaggacaa aggcttcacc cagagcacca agtccacccc caccgacgtc 120gtgacccaag ccgacaagga ggccgaggcc gccatccgcg ccctcatcga gcagcggcac 180cccggccacg tggtgctcgg cgaggaggag ggccagcagg gcgagggcga gtaccgctgg 240atcgtggacc cgctcgacgg caccgtgaat tacgcccacg gcttcccctt ctactgcgtg 300agcatcgggc tcgaggtgcg cggcgaggtg atggtgggcg tggtgctcga caccgcccgc 360ggcgacctct tcaccgcgac ccgcggcggc ggggcctact tcaacgggcg gcccatgcgg 420gtctcgcggt cgcccaagct gctgggcagc ctcatcgcca ccggcttccc ctacgacgtc 480gcccgcgacc gcgaaaacct gacctacctc gagcgcgtcc tcttcaaggg catcaccgtg 540cgccgccccg gcgccgccgc cctcgacctc gcctacgtgg cctgcgggcg gctcgacggc 600ttctgggagg tcaagctcaa cccctgggac gtggcggcgg gctggctgct ggtcgaggag 660gcgggcggca ggatcaccgg catccacggc gagccctacc gcatgggcaa ccgctacctc 720atggcctcca acggccacat ccacgaggaa ttgctggcga cgatccacgg ccggtag 777<210> 40<211> 777<212> DNA<213> 人工序列<220><223> MCE的核苷酸序列<400> 40atggacttgc gtgtatacct gcagaccgcc ctcgatgcag cctatctggc caaaggcatt 60caccagtact accaggagaa gggttttacc ctaagcagca agtccacccc cacagacctg 120gttactcagg ccgaccacga gtcggaagcg gccatccgag aactcattgc cgcgcgccac 180cccgaccacg tggtgctggg agaggagcag ggccaggaca gagaaggggc ttttcgctgg 240attgtagacc ccctggatgg caccgtaaac tacgcccacg gttttccctt ttatgcggtg 300agtatcggcc tcgaggccca cggcgaggtg gtgctgggag tgattctcga taccgcccgg 360ggcgacctat tcaccgctac caaggggggc ggggccttca tgaatggccg ccccatccgg 420gtttcccctc gagccaccct ggtgggaagc ctgctggcca ccggcttccc ctatgacgtt 480agcaaagaca ccgaaaacct ggtctacttc cagcgggccc tgaccagagg gcttatggtg 540cggcgtcccg gcgctgccgc cctcgacctg gcctacgtgg ccgccgggcg tctggatggt 600ttctgggagg tgaagctcaa cccctgggat gtggccgcag gctggctcat catccgcgag 660gccgggggta cggttacggg catggagggg gaggcctacc ggctgggcaa ccgctacctg 720gtagcctcca acggcctgat tcaccagcct ctgctggaca ccatacacgg gcgatag 777<210> 41<211> 26<212> DNA<213> 人工序列<220><223> Rma的正向引子DNA序列<400> 41ctccgccata tgatggatgc ctacac 26<210> 42<211> 25<212> DNA<213> 人工序列<220><223> Rma的反向引子DNA序列<400> 42gccacctcga gggcgtagac gtggt 25<210> 43<211> 33<212> DNA<213> 人工序列<220><223> Tle的正向引子DNA序列<400> 43gtgcaaatca tatggacaga atggattttt caa 33<210> 44<211> 34<212> DNA<213> 人工序列<220><223> Tle的反向引子DNA序列<400> 44gatattctcg agttttctta cttttttatt cacc 34<210> 45<211> 27<212> DNA<213> 人工序列<220><223> Mrub的正向引子DNA序列<400> 45tgaccccata tggacttgcg tgcctat 27<210> 46<211> 25<212> DNA<213> 人工序列<220><223> Mrub的反向引子DNA序列<400> 46ttctgcctcg agtcgcccgt ggatg 25<210> 47<211> 34<212> DNA<213> 人工序列<220><223> Dtu的正向引子DNA序列<400> 47taagctcata tgaagagaat acttgaagta gcta 34<210> 48<211> 34<212> DNA<213> 人工序列<220><223> Dtu的反向引子DNA序列<400> 48acaaaagact cgagaaattt ttcatttcta atga 34<210> 49<211> 34<212> DNA<213> 人工序列<220><223> Msi的正向引子DNA序列<400> 49atatacatat ggacttgcaa cgctacttgg aagc 34<210> 50<211> 31<212> DNA<213> 人工序列<220><223> Msi的反向引子DNA序列<400> 50tggtggtcga ctcgcccgtg gagcgtgtcg a 31<210> 51<211> 34<212> DNA<213> 人工序列<220><223> Mruf的正向引子DNA序列<400> 51atatacatat ggatctgcgt ccctacctcg aggc 34<210> 52<211> 30<212> DNA<213> 人工序列<220><223> Mruf的反向引子DNA序列<400> 52tggtggtcga ctcggccctg aagggcctcg 30<210> 53<211> 34<212> DNA<213> 人工序列<220><223> Mta的正向引子DNA序列<400> 53atatacatat ggacttgcgt gcctacctgc aaac 34<210> 54<211> 31<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Mta的反向引子DNA序列<400> 54tggtggtcga ctcgcccgtg gagggtgtcc a 31<210> 55<211> 34<212> DNA<213> 人工序列<220><223> Mch的正向引子DNA序列<400> 55atatacatat ggacctgcgc cccttcctcg agac 34<210> 56<211> 31<212> DNA<213> 人工序列<220><223> Mch的反向引子DNA序列<400> 56tggtggtcga cccggccgtg gatcgtcgcc a 31<210> 57<211> 34<212> DNA<213> 人工序列<220><223> Mce的正向引子DNA序列<400> 57atatacatat ggacttgcgt gtatacctgc agac 34<210> 58<211> 31<212> DNA<213> 人工序列<220><223> Mce的反向引子DNA序列<400> 58tggtggtcga ctcgcccgtg tatggtgtcc a 31<210> 59<211> 823<212> PRT<213> 人工序列<220><223> CT1的胺基酸序列<400> 59Met Leu Lys Lys Leu Pro Glu Asn Leu Glu His Leu Glu Glu Leu Ala 1 5 10 15 Tyr Asn Leu Trp Trp Ser Trp Ser Arg Pro Ala Gln Arg Leu Trp Arg 20 25 30 Lys Ile Asp Pro Glu Gly Trp Glu Glu His Arg Asn Pro Val Lys Ile 35 40 45 Leu Lys Glu Val Ser Asp Glu Arg Leu Glu Glu Leu Ser Lys Asp Asp 50 55 60 Asp Phe Ile Ser Leu Tyr Glu Leu Thr Ile Glu Arg Phe Lys Asp Tyr 65 70 75 80 Met Glu Lys Glu Asp Thr Trp Phe Asn Val Asn Tyr Pro Glu Trp Asp 85 90 95 Glu Lys Ile Val Tyr Met Cys Met Glu Tyr Gly Leu Thr Lys Ala Leu 100 105 110 Pro Ile Tyr Ser Gly Gly Leu Gly Ile Leu Ala Gly Asp His Leu Lys 115 120 125 Ser Ala Ser Asp Leu Gly Leu Pro Leu Ile Ala Ile Gly Leu Leu Tyr 130 135 140 Lys His Gly Tyr Phe Thr Gln Gln Ile Asp Arg Asp Gly Lys Gln Ile145 150 155 160 Glu Ile Phe Pro Asp Tyr Asn Pro Glu Asp Leu Pro Met Lys Pro Leu 165 170 175 Lys Asp Glu 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tgggggaatg aagcttctca gggctctgaa cctgaaacca 780ggagtcatcc atctgaacga aggacatccg gcgttctctt ccctcgaaag gataaagaac 840tacatggaag aaggatattc cttcacagag gcccttgaga tcgtgagaca gacgagtgtg 900tttacaaccc acacacccgt tcccgctgga cacgacagat ttccctttga cctcgtggaa 960aagaaacttt cgaaattctt cgaaggattc gaaaagagaa atcttctcat ggatcttggg 1020aaagatgaaa caggcagttt caacatgacg tatcttgccc tgagaacgtc ctctttcata 1080aacggcgtga gcaaactgca tgcggaagtt tccagaagga tgttcaaaaa cgtgtggcag 1140ggtgttcccg tggaggaaat accgatcgaa gggataacga acggcgttca catgggaacc 1200tggatcaacc gtgagatgag aaaactgtac gacagatatc tcggaagggt atggagagat 1260cacaccgacc ttgagggtat ctggtacggt gttgacagga ttccagatga agaactctgg 1320caggctcacc tgagggcaaa gaagagattc atcgagtaca taaaagaatc ggtaagaaga 1380agaaacgaga gactgggaat cgacgaagat gtgccgaaca tcgatgaaaa ttcgctcatc 1440ataggttttg caagaaggtt tgccacttac aagagggcag ttctcctgct cagcgatctg 1500gagagactca agaagatcct caacgatcca gaaagacccg tttacgtggt ctatgcgggg 1560aaggcccatc caagggacga tgcggggaag gaatttttga aacgcatcta cgaagtctcg 1620cagatgcctg agttcaaaaa caggatcatc gtactggaaa actacgacat tggaatggca 1680cggctcatgg tgtcgggagt ggatgtgtgg ctgaacaacc cgagaagacc catggaagca 1740agtggaacaa gcggaatgaa ggcagcagcc aacggagttc ttaacgcgag tgtttacgat 1800ggatggtggg ttgaagggta caacggcaga aacggctggg tcataggcga tgaaagcgtt 1860cttccagaga cggaagtgga cgatcccagg gacgcagaag cactctacga tctcctcgaa 1920aacgaaatca tcccaaccta ctacgaaaac aaagaaaagt ggatcttcat gatgaaagag 1980agcataaaga gtgttgctcc aagattcagc accaccagaa tgctcaaaga atacacggag 2040aagttctaca taaagggact tgtgaacaaa gaatggcttg aaagaaaaga aaacgccgaa 2100aggtttggtg catggaagga aaggatcctc agaaactgga gcagcgtttc catagaaaga 2160atcgtccttg aggacacaag gagtgttgag gtgacggtga aactgggaga cctttcacct 2220gatgatgtac tggttgaact tttgattgga agaggagaaa gcatggaaga tctggagatc 2280tggaaggtga tacagataag aaagcacaga agggaagggg atctgttcat ctacagttat 2340gtcaacggtg ccctcggtca tcttggctct ccgggatggt tctacgcggt gagggtgcta 2400ccttatcatc cgaaacttcc caccagattc ttgccggaga tacctgtggt gtggaaaaag 2460gttctcgggt ga 2472<210> 61<211> 441<212> PRT<213> 人工序列<220><223> CT2的胺基酸序列<400> 61Met Ile Gly Tyr Gln Ile Tyr Val Arg Ser Phe Arg Asp Gly Asn Phe 1 5 10 15 Asp Gly Val Gly Asp Phe Lys Gly Leu Lys Gly Ala Ile Ser Tyr Leu 20 25 30 Lys Glu Leu Gly Val Asp Phe Val Trp Leu Met Pro Val Phe Ser Ser 35 40 45 Ile Ser Phe His Gly Tyr Asp Val Val Asp Phe Tyr Ser Phe Lys Ala 50 55 60 Glu Tyr Gly Asp Glu Lys Asp Phe Arg Glu Met Ile Glu Ala Phe His 65 70 75 80 Asp Asn Gly Ile Lys Val Val Leu Asp Leu Pro Ile His His Thr Gly 85 90 95 Phe Leu His Val Trp Phe Gln Lys Ala Leu Lys Gly Asp Pro His Tyr 100 105 110 Arg Asp Tyr Tyr Val Trp Ala Ser Glu Lys Thr Asp Leu Asp Glu Arg 115 120 125 Arg Glu Trp Asp Asn Glu Arg Ile Trp His Pro Leu Glu Asp Gly Arg 130 135 140 Phe Tyr Arg Gly Leu Phe Gly Pro Leu Ser Pro Asp Leu Asn Tyr Asp145 150 155 160 Asn Pro Gln Val Phe Glu Glu Met Lys Lys Val Val Tyr His Leu Leu 165 170 175 Glu Met Gly Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Ala Ala Lys His Met Arg 180 185 190 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Lys Leu Leu Val Tyr Arg Leu Val Asp Glu Gly Arg Ser Leu Lys 405 410 415 Val Ile His Asn Leu Ser Asn Gly Glu Met Val Phe Glu Gly Val Arg 420 425 430 Val Gln Pro Tyr Ser Thr Glu Val Val 435 440 <210> 62<211> 1326<212> DNA<213> 人工序列<220><223> CT2的核苷酸序列<400> 62atgataggct accagatcta cgtgagatca ttcagggatg gaaacttcga tggtgtgggg 60gatttcaaag gattgaaagg tgcgatttcc tacctgaaag aactgggtgt tgattttgtc 120tggctcatgc ccgtcttttc ctccatttcc ttccacgggt atgacgtggt ggatttttat 180tctttcaaag ccgagtacgg agacgagaaa gactttagag agatgatcga ggcgttccac 240gacaacggta taaaagtcgt tctcgatctt cccatccatc atactggttt cctccatgtg 300tggtttcaga aagccctgaa aggagatcca cactacaggg attattacgt atgggcgagt 360gaaaaaacgg atctggacga aagaagagag tgggacaacg aaaggatctg gcatcctctg 420gaggacggaa ggttctacag aggacttttc ggtcccctct cacccgatct gaactacgat 480aacccgcagg tttttgaaga gatgaagaag gtggtttatc accttcttga aatgggagtg 540gacggattca gattcgacgc agcaaagcac atgagagata ctctggaaca gaacgttcgc 600ttttggaggt atttcctctc cgatattgag ggaatattcc ttgcggaaat ctgggcagaa 660tccaaagttg tggatgaaca cggcaggata ttcggctaca tgctaaattt cgatacctca 720cactgtatta aggaagcggt gtggaaggaa aacttcaaag tgttgatcga gtcgatcgaa 780agggccctgg ttggaaaaga ttatctgccg gtgaacttca catcgaacca tgatatgtca 840aggcttgcga gtttcgaagg agggttgagt gaagagaagg tgaaactctc actttccatt 900ctgttcacgc ttcccggggt tcctctcata ttctacggag acgaactggg aatgaaagga 960atctatcgaa aaccgaacac ggaagtcgtg ctggatccgt tcccctggag cgaaaacatg 1020tgtgttgaag gccagacatt ttggaaatgg cccgcgtata acgatccatt ctccggtgtt 1080tctgttgagt atcagaggag aaatcgtgat tcgattctct cacacacgat gaggtgggca 1140ggattcagag gggaaaatca ctggctggac agggcaaaca tcgaatttct gtgcaaagaa 1200gaaaaactgc tcgtgtacag actggtcgat gaagggcgtt ctctgaaagt gatacacaac 1260ctgtcgaatg gtgaaatggt gtttgaggga gtgcgcgtac aaccctacag cacggaggtg 1320gtttga 1326<210> 63<211> 451<212> PRT<213> 人工序列<220><223> TN1的胺基酸序列<400> 63Met Lys Lys Met Ala Leu Lys Phe Asp Phe Ser Asn Leu Phe Glu Pro 1 5 10 15 Asn Ile Ser Gly Gly Leu Arg Glu Glu Asp Leu Glu Ser Thr Lys Glu 20 25 30 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tcgtggactg gtacagacag 840ctgtgggcag aaagtctggg aaagagatac aacctgaaag gagaggaggt cttcacgggt 900cagaccccgg tgaaggcaat aggagccacc gatcagcact ctcagataca gctttacaac 960gagggcccaa acgacaaagt gataacgttt ttgcggttgg aaaacttcga tagagagatc 1020ataataccgg acaccggaag agaagagctc aaataccttg caagaaaaag actctctgaa 1080cttctccttg cagaacagac aggaacagag gaagccctaa ggaaaaacga cagaccgaac 1140atgaaggtga tcttcgacag actcacctct tacaatgtgg gccagttctt cgcttattat 1200gaagccgcaa ctgctttcat ggggtatctc ctcgagatca acccgtttga tcagccgggt 1260gtggaacttg gaaagaagat cacgtttgcc ctcatgggaa gggaaggtta cgaatacgaa 1320ataaaagatc gcaccaagaa ggtgatcata gaatga 1356<210> 65<211> 221<212> PRT<213> 人工序列<220><223> FP3E的胺基酸序列<400> 65Met Met Val Lys Ile Ala Ala Ser Ile Leu Ala Cys Asp Leu Ala Arg 1 5 10 15 Leu Ala Asp Glu Val Lys Arg Val Glu Glu His Ile Asp Met Val His 20 25 30 Phe Asp Val Met Asp Gly His Phe Val Pro Asn Ile Ser Phe Gly Leu 35 40 45 Pro Val Leu Lys Ala Leu Arg Lys Glu Thr Ser Leu Pro Ile Ser Val 50 55 60 His Leu Met Ile Thr Asn Pro Glu Asp Tyr Val Asp Arg Phe Val Glu 65 70 75 80 Glu Gly Ala Asp Met Val Ala Val His Tyr Glu Thr Thr Pro His Leu 85 90 95 His Arg Ile Val His Arg Ile Lys Asp Leu Gly Ala Lys Ala Phe Val 100 105 110 Ala Leu Asn Pro His Thr Pro Val Phe Leu Leu Ser Glu Ile Ile Thr 115 120 125 Asp Val Asp Gly Val Leu Val Met Ser Val Asn Pro Gly Phe Ser Gly 130 135 140 Gln Arg Phe Ile Ala Arg Ser Leu Glu Lys Ile Arg Ser Leu Lys Lys145 150 155 160 Met Ile Arg Asp Leu Gly Leu Glu Thr Glu Ile Met Val Asp Gly Gly 165 170 175 Val Asn Glu Glu Asn Ala Ser Ile Leu Ile Lys Asn Gly Ala Thr Ile 180 185 190 Leu Val Met Gly Tyr Gly Ile Phe Lys Asn Glu Asn Tyr Val Glu Leu 195 200 205 Val Arg Ser Ile Lys Gln Glu Arg Gly Glu Ser Ala Gly 210 215 220 <210> 66<211> 666<212> DNA<213> 人工序列<220><223> FP3E的核苷酸序列<400> 66atgatggtaa agatcgccgc ttcaatcctt gcgtgtgatc ttgcaagact cgccgatgag 60gtaaaaaggg tggaagaaca catagacatg gttcacttcg atgtcatgga tggacacttc 120gttccgaaca tctcgttcgg attgcccgtt ctcaaagccc tgagaaaaga aaccagcctt 180cctataagtg ttcatctgat gatcacaaat ccagaggact atgtggaccg tttcgtggaa 240gagggagcgg acatggtggc ggtccactac gagacaacgc cgcaccttca caggatagtg 300cacaggataa aggatctcgg ggcgaaggcg ttcgtcgccc tcaacccaca cacaccggtt 360tttctcctgt ctgagatcat aacggatgtg gatggcgtac tcgtgatgag tgtgaacccg 420ggcttttctg gtcagagatt cattgcaagg agtctggaaa aaataaggag tctgaagaag 480atgataaggg atctgggact cgaaacggag atcatggtcg atggtggtgt caacgaagaa 540aacgcttcta tcttaataaa gaacggtgcg acgatccttg taatggggta cggtatcttc 600aaaaacgaaa actatgtgga actggtgaga tccatcaagc aggaaagagg ggaatctgct 660ggctga 666<210> 67<211> 441<212> PRT<213> 人工序列<220><223> TN2的胺基酸序列<400> 67Met Ile Gly Tyr Gln Ile Tyr Val Arg Ser Phe Arg Asp Gly Asn Phe 1 5 10 15 Asp Gly Val Gly Asp Phe Lys Gly Leu Lys Gly Ala Ile Ser Tyr Leu 20 25 30 Lys Glu Leu Gly Val Asp Phe Val Trp Leu Met Pro Val Phe Ser Ser 35 40 45 Ile Ser Phe His Gly Tyr Asp Val Val Asp Phe Tyr Ser Phe Lys Ala 50 55 60 Glu Tyr Gly Asp Glu Lys Asp Phe Arg Glu Met Ile Glu Ala Phe His 65 70 75 80 Asp Asn Gly Ile Lys Val Val Leu Asp Leu Pro Ile His His Thr Gly 85 90 95 Phe Leu His Val Trp Phe Gln Lys Ala Leu Lys Gly Asp Pro His Tyr 100 105 110 Arg Asp Tyr Tyr Val Trp Ala Ser Glu Lys Thr Asp Leu Asp Glu Arg 115 120 125 Arg Glu Trp Asp Asn Glu Arg Ile Trp His Pro Leu Glu Asp Gly Arg 130 135 140 Phe Tyr Arg Gly Leu Phe Gly Pro Leu Ser Pro Asp Leu Asn Tyr Asp145 150 155 160 Asn Pro Gln Val Phe Glu Glu Met Lys Lys Val Val Tyr His Leu Leu 165 170 175 Glu Met Gly Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Ala Ala Lys His Met Arg 180 185 190 Asp Thr Leu Glu Gln Asn Val Arg Phe Trp Arg Tyr Phe Leu Ser Asp 195 200 205 Ile Glu Gly Ile Phe Leu Ala Glu Ile Trp Ala Glu Ser Lys Val Val 210 215 220 Asp Glu His Gly Arg Ile Phe Gly Tyr Met Leu Asn Phe Asp Thr Ser225 230 235 240 His Cys Ile Lys Glu Ala Val Trp Lys Glu Asn Phe Lys Val Leu Ile 245 250 255 Glu Ser Ile Glu Arg Ala Leu Val Gly Lys Asp Tyr Leu Pro Val Asn 260 265 270 Phe Thr Ser Asn His Asp Met Ser Arg Leu Ala Ser Phe Glu Gly Gly 275 280 285 Leu Ser Glu Glu Lys Val Lys Leu Ser Leu Ser Ile Leu Phe Thr Leu 290 295 300 Pro Gly Val Pro Leu Ile Phe Tyr Gly Asp Glu Leu Gly Met Lys Gly305 310 315 320 Ile Tyr Arg Lys Pro Asn Thr Glu Val Val Leu Asp Pro Phe Pro Trp 325 330 335 Ser Glu Asn Met Cys Val Glu Gly Gln Thr Phe Trp Lys Trp Pro Ala 340 345 350 Tyr Asn Asp Pro Phe Ser Gly Val Ser Val Glu Tyr Gln Arg Arg Asn 355 360 365 Arg Asp Ser Ile Leu Ser His Thr Met Arg Trp Ala Gly Phe Arg Gly 370 375 380 Glu Asn His Trp Leu Asp Arg Ala Asn Ile Glu Phe Leu Cys Lys Glu385 390 395 400 Glu Lys Leu Leu Val Tyr Arg Leu Val Asp Glu Gly Arg Ser Leu Lys 405 410 415 Val Ile His Asn Leu Ser Asn Gly Glu Met Val Phe Glu Gly Val Arg 420 425 430 Val Gln Pro Tyr Ser Thr Glu Val Val 435 440 <210> 68<211> 1326<212> DNA<213> 人工序列<220><223> TN2的核苷酸序列<400> 68atgataggct accagatcta cgtgagatca ttcagggatg gaaacttcga tggtgtgggg 60gatttcaaag gattgaaagg tgcgatttcc tacctgaaag aactgggtgt tgattttgtc 120tggctcatgc ccgtcttttc ctccatttcc ttccacgggt atgacgtggt ggatttttat 180tctttcaaag ccgagtacgg agacgagaaa gactttagag agatgatcga ggcgttccac 240gacaacggta taaaagtcgt tctcgatctt cccatccatc atactggttt cctccatgtg 300tggtttcaga aagccctgaa aggagatcca cactacaggg attattacgt atgggcgagt 360gaaaaaacgg atctggacga aagaagagag tgggacaacg aaaggatctg gcatcctctg 420gaggacggaa ggttctacag aggacttttc ggtcccctct cacccgatct gaactacgat 480aacccgcagg tttttgaaga gatgaagaag gtggtttatc accttcttga aatgggagtg 540gacggattca gattcgacgc agcaaagcac atgagagata ctctggaaca gaacgttcgc 600ttttggaggt atttcctctc cgatattgag ggaatattcc ttgcggaaat ctgggcagaa 660tccaaagttg tggatgaaca cggcaggata ttcggctaca tgctaaattt cgatacctca 720cactgtatta aggaagcggt gtggaaggaa aacttcaaag tgttgatcga gtcgatcgaa 780agggccctgg ttggaaaaga ttatctgccg gtgaacttca catcgaacca tgatatgtca 840aggcttgcga gtttcgaagg agggttgagt gaagagaagg tgaaactctc actttccatt 900ctgttcacgc ttcccggggt tcctctcata ttctacggag acgaactggg aatgaaagga 960atctatcgaa aaccgaacac ggaagtcgtg ctggatccgt tcccctggag cgaaaacatg 1020tgtgttgaag gccagacatt ttggaaatgg cccgcgtata acgatccatt ctccggtgtt 1080tctgttgagt atcagaggag aaatcgtgat tcgattctct cacacacgat gaggtgggca 1140ggattcagag gggaaaatca ctggctggac agggcaaaca tcgaatttct gtgcaaagaa 1200gaaaaactgc tcgtgtacag actggtcgat gaagggcgtt ctctgaaagt gatacacaac 1260ctgtcgaatg gtgaaatggt gtttgaggga gtgcgcgtac aaccctacag cacggaggtg 1320gtttga 1326<210> 69<211> 34<212> DNA<213> 人工序列<220><223> ct1的正向引子DNA序列<400> 69aggagaaact catatgctga agaaactccc ggag 34<210> 70<211> 21<212> DNA<213> 人工序列<220><223> ct1的反向引子DNA序列<400> 70agccccctcg agcccgagaa c 21<210> 71<211> 26<212> DNA<213> 人工序列<220><223> ct2的正向引子DNA序列<400> 71aaagggcata tgatcctgtt tggaac 26<210> 72<211> 27<212> DNA<213> 人工序列<220><223> ct2的反向引子DNA序列<400> 72ataccagtct cgagcagttt caggatc 27<210> 73<211> 34<212> DNA<213> 人工序列<220><223> tn1的正向引子DNA序列<400> 73ttactgaggg catatgaaaa agatggcttt gaaa 34<210> 74<211> 30<212> DNA<213> 人工序列<220><223> tn1反向引子DNA序列<400> 74aagacgcgtc gacttctatg atcaccttct 30<210> 75<211> 34<212> DNA<213> 人工序列<220><223> fp3e的正向引子DNA序列<400> 75ggaacatatg atggtaaaga tcgccgcttc aatc 34<210> 76<211> 27<212> DNA<213> 人工序列<220><223> fp3e的反向引子DNA序列<400> 76catactcgag cttcccctct cctatct 27<210> 77<211> 270<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 衍生自熱泉奇異球菌的多磷酸鹽相依性葡萄糖激酶<400> 77Met Leu Ala Ala Ser Asp Ser Ser Gln His Gly Gly Lys Ala Val Thr 1 5 10 15 Leu Ser Pro Met Ser Val Ile Leu Gly Ile Asp Ile Gly Gly Ser Gly 20 25 30 Ile Lys Gly Ala Pro Val Asp Thr Ala Thr Gly Lys Leu Val Ala Glu 35 40 45 Arg His Arg Ile Pro Thr Pro Glu Gly Ala His Pro Asp Ala Val Lys 50 55 60 Asp Val Val Val Glu Leu Val Arg His Phe Gly His Ala Gly Pro Val 65 70 75 80 Gly Ile Thr Phe Pro Gly Ile Val Gln His Gly His Thr Leu Ser Ala 85 90 95 Ala Asn Val Asp Lys Ala Trp Ile Gly Leu Asp Ala Asp Thr Leu Phe 100 105 110 Thr Glu Ala Thr Gly Arg Asp Val Thr Val Ile Asn Asp Ala Asp Ala 115 120 125 Ala Gly Leu Ala Glu Ala Arg Phe Gly Ala Gly Ala Gly Val Pro Gly 130 135 140 Glu Val Leu Leu Leu Thr Phe Gly Thr Gly Ile Gly Ser Ala Leu Ile145 150 155 160 Tyr Asn Gly Val Leu Val Pro Asn Thr Glu Phe Gly His Leu Tyr Leu 165 170 175 Lys Gly Asp Lys His Ala Glu Thr Trp Ala Ser Asp Arg Ala Arg Glu 180 185 190 Gln Gly Asp Leu Asn Trp Lys Gln Trp Ala Lys Arg Val Ser Arg Tyr 195 200 205 Leu Gln Tyr Leu Glu Gly Leu Phe Ser Pro Asp Leu Phe Ile Ile Gly 210 215 220 Gly Gly Val Ser Lys Lys Ala Asp Lys Trp Gln Pro His Val Ala Thr225 230 235 240 Thr Arg Thr Arg Leu Val Pro Ala Ala Leu Gln Asn Glu Ala Gly Ile 245 250 255 Val Gly Ala Ala Met Val Ala Ala Gln Arg Ser Gln Gly Asp 260 265 270<210> 78<211> 253<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 衍生自四膜蟲厭氧繩菌的多磷酸鹽相依性葡萄糖激酶<400> 78Met Gly Arg Gln Gly Met Glu Ile Leu Gly Ile Asp Ile Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Ile Lys Gly Ala Pro Val Asp Val Glu Thr Gly Gln Leu Thr Ala 20 25 30 Glu Arg Tyr Arg Leu Pro Thr Pro Glu Asn Ala Leu Pro Glu Glu Val 35 40 45 Ala Leu Val Val Ala Gln Ile Val Glu His Phe Gln Trp Lys Gly Arg 50 55 60 Val Gly Ala Gly Phe Pro Ala Ala Ile Lys His Gly Val Ala Gln Thr 65 70 75 80 Ala Ala Asn Ile His Pro Thr Trp Ile Gly Leu His Ala Gly Asn Leu 85 90 95 Phe Ser Glu Lys Cys Gly Cys Pro Val Ser Val Leu Asn Asp Ala Asp 100 105 110 Ala Ala Gly Leu Ala Glu Met Ile Phe Gly Ala Gly Lys Gly Gln Lys 115 120 125 Gly Val Val Leu Met Ile Thr Ile Gly Thr Gly Ile Gly Thr Ala Leu 130 135 140 Phe Thr Asp Gly Ile Leu Val Pro Asn Thr Glu Leu Gly His Ile Glu145 150 155 160 Ile Arg Gly Lys Asp Ala Glu Gln Arg Ser Ser Glu Ala Ala Arg Gln 165 170 175 Arg Lys Asp Trp Thr Trp Gln Gln Trp Ala Lys Arg Leu Asn Glu His 180 185 190 Leu Glu Arg Leu Glu Ala Leu Phe Trp Pro Asp Leu Phe Ile Leu Gly 195 200 205 Gly Gly Ala Val Lys Asn His Glu Lys Phe Phe Pro Tyr Leu Lys Leu 210 215 220 Arg Thr Pro Phe Val Ala Ala Lys Leu Gly Asn Leu Ala Gly Ile Val225 230 235 240 Gly Ala Ala Trp Tyr Ala His Thr Gln Glu Thr Gln Ala 245 250

Claims (18)

  1. 一種阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶，包括： 由Xa1 -Xa2 -Xa3 -DPLDG-Xa4 表示的模體A，其中Xa1 為W、F、V、I或A，Xa2 為I、F、V、A或間隙，Xa3 為V、I或L，且Xa4 為T或S；以及 由Ya1 -D-Ya2 -Wa1 -Ya3 -Wa2 -Ya4 -Wa3 表示的模體B，其中Ya1 為W、Y、T、L或V，Ya2 為V、I、C、F或A，Wa1 為AAG、AAS、SAG、APG、APF、AGG、APL或AGA，Ya3 為W、I、P、M、V、Y、F、R、L、T或S，Wa2 為LLV、LIV、LLI、LII、ILI、FIA、ALV、IIA、VLV、VIL、TIG、NFC或PIF，Ya4 為E、R、S、T、L、K或P，且Wa3 為EAGG、EGGG、EAKG、KAGG、AAGG、YVDG、EAGA或RLGV。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶，其中在所述模體A中，Xa1 為W或F，Xa2 為I或V，Xa3 為V或I，且Xa4 為T；且在所述模體B中，Ya1 為W，Ya2 為V或I，Wa1 為AAG，Ya3 為W、I或V，Wa2 為LLV、LIV、LII或LLI，Ya4 為E、R或S，且Wa3 為EAGG或EGGG。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶，其中所述阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶包括以SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19及20陳述的胺基酸序列中的任一者，或在以SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19及20陳述的序列中與除所述模體A及所述模體B以外的胺基酸序列具有至少85%的同一性的序列。
  4. 如申請專利範圍第3項所述的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶，其中所述阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶是由以SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20陳述的胺基酸序列組成，分別是藉由以SEQ ID NO：21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40陳述的核苷酸序列來編碼。
  5. 一種核酸，對如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶進行編碼。
  6. 一種用於生產D-阿洛酮糖的組成物，包括肌醇-單-磷酸酶、表達所述肌醇-單-磷酸酶的微生物或表達所述肌醇-單-磷酸酶的微生物的培養物。
  7. 如申請專利範圍第6項所述的用於生產D-阿洛酮糖的組成物，其中所述肌醇-單-磷酸酶是如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶。
  8. 如申請專利範圍第7項所述的用於生產D-阿洛酮糖的組成物，更包括： （a）（i）澱粉、麥芽糖糊精、蔗糖或其組合、（ii）磷酸鹽、（iii）D-果糖-6-磷酸-3-差向異構酶、（iv）D-葡萄糖-6-磷酸-異構酶、（v）磷酸葡萄醣變位酶或葡萄糖激酶及（vi）α-葡聚糖磷酸化酶、澱粉磷酸化酶、麥芽糖糊精磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、α-澱粉酶、普魯蘭酶、異澱粉酶、葡萄糖澱粉酶或蔗糖酶；或 （b）表達（a）中的酶的微生物或表達（a）中的酶的微生物的培養物。
  9. 一種用於生產D-阿洛酮糖的方法，包括：使如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶或肌醇-單-磷酸酶、表達所述肌醇-單-磷酸酶的微生物或表達所述肌醇-單-磷酸酶的微生物的培養物接觸D-阿洛酮糖-6-磷酸，以將所述D-阿洛酮糖-6-磷酸轉化成D-阿洛酮糖。
  10. 如申請專利範圍第9項所述的用於生產D-阿洛酮糖的方法，其中所述肌醇-單-磷酸酶是如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶。
  11. 如申請專利範圍第9項所述的用於生產D-阿洛酮糖的方法，更包括：在所述將D-阿洛酮糖-6-磷酸轉化成所述D-阿洛酮糖之前，使D-果糖-6-磷酸-3-差向異構酶、表達所述D-果糖-6-磷酸-3-差向異構酶的微生物或表達所述D-果糖-6-磷酸-3-差向異構酶的微生物的培養物接觸D-果糖-6-磷酸，以將所述D-果糖-6-磷酸轉化成所述D-阿洛酮糖-6-磷酸。
  12. 如申請專利範圍第10項所述的用於生產D-阿洛酮糖的方法，更包括：在將D-果糖-6-磷酸轉化成所述D-阿洛酮糖-6-磷酸之前，使D-葡萄糖-6-磷酸-異構酶、表達所述D-葡萄糖-6-磷酸-異構酶的微生物或表達所述D-葡萄糖-6-磷酸-異構酶的微生物的培養物接觸D-葡萄糖-6-磷酸，以將所述D-葡萄糖-6-磷酸轉化成所述D-果糖-6-磷酸。
  13. 如申請專利範圍第12項所述的用於生產D-阿洛酮糖的方法，更包括：在將所述D-葡萄糖-6-磷酸轉化成所述D-果糖-6-磷酸之前，使磷酸葡萄糖變位酶、表達所述磷酸葡萄糖變位酶的微生物或表達所述磷酸葡萄糖變位酶的微生物的培養物接觸D-葡萄糖-1-磷酸，以將所述D-葡萄糖-1-磷酸轉化成所述D-葡萄糖-6-磷酸。
  14. 如申請專利範圍第13項所述的用於生產D-阿洛酮糖的方法，更包括在將所述D-葡萄糖-6-磷酸轉化成所述D-果糖-6-磷酸之前，使葡萄糖激酶、表達所述葡萄糖激酶的微生物或表達所述葡萄糖激酶的微生物的培養物及磷酸鹽接觸葡萄糖，以將所述葡萄糖轉化成所述D-葡萄糖-6-磷酸。
  15. 如申請專利範圍第14項所述的用於生產D-阿洛酮糖的方法，更包括：在所述將所述D-葡萄糖-1-磷酸轉化成所述D-葡萄糖-6-磷酸之前，使α-葡聚糖磷酸化酶、澱粉磷酸化酶、麥芽糖糊精磷酸化酶或蔗糖磷酸化酶、表達磷酸化酶的微生物或表達所述磷酸化酶的微生物的培養物及磷酸鹽接觸澱粉、麥芽糖糊精、蔗糖或其組合，以將所述澱粉、所述麥芽糖糊精、所述蔗糖或其組合轉化成所述D-葡萄糖-1-磷酸。
  16. 如申請專利範圍第14項所述的用於生產D-阿洛酮糖的方法，更包括在所述將所述葡萄糖轉化成所述D-葡萄糖-6-磷酸之前，使α-澱粉酶、普魯蘭酶、葡萄糖澱粉酶、蔗糖酶或異澱粉酶、表達所述α-澱粉酶、所述普魯蘭酶、所述葡萄糖澱粉酶、所述蔗糖酶或所述異澱粉酶的微生物或表達所述α-澱粉酶、所述普魯蘭酶、所述葡萄糖澱粉酶、所述蔗糖酶或所述異澱粉酶的微生物的培養物接觸澱粉、麥芽糖糊精、蔗糖或其組合，以將所述澱粉、所述麥芽糖糊精、所述蔗糖或其組合轉化成所述葡萄糖。
  17. 一種用於生產D-阿洛酮糖的方法，包括使以下物質接觸澱粉、麥芽糖糊精、蔗糖或其組合及磷酸鹽： （a）如申請專利範圍第1項所述的阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶、D-果糖-6-磷酸-3-差向異構酶、D-葡萄糖-6-磷酸-異構酶、磷酸葡萄醣變位酶或葡萄糖激酶以及α-葡聚糖磷酸化酶、澱粉磷酸化酶、麥芽糖糊精磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、α-澱粉酶、普魯蘭酶、異澱粉酶、葡萄糖澱粉酶或蔗糖酶；或 （b）表達（a）中的酶的微生物或表達（a）中的酶的微生物的培養物。
  18. 如申請專利範圍第9項以及第11項至第17項中任一項所述的用於生產D-阿洛酮糖的方法，其中接觸反應是在5.0至9.0的pH下、在40℃至80℃的溫度下進行及/或進行2小時至24小時。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115380109A (zh) * 2020-05-11 2022-11-22 康纳根有限公司 用于将d-果糖生物转化为d-阿洛酮糖的d-阿洛酮糖3-差向异构酶

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102233375B1 (ko) * 2018-12-11 2021-03-31 씨제이제일제당 주식회사 신규 싸이코스-6-인산의 탈인산화 효소, 이를 포함하는 싸이코스 생산용 조성물, 및 이를 이용한 싸이코스 제조방법
KR102138862B1 (ko) * 2019-03-08 2020-07-30 씨제이제일제당 주식회사 알룰로스를 생산하는 스태필로코커스 속 미생물 및 이를 이용한 알룰로스 제조방법
KR102193207B1 (ko) * 2019-05-21 2020-12-21 씨제이제일제당 주식회사 특정 모티프를 포함하는 신규 내열성 리불로스-인산 3-에피머화 효소
KR102080886B1 (ko) * 2019-05-21 2020-02-24 씨제이제일제당 주식회사 부반응성이 낮은 리불로스-인산 3-에피머화 효소의 모티프 및 이를 포함하는 효소
CN114790469B (zh) * 2021-01-26 2024-03-26 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种酶促合成阿洛酮糖的方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3333969B2 (ja) * 1992-10-08 2002-10-15 株式会社林原生物化学研究所 Ｄ−ケトヘキソース・３−エピメラーゼとその製造方法並びに用途
FR2878850B1 (fr) * 2004-12-02 2008-10-31 Cis Bio Internat Sa Derives de l'inositol-1-phosphate
KR20110035805A (ko) * 2009-09-30 2011-04-06 씨제이제일제당 (주) 사이코스-에피머화 효소의 고정화 및 이를 이용한 사이코스의 제조방법
EP2811029B1 (en) * 2012-02-02 2018-03-21 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Method for producing scyllo-inositol
KR101539096B1 (ko) * 2012-08-10 2015-07-24 주식회사 삼양제넥스 사이코스 에피머화 효소 및 이를 이용한 사이코스로 전환용 조성물
KR101455624B1 (ko) * 2013-04-12 2014-10-28 주식회사한국야쿠르트 기능성 희귀당 사이코스의 생산능을 지닌 신규 클로스트리디움 볼티에 유래의 사이코스-3-에피머화 효소 및 이를 이용한 사이코스 생산방법
KR20140140215A (ko) * 2013-05-28 2014-12-09 경상대학교산학협력단 사이코스 3-에피머라제 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코리네박테리움 및 이를 이용한 사이코스의 생산 방법
US20150110940A1 (en) * 2013-10-22 2015-04-23 Pepsico, Inc. D-Psicose In Zero Or Low Calorie Frozen Beverages
KR101539097B1 (ko) * 2013-12-26 2015-07-23 주식회사 삼양제넥스 사이코스 에피머화 효소를 암호화 하는 폴리뉴클레오타이드, 및 이를 이용하는 사이코스 생산방법
KR101473918B1 (ko) * 2014-05-28 2014-12-17 대상 주식회사 사이코스 에피머화 효소, 이의 제조방법 및 이를 이용한 사이코스의 제조방법
WO2017002978A1 (ja) * 2015-07-02 2017-01-05 協和発酵バイオ株式会社 希少糖の製造法
PE20191355A1 (es) * 2016-12-14 2019-10-01 Bonumose Llc Produccion enzimatica de d-alulosa

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115380109A (zh) * 2020-05-11 2022-11-22 康纳根有限公司 用于将d-果糖生物转化为d-阿洛酮糖的d-阿洛酮糖3-差向异构酶

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