KR20190013558A - 신규한 싸이코스-6-인산 탈인산효소, 상기 효소를 포함하는 사이코스 생산용 조성물, 상기 효소를 이용하여 사이코스를 제조하는 방법 - Google Patents

신규한 싸이코스-6-인산 탈인산효소, 상기 효소를 포함하는 사이코스 생산용 조성물, 상기 효소를 이용하여 사이코스를 제조하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 출원은 모티프 A 및 모티프 B를 포함하는 싸이코스-6-인산 탈인산효소, 상기 효소를 포함하는 싸이코스 생산용 조성물, 상기 효소를 이용하여 싸이코스를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

신규한 싸이코스-6-인산 탈인산효소, 상기 효소를 포함하는 사이코스 생산용 조성물, 상기 효소를 이용하여 사이코스를 제조하는 방법 {A Novel Psicose-6-phosphate phosphatase, a composition for producing psicose containing the phosphatase and a method for producing psicose using the phosphatase}
본 출원은 신규한 싸이코스-6-인산 탈인산효소, 상기 효소를 포함하는 싸이코스 생산용 조성물, 상기 효소를 이용하여 싸이코스를 제조하는 방법에 관한 것이다.
싸이코스-3-에피머화효소(D-psicose-3-epimerase, EC 5.1.3.30) 및 타가토스-3-에피머화효소(D-tagatose-3-epimerase, EC 5.1.3.31)는 과당(D-fructose)을 3-에피머화(3-epimerization, 3번 탄소 에피머화)하여 싸이코스(D-psicose)를 생산할 수 있는 효소로 알려져 있다. 상기 효소를 이용하는 단일 효소반응으로 싸이코스를 생산하는 경우, 기질인 과당과 산물인 싸이코스 간에 일정 수준의 반응평형(reaction equilibrium)이 존재한다(산물/기질 = 약 20% 내지 35%). 따라서, 고순도의 싸이코스를 제조하기 위해서는 효소 반응 결과물로부터 비교적 고농도의 과당을 분리하여 제거해야 하는 추가 정제공정이 요구되는 문제점이 있다.
한편, Chan 등(2008. Biochemistry. 47:9608-9617)은 과당-6-인산(D-fructose-6-phosphate) 및 싸이코스-6-인산(D-psicose-6-phosphate)에 대해서 3-에피머화 반응을 수행할 수 있는 스트렙토코커스 파이로제네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 리불로스-5-인산-3-에피머화효소(D-ribulose-5-phosphate-3-epimerase, EC 5.1.3.1) 및 E. coli 유래의 싸이코스-6-인산-3-에피머화효소(D-psicose 6-phosphate-3-epimerase, EC 5.1.3.-)를 보고한 바 있으나, 상기 효소들은 내열성을 갖지 못하여 산업적으로 이용이 불가능한 문제점이 있다..
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 경제적이면서 산업적으로 사이코스로의 전환율을 높일 수 있는 방법을 개발하기 위해 예의 노력하였다. 그 결과, 경제적 원료인 수크로스 또는 전분(예컨대, 말토덱스트린)을 싸이코스-6-인산으로 전환시킨 후, 상기 싸이코스-6-인산에 특이적이면서 비가역 반응경로를 수행하는 본 출원의 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소(psicose-6-phosphate phosphatase)를 이용하여 싸이코스를 생산하는 경우, 싸이코스 생산 경로에 관여하는 복수의 효소를 동시에 사용 가능한 동시효소반응(one-pot enzymatic conversions)이 가능하고, 싸이코스 전환율을 현저히 높일 수 있음을 확인함으로써 본 출원을 완성하였다.
없음
2008. Biochemistry. 47:9608-9617
본 출원의 일 목적은 모티프 A 및 모티프 B를 포함하는 신규한 싸이코스-6-인산 탈인산효소를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 일 목적은 본원에 기술된 싸이코스-6-인산 탈인산효소를 암호화하는 핵산과, 상기 핵산을 포함하는 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 일 목적은 이노시톨-모노-포스파타아제, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 싸이코스 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 일 목적은 싸이코스-6-인산에 이노시톨-모노-포스파타아제, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜 상기 싸이코스-6-인산을 싸이코스로 전환하는 단계를 포함하는 싸이코스 제조방법을 제공하는 것이다.
이하, 본 출원 내용에 대하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시한 일 양태의 설명 및 실시형태는 공통된 사항에 대하여 다른 양태의 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 또한, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 더불어, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
출원의 목적을 달성하기 위하여, 본 출원은 하나의 양태로서,
Xa1-Xa2-Xa3-DPLDG-Xa4의 모티프 A; 및
Ya1-D-Ya2-Wa1-Ya3-Wa2-Ya4-Wa3의 모티프 B를 포함하는 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소를 제공하며,
상기 모티프 A에서, Xa1는 W, F, V, I, 또는 A이고, Xa2는 I, F, V, A, 또는 없음이고, Xa3는 V, I, 또는 L이고, Xa4 는 T 또는 S이고,
상기 모티프 B에서, Ya1는 W, Y, T, L, 또는 V이고, Ya2는 V, I, C, F, 또는 A이고, Wa1은 AAG, AAS, SAG, APG, APF, AGG, APL, 또는 AGA이고, Ya3은 W, I, P, M, V, Y, F, R, L, T, 또는 S이고, Wa2는 LLV, LIV, LLI, LII, ILI, FIA, ALV, IIA, VLV, VIL, TIG, NFC 또는 PIF이고, Ya4는 E, R, S, T, L, K, 또는 P이고, Wa3은 EAGG, EGGG, EAKG, KAGG, AAGG, YVDG, EAGA, 또는 RLGV이다.
구체적으로 상기 모티프 A에서, Xa1는 W 또는 F이고, Xa2는 I 또는 V이고, Xa3는 V, 또는 I이고, Xa4 는 T이고, 상기 모티프 B에서, Ya1는 W이고, Ya2는 V, 또는 I이고, Wa1은 AAG 이고, Ya3은 W, I, 또는 V이고, Wa2는 LLV, LIV, LII 또는 LLI 이고, Ya4는 E, R, 또는 S이고, Wa3은 EAGG, 또는 EGGG일 수 있다.
상기 모티프 A와 상기 모티프 B 사이, 상기 모티프 A의 말단, 또는 상기 모티프 B의 말단에는 1개 이상의 아미노산이 포함될 수 있으며, 모티프 A와 모티프 B 이외의 아미노산 서열은 공지된 이노시톨-모노-포스파타아제의 서열(예컨데, 서열번호 1 내지 20의 서열 중 모티프 A와 모티프 B를 제외한 서열)로부터 정의될 수 있다.
상기 모티프 A 및/또는 모티프 B는 이노시톨-모노-포스파타아제의 서열 중 활성 부위로, 상기 효소의 기질인 이노시톨 포스페이트의 결합 부위로 알려져 있다(참조문헌: Federation of European Biochemical Societies, Volume 294, number 1,2, 16-18, December 1991). 본 출원에서는 이노시톨-모노-포스파타아제가 싸이코스-6-인산 탈인산효소로서의 활성을 나타냄을 밝혀내었으며, 이노시톨-모노-포스파타아제의 모티프 A 및/또는 모티프 B는 또한 상기 탈인산효소의 기질 결합 부위일 수 있음을 밝혀내었다.
싸이코스-6-인산 탈인산효소는 구체예에서 서열번호 1 내지 20 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 싸이코스-6-인산 탈인산효소(psicose-6-phosphate phosphatase)일 수 있다.
본 출원의 싸이코스-6-인산 탈인산효소는 종래 이노시톨-모노포스파테이즈 효소로 기능이 공지된 효소일 수 있다.
본 출원의 싸이코스-6-인산 탈인산효소는 싸이코스-6-인산에 보다 선택적으로 탈인산화 반응을 하며, 포도당-1-인산(D-glucose-1-phosphate), 포도당-6-인산(D-glucose-6-phosphate) 또는 과당-6-인산(D-fructose-6-phosphate)에는 비특이적일 수 있다.
본 출원의 싸이코스-6-인산 탈인산효소는 상기 효소 자체 또는 이를 발현하는 DNA(예컨대, 본 출원의 서열번호 21 내지 40)를 균주에 형질전환시키고, 이를 배양하여 배양물을 수득하고, 상기 배양물을 파쇄하여, 컬럼 등을 통해 정제한 것일 수 있다. 상기 형질전환용 균주로는 대장균(Escherichia coli), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterum glutamicum), 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae), 또는 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 등이 있다.
본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 싸이코스-6-인산 탈인산효소는 모티프 A 및/또는 모티프 B의 서열과 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상 또는 100%의 상동성, 유사성 또는 동일성을 가지며 싸이코스-6-인산 탈인산효소 활성을 나타내는 효소를 포함할 수 있다. 추가로 모티프 A 및 모티프 B를 제외한 서열과는 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는 효소일 수 있다. 구체예에서 서열번호 1 내지 20 중 모티프 A 및/또는 모티프 B의 서열과 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상 또는 100%의 상동성, 유사성, 또는 동일성을 가지면서, 모티프 A 및/또는 모티프 B 이외의 부분과는 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상 또는 100%, 또는 상기 수치 중 임의의 2개의 수치에 의해 정해지는 범위 내의 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는 서열로 이루어진 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 상동성, 유사성 또는 동일성을 가지며 상기 싸이코스-6-인산 탈인산효소 단백질, 예컨데 상기 서열번호 1 내지 20중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지더라도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
또한, 본 출원의 모티프 A 및 모티프 B를 포함하는 싸이코스-6-인산 탈인산효소와 상응하는 활성을 가지는 단백질이라면, 상기 모티프 A 및 상기 모티프 B의 서열 중 서열 앞뒤의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 특히 서열번호 1 내지 20의 어느 하나의 아미노산 서열 앞뒤의 무의미한 서열 추가 또는 자연 발생 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이를 제외하는 것은 아니고, 모티프 A 및 모티프 B를 포함하는 단백질 또는 서열번호 1 내지 20의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또한 본 출원의 범위 내에 속한다.
본 출원은 다른 하나의 양태로서, 본 출원의 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소를 암호화하는 핵산을 제공한다.
본 출원에서 용어, "핵산"은 DNA 또는 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 천연 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체도 포함할 수 있다(참조문헌: Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
구체적으로, 본 출원의 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소를 암호화하는 핵산은 모티프 A 및 모티프 B로 번역될 수 있는 각각의 뉴클레오티드를 포함하는 서열을 포함할 수 있고, 구체예에서 서열번호 21 내지 40 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 본 출원의 모티프 A 및 모티프 B로 번역될 수 있는 각각의 뉴클레오티드와 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상 또는 100%의 상동성, 유사성 또는 동일성을 가지면서, 번역되어 목적하는 효소 활성을 나타낼 수 있는 핵산을 포함할 수 있다. 구체적으로 서열번호 21 내지 40 중 모티프 A 및 모티프 B로 번역될 수 있는 각각의 뉴클레오티드와 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상 또는 100%의 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는 핵산을 포함할 수 있고, 이에 추가하여 서열번호 21 내지 40 중 모티프 A 및 모티프 B 이외의 부분으로 번역될 수 있는 뉴클레오티드와 적어도 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99%의 상동성, 유사성 또는 동일성을 가지는 핵산일 수 있다. 코돈 축퇴성(codon degeneracy)에 의해 상기 모티프 A 및 모티프 B를 포함하는 단백질, 구체적으로 서열번호 1 내지 20 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 이와 상동성, 유사성, 또는 동일성을 가지는 단백질로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 본 출원의 범위에 포함될 수 있음은 자명하다.
본 출원의 모티프 A 및 모티프 B를 포함하는 효소는 내열성을 갖거나 호열성인 균주로부터 유래된 효소일 수 있다. 구체적으로 서열번호 1 내지 20 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 효소는 각각 로도써머스 마리너스(Rhodothermus marinus), 써모토가 레팅게(Thermotoga lettingae), 메이오써머스 루버(Meiothermus ruber), 딕토글로머스 터기덤(Dictyoglomus turgidum), 파이로바쿨럼 페리듄센스(Pyrobaculum ferrireducens), 써모어네로박터 위제리(Thermoanaerobacter wiegelii), 써머스 써모필러스(Thermus thermophilus), 써모코커스 리토랄리스(Thermococcus litoralis), 지오바실러스 스테레아써모필러스(Geobacillus stearothermophilus), 어네오리아 써모필리아(Anaerolinea thermophila), 썰폴로보스 에씨도칼다리어스(Sulfolobus acidocaldarius), 써모썰피디박터 타카이(Thermosulfidibacter takaii), 파이로코커스 퓨리어스(Pyrococcus furiosus), 아키오글로버스 퓰지더스(Archaeoglobus fulgidus), 알리시슬로바실러스 에씨도칼다리어스(Alicyclobacillus acidocaldarius), 메이오써머스 실바너스(Meiothermus silvanus), 메이오써머스 루퍼스(Meiothermus rufus), 메이오써머스 타이완네시스(Meiothermus taiwanensis), 메이오써머스 치리아로필러스(Meiothermus chliarophilus), 또는 메이오써머스 쎄베레우스(Meiothermus cerbereus) 유래 효소일 수 있다.
본 출원에서 용어, "상동성" 또는 "동일성"은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다.
용어 "유사성" 및 "동일성"은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된 (conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 따라 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다. (GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol.48 : 443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 일진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 것으로서, 용어 "상동성" 또는 "동일성"은 서열들간의 관련성(relevance)를 나타낸다.
본 출원은 또 다른 양태로서, 본원에 기재된 싸이코스-6-인산 탈인산효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 본 출원의 싸이코스-6-인산 탈인산효소를 암호화하는 핵산 또는 본 출원의 싸이코스-6-인산 탈인산효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.
본 출원에서 용어 "벡터"는 유기체, 예컨대 숙주세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. 여기서, "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 용어 "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 유기체, 예컨대, 숙주 세포로 염기를 도입하기 위한 바이러스 및 비바이러스 매개물을 포함한다. 용어 "벡터"는 또한 미니구형 DNA를 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 싸이코스-6-인산 탈인산효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터는 pET21a-CJ_Rma, pET21a-CJ_Tle, pET21a-CJ_Mrub, pET21a-CJ_Dtu, pET21a-CJ_Msi, pET21a-CJ_Mruf, pET21a-CJ_Mta, pET21a-CJ_Mch, pET21a-CJ_Mce, pBT7-C-His-CJ_Pfe, pBT7-C-His-CJ_Twi, pBT7-C-His-CJ_Tth, pBT7-C-His-CJ_Tli, pBT7-C-His-CJ_Gst, pBT7-C-His-CJ_Ath, pBT7-C-His-CJ_Sac, pBT7-C-His-CJ_Tta, pBT7-C-His-CJ_Pfu, pBT7-C-His-CJ_Afu, 또는 pBT7-C-His-CJ_Aac일 수 있다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 암호화하는 핵산 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 핵산이 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 핵산은 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 핵산은 표적 단백질을 암호화하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 핵산은 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 핵산은 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 핵산에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 핵산은 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 암호화하는 핵산의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본원에서 아미노산은 아래와 같은 약어 또는 아미노산 명으로 표시될 수 있다:
아미노산 종류 약어
알라닌(alanine) A
아르기닌(arginine) R
아스파라긴(asparagines) N
아스파르트산(aspartic acid) D
시스테인(cystein) C
글루탐산(glutamic acid) E
글루타민(glutamine) Q
글라이신(glycine) G
히스티딘(histidine) H
이소류신(isoleucine) I
류신(leucine) L
라이신(lycine) K
메티오닌(methionine) M
페닐알라닌(phenylalanine) F
프롤린(proline) P
세린(serine) S
트레오닌(threonine) T
트립토판(tryptophan) W
타이로신(tyrosine) Y
발린(valine) V
본 출원의 벡터를 형질전환 시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 레트로바이러스 감염(retroviral infection), 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 숙주 세포로는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주를 사용하는 것이 좋은데, 예를 들어 코리네속 미생물, 에스케리키아속 미생물 또는 세라티아속 미생물일 수 있고, 구체적으로 대장균(E. coli)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 형질전환체는 E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Rma(E. coli_P1_CJ_Rma, KCCM12057P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Tle(E. coli_P2_CJ_Tle, KCCM12058P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mrub(E. coli_P3_CJ_Mrub, KCCM12059P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Dtu(E. coli_P4_CJ_Dtu, KCCM12060P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Pfe(E. coli_P5_CJ_Pfe, KCCM12061P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Twi(E. coli_P6_CJ_Twi, KCCM12062P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tth(E. coli_P7_CJ_Tth, KCCM12063P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tli(E. coli_P8_CJ_Tli, KCCM12064P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Gst(E. coli_P9_CJ_Gst, KCCM12065P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Ath(E. coli_P10_CJ_Ath, KCCM12066P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Sac(E. coli_P11_CJ_Sac, KCCM12067P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tta(E. coli_P12_CJ_Tta, KCCM12068P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Pfu(E. coli_P13_CJ_Pfu, KCCM12069P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Afu(E. coli_P14_CJ_Afu, KCCM12070P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Aac(E. coli_P15_CJ_Aac, KCCM12071P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Msi(E. coli_P16_CJ_Msi, KCCM12072P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mruf(E. coli_P17_CJ_Mruf, KCCM12073P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mta(E. coli_P18_CJ_Mta, KCCM12074P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mch(E. coli_P19_CJ_Mch, KCCM12075P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mce(E. coli_P20_CJ_Mce, KCCM12076P)일 수 있다.
본 출원은 또 다른 하나의 양태로서, 이노시톨-모노-포스파타아제, 상기 이노시톨-모노-포스파타아제를 발현하는 미생물 또는 상기 이노시톨-모노-포스파타아제를 발현하는 미생물의 배양물을 포함하는 싸이코스 생산용 조성물을 제공한다.
본 출원의 이노시톨-모노-포스파타아제는 Xa1-Xa2-Xa3-DPLDG-Xa4의 모티프 A; 및 Ya1-D-Ya2-Wa1-Ya3-Wa2-Ya4-Wa3의 모티프 B를 포함하는 이노시톨-모노-포스파타아제일 수 있으며, 상기 모티프 A에서, Xa1는 W, F, V, I, 또는 A이고, Xa2는 I, F, V, A, 또는 없음이고, Xa3는 V, I, 또는 L이고, Xa4 는 T 또는 S이고, 상기 모티프 B에서, Ya1는 W, Y, T, L, 또는 V이고, Ya2는 V, I, C, F, 또는 A이고, Wa1은 AAG, AAS, SAG, APG, APF, AGG, APL, 또는 AGA이고, Ya3은 W, I, P, M, V, Y, F, R, L, T, 또는 S이고, Wa2는 LLV, LIV, LLI, LII, ILI, FIA, ALV, IIA, VLV, VIL, TIG, NFC 또는 PIF이고, Ya4는 E, R, S, T, L, K, 또는 P이고, Wa3은 EAGG, EGGG, EAKG, KAGG, AAGG, YVDG, EAGA, 또는 RLGV이다. 즉, 본 출원에서 이노시톨-모노-포스파타아제는 싸이코스-6-인산 탈인산효소와 호환되어 사용될 수 있으며, 따라서 싸이코스-6-인산 탈인산효소에 대한 전술한 설명은 이노시톨-모노-포스파타아제에 적용될 수 있다. 구체예에서 이노시톨-모노-포스파타아제는 서열번호 1 내지 20 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 효소일 수 있다.
본 출원의 싸이코스 생산용 조성물은, 본 출원의 싸이코스 제조 경로(도 1 참고)에 관여하는 효소 및/또는 기질[(i) 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합; (ii) 포스페이트(phosphate); (iii) 과당-6-인산-3-에피머화 효소; (iv) 포도당-6-인산-이성화효소; (v) 포스포글루코무타아제 또는 포도당 인산화 효소; 및/또는 (vi) α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, α-아밀라아제, 풀루란아제, 이소아밀라아제, 글루코아밀라아제 또는 수크라아제]; 상기 싸이코스 제조 경로에 관여하는 효소를 발현하는 미생물; 또는 상기 싸이코스 제조 경로에 관여하는 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 추가적으로 포함할 수 있다. 다만, 이는 예시적인 것으로 본 출원의 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소를 이용하여 싸이코스를 생산할 수 있다면, 본 출원의 싸이코스 생산용 조성물에 포함되는 효소 및 싸이코스 생산에 이용되는 기질이 제한되지 않는다.
본 출원의 전분/말토덱스트린 포스포릴라아제(starch/maltodextrin phosphorylase, EC 2.4.1.1) 및 α-글루칸 포스포릴라아제는 포스페이트(phosphate)를 포도당에 인산화 전이시켜 전분 또는 말토덱스트린으로부터 포도당-1-인산을 생산하는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 전분 또는 말토덱스트린으로부터 포도당-1-인산을 생산하는 활성을 갖는 단백질은 서열번호 서열번호 59의 아미노산 서열로 이루어진 단백질일 수 있다. 또한, 상기 전분 또는 말토덱스트린으로부터 포도당-1-인산을 생산하는 활성을 갖는 단백질은 서열번호 60의 염기서열에 의해 암호화될 수 있다.
본 출원의 수크로스 포스포릴라아제(sucrose phosphorylase, EC 2.4.1.7)는 포스페이트를 포도당에 인산화 전이시켜 수크로스로부터 포도당-1-인산을 생산하는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다.
본 출원의 전분 액당화 효소인 α-아밀라아제(α-amylase, EC 3.2.1.1), 풀루란아제(pullulanse, EC 3.2.1.41), 글루코아밀라아제(glucoamylase, EC 3.2.1.3) 및 이소아밀라아제(isoamylase)는 전분 또는 말토덱스트린을 포도당으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다.
본 출원의 수크라제(sucrase, EC 3.2.1.26)는 수크로스를 포도당으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다.
본 출원의 포스포글루코무타아제(phosphoglucomutase, EC 5.4.2.2)는 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질은 서열번호 서열번호 61의 아미노산 서열로 이루어진 단백질일 수 있다. 또한, 상기 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질은 서열번호 62의 염기서열에 의해 암호화될 수 있다.
포도당인산화효소(glucokinase)는 포도당에 인산을 전이시켜 포도당-6-인산으로 전환하는 활성을 가지는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 포도당인산화효소는 폴리포스페이트 의존형 포도당인산화 효소일 수 있고 보다 구체적으로, 서열번호 77 또는 78의 아미노산 서열로 이루어진 단백질일 수 있다. 본 출원의 포도당-6-인산-이성화효소는 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 포도당-6-인산-이성화효소는 서열번호 63의 아미노산 서열로 이루어진 단백질일 수 있다. 또한, 상기 포도당-6-인산-이성화효소는 서열번호 64의 염기서열에 의해 암호화될 수 있다.
본 출원의 과당-6-인산-3-에피머화 효소는 과당-6-인산을 싸이코스-6-인산으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 과당-6-인산-3-에피머화 효소는 서열번호 65의 아미노산 서열로 이루어진 단백질일 수 있다. 또한, 본 출원의 과당-6-인산-3-에피머화 효소는 서열번호 66의 뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화될 수 있다.
본 출원의 싸이코스 생산용 조성물은 포도당을 전분, 말토덱스트린 또는 수크로스로 전환시키는 활성을 가지는 단백질(예컨대, 4-α-글루카노트랜스퍼라아제 등)을 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 포도당을 전분, 말토덱스트린 또는 수크로스로 전환시키는 활성을 가지는 단백질은 서열번호 67의 아미노산 서열로 이루어진 효소일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 68의 뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화될 수 있다. 본원의 싸이코스 생산용 조성물은 당해 싸이코스 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 부형제에는, 예를 들어, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 및 등장화제 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원의 싸이코스 생산용 조성물은 금속 이온 또는 금속염을 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 금속 이온은 2가 양이온일 수 있으며, 구체적으로 Ni, Mg, Mg, Ni, Co, Mn, Fe 및 Zn으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 금속 이온일 수 있다. 보다 구체적으로, 본 출원의 싸이코스 생산용 조성물은 금속염을 추가로 포함할 수 있으며, 보다 더 구체적으로 상기 금속염은 NiSO4, MgSO4, MgCl2, NiCl2, CoSO4, CoCl2, MnCl2, FeSO4 및 ZnSO4로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 출원은 또 다른 하나의 양태로서, 싸이코스-6-인산에 이노시톨-모노-포스파타아제, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜 상기 싸이코스-6-인산을 싸이코스로 전환하는 단계를 포함하는 싸이코스 제조방법을 제공한다.
본 출원의 제조방법에서 이노시톨-모노-포스파타아제는 Xa1-Xa2-Xa3-DPLDG-Xa4의 모티프 A; 및 Ya1-D-Ya2-Wa1-Ya3-Wa2-Ya4-Wa3의 모티프 B를 포함하는 이노시톨-모노-포스파타아제일 수 있다. 본 출원에서 이노시톨-모노-포스파타아제는 싸이코스-6-인산 탈인산효소와 호환되어 사용될 수 있으며, 따라서 싸이코스-6-인산 탈인산효소에 대한 전술한 양태에서의 설명은 이노시톨-모노-포스파타아제에 적용될 수 있다.
본 출원의 방법은 싸이코스-6-인산을 싸이코스로 전환하는 단계 이전, 과당-6-인산(fructose-6-phosphate)에 과당-6-인산-3-에피머화 효소, 상기 과당-6-인산-3-에피머화 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 과당-6-인산-3-에피머화 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 과당-6-인산을 싸이코스-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 출원의 방법은 상기 과당-6-인산을 싸이코스-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당-6-인산(Glucose-6-phosphate)에 포도당-6-인산-이성화효소, 상기 포도당-6-인산-이성화효소를 발현하는 미생물 또는 상기 포도당-6-인산-이성화효소를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 출원의 방법은 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당-1-인산(Glucose-1-phosphate)에 포스포글루코무타아제, 상기 포스포글루코무타아제를 발현하는 미생물 또는 상기 포스포글루코무타아제를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 출원의 방법은 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당(Glucose)에 포도당 인산화 효소, 상기 포도당 인산화 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 포도당 인산화 효소를 발현하는 미생물의 배양물, 및 포스페이트를 접촉시켜, 상기 포도당을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 출원의 방법은 상기 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제 또는 수크로오스 포스포릴라아제; 상기 포스포릴라아제를 발현하는 미생물; 또는 상기 포스포릴라아제를 발현하는 미생물의 배양물, 및 포스페이트를 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합을 포도당-1-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 출원의 방법은 상기 포도당을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제; 상기 α-아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제를 발현하는 미생물; 또는 상기 α-아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합을 포도당으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 출원은 또 다른 일 양태로서, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합, 및 포스페이트에 (a) 이노시톨-모노-포스파타아제; 과당-6-인산-3-에피머화효소; 포도당-6-인산-이성화효소; 포스포글루코무타아제 또는 포도당 인산화 효소; 및 α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, α-아밀라아제, 풀루란아제, 이소아밀라아제, 글루코아밀라아제 또는 수크라아제; 또는 (b) 상기 항목 (a)의 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시키는 단계를 포함하는, 싸이코스 제조방법을 제공한다.
본 출원의 제조방법에 있어서, 본 출원의 접촉은 pH 5.0 내지 9.0, 구체적으로 pH 6.0 내지 8.0에서 실시할 수 있다.
본 출원의 제조방법에 있어서, 본 출원의 접촉은 40℃ 내지 80℃ 온도, 구체적으로 40℃ 내지 60℃ 또는 50℃ 내지 60℃ 온도에서 실시할 수 있다.
본 출원의 제조방법에 있어서, 본 출원의 접촉은 2시간 내지 24시간, 구체적으로 6 시간 내지 24시간 동안 실시할 수 있다.
본 출원의 제조방법에 있어서, 본 출원의 접촉은 pH 5.0 내지 9.0, 40℃ 내지 80℃ 온도, 및/또는 2 시간 내지 24 시간 동안 실시할 수 있다. 구체적으로, 상기 접촉은 pH 6.0 내지 8.0, 40℃ 내지 60℃ 또는 50℃ 내지 60℃ 온도, 및/또는 6시간 내지 24시간 동안 실시할 수 있다.
본 출원의 제조방법은 싸이코스를 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 출원의 정제는 특별히 제한되지 아니하며, 본 출원의 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법을 사용할 수 있다. 비제한적인 예로, 크로마토그래피, 분별 결정 및 이온 정제 등을 들 수 있다. 상기 정제 방법은 하나만 실시될 수도 있으며, 두 가지 이상의 방법을 함께 실시할 수도 있다. 예를 들어, 크로마토그래피를 통해 싸이코스 생성 반응물을 정제할 수 있으며, 상기 크로마토그래피에 의한 당의 분리는 분리하고자 하는 당과 이온 수지에 부착된 금속 이온 사이의 약한 결합력의 차이를 이용하여 수행될 수 있다.
또한, 본 출원은 본 출원의 정제하는 단계의 전 또는 후에 탈색, 탈염 또는 둘 다를 실시하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 탈색 및/또는 탈염을 실시함으로써, 불순물 없이 보다 정제된 싸이코스 반응물을 얻을 수 있다.
본 출원의 신규한 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소인 이노시톨-모노-포스파타아제는 내열성이 있어 싸이코스-6-인산을 싸이코스로 전환하는 경로를 산업적으로 수행할 수 있고, 경제적인 원료인 포도당 또는 전분(예컨대, 말토덱스트린)을 사용하여 싸이코스 합성 경로의 진행을 가능하게 하며, 비가역 반응 경로인 싸이코스-6-인산 탈인산화 반응에 의하여 싸이코스 생산을 가능하게 하는바 싸이코스로의 전환율을 현저히 높일 수 있다.
또한, 본 출원의 이노시톨-모노-포스파타아제를 이용한 싸이코스 제조방법은 싸이코스 전환율 상승에 의하여 반응 결과물이 고농도의 싸이코스를 포함하여 분리정제 공정을 단순화 또는 제거할 수 있는바, 제조방법이 간단하면서도 경제적인 이점이 있다.
도 1은 전분(예컨대, 말토덱스트린) 또는 포도당으로부터 싸이코스를 제조할 수 있는 효소반응 경로의 일 모식도이다.
도 2a 내지 2c는 본 출원의 정제된 재조합 효소들(pET21a-CJ_Rma, pET21a-CJ_Tle, pET21a-CJ_Mrub, pET21a-CJ_Dtu, pBT7-C-His-CJ_Pfe, pBT7-C-His-CJ_Twi, pBT7-C-His-CJ_Tth, pBT7-C-His-CJ_Tli, pBT7-C-His-CJ_Gst, pBT7-C-His-CJ_Ath, pBT7-C-His-CJ_Sac, pBT7-C-His-CJ_Tta, pBT7-C-His-CJ_Pfu, pBT7-C-His-CJ_Afu, pBT7-C-His-CJ_Aac, pET21a-CJ_Msi, pET21a-CJ_Mruf, pET21a-CJ_Mta, pET21a-CJ_Mch 및 pET21a-CJ_Mce)의 분자량을 단백질 전기영동(SDS-PAGE) 분석결과이다. M은 단백질 크기 측정 마커(size marker), S는 발현된 조효소, E는 각각의 효소를 나타낸다.
도 3a는 본 출원의 이노시톨-모노-포스파타아제(pET21a-CJ_Rma, pET21a-CJ_Tle, pET21a-CJ_Mrub, pET21a-CJ_Dtu, pBT7-C-His-CJ_Pfe, pBT7-C-His-CJ_Twi, pBT7-C-His-CJ_Tth, pBT7-C-His-CJ_Tli, pBT7-C-His-CJ_Gst, pBT7-C-His-CJ_Ath, pBT7-C-His-CJ_Sac, pBT7-C-His-CJ_Tta, pBT7-C-His-CJ_Pfu, pBT7-C-His-CJ_Afu, pBT7-C-His-CJ_Aac)의 싸이코스 탈인산 상대활성(%, 왼쪽 Y축, 막대그래프)과 포도당-6-인산, 포도당-1-인산, 과당-6-인산 및 싸이코스-6-인산 탈인산 혼합액에서의 싸이코스 선택적 탈인산율(%, 오른쪽 Y축, 사각 도트)을 나타낸 결과이다.
도 3b는 본 출원의 이노시톨-모노-포스파타아제(pET21a-CJ_Mrub, pET21a-CJ_Msi, pET21a-CJ_Mruf, pET21a-CJ_Mta, pET21a-CJ_Mch, pET21a-CJ_Mce)의 싸이코스 탈인산 상대활성(%) 비교 결과이다.
도 4a는 α-글루칸 포스포릴라이제, 포스포글루코무타아제, 포도당-6-인산-이성화효소, 4-α-글루카노트랜스퍼라아제, 과당-6-인산-3-에피머화효소 및 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소가 첨가된 복합효소반응을 이용하여 말토덱스트린으로부터 싸이코스가 생성됨을 확인한 HPLC 크로마토그래피 결과이다.
도 4b는 본 출원의 이노시톨-모노-포스파타아제가 포도당-1-인산, 포도당-6-인산, 과당-6인산 및 싸이코스-6-인산이 혼재된 복합 반응액에서도 싸이코스-6-인산을 선택적으로 탈인산화하여 싸이코스를 생성함을 확인한 HPLC 크로마토그래피 결과이다.
이하, 본 출원을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하나, 이는 본 출원의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 출원의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 이노시톨-모노-포스파타아제의 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물의 제조
본 출원의 싸이코스 제조 경로에 필요한 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소를 제공하기 위하여 내열성의 이노시톨-모노-포스파타아제 유전자를 선발하였다. 구체적으로, Genbank에 등록된 로도써머스 마리너스(Rhodothermus marinus), 써모토가 레팅게(Thermotoga lettingae), 메이오써머스 루버(Meiothermus ruber), 딕토글로머스 터기덤(Dictyoglomus turgidum), 파이로바쿨럼 페리듄센스(Pyrobaculum ferrireducens), 써모어네로박터 위제리(Thermoanaerobacter wiegelii), 써머스 써모필러스(Thermus thermophilus), 써모코커스 리토랄리스(Thermococcus litoralis), 지오바실러스 스테레아써모필러스(Geobacillus stearothermophilus), 어네오리아 써모필리아(Anaerolinea thermophila), 썰폴로보스 에씨도칼다리어스(Sulfolobus acidocaldarius), 써모썰피디박터 타카이(Thermosulfidibacter takaii), 파이로코커스 퓨리어스(Pyrococcus furiosus), 아키오글로버스 퓰지더스(Archaeoglobus fulgidus), 알리시슬로바실러스 에씨도칼다리어스(Alicyclobacillus acidocaldarius), 메이오써머스 실바너스(Meiothermus silvanus), 메이오써머스 루퍼스(Meiothermus rufus), 메이오써머스 타이완네시스(Meiothermus taiwanensis), 메이오써머스 치리아로필러스(Meiothermus chliarophilus), 메이오써머스 쎄베레우스(Meiothermus cerbereus) 유전체 서열들을 대상으로 이노시톨-모노-포스파타아제 유전자(Rma, Tle, Mrub, Dtu, Msi, Mruf, Mta, Mch 및 Mce)를 선발하였다.
상기 선발한 유전자의 염기서열[상기 유전자의 순서대로 각각 서열번호 21, 22, 23, 24, 36, 37, 38, 39, 40]과 아미노산 서열[상기 유전자의 순서대로 각각 서열번호 1, 2, 3, 4, 16, 17, 18, 19, 내지 20] 정보를 바탕으로 정방향 프라이머(forward primer, 서열번호 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57) 및 역방향 프라이머(reverse primer, 서열번호 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58)를 고안하였다. 합성된 프라이머를 이용하여 각 로도써머스 마리너스(Rhodothermus marinus), 써모토가 레팅게(Thermotoga lettingae), 메이오써머스 루버(Meiothermus ruber), 딕토글로머스 터기덤(Dictyoglomus turgidum), 메이오써머스 실바너스(Meiothermus silvanus), 메이오써머스 루퍼스(Meiothermus rufus), 메이오써머스 타이완네시스(Meiothermus taiwanensis), 메이오써머스 치리아로필러스(Meiothermus chliarophilus), 메이오써머스 쎄베레우스(Meiothermus cerbereus)의 염색체 DNA(genomic DNA)로부터 각각의 유전자를 중합효소 연쇄반응(PCR)을 이용하여 증폭하고, 증폭된 각각의 이노시톨-모노-포스파타아제를 제한효소 NdeⅠ 및 XhoⅠ 또는 Sal I을 사용하여 대장균 발현용 플라스미드 벡터 pET21a(Novagen사)에 삽입하여 각각 pET21a-CJ_Rma(Nde I/Xho I), pET21a-CJ_Tle(Nde I/Xho I), pET21a-CJ_Mrub(Nde I/Xho I), pET21a-CJ_Dtu(Nde I/Xho I), pET21a-CJ_Msi(Nde I/Sal I), pET21a-CJ_Mruf(Nde I/Sal I), pET21a-CJ_Mta(Nde I/Sal I), pET21a-CJ_Mch(Nde I/Sal I), pET21a-CJ_Mce(Nde I/Sal I) 이라 명명된 재조합 발현벡터를 제작하였다.
추가적으로 파이로바쿨럼 페리듄센스(Pyrobaculum ferrireducens), 써모어네로박터 위제리(Thermoanaerobacter wiegelii), 써머스 써모필러스(Thermus thermophilus), 써모코커스 리토랄리스(Thermococcus litoralis), 지오바실러스 스테레아써모필러스(Geobacillus stearothermophilus), 어네오리아 써모필리아(Anaerolinea thermophila), 썰폴로보스 에씨도칼다리어스(Sulfolobus acidocaldarius), 써모썰피디박터 타카이(Thermosulfidibacter takaii), 파이로코커스 퓨리어스(Pyrococcus furiosus), 아키오글로버스 퓰지더스(Archaeoglobus fulgidus), 알리시슬로바실러스 에씨도칼다리어스(Alicyclobacillus acidocaldarius) 유래 이노시톨-모노포스파테이즈 유전자(Pfe, Twi, Tth, Tli, Gst, Ath, Sac, Tta, Pfu, Afu, Aac)를 선발하고, 상기 유전자의 각 염기서열[상기 유전자의 순서대로 각각 서열번호 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35]과 아미노산 서열[상기 유전자의 순서대로 각각 서열번호 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15] 정보를 바탕으로 DNA를 합성을 의뢰하여(바이오니아社), 벡터 pBT7-C-His(바이오니아사)에 삽입한 각각 pBT7-C-His-CJ_Pfe, pBT7-C-His-CJ_Twi, pBT7-C-His-CJ_Tth, pBT7-C-His-CJ_Tli, pBT7-C-His-CJ_Gst, pBT7-C-His-CJ_Ath, pBT7-C-His-CJ_Sac, pBT7-C-His-CJ_Tta, pBT7-C-His-CJ_Pfu, pBT7-C-His-CJ_Afu, pBT7-C-His-CJ_Aac이라 명명된 재조합 발현벡터를 제작하였다.
상기 발현벡터는 통상적인 형질전환 방법[참조: Sambrook et al. 1989]으로 대장균(E. coli) BL21(DE3) 균주에 각각 형질 전환하여 E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Rma(E. coli_P1_CJ_Rma, KCCM12057P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Tle(E. coli_P2_CJ_Tle, KCCM12058P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mrub(E. coli_P3_CJ_Mrub, KCCM12059P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Dtu(E. coli_P4_CJ_Dtu, KCCM12060P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Pfe(E. coli_P5_CJ_Pfe, KCCM12061P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Twi(E. coli_P6_CJ_Twi, KCCM12062P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tth(E. coli_P7_CJ_Tth, KCCM12063P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tli(E. coli_P8_CJ_Tli, KCCM12064P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Gst(E. coli_P9_CJ_Gst, KCCM12065P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Ath(E. coli_P10_CJ_Ath, KCCM12066P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Sac(E. coli_P11_CJ_Sac, KCCM12067P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tta(E. coli_P12_CJ_Tta, KCCM12068P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Pfu(E. coli_P13_CJ_Pfu, KCCM12069P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Afu(E. coli_P14_CJ_Afu, KCCM12070P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Aac(E. coli_P15_CJ_Aac, KCCM12071P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Msi(E. coli_P16_CJ_Msi, KCCM12072P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mruf(E. coli_P17_CJ_Mruf, KCCM12073P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mta(E. coli_P18_CJ_Mta, KCCM12074P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mch(E. coli_P19_CJ_Mch, KCCM12075P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mce(E. coli_P20_CJ_Mce, KCCM12076P)이라 명명된 형질전환 미생물을 제조하였다.
상기 형질전환균주를 부다페스트 조약 하에 2017년 7월 10일자로 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 기탁하여 기탁번호 KCCM12057P 내지 KCCM12076P를 부여 받았다.
실시예 2: 싸이코스 제조 경로에 필요한 효소의 제조
써모토가 네아폴리타나 유래 본 출원의 싸이코스 제조 경로에 필요한 내열성 효소인 α-글루칸 포스포릴라아제(α-glucan phosphorylase), 포스포글루코무타아제(phosphoglucomutase), 포도당-6-인산-이성화효소(glucose-6-phosphate-isomerase) 및 과당-6-인산-3-에피머화효소(fructose-6-phosphate-3-epimerase)를 제공하기 위하여 상기 효소들로 예상되는 유전자(상기 효소들의 기재 순서대로 각각 ct1, ct2, tn1 및 fp3e)를 선발하였다.
상기 선발한 유전자의 염기서열[상기 효소들의 기재 순서대로 각각 서열번호 60, 62, 64 및 66] 및 아미노산 서열[상기 효소들의 기재 순서대로 각각 서열번호 59, 61, 63 및 65]을 기반으로 정방향 프라이머(forward primer, 서열번호 69, 71, 73 및 75) 및 역방향 프라이머(reverse primer, 서열번호 70, 72, 74 및 76)를 고안하여 합성하고, 이를 이용하여 써모토가 네아폴리타나의 염색체 DNA(genomic DNA)를 주형으로 중합효소 연쇄반응(PCR)을 이용하여 95℃에서 30초 동안 변성, 55℃에서 30초 동안 어닐링 및 68℃에서 2분 동안 중합하였고, 상기 반응들은 25회 반복한 조건을 사용하여 각 효소의 유전자를 증폭하였다. 증폭된 각 효소 유전자는 제한효소 NdeⅠ 및 XhoⅠ을 사용하여 대장균 발현용 플라스미드 벡터 pET21a(Novagen사)에 삽입하여 각각 pET21a-CJ_ct1, pET21a-CJ_ct2, pET21a-CJ_ tn1 및 pET21a-CJ_ fp3e라 명명된 재조합 발현벡터를 제작하였다. 상기 재조합 발현벡터를 통상적인 형질전환 방법(참조: Sambrook et al. 1989)으로 대장균 BL21(DE3) 균주에 형질 전환하여 형질전환된 미생물을 제조하고 E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct1(KCCM11990P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct2(KCCM11991P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn1(KCCM11992P) 및 E. coli BL21(DE3)/CJ_tn_fp3e(KCCM11848P)로 명명하였다. 균주는 부다페스트 조약 하에 2016년 6월 23일자로 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 기탁하여 기탁번호를 부여 받았다.
실시예 3: 재조합 효소의 제조
재조합 효소를 제조하기 위해, 실시예 1 및 2에서 제조한 각 형질전환 미생물을 LB 액체배지 5 ml를 포함하는 배양 튜브에 접종하고, 600 nm에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37 ℃의 진탕 배양기에서 종균 배양을 하였다. 본 종균 배양된 배양액을 LB 액체배지를 포함하는 배양 플라스크에 접종하여 본 배양을 진행하였다. 600 nm에서의 흡광도가 2.0이 될 때 1 mM IPTG를 첨가하여 재조합 효소의 발현생산을 유도하였다. 상기 배양 과정 중의 교반 속도는 180 rpm이며 배양 온도는 37 ℃가 유지되도록 하였다. 배양액은 8,000×g로 4 ℃에서 20분 동안 원심분리 후 균체를 회수하였다. 회수된 균체는 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액으로 2회 세척하였고, 동일 완충용액으로 현탁 후 초음파 세포파쇄기를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄물은 13,000×g로 4 ℃에서 20분 동안 원심분리 후 상등액만을 취하였다. 상기 상등액으로부터 His-tag 친화 크로마토그래피를 사용하여 재조합 효소를 정제하고, 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액으로 투석한 후 반응에 사용하였다.
SDS-PAGE 분석을 통하여 분자량을 확인하였으며, 각 형질전환미생물에 의하여 제조한 정제된 효소명 및 분자량(도 2a 내지 도 2c)은 하기와 같다:
E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Rma(E. coli_P1_CJ_Rma)로부터 제조된 효소(RMA로 기재)는 30.3 kDa,
E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Tle(E. coli_P2_CJ_Tle)로부터 제조된 효소(TLE로 기재)는 28.5 kDa,
E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mrub(E. coli_P3_CJ_Mrub)로부터 제조된 효소(MRUB로 기재)는 28 kDa,
E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Dtu(E. coli_P4_CJ_Dtu)로부터 제조된 효소(DTU로 기재)는 30.2 kDa,
E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Pfe(E. coli_P5_CJ_Pfe)로부터 제조된 효소(PFE로 기재)는 27.2 kDa,
E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Twi(E. coli_P6_CJ_Twi)로부터 제조된 효소(TWI로 기재)는 28.8 kDa,
E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tth(E. coli_P7_CJ_Tth)로부터 제조된 효소(TTH로 기재)는 28.6 kDa,
E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tli(E. coli_P8_CJ_Tli)로부터 제조된 효소(TLI로 기재)는 28 kDa,
E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Gst(E. coli_P9_CJ_Gst)로부터 제조된 효소(GST로 기재)는 29.6 kDa,
E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Ath(E. coli_P10_CJ_Ath)로부터 제조된 효소(ATH로 기재)는 28.7 kDa,
E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Sac(E. coli_P11_CJ_Sac)로부터 제조된 효소(SAC로 기재)는 29.9 kDa,
E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tta(E. coli_P12_CJ_Tta)로부터 제조된 효소(TTA로 기재)는 28.6 kDa,
E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Pfu(E. coli_P13_CJ_Pfu)로부터 제조된 효소(PFU로 기재)는 27.9 kDa,
E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Afu(E. coli_P14_CJ_Afu)로부터 제조된 효소(AFU로 기재)는 28 kDa,
E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Aac(E. coli_P15_CJ_Aac)로부터 제조된 효소(AAC로 기재)는 29 kDa,
E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Msi(E. coli_P16_CJ_Msi)로부터 제조된 효소(MSI로 기재)는 28.1 kDa,
E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mruf(E. coli_P17_CJ_Mruf)로부터 제조된 효소(MRUF로 기재)는 28 kDa,
E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mta(E. coli_P18_CJ_Mta)로부터 제조된 효소(MTA로 기재)는 28.1 kDa,
E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mch(E. coli_P19_CJ_Mch)로부터 제조된 효소(MCH로 기재)는 28.4 kDa,
E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mce(E. coli_P20_CJ_Mce)로부터 제조된 효소(MCE로 기재)는 28.1 kDa,
E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct1(KCCM11990P)로부터 제조된 효소(CT1로 기재),
E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct2(KCCM11991P)로부터 제조된 효소(CT2로 기재),
E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn1(KCCM11992P)로부터 제조된 효소(TN1로 기재),
E. coli BL21(DE3)/CJ_tn_fp3e(KCCM11848P)로부터 제조된 효소(FP3E로 기재).
실시예 4: 이노시톨-모노-포스파타아제의 활성 분석
4-1. 싸이코스 -6-인산 탈인산 효소 활성 분석
싸이코스-6-인산의 구입이 어려운바, 과당-6-인산으로부터 싸이코스-6-인산을 제조한 후 이노시톨-모노-포스파타아제에 의한 싸이코스 생산 활성을 확인하였다.
구체적으로, 50 mM 과당-6-인산을 50 mM Tris-HCl(pH 7.0) 완충용액에 현탁한 후, 실시예 3에서 제조한 과당-6-인산-3-에피머화효소(이하, FP3E) 및 이노시톨-모노-포스파타아제 20종을 각각 0.1 unit/ml 첨가하고, 70℃에서 1시간 동안 반응시켰다. HPLC를 이용하여 싸이코스 생성 여부를 분석하였으며, HPLC 분석은 SP_0810(Shodex사) 컬럼과 Aminex HPX-87C(Bio-RAD사) 컬럼을 사용하여 80℃에서 이동상으로 0.6 ml/min 유속으로 흘려 주면서 수행하였으며, Refractive Index Detector(RID)로 검출하였다.
그 결과, 모든 20종의 이노시톨-모노-포스파타아제에서 싸이코스-6-인산의 탈인산 역가를 확인하였다(도 3a 및 3b).
4-2. 싸이코스 -6-인산 특이적 탈인산화 활성 분석
포도당-6-인산, 포도당-1-인산, 과당-6-인산 및 싸이코스-6-인산의 혼합액에서 각 이노시톨-모노-포스파타아제의 싸이코스-6-인산 특이적 탈인산화율을 측정하였다.
구체적으로, 0.1 unit/ml의 각각의 이노시톨-모노-포스파타아제 및 5 mM MgCl2을 1 %(w/v) 포도당-6-인산, 포도당-1-인산, 과당-6-인산 및 싸이코스-6-인산의 혼합액에 첨가하여 50℃에서 12시간 반응시킨 후, HPLC를 이용하여 반응물을 분석하였다. HPLC 분석은 Aminex HPX-87C(Bio-RAD사) 컬럼을 사용하여 80℃에서 이동상으로 0.6 ml/min 유속으로 흘려 주면서 수행하였고 Refractive Index Detector로 생성된 싸이코스 및 기타당(과당 및 포도당)을 검출하였다.
그 결과, MRUB 효소 싸이코스-6-인산 특이적 탈인산화율이 가장 높음을 확인하였다(도 3a).
실시예 5: 복합효소 반응을 통한 싸이코스 생산 활성 분석
말토덱스트린으로부터 싸이코스 생산을 위해 및 CT1, CT2, TN1, FP3E 및 MRUB 효소를 동시에 반응시켰다. 각 효소는 0.1 unit/ml을 사용하였고, 5 mM MgCl2, 20 mM의 인산나트륨(Sodium phosphate pH 7.0)에 5 %(w/v) 말토덱스트린을 첨가하여 온도 50℃에서 12시간 반응 후 HPLC를 이용하여 반응 결과물에서 싸이코스를 HPLC를 이용하여 분석하였다. HPLC 분석은 Aminex HPX-87C(Bio-RAD사) 컬럼을 사용하여 80℃에서 이동상으로 0.6 ml/min 유속으로 흘려 주면서 수행하였으며, Refractive Index Detector로 검출하였다.
그 결과, 복합효소반응에 의하여 말토덱스트린으로부터 싸이코스가 생성됨을 확인하였다(도 4a).
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
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<110> CJ CHEILJEDANG CORPORATION <120> A Novel Psicose-6-phosphate phosphatase, a composition for producing psicose containing the phosphatase and a method for producing psicose using the phosphatase <130> P18-0210 <150> KR 2017/0097334 <151> 2017-07-31 <160> 78 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequences of RMA <400> 1 Met Met Asp Ala Tyr Thr Leu Tyr Glu Glu Ala Arg Glu Val Ala Ala 1 5 10 15 Arg Leu Ala Arg Asp Ala Gly Gln Ile Ala Arg Tyr Tyr Ala Gly Arg 20 25 30 Val Thr Val Arg Glu Lys Gly Tyr Asn Glu Leu Val Thr Gln Ala Asp 35 40 45 Glu Glu Val Gln Arg Phe Leu Ile Glu Gln Ile His Arg His Phe Pro 50 55 60 Glu His Ala Ile Leu Ala Glu Glu Asn Leu Ser Asp Met Gln Asp Gly 65 70 75 80 Arg Glu Gly Ala Ser Phe Arg Trp Ile Ile Asp Pro Ile Asp Gly Thr 85 90 95 Thr Asn Phe Thr His Gly Val Pro Pro Tyr Gly Ile Ser Leu Ala Leu 100 105 110 Gln His Glu Gly Arg Thr Val Val Gly Val Val Tyr Asp Val Pro His 115 120 125 Asp Glu Leu Phe Thr 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<212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequences of MRUB <400> 3 Met Asp Leu Arg Ala Tyr Leu Gln Thr Ala Leu Asp Ala Ala Tyr Leu 1 5 10 15 Ala Lys Gly Ile His Gln Tyr Tyr Gln Glu Lys Gly Phe Thr Gln Ser 20 25 30 Thr Lys Ser Thr Pro Thr Asp Leu Val Thr Gln Ala Asp His Glu Ser 35 40 45 Glu Ala Ala Ile Arg Glu Leu Ile Ala Ser Arg His Pro Asp His Val 50 55 60 Val Leu Gly Glu Glu Gln Gly Gln Asp Lys Glu Gly Ala Phe Arg Trp 65 70 75 80 Ile Val Asp Pro Leu Asp Gly Thr Val Asn Tyr Ala His Gly Phe Pro 85 90 95 Phe Tyr Ala Val Ser Ile Gly Leu Glu Ala His Gly Glu Val Val Leu 100 105 110 Gly Val Val Leu Asp Thr Ala Arg Gly Glu Leu Phe Thr Ala Thr Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Ala Tyr Leu Asn Gly Arg Pro Ile Arg Val Ser Thr Arg 130 135 140 Ser Thr Leu Val Gly Ser Leu Leu Ala Thr Gly Phe Pro Tyr Asp Val 145 150 155 160 Ser Lys Asp Thr Glu Asn Leu Val Tyr Phe Gln Arg Ala Leu Thr Lys 165 170 175 Gly Leu Met Val Arg Arg Pro Gly Ala Ala Ala Leu Asp Leu Ala Tyr 180 185 190 Val Ala Ala 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Sequence <220> <223> Amino acid sequences of TWI <400> 6 Met Lys Asp Glu Lys Gly Ile Val Val Asp Ile Ile Lys Lys Ala Gly 1 5 10 15 Glu Ile Leu Gln Asp Gly Trp Asn Lys Lys Asn Phe Lys Ile Tyr Arg 20 25 30 Lys Gly Thr Ile Asn Leu Val Thr Glu Ile Asp Lys Lys Ile Glu Phe 35 40 45 Leu Ile Ile Gln Leu Leu Lys Gln Tyr Phe Pro Asp Tyr Gly Ile Leu 50 55 60 Thr Glu Glu Ser Lys Glu Ile Asn Ser Lys Ala Asn Val Arg Trp Ile 65 70 75 80 Ile Asp Pro Leu Asp Gly Thr Thr Asn Tyr Ile Lys Gln Tyr Pro Phe 85 90 95 Val Ala Ile Ser Ile Ala Leu Glu Lys Glu Gly Glu Leu Ile Leu Gly 100 105 110 Val Val Tyr Asn Pro Ile Leu Asn Glu Met Phe Ile Ala Gln Lys Gly 115 120 125 Cys Gly Ala Thr Tyr Asn Gly Lys Ser Ile His Val Ser Lys Ile Lys 130 135 140 Glu Leu Gly Ser Ala Val Leu Ala Ser Gly Phe Pro Tyr Asp Ala Trp 145 150 155 160 Glu Asn Pro Asp Asn Asn Ala Lys Gln Trp Arg Gln Phe Leu Thr Arg 165 170 175 Ser Leu Ser Leu Arg Cys Asp Gly Ser Ala Ala Leu Asp Leu Cys Arg 180 185 190 Val Ala Cys Gly Gln Leu Asp Gly Tyr Trp 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GST <400> 9 Met Ala Glu Lys Trp Glu Glu Ile Asp Arg Tyr Ala Arg Gln Trp Ile 1 5 10 15 Asp Glu Ala Gly Lys Arg Ile Arg Ala Ser Phe Ala Lys Gln Leu Thr 20 25 30 Val Glu Ala Lys Glu Asn Pro Asn Asp Leu Val Thr Asn Val Asp Arg 35 40 45 Ala Ile Glu Gln Phe Phe Ala Glu His Ile Arg Arg Gln Phe Pro Ser 50 55 60 His Arg Leu Leu Gly Glu Glu Gly Phe Gly Asp Arg Ile Asp Ala Leu 65 70 75 80 Asp Gly Val Val Trp Val Ile Asp Pro Ile Asp Gly Thr Met Asn Phe 85 90 95 Val His Gln Arg Arg His Phe Ala Val Ser Ile Gly Ile Phe Glu Asp 100 105 110 Gly Ile Gly Gln Leu Gly Tyr Val Tyr Asp Val Val Phe Asp Glu Leu 115 120 125 Tyr Ala Ala Gln Lys Gly Arg Gly Val Phe Leu Asn Gly Glu Pro Leu 130 135 140 Gly Leu Leu Gln Pro Ala Pro Val Ala Glu Ser Ile Ile Ala Ile Asn 145 150 155 160 Gly Thr Trp Leu Met Glu Asn Lys Arg Leu Asp His Arg Pro Leu Met 165 170 175 Arg Leu Ala Lys Glu Ala Arg Gly Thr Arg Ser Tyr Gly Ser Ala Ala 180 185 190 Leu Glu Leu Ala Tyr Val Ala Ala Gly Arg Leu Asp Ala Tyr Ile Ser 195 200 205 Pro Arg 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Sequence <220> <223> Amino acid sequences of TTA <400> 12 Met Leu Glu Leu Leu Lys Asp Thr Ala Lys Lys Ala Gly Arg Leu Leu 1 5 10 15 Lys Ile Arg Phe Leu Glu Leu Leu Asn Gly Met Glu Thr Glu Val Arg 20 25 30 Glu Lys Gly Lys Ser Asp Phe Val Thr Arg Val Asp Val Glu Val Glu 35 40 45 Asn Tyr Ile Lys Glu Leu Leu Ala Asn Thr Asn Ile Ser Val Val Gly 50 55 60 Glu Glu Ser Phe Lys Gly Glu Ile Pro Gly Thr Cys Ile Phe Ile Asp 65 70 75 80 Pro Ile Asp Gly Thr Arg Asn Phe Met Arg Lys Asn Pro His Phe Ala 85 90 95 Ile Asn Leu Ala Tyr Gln Glu Lys Gly Lys Leu Leu Ala Gly Val Thr 100 105 110 Tyr Asp Pro Met Lys Asn Glu Met Phe Ser Ala Ala Phe Ser Lys Gly 115 120 125 Ala Phe Leu Asn Gly Glu Arg Ile Tyr Ala Ser Thr Asn Lys Asp Ile 130 135 140 Gly Lys Ala Ile Ile Ala Ile Gly Leu Pro Tyr Arg Gly Arg Glu Leu 145 150 155 160 Ile Asp Ile Gln Thr Asn Leu Tyr Arg Asn Ile Phe Leu Asn Gly Ala 165 170 175 Ala Thr Arg His Thr Gly Ser Ala Ala Leu Asp Leu Ala Tyr Ile Ser 180 185 190 Cys Gly Arg Tyr Asp Ala Ala Ile Tyr Phe 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Ser Leu Ile Ala Thr Gly Phe Pro Tyr Asp Val 145 150 155 160 Ala Arg Asp Arg Glu Asn Leu Thr Tyr Leu Glu Arg Val Leu Phe Lys 165 170 175 Gly Ile Thr Val Arg Arg Pro Gly Ala Ala Ala Leu Asp Leu Ala Tyr 180 185 190 Val Ala Cys Gly Arg Leu Asp Gly Phe Trp Glu Val Lys Leu Asn Pro 195 200 205 Trp Asp Val Ala Ala Gly Trp Leu Leu Val Glu Glu Ala Gly Gly Arg 210 215 220 Ile Thr Gly Ile His Gly Glu Pro Tyr Arg Met Gly Asn Arg Tyr Leu 225 230 235 240 Met Ala Ser Asn Gly His Ile His Glu Glu Leu Leu Ala Thr Ile His 245 250 255 Gly Arg <210> 20 <211> 258 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequences of MCE <400> 20 Met Asp Leu Arg Val Tyr Leu Gln Thr Ala Leu Asp Ala Ala Tyr Leu 1 5 10 15 Ala Lys Gly Ile His Gln Tyr Tyr Gln Glu Lys Gly Phe Thr Leu Ser 20 25 30 Ser Lys Ser Thr Pro Thr Asp Leu Val Thr Gln Ala Asp His Glu Ser 35 40 45 Glu Ala Ala Ile Arg Glu Leu Ile Ala Ala Arg His Pro Asp His Val 50 55 60 Val Leu Gly Glu Glu Gln Gly Gln Asp Arg Glu Gly Ala Phe Arg Trp 65 70 75 80 Ile Val Asp Pro Leu Asp Gly Thr Val Asn Tyr Ala His Gly Phe Pro 85 90 95 Phe Tyr Ala Val Ser Ile Gly Leu Glu Ala His Gly Glu Val Val Leu 100 105 110 Gly Val Ile Leu Asp Thr Ala Arg Gly Asp Leu Phe Thr Ala Thr Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Ala Phe Met Asn Gly Arg Pro Ile Arg Val Ser Pro Arg 130 135 140 Ala Thr Leu Val Gly Ser Leu Leu Ala Thr Gly Phe Pro Tyr Asp Val 145 150 155 160 Ser Lys Asp Thr Glu Asn Leu Val Tyr Phe Gln Arg Ala Leu Thr Arg 165 170 175 Gly Leu Met Val Arg Arg Pro Gly Ala Ala Ala Leu Asp Leu Ala Tyr 180 185 190 Val Ala Ala Gly Arg Leu Asp Gly Phe Trp Glu Val Lys Leu Asn Pro 195 200 205 Trp Asp Val Ala Ala Gly Trp Leu Ile Ile Arg Glu Ala Gly Gly Thr 210 215 220 Val Thr Gly Met Glu Gly Glu Ala Tyr Arg Leu Gly Asn Arg Tyr Leu 225 230 235 240 Val Ala Ser Asn Gly Leu Ile His Gln Pro Leu Leu Asp Thr Ile His 245 250 255 Gly Arg <210> 21 <211> 819 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequences of RMA <400> 21 atgatggatg cctacacgct ttacgaagaa gcccgtgagg tggcggcccg gctggcccgc 60 gatgccggac agatcgcccg ctactatgcc ggtcgggtga ccgtccgcga aaaaggctat 120 aacgagctgg tcacgcaggc cgacgaagaa gtacagcgct tcctgatcga gcagatccac 180 cggcatttcc ccgagcacgc gattctggcc gaggagaacc tgtccgacat gcaggacggc 240 agggaagggg cgtcgtttcg atggatcatc gatccgatcg acggcacgac gaacttcacg 300 cacggtgtgc cgccctatgg catcagtctg gcactccagc atgaaggccg gacggtcgtg 360 ggggtcgtct acgacgtgcc ccacgacgag ctgttcaccg cagtgcgggg cggcgggctg 420 tacgtcaacg gggtgcgcgc ccgggttagc cagaccgaaa cgctccggga ggcgctcatc 480 acgaccggct tcccctaccg ggaagtcgtg catctggaag aatatctgga ggcgctcggg 540 cgtgtgattc gagcgacgcg aggggtgcgt cggccgggcg cggcttcggt cgatctggcc 600 tgggtggcct gcggacgctt cgacggattc ttcgagacgg gcctgagtcc ctgggatgta 660 gcggccggca tcctgctggt cgaagaaggc ggaggacggg tgacggactt tcacgggcgg 720 cccgatccga tctttgcccg ccagatgctg gccacgaacg ggcgcatcca cgaggcgctc 780 tgcgagctgg tcgcgccgct gcaccacgtc tacgcctga 819 <210> 22 <211> 768 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequences of TLE <400> 22 atggacagaa tggatttttc aataaagatc gccagaaaag tcggtctcta cctgatggaa 60 cactggggca atgcagaaaa tgttcggcaa aaaagctctt ttcaggacct ggtaagtgac 120 tgcgacaagc aagcacagaa aatgattgtt cagaagataa aagaccattt tccagatgac 180 gctattttag ccgaggaagg gctattcgaa aaaggagaca gaatgtggat aattgaccca 240 atagatggca caatgaacta cgtccatggt ctaccttctt ttgcgattgg aatcgcctac 300 gttgaaaaag agcaagttat ccttggcgta gcacacgatc cagttctcaa cgagacatac 360 tatgcaatca aagggcaggg tgcgtataaa aatggggaaa gaataaatgt ttcagaaaat 420 tcgcttttga aagactctat tggaaatact ggcttttata cagattttac agggatcttc 480 atcagcgcaa tcgaaaagaa agtcaggcgg gtgagaatga caggcagtgc tatacttgct 540 ggcgcttatg ttgcctgtgg aaggtttgat ttctttatag caaaaagagc caattcttgg 600 gatgtagctc ctttattcgt cctcgtccca gaagctggtg gaatcgtaac ggacctgtcc 660 ggaaaccagg cacatctcaa caccggtaat tttcttttca gtaacggtct attacacgat 720 caggtcttag aagtcataag agaggtgaat aaaaaagtaa gaaaatga 768 <210> 23 <211> 777 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequences of MRUB <400> 23 atggacttgc gtgcctatct gcaaaccgcc ctcgacgccg cctatttagc caaaggcatc 60 caccagtact accaggaaaa aggctttacc cagagcacca agtccacccc caccgatcta 120 gtcacccagg ccgaccacga gtcggaggcg gccatccgag aactcattgc ttcgcgccac 180 cccgaccacg tggtgctggg cgaggaacaa ggccaggaca aagagggggc cttccgctgg 240 attgtagacc ccctggacgg caccgtaaac tacgcccatg gcttcccttt ttatgcggtg 300 agcatcggcc tggaagccca cggcgaggtg gtgctggggg tggttctgga taccgcccgg 360 ggcgagctat ttaccgctac caaggggggc ggggcctacc tgaatggtcg tcccattcgg 420 gtatccaccc gttcaaccct ggtgggcagc cttctagcca ccggattccc ctacgatgtg 480 agcaaggaca ccgaaaacct ggtctacttt cagcgggccc tgaccaaggg gctcatggtg 540 cggcgaccgg gcgcggcagc cctcgacctg gcttatgtgg ccgctgggcg cctggacggc 600 ttctgggaag tgaagctcaa cccctgggat gtggccgcgg gctggctcat cgttagcgag 660 gccggagggc ggataaccgg ccttcaaggg gaggattacc ggctgggcaa ccgctaccta 720 gtggcctcca acggcctgat ccacgggccg ctgctggaca ccatccacgg gcgatag 777 <210> 24 <211> 798 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequences of DTU <400> 24 atgaagagaa tacttgaagt agctataaaa acaattaaag aatctggtaa tatacttttg 60 aactacatag gcgaggaaaa agaaatagaa cttaaaggaa tttccaattt agtcactcaa 120 gtagataaac tctcagaaag acatatacta aaatccatag aagaaaattt tccggatcat 180 tcaatcttga cagaagaaac aggctttata aataaaaatt ctgaatatac ctggattgta 240 gatcccttag atggaaccac aaattatgcc cataatttcc ctttttttgg aattagtatt 300 gccctcataa aaaataaaga aataatactt ggattaatct atgatcccat aagagacgag 360 ttattttatg ccataaaaaa tgaaggtgca tacctaaatg ataggagaat agaggtatca 420 aaaacagaaa gtcttgaaaa ttctctcatt agttttgcct ttccttacga attaagtctt 480 gaggagaaaa attttattcc ttttataaat ttttcctcta gaactcatgg tataagaagg 540 acaggttcgg cagcaataga aatagcctat gtagggtgtg gaagacttga tggattttgg 600 gcaaagaaac taaaaccatg ggatattagt gcaggcattc taatagtgga agaggcaaaa 660 ggtaaagtta cagattttag tggaaacaat attgatattc atacagacaa tattttgttt 720 tcaaacggta aaatacacca agagatgata aaaatcttaa atttaggtaa aatattcatt 780 agaaatgaaa aattttga 798 <210> 25 <211> 756 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequences of PFE <400> 25 atgctcggcg tcttggaggc cgtggcggtc cgcgcctcgc attttttaat ggagtacttc 60 agagccggca gaggcgtaga cgtcgtgtcg cgtaaagagg acgacgtcac cagggaggtg 120 gacatcgccg cggagacgct catatacaaa atgctcagag aggcctttaa agaaggcggc 180 gtcctatacg cagaggaagg cggcatctac aggtggggag acgagcgcta catcttcgtc 240 ctagacccac tcgacgggtc gctgaactac gccgtgggcg tgcccttctt cgccgtatct 300 atcgcggcag ggaaacatag agagggcacc ctggccgatt tagaatacgc cgtcgtggcg 360 atacccccca cgggagacgt ctacacggcg gcccccggcg tcggcgcccg caaaaacgga 420 aagccgttga ggaggacccc gaggagcaat atagtattcg tagcggtgag caacagcttc 480 cccccaaaga cctgcgaagt cgtgaggcgg ctggggctca gggggaggag cctcggcagc 540 tccgccgccg agctggcgta cacggtggaa ggcatagccc gcggcttcct agacctccgg 600 ggcaagctca gactgctcga cgtggcgggg gcattgacga taggcaaata cgtagacggc 660 ttccggtacg tggtgatggg cgacaccaag ccgcactcca aggtgtctct agtggcgggc 720 gacgtagatt tcgtaaatgc cgcaaccaca gattga 756 <210> 26 <211> 774 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequences of TWI <400> 26 atgaaagatg agaaaggaat tgtagtagat attataaaaa aagcaggaga gattcttcaa 60 gatgggtgga ataaaaaaaa ttttaaaatt tatcggaaag gaacaattaa tttagttaca 120 gaaatagata agaaaattga atttcttata atacaacttt taaaacaata ttttcctgat 180 tatggtattc ttacagaaga aagcaaagaa attaacagca aagcaaacgt gcgatggatt 240 atagatcccc tagatggtac tactaattat ataaaacaat atccgtttgt agccatatca 300 attgctttag agaaagaagg agaattaatt ttgggagttg tttataatcc gattttaaat 360 gaaatgttta tagctcaaaa aggatgtggt gcgacttata atgggaagtc aattcatgtt 420 tctaaaataa aagaattggg atcggcagtt ctagcatcgg gctttcctta tgatgcgtgg 480 gaaaatcctg ataataatgc taaacaatgg aggcaatttc ttactcgtag tttatctctt 540 cgatgcgatg gatcagcagc tctcgatctt tgtagagtag cttgtggaca attggatggt 600 tattgggaaa agggaattag cccgtgggat gttgcagctg gtattgtaat attgcgcgaa 660 gcaggaggaa taattactga ttatttgggt gaggaaaatt tctttaaacg tggagaagtt 720 gttgctgcaa atcctgttct ccacgcacaa atgttgaaag ttttaaataa ttag 774 <210> 27 <211> 795 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequences of TTH <400> 27 atgatcggga ggcgccaccc ctactacccg tacctggagg cggccctgga ggcggcgagc 60 ctcgcccggg gcatccacct ctactacctg gaaaagggct tcaccgaggg gaccaagtcc 120 ggccccaccg acctggtgac ccaggcggac cgggaggcgg aagaggcggt gaagggcctc 180 ctcctctccc gcttccccga ggcggggttt ctgggggagg aagggggaag cgagggcggg 240 aaggccctcc gcttcatcgt ggacccgctg gacgggacgg tgaactacgc ccacggcttc 300 cccttcttcg ccgtatccat cgccctcgag gccgagggcg ccatccagat gggcgtggtg 360 atggacaccg cccgggggga ggtcttctac gccctgaggg gggaaggggc ctacctcaac 420 ggccgcccca tccgggtcac ggggcgggag agcctcgtgg ggagcctcct cgccacgggc 480 ttcccctacg acgtggccaa ggacccggaa aacctcacct actttgaacg ggccctgggc 540 aagggcctgc tcgtccgcag gcctggggcg gcggccctgg acctggccta cgtggccgcg 600 gggcggctgg agggcttctg ggaggtgaag ctgaacccct gggacgtggc ggcggggtgg 660 ctcctcgtgg aagaggcggg aggaagggtg acggacctcg aggggaaccc ctaccgcctg 720 ggcagccgct acatcctcgc caccaacggg cgggtccacg aggccctgcg ccggaccctc 780 ctgggcctgg actga 795 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ttgtaaaaga tttagttata agtcttgacg aaagtcttct aagatctttc 780 tctcttgctt tacagacggt ttaa 804 <210> 32 <211> 777 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequences of TTA <400> 32 atgctagaac tgctaaagga tacagcaaaa aaagcaggac gactgctaaa aataagattc 60 ttggaacttt tgaacggcat ggaaaccgag gtaagagaaa agggaaaaag cgattttgta 120 acaagggtag atgttgaagt ggaaaactac ataaaggaac tgcttgctaa cacaaatata 180 tcggtggtgg gagaagaaag ctttaaaggc gagataccgg gcacctgcat cttcatagac 240 cccatagatg gcacaagaaa cttcatgaga aagaaccccc acttcgccat taaccttgct 300 tatcaggaga agggaaagct tttggctgga gtgacctatg accctatgaa gaatgaaatg 360 ttttctgctg catttagcaa aggtgcattt ttaaacggag agcgcatcta cgcttccaca 420 aacaaggata ttggcaaagc catcatcgct ataggacttc catacagagg aagagaactc 480 atagatattc aaaccaacct ttacaggaac atcttcctaa acggcgctgc tacccgccac 540 acaggctcag cagcccttga tctggcctac atatcctgcg gaagatacga tgctgctatc 600 tatttttatc tttccccctg ggacgtagct ccgggcatac tgctggtaga agaggcaggc 660 ggagaagttg aaggcaccat gggacgagaa cccatccagg ggtggataat agcatctaac 720 aaagtcatcc accccgaagt taaagacatc cttgaaggct ctttaaaagc ggtataa 777 <210> 33 <211> 765 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequences of PFU <400> 33 atgaagctta agttctggag ggaagtagcc attgacataa tctcagattt cgaaactaca 60 ataatgcctt tctttggaaa ccctgatggg ggaaagctcg taaagataag ccccagtgga 120 gatgagacaa agctggttga taagctcgcc gaggatttaa tactttcaag aatcacagag 180 cttggagtca acgttgtgag cgaggaagtt ggtgttattg ataacgagag tgaatacacc 240 gttatagtag acccactaga tggttcatat aacttcattg ctggaattcc tttttttgct 300 ttgagtctag cagtatttaa aaaagataag ccaatatatg caattatcta tgaacctatg 360 acagagagat tctttgaggg aatcccagga gagggagctt ttttaaatgg aaaaagaata 420 aaggtaagaa aaaccccgga cgagaagcca tcaataagct tttattctcg aggtaaaggc 480 catgaaatcg ttaaacatgt aaagagaact agaaccttag gggcaatcgc tctagaattg 540 gcatacctag ctatgggtgc attagatgga gtagttgatg tgaggaaata cgtaaggcca 600 acggacatag ctgctggaac gataattgca aaagaggcag gagcccttat taaggactcc 660 gcgggaaagg atatagatat ttcatttaat gcaactgata ggcttgatgt gatagccgtg 720 aacagcgaag agttgctaaa aacaatttta agcttactgg agtag 765 <210> 34 <211> 759 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequences of AFU <400> 34 atggatgaaa gggatgcgct gagaatttcg agggagattg caggagaggt cagaaaggcc 60 attgcgtcaa tgcccttgag ggagagagta aaggacgtgg gaatggggaa ggatggcact 120 ccaaccaagg cagccgacag agttgcggaa gatgctgcgc ttgaaatttt gagaaaggag 180 agggttacgg tggttacaga ggagtcggga gttttggggg agggagatgt ctttgttgcc 240 ctcgaccccc tcgatggaac cttcaatgct acgagaggga ttccagttta ttcagtcagc 300 ctctgcttct cctattcgga taaactgaaa gacgccttct ttggctacgt ttacaacctc 360 gcaacagggg atgaatacta cgcggactcc agcggggctt acagaaacgg ggagaggatt 420 gaggtgagcg atgctgagga gctttactgc aacgccataa tctactatcc cgacaggaag 480 tttcccttta agaggatgag gatttttgga agtgctgcaa cggagctttg cttctttgct 540 gacggctcct ttgactgctt cctcgacatc cgccccggaa agatgcttag aatctacgat 600 gccgctgcgg gtgtttttat tgcagaaaag gcaggaggaa aggttaccga acttgatgga 660 gaaagcttgg ggaataaaaa atttgatatg caggaaaggc tcaatatcgt cgccgcaaat 720 gaaaaactcc atccaaagct gctggagctg attaaatga 759 <210> 35 <211> 798 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequences of AAC <400> 35 atggacaagg catggctcga tggcctggcg gaggtcgtgc gggaggctgg ccgcctggtg 60 gaggagatcg ccaggcaggg cttcgatacg caattcaagc atccggaaga gaggcgagat 120 ccggtcacga cagccgatct cgcctgtgac gcgtttctga aagagcggct gctcacgctg 180 cttccggagg cgggctggct gtccgaggag acgaaggatc ggccggatcg attggagaaa 240 aggtgggtgt ggatcgtcga tcccatcgac ggcacgcggg agttcgtccg ccgcattccc 300 gagtacgcca tctcggtggc gctcgcgcgg gacggcgagc cggtggcggg cgcggtggtg 360 aatcccgcga cgggggatct gtttctcggc gccgtgggcg tcggcgcatg gcggaatgga 420 acgcccatgg tttgttcccg catccgcggc gagcggctca cgattctcgg cagccggtcg 480 gagatgaacc gcggcgagtt cgagccgttt gccggcattc tcgaggtccg ggcggtgggc 540 tccatcgcgt ataagctcgc gctcgtcgcg gcgggcgagg cggatggcac gttcagcctc 600 ggcccgaaac acgagtggga tatcgcggcc ggcgtcgcgc tcgtcctggc ggcgggcggc 660 cgggtacacg atggcgccgg gcgcccgttt cgcttcaacc agccgcacac gctcacccgt 720 ggcatcgtcg cggccacgcg cgaggcgtat ggcgatctcg ccctgctcat cgagcggcac 780 gccccacggc gcgcctag 798 <210> 36 <211> 777 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequences of MSI <400> 36 atggacttgc aacgctactt ggaagccgca ctcgatgctg cgtacttggc tcgaggcatc 60 cacctctact accgcgaaaa aggcttcgcc ctggagagca aaaccagtcc caccgacttg 120 gtcacccaag ccgaccggga gagcgaagaa gctatccgga gtttactgct cgagcgcttc 180 cccgatcatg tggtgctggg tgaagaaggt gggcaggaag gccacagcga ttttcgctgg 240 atcgtggacc cgctcgacgg cacggtcaac tacgcccacg gcttcccctt ctacgcggta 300 agcatcgccc tcgaggtggg gggcgaggtc gtggtggggg cagtgctgga caccgcacgg 360 ggcgagctgt ttaccgccct caaaggagag ggagcattcc aaaatggacg ccccattcgc 420 gtttcgagca ccgcgaccct catcggaagc ctgctggcaa ccggcttccc ctacgatgtg 480 gccaaggacg ccgagaacct gacctacttc cagcgggctc ttgccaaagg ccttaccgtg 540 cgccgccccg gagccgccgc gctggatttg gcttacgtgg cggcagggcg gctggagggt 600 ttctgggagg tcaagctcaa cccctgggac gtggccgcgg gctggctcct catcaccgag 660 gcgggcggaa ccgtgagcgg catccagggc gagccttacc ggctaggaaa ccgctacttg 720 gtagccagca acgggaagat tcatgagcag ctcctcgaca cgctccacgg gcgatga 777 <210> 37 <211> 777 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequences of MRUF <400> 37 atggatctgc gtccctacct cgaggccgct ctcgatgcgg cctacctagc caaaggcatt 60 caccagtact accaggaaaa aggcttcacc cacagcacca aatctacccc taccgatgtg 120 gtcacccagg ccgaccacga ggccgaggca gccatccggg ctcttatcgc cgagcgcttc 180 cccgaccacg tggtgttagg cgaggagcag ggccaggaag gggagggcga gtttcgctgg 240 attgtagacc ccttggatgg cacggtgaac tacgcccacg gctttccctt ctatggggtg 300 agcatcgggc tggaggtacg aggagaggtg gtgttggggg tggtgctgga taccgcccgg 360 ggcgatctct tcaccgctac caaaggcggc ggggcctacc tgaatggccg cccgctgcgg 420 gtttcccagc gaaccacttt ggtgggcagt ctgctggcta ccggttttcc ctacgatgtg 480 gcacgagacc cggagaacct cacctacttc cagcgggctt tggccaaggg gctgaccgtg 540 cggcggcccg gggcagcggc cctcgacctg gccaatgtgg ccgcgggccg gctggacggt 600 ttctgggagg ttaagctcaa cccctgggat gtggctgcgg gctggctcct catcaccgag 660 gcaggcggcc aggtcaccgg gttccagggc gaggcctacc gcctgggtaa ccgctattta 720 gtggcctcca atgggcggat tcaccaggcg ctgctcgagg cccttcaggg ccgatag 777 <210> 38 <211> 777 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequences of MTA <400> 38 atggacttgc gtgcctacct gcaaaccgcc ctcgacgccg cctatttagc caaaggcatc 60 caccagtact accaggaaaa aggctttacc cagagcagca agtccacccc caccgatctg 120 gtcacccagg ccgaccacga gtcggaggcg gccatccgag aactcatcgc cgcgcgccac 180 cccgaccacg tggtgctggg cgaggagcag ggccaggaca aagaaggggc cttccgctgg 240 attgtagacc ccctggacgg caccgtaaac tacgcccatg gttttccttt ttatgcggtg 300 agcattggcc tggaagccca cggcgaggtg gtgctggggg tggttctgga taccgctcga 360 ggcgagctgt ttaccgctac caaagggggt ggggcttacc tgaacggtcg tcccatccgg 420 gtttccactc gttcaaccct ggtgggcagc ctcctggcca ccggatttcc ctacgacgta 480 agcaaggata ccgaaaacct gacctacttc cagcgggcat tgaccaaagg gctcatggta 540 cggcgccccg gcgcggcggc cctcgacctg gcctatgtgg ccgccgggcg cctggacggc 600 ttctgggagg tgaagctgaa cccctgggac gtggccgcgg gctggctcat cgtcagtgag 660 gcgggggggc gggtaagcgg ccttcagggc gaggattacc ggctgggcaa ccgctacctg 720 gtggcctcca acggcctaat tcatcagccc ttgctggaca ccctccacgg gcgatag 777 <210> 39 <211> 777 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequences of MCH <400> 39 atggacctgc gccccttcct cgagaccgcg ctcgccgcgg cttacgtggc tcgaggcatc 60 caccagctct accaggacaa aggcttcacc cagagcacca agtccacccc caccgacgtc 120 gtgacccaag ccgacaagga ggccgaggcc gccatccgcg ccctcatcga gcagcggcac 180 cccggccacg tggtgctcgg cgaggaggag ggccagcagg gcgagggcga gtaccgctgg 240 atcgtggacc cgctcgacgg caccgtgaat tacgcccacg gcttcccctt ctactgcgtg 300 agcatcgggc tcgaggtgcg cggcgaggtg atggtgggcg tggtgctcga caccgcccgc 360 ggcgacctct tcaccgcgac ccgcggcggc ggggcctact tcaacgggcg gcccatgcgg 420 gtctcgcggt cgcccaagct gctgggcagc ctcatcgcca ccggcttccc ctacgacgtc 480 gcccgcgacc gcgaaaacct gacctacctc gagcgcgtcc tcttcaaggg catcaccgtg 540 cgccgccccg gcgccgccgc cctcgacctc gcctacgtgg cctgcgggcg gctcgacggc 600 ttctgggagg tcaagctcaa cccctgggac gtggcggcgg gctggctgct ggtcgaggag 660 gcgggcggca ggatcaccgg catccacggc gagccctacc gcatgggcaa ccgctacctc 720 atggcctcca acggccacat ccacgaggaa ttgctggcga cgatccacgg ccggtag 777 <210> 40 <211> 777 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequences of MCE <400> 40 atggacttgc gtgtatacct gcagaccgcc ctcgatgcag cctatctggc caaaggcatt 60 caccagtact accaggagaa gggttttacc ctaagcagca agtccacccc cacagacctg 120 gttactcagg ccgaccacga gtcggaagcg gccatccgag aactcattgc cgcgcgccac 180 cccgaccacg tggtgctggg agaggagcag ggccaggaca gagaaggggc ttttcgctgg 240 attgtagacc ccctggatgg caccgtaaac tacgcccacg gttttccctt ttatgcggtg 300 agtatcggcc tcgaggccca cggcgaggtg gtgctgggag tgattctcga taccgcccgg 360 ggcgacctat tcaccgctac caaggggggc ggggccttca tgaatggccg ccccatccgg 420 gtttcccctc gagccaccct ggtgggaagc ctgctggcca ccggcttccc ctatgacgtt 480 agcaaagaca ccgaaaacct ggtctacttc cagcgggccc tgaccagagg gcttatggtg 540 cggcgtcccg gcgctgccgc cctcgacctg gcctacgtgg ccgccgggcg tctggatggt 600 ttctgggagg tgaagctcaa 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sequence of Mrub <400> 46 ttctgcctcg agtcgcccgt ggatg 25 <210> 47 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer DNA sequence of Dtu <400> 47 taagctcata tgaagagaat acttgaagta gcta 34 <210> 48 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer DNA sequence of Dtu <400> 48 acaaaagact cgagaaattt ttcatttcta atga 34 <210> 49 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer DNA sequence of Msi <400> 49 atatacatat ggacttgcaa cgctacttgg aagc 34 <210> 50 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer DNA sequence of Msi <400> 50 tggtggtcga ctcgcccgtg gagcgtgtcg a 31 <210> 51 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer DNA sequence of Mruf <400> 51 atatacatat ggatctgcgt ccctacctcg aggc 34 <210> 52 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer DNA sequence of Mruf <400> 52 tggtggtcga ctcggccctg aagggcctcg 30 <210> 53 <211> 34 <212> DNA <213> 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Amino acid sequences of CT2 <400> 61 Met Ile Gly Tyr Gln Ile Tyr Val Arg Ser Phe Arg Asp Gly Asn Phe 1 5 10 15 Asp Gly Val Gly Asp Phe Lys Gly Leu Lys Gly Ala Ile Ser Tyr Leu 20 25 30 Lys Glu Leu Gly Val Asp Phe Val Trp Leu Met Pro Val Phe Ser Ser 35 40 45 Ile Ser Phe His Gly Tyr Asp Val Val Asp Phe Tyr Ser Phe Lys Ala 50 55 60 Glu Tyr Gly Asp Glu Lys Asp Phe Arg Glu Met Ile Glu Ala Phe His 65 70 75 80 Asp Asn Gly Ile Lys Val Val Leu Asp Leu Pro Ile His His Thr Gly 85 90 95 Phe Leu His Val Trp Phe Gln Lys Ala Leu Lys Gly Asp Pro His Tyr 100 105 110 Arg Asp Tyr Tyr Val Trp Ala Ser Glu Lys Thr Asp Leu Asp Glu Arg 115 120 125 Arg Glu Trp Asp Asn Glu Arg Ile Trp His Pro Leu Glu Asp Gly Arg 130 135 140 Phe Tyr Arg Gly Leu Phe Gly Pro Leu Ser Pro Asp Leu Asn Tyr Asp 145 150 155 160 Asn Pro Gln Val Phe Glu Glu Met Lys Lys Val Val Tyr His Leu Leu 165 170 175 Glu Met Gly Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Ala Ala Lys His Met Arg 180 185 190 Asp Thr Leu Glu Gln Asn Val Arg Phe Trp Arg Tyr Phe Leu Ser Asp 195 200 205 Ile Glu Gly Ile Phe Leu Ala Glu Ile Trp Ala Glu Ser Lys Val Val 210 215 220 Asp Glu His Gly Arg Ile Phe Gly Tyr Met Leu Asn Phe Asp Thr Ser 225 230 235 240 His Cys Ile Lys Glu Ala Val Trp Lys Glu Asn Phe Lys Val Leu Ile 245 250 255 Glu Ser Ile Glu Arg Ala Leu Val Gly Lys Asp Tyr Leu Pro Val Asn 260 265 270 Phe Thr Ser Asn His Asp Met Ser Arg Leu Ala Ser Phe Glu Gly Gly 275 280 285 Leu Ser Glu Glu Lys Val Lys Leu Ser Leu Ser Ile Leu Phe Thr Leu 290 295 300 Pro Gly Val Pro Leu Ile Phe Tyr Gly Asp Glu Leu Gly Met Lys Gly 305 310 315 320 Ile Tyr Arg Lys Pro Asn Thr Glu Val Val Leu Asp Pro Phe Pro Trp 325 330 335 Ser Glu Asn Met Cys Val Glu Gly Gln Thr Phe Trp Lys Trp Pro Ala 340 345 350 Tyr Asn Asp Pro Phe Ser Gly Val Ser Val Glu Tyr Gln Arg Arg Asn 355 360 365 Arg Asp Ser Ile Leu Ser His Thr Met Arg Trp Ala Gly Phe Arg Gly 370 375 380 Glu Asn His Trp Leu Asp Arg Ala Asn Ile Glu Phe Leu Cys Lys Glu 385 390 395 400 Glu Lys Leu Leu Val Tyr Arg Leu Val Asp Glu Gly Arg Ser Leu Lys 405 410 415 Val Ile His Asn Leu Ser Asn Gly Glu Met Val Phe Glu Gly Val Arg 420 425 430 Val Gln Pro Tyr Ser Thr Glu Val Val 435 440 <210> 62 <211> 1326 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequences of CT2 <400> 62 atgataggct accagatcta cgtgagatca ttcagggatg gaaacttcga tggtgtgggg 60 gatttcaaag gattgaaagg tgcgatttcc tacctgaaag aactgggtgt tgattttgtc 120 tggctcatgc ccgtcttttc ctccatttcc ttccacgggt atgacgtggt ggatttttat 180 tctttcaaag ccgagtacgg agacgagaaa gactttagag agatgatcga ggcgttccac 240 gacaacggta taaaagtcgt tctcgatctt cccatccatc atactggttt cctccatgtg 300 tggtttcaga aagccctgaa aggagatcca cactacaggg attattacgt atgggcgagt 360 gaaaaaacgg atctggacga aagaagagag tgggacaacg aaaggatctg gcatcctctg 420 gaggacggaa ggttctacag aggacttttc ggtcccctct cacccgatct gaactacgat 480 aacccgcagg tttttgaaga gatgaagaag gtggtttatc accttcttga aatgggagtg 540 gacggattca gattcgacgc agcaaagcac atgagagata ctctggaaca gaacgttcgc 600 ttttggaggt atttcctctc cgatattgag ggaatattcc ttgcggaaat ctgggcagaa 660 tccaaagttg tggatgaaca cggcaggata ttcggctaca tgctaaattt cgatacctca 720 cactgtatta aggaagcggt gtggaaggaa aacttcaaag tgttgatcga gtcgatcgaa 780 agggccctgg ttggaaaaga ttatctgccg gtgaacttca catcgaacca tgatatgtca 840 aggcttgcga gtttcgaagg agggttgagt gaagagaagg tgaaactctc actttccatt 900 ctgttcacgc ttcccggggt tcctctcata ttctacggag acgaactggg aatgaaagga 960 atctatcgaa aaccgaacac ggaagtcgtg ctggatccgt tcccctggag cgaaaacatg 1020 tgtgttgaag gccagacatt ttggaaatgg cccgcgtata acgatccatt ctccggtgtt 1080 tctgttgagt atcagaggag aaatcgtgat tcgattctct cacacacgat gaggtgggca 1140 ggattcagag gggaaaatca ctggctggac agggcaaaca tcgaatttct gtgcaaagaa 1200 gaaaaactgc tcgtgtacag actggtcgat gaagggcgtt ctctgaaagt gatacacaac 1260 ctgtcgaatg gtgaaatggt gtttgaggga gtgcgcgtac aaccctacag cacggaggtg 1320 gtttga 1326 <210> 63 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequences of TN1 <400> 63 Met Lys Lys Met Ala Leu Lys Phe Asp Phe Ser Asn Leu Phe Glu Pro 1 5 10 15 Asn Ile Ser Gly Gly Leu Arg Glu Glu Asp Leu Glu Ser Thr Lys Glu 20 25 30 Lys Val Ile Glu Ala Ile Lys Asn Phe Thr Glu Asn Thr Pro Asp Phe 35 40 45 Ala Arg Leu Asp Arg Lys Trp Ile Asp Ser Val Lys Glu Leu Glu Glu 50 55 60 Trp Val Val Asn Phe Asp Thr Val Val Val Leu Gly Ile Gly Gly Ser 65 70 75 80 Gly Leu Gly Asn Leu Ala Leu His Tyr Ser Leu Arg Pro Leu Asn Trp 85 90 95 Asn Glu Met Ser Arg Glu Glu Arg Asn Gly Tyr Ala Arg Val Phe Val 100 105 110 Val Asp Asn Val Asp Pro Asp Leu Met Ala Ser Val Leu Asp Arg Ile 115 120 125 Asp Leu Lys Thr Thr Leu Phe Asn Val Ile Ser Lys Ser Gly Ser Thr 130 135 140 Ala Glu Val Met Ala Asn Tyr Ser Ile Ala Arg Gly Ile Leu Glu Ala 145 150 155 160 Asn Gly Leu Asp Pro Lys Glu His Ile Leu Ile Thr Thr Asp Pro Glu 165 170 175 Lys Gly Phe Leu Arg Lys Val Val Lys Glu Glu Gly Phe Arg Ser Leu 180 185 190 Glu Val Pro Pro Gly Val Gly Gly Arg Phe Ser Val Leu Thr Pro Val 195 200 205 Gly Leu Phe Ser Ala Met Ala Glu Gly Ile Asp Ile Glu Glu Leu His 210 215 220 Asp Gly Ala Arg Asp Ala Phe Glu Arg Cys Lys Lys Glu Asp Leu Phe 225 230 235 240 Glu Asn Pro Ala Ala Met Ile Ala Leu Thr His Tyr Leu Tyr Leu Lys 245 250 255 Arg Gly Lys Ser Ile Ser Val Met Met Ala Tyr Ser Asn Arg Met Thr 260 265 270 Tyr Leu Val Asp Trp Tyr Arg Gln Leu Trp Ala Glu Ser Leu Gly Lys 275 280 285 Arg Tyr Asn Leu Lys Gly Glu Glu Val Phe Thr Gly Gln Thr Pro Val 290 295 300 Lys Ala Ile Gly Ala Thr Asp Gln His Ser Gln Ile Gln Leu Tyr Asn 305 310 315 320 Glu Gly Pro Asn Asp Lys Val Ile Thr Phe Leu Arg Leu Glu Asn Phe 325 330 335 Asp Arg Glu Ile Ile Ile Pro Asp Thr Gly Arg Glu Glu Leu Lys Tyr 340 345 350 Leu Ala Arg Lys Arg Leu Ser Glu Leu Leu Leu Ala Glu Gln Thr Gly 355 360 365 Thr Glu Glu Ala Leu Arg Lys Asn Asp Arg Pro Asn Met Lys Val Ile 370 375 380 Phe Asp Arg Leu Thr Ser Tyr Asn Val Gly Gln Phe Phe Ala Tyr Tyr 385 390 395 400 Glu Ala Ala Thr Ala Phe Met Gly Tyr Leu Leu Glu Ile Asn Pro Phe 405 410 415 Asp Gln Pro Gly Val Glu Leu Gly Lys Lys Ile Thr Phe Ala Leu Met 420 425 430 Gly Arg Glu Gly Tyr Glu Tyr Glu Ile Lys Asp Arg Thr Lys Lys Val 435 440 445 Ile Ile Glu 450 <210> 64 <211> 1356 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequences of TN1 <400> 64 atgaaaaaga tggctttgaa atttgatttt tcaaatcttt ttgaaccgaa catctccggt 60 ggactgagag aggaagatct ggaaagcaca aaagaaaagg tgatagaggc gataaagaat 120 ttcactgaga acacaccgga ttttgccaga ctggacagaa aatggatcga ttcggtgaag 180 gaactcgagg agtgggtggt gaacttcgac acggtggtcg ttctgggaat tgggggatcc 240 ggtcttggaa accttgccct tcattattcg ttgagaccac tgaactggaa cgagatgtcg 300 agagaggaaa gaaacggtta tgcgagagtc ttcgtggtgg acaacgtaga tcccgatctc 360 atggcctccg tccttgatag gatagatctg aagacaacgc tgttcaacgt gatctcaaaa 420 tctggatcca cggctgaggt tatggcgaat tactcgatcg caaggggaat cctggaggct 480 aatggtctgg acccgaaaga acacatcctc atcacaacag atccagagaa gggctttttg 540 agaaaagtag tgaaagaaga gggcttcaga agtcttgagg tccctcccgg cgttggagga 600 aggttcagcg tgctgacgcc cgttggcctc ttctctgcca tggcggaggg tatcgacata 660 gaagaactcc acgacggtgc ccgggatgcg ttcgagagat gcaagaagga agacctgttc 720 gaaaatccag cggcgatgat cgccctcaca cactatctct atctgaagag aggaaagagc 780 atctccgtca tgatggccta ctccaacagg atgacctacc tcgtggactg gtacagacag 840 ctgtgggcag aaagtctggg aaagagatac aacctgaaag gagaggaggt cttcacgggt 900 cagaccccgg tgaaggcaat aggagccacc gatcagcact ctcagataca gctttacaac 960 gagggcccaa acgacaaagt gataacgttt ttgcggttgg aaaacttcga tagagagatc 1020 ataataccgg acaccggaag agaagagctc aaataccttg caagaaaaag actctctgaa 1080 cttctccttg cagaacagac aggaacagag gaagccctaa ggaaaaacga cagaccgaac 1140 atgaaggtga tcttcgacag actcacctct tacaatgtgg gccagttctt cgcttattat 1200 gaagccgcaa ctgctttcat ggggtatctc ctcgagatca acccgtttga tcagccgggt 1260 gtggaacttg gaaagaagat cacgtttgcc ctcatgggaa gggaaggtta cgaatacgaa 1320 ataaaagatc gcaccaagaa ggtgatcata gaatga 1356 <210> 65 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequences of FP3E <400> 65 Met Met Val Lys Ile Ala Ala Ser Ile Leu Ala Cys Asp Leu Ala Arg 1 5 10 15 Leu Ala Asp Glu Val Lys Arg Val Glu Glu His Ile Asp Met Val His 20 25 30 Phe Asp Val Met Asp Gly His Phe Val Pro Asn Ile Ser Phe Gly Leu 35 40 45 Pro Val Leu Lys Ala Leu Arg Lys Glu Thr Ser Leu Pro Ile Ser Val 50 55 60 His Leu Met Ile Thr Asn Pro Glu Asp Tyr Val Asp Arg Phe Val Glu 65 70 75 80 Glu Gly Ala Asp Met Val Ala Val His Tyr Glu Thr Thr Pro His Leu 85 90 95 His Arg Ile Val His Arg Ile Lys Asp Leu Gly Ala Lys Ala Phe Val 100 105 110 Ala Leu Asn Pro His Thr Pro Val Phe Leu Leu Ser Glu Ile Ile Thr 115 120 125 Asp Val Asp Gly Val Leu Val Met Ser Val Asn Pro Gly Phe Ser Gly 130 135 140 Gln Arg Phe Ile Ala Arg Ser Leu Glu Lys Ile Arg Ser Leu Lys Lys 145 150 155 160 Met Ile Arg Asp Leu Gly Leu Glu Thr Glu Ile Met Val Asp Gly Gly 165 170 175 Val Asn Glu Glu Asn Ala Ser Ile Leu Ile Lys Asn Gly Ala Thr Ile 180 185 190 Leu Val Met Gly Tyr Gly Ile Phe Lys Asn Glu Asn Tyr Val Glu Leu 195 200 205 Val Arg Ser Ile Lys Gln Glu Arg Gly Glu Ser Ala Gly 210 215 220 <210> 66 <211> 666 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequences of FP3E <400> 66 atgatggtaa agatcgccgc ttcaatcctt gcgtgtgatc ttgcaagact cgccgatgag 60 gtaaaaaggg tggaagaaca catagacatg gttcacttcg atgtcatgga tggacacttc 120 gttccgaaca tctcgttcgg attgcccgtt ctcaaagccc tgagaaaaga aaccagcctt 180 cctataagtg ttcatctgat gatcacaaat ccagaggact atgtggaccg tttcgtggaa 240 gagggagcgg acatggtggc ggtccactac gagacaacgc cgcaccttca caggatagtg 300 cacaggataa aggatctcgg ggcgaaggcg ttcgtcgccc tcaacccaca cacaccggtt 360 tttctcctgt ctgagatcat aacggatgtg gatggcgtac tcgtgatgag tgtgaacccg 420 ggcttttctg gtcagagatt cattgcaagg agtctggaaa aaataaggag tctgaagaag 480 atgataaggg atctgggact cgaaacggag atcatggtcg atggtggtgt caacgaagaa 540 aacgcttcta tcttaataaa gaacggtgcg acgatccttg taatggggta cggtatcttc 600 aaaaacgaaa actatgtgga actggtgaga tccatcaagc aggaaagagg ggaatctgct 660 ggctga 666 <210> 67 <211> 441 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequences of TN2 <400> 67 Met Ile Gly Tyr Gln Ile Tyr Val Arg Ser Phe Arg Asp Gly Asn Phe 1 5 10 15 Asp Gly Val Gly Asp Phe Lys Gly Leu Lys Gly Ala Ile Ser Tyr Leu 20 25 30 Lys Glu Leu Gly Val Asp Phe Val Trp Leu Met Pro Val Phe Ser Ser 35 40 45 Ile Ser Phe His Gly Tyr Asp Val Val Asp Phe Tyr Ser Phe Lys Ala 50 55 60 Glu Tyr Gly Asp Glu Lys Asp Phe Arg Glu Met Ile Glu Ala Phe His 65 70 75 80 Asp Asn Gly Ile Lys Val Val Leu Asp Leu Pro Ile His His Thr Gly 85 90 95 Phe Leu His Val Trp Phe Gln Lys Ala Leu Lys Gly Asp Pro His Tyr 100 105 110 Arg Asp Tyr Tyr Val Trp Ala Ser Glu Lys Thr Asp Leu Asp Glu Arg 115 120 125 Arg Glu Trp Asp Asn Glu Arg Ile Trp His Pro Leu Glu Asp Gly Arg 130 135 140 Phe Tyr Arg Gly Leu Phe Gly Pro Leu Ser Pro Asp Leu Asn Tyr Asp 145 150 155 160 Asn Pro Gln Val Phe Glu Glu Met Lys Lys Val Val Tyr His Leu Leu 165 170 175 Glu Met Gly Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Ala Ala Lys His Met Arg 180 185 190 Asp Thr Leu Glu Gln Asn Val Arg Phe Trp Arg Tyr Phe Leu Ser Asp 195 200 205 Ile Glu Gly Ile Phe Leu Ala Glu Ile Trp Ala Glu Ser Lys Val Val 210 215 220 Asp Glu His Gly Arg Ile Phe Gly Tyr Met Leu Asn Phe Asp Thr Ser 225 230 235 240 His Cys Ile Lys Glu Ala Val Trp Lys Glu Asn Phe Lys Val Leu Ile 245 250 255 Glu Ser Ile Glu Arg Ala Leu Val Gly Lys Asp Tyr Leu Pro Val Asn 260 265 270 Phe Thr Ser Asn His Asp Met Ser Arg Leu Ala Ser Phe Glu Gly Gly 275 280 285 Leu Ser Glu Glu Lys Val Lys Leu Ser Leu Ser Ile Leu Phe Thr Leu 290 295 300 Pro Gly Val Pro Leu Ile Phe Tyr Gly Asp Glu Leu Gly Met Lys Gly 305 310 315 320 Ile Tyr Arg Lys Pro Asn Thr Glu Val Val Leu Asp Pro Phe Pro Trp 325 330 335 Ser Glu Asn Met Cys Val Glu Gly Gln Thr Phe Trp Lys Trp Pro Ala 340 345 350 Tyr Asn Asp Pro Phe Ser Gly Val Ser Val Glu Tyr Gln Arg Arg Asn 355 360 365 Arg Asp Ser Ile Leu Ser His Thr Met Arg Trp Ala Gly Phe Arg Gly 370 375 380 Glu Asn His Trp Leu Asp Arg Ala Asn Ile Glu Phe Leu Cys Lys Glu 385 390 395 400 Glu Lys Leu Leu Val Tyr Arg Leu Val Asp Glu Gly Arg Ser Leu Lys 405 410 415 Val Ile His Asn Leu Ser Asn Gly Glu Met Val Phe Glu Gly Val Arg 420 425 430 Val Gln Pro Tyr Ser Thr Glu Val Val 435 440 <210> 68 <211> 1326 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequences of TN2 <400> 68 atgataggct accagatcta cgtgagatca ttcagggatg gaaacttcga tggtgtgggg 60 gatttcaaag gattgaaagg tgcgatttcc tacctgaaag aactgggtgt tgattttgtc 120 tggctcatgc ccgtcttttc ctccatttcc ttccacgggt atgacgtggt ggatttttat 180 tctttcaaag ccgagtacgg agacgagaaa gactttagag agatgatcga ggcgttccac 240 gacaacggta taaaagtcgt tctcgatctt cccatccatc atactggttt cctccatgtg 300 tggtttcaga aagccctgaa aggagatcca cactacaggg attattacgt atgggcgagt 360 gaaaaaacgg atctggacga aagaagagag tgggacaacg aaaggatctg gcatcctctg 420 gaggacggaa ggttctacag aggacttttc ggtcccctct cacccgatct gaactacgat 480 aacccgcagg tttttgaaga gatgaagaag gtggtttatc accttcttga aatgggagtg 540 gacggattca gattcgacgc agcaaagcac atgagagata ctctggaaca gaacgttcgc 600 ttttggaggt atttcctctc cgatattgag ggaatattcc ttgcggaaat ctgggcagaa 660 tccaaagttg tggatgaaca cggcaggata ttcggctaca tgctaaattt cgatacctca 720 cactgtatta aggaagcggt gtggaaggaa aacttcaaag tgttgatcga gtcgatcgaa 780 agggccctgg ttggaaaaga ttatctgccg gtgaacttca catcgaacca tgatatgtca 840 aggcttgcga gtttcgaagg agggttgagt gaagagaagg tgaaactctc actttccatt 900 ctgttcacgc ttcccggggt tcctctcata ttctacggag acgaactggg aatgaaagga 960 atctatcgaa aaccgaacac ggaagtcgtg ctggatccgt tcccctggag cgaaaacatg 1020 tgtgttgaag gccagacatt ttggaaatgg cccgcgtata acgatccatt ctccggtgtt 1080 tctgttgagt atcagaggag aaatcgtgat tcgattctct cacacacgat gaggtgggca 1140 ggattcagag gggaaaatca ctggctggac agggcaaaca tcgaatttct gtgcaaagaa 1200 gaaaaactgc tcgtgtacag actggtcgat gaagggcgtt ctctgaaagt gatacacaac 1260 ctgtcgaatg gtgaaatggt gtttgaggga gtgcgcgtac aaccctacag cacggaggtg 1320 gtttga 1326 <210> 69 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer DNA sequence of ct1 <400> 69 aggagaaact catatgctga agaaactccc ggag 34 <210> 70 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer DNA sequence of ct1 <400> 70 agccccctcg agcccgagaa c 21 <210> 71 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer DNA sequence of ct2 <400> 71 aaagggcata tgatcctgtt tggaac 26 <210> 72 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer DNA sequence of ct2 <400> 72 ataccagtct cgagcagttt caggatc 27 <210> 73 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer DNA sequence of tn1 <400> 73 ttactgaggg catatgaaaa agatggcttt gaaa 34 <210> 74 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer DNA sequence of tn1 <400> 74 aagacgcgtc gacttctatg atcaccttct 30 <210> 75 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer DNA sequence of fp3e <400> 75 ggaacatatg atggtaaaga tcgccgcttc aatc 34 <210> 76 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer DNA sequence of fp3e <400> 76 catactcgag cttcccctct cctatct 27 <210> 77 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polyphospate-dependent glucokinase derived from Deinococcus geothermalis <400> 77 Met Leu Ala Ala Ser Asp Ser Ser Gln His Gly Gly Lys Ala Val Thr 1 5 10 15 Leu Ser Pro Met Ser Val Ile Leu Gly Ile Asp Ile Gly Gly Ser Gly 20 25 30 Ile Lys Gly Ala Pro Val Asp Thr Ala Thr Gly Lys Leu Val Ala Glu 35 40 45 Arg His Arg Ile Pro Thr Pro Glu Gly Ala His Pro Asp Ala Val Lys 50 55 60 Asp Val Val Val Glu Leu Val Arg His Phe Gly His Ala Gly Pro Val 65 70 75 80 Gly Ile Thr Phe Pro Gly Ile Val Gln His Gly His Thr Leu Ser Ala 85 90 95 Ala Asn Val Asp Lys Ala Trp Ile Gly Leu Asp Ala Asp Thr Leu Phe 100 105 110 Thr Glu Ala Thr Gly Arg Asp Val Thr Val Ile Asn Asp Ala Asp Ala 115 120 125 Ala Gly Leu Ala Glu Ala Arg Phe Gly Ala Gly Ala Gly Val Pro Gly 130 135 140 Glu Val Leu Leu Leu Thr Phe Gly Thr Gly Ile Gly Ser Ala Leu Ile 145 150 155 160 Tyr Asn Gly Val Leu Val Pro Asn Thr Glu Phe Gly His Leu Tyr Leu 165 170 175 Lys Gly Asp Lys His Ala Glu Thr Trp Ala Ser Asp Arg Ala Arg Glu 180 185 190 Gln Gly Asp Leu Asn Trp Lys Gln Trp Ala Lys Arg Val Ser Arg Tyr 195 200 205 Leu Gln Tyr Leu Glu Gly Leu Phe Ser Pro Asp Leu Phe Ile Ile Gly 210 215 220 Gly Gly Val Ser Lys Lys Ala Asp Lys Trp Gln Pro His Val Ala Thr 225 230 235 240 Thr Arg Thr Arg Leu Val Pro Ala Ala Leu Gln Asn Glu Ala Gly Ile 245 250 255 Val Gly Ala Ala Met Val Ala Ala Gln Arg Ser Gln Gly Asp 260 265 270 <210> 78 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polyphospate-dependent glucokinase derived from Anaerolinea thermophila <400> 78 Met Gly Arg Gln Gly Met Glu Ile Leu Gly Ile Asp Ile Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Ile Lys Gly Ala Pro Val Asp Val Glu Thr Gly Gln Leu Thr Ala 20 25 30 Glu Arg Tyr Arg Leu Pro Thr Pro Glu Asn Ala Leu Pro Glu Glu Val 35 40 45 Ala Leu Val Val Ala Gln Ile Val Glu His Phe Gln Trp Lys Gly Arg 50 55 60 Val Gly Ala Gly Phe Pro Ala Ala Ile Lys His Gly Val Ala Gln Thr 65 70 75 80 Ala Ala Asn Ile His Pro Thr Trp Ile Gly Leu His Ala Gly Asn Leu 85 90 95 Phe Ser Glu Lys Cys Gly Cys Pro Val Ser Val Leu Asn Asp Ala Asp 100 105 110 Ala Ala Gly Leu Ala Glu Met Ile Phe Gly Ala Gly Lys Gly Gln Lys 115 120 125 Gly Val Val Leu Met Ile Thr Ile Gly Thr Gly Ile Gly Thr Ala Leu 130 135 140 Phe Thr Asp Gly Ile Leu Val Pro Asn Thr Glu Leu Gly His Ile Glu 145 150 155 160 Ile Arg Gly Lys Asp Ala Glu Gln Arg Ser Ser Glu Ala Ala Arg Gln 165 170 175 Arg Lys Asp Trp Thr Trp Gln Gln Trp Ala Lys Arg Leu Asn Glu His 180 185 190 Leu Glu Arg Leu Glu Ala Leu Phe Trp Pro Asp Leu Phe Ile Leu Gly 195 200 205 Gly Gly Ala Val Lys Asn His Glu Lys Phe Phe Pro Tyr Leu Lys Leu 210 215 220 Arg Thr Pro Phe Val Ala Ala Lys Leu Gly Asn Leu Ala Gly Ile Val 225 230 235 240 Gly Ala Ala Trp Tyr Ala His Thr Gln Glu Thr Gln Ala 245 250

Claims (19)

  1. Xa1-Xa2-Xa3-DPLDG-Xa4의 아미노산 서열을 갖는 모티프 A; 및
    Ya1-D-Ya2-Wa1-Ya3-Wa2-Ya4-Wa3의 아미노산 서열을 갖는 모티프 B를 포함하는 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소로,
    상기 모티프 A에서, Xa1는 W, F, V, I, 또는 A이고, Xa2는 I, F, V, A, 또는 없음이고, Xa3는 V, I, 또는 L이고, Xa4 는 T 또는 S이고,
    상기 모티프 B에서, Ya1는 W, Y, T, L, 또는 V이고, Ya2는 V, I, C, F, 또는 A이고, Wa1은 AAG, AAS, SAG, APG, APF, AGG, APL, 또는 AGA이고, Ya3은 W, I, P, M, V, Y, F, R, L, T, 또는 S이고, Wa2는 LLV, LIV, LLI, LII, ILI, FIA, ALV, IIA, VLV, VIL, TIG, NFC 또는 PIF이고, Ya4는 E, R, S, T, L, K, 또는 P이고, Wa3은 EAGG, EGGG, EAKG, KAGG, AAGG, YVDG, EAGA, 또는 RLGV인 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소.
  2. 제1항에 있어서, 상기 모티프 A에서, Xa1는 W 또는 F이고, Xa2는 I 또는 V이고, Xa3는 V, 또는 I이고, Xa4 는 T이고, 상기 모티프 B에서, Ya1는 W이고, Ya2는 V, 또는 I이고, Wa1은 AAG 이고, Ya3은 W, I, 또는 V이고, Wa2는 LLV, LIV, LII 또는 LLI 이고, Ya4는 E, R, 또는 S이고, Wa3은 EAGG, 또는 EGGG인 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소.
  3. 제1항에 있어서, 상기 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19,서열번호 20의 아미노산 또는 이와 상기 모티프 A 및 상기 모티프 B를 이외의 부분에서 85% 이상의 상동성을 갖는 서열을 포함하는 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소(psicose-6-phosphate phosphatase).
  4. 제3항에 있어서, 상기 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19 또는 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 싸이코스-6-인산 탈인산 효소는 각각 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39 또는 서열번호 40의 뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화되는 것인, 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항의 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소를 암호화하는 핵산.
  6. 제5항의 핵산을 포함하는 형질전환체.
  7. 이노시톨-모노-포스파타아제(inositol-mono-phosphatase), 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 싸이코스 생산용 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 이노시톨-모노-포스파타아제는 제1항 내지 제4항의 중 어느 하나의 항의 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소인, 싸이코스 생산용 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 싸이코스 생산용 조성물은,
    (a) (i) 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합; (ii) 포스페이트(phosphate); (iii) 과당-6-인산-3-에피머화 효소; (iv) 포도당-6-인산-이성화효소; (v) 포스포글루코무타아제 또는 포도당 인산화 효소; 및
    (vi) α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, α-아밀라아제, 풀루란아제, 이소아밀라아제, 글루코아밀라아제 또는 수크라아제; 또는
    (b) 상기 항목 (a)의 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 추가적으로 포함하는, 싸이코스 생산용 조성물.
  10. 싸이코스-6-인산에 제1항 내지 제4항의 효소 또는 이노시톨-모노-포스파타아제, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜 상기 싸이코스-6-인산을 싸이코스로 전환하는 단계를 포함하는 싸이코스 제조방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 이노시톨-모노-포스파타아제는 제1항 내지 제4항의 효중 어느 하나의 항에 따른 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소인, 싸이코스 제조방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 방법은 싸이코스-6-인산을 싸이코스로 전환하는 단계 이전, 과당-6-인산(fructose-6-phosphate)에 과당-6-인산-3-에피머화 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 과당-6-인산을 싸이코스-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함하는, 싸이코스 제조방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 방법은 상기 과당-6-인산을 싸이코스-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당-6-인산(Glucose-6-phosphate)에 포도당-6-인산-이성화효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함하는, 싸이코스 제조방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 방법은 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당-1-인산(Glucose-1-phosphate)에 포스포글루코무타아제, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함하는, 싸이코스 제조방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 방법은 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당(Glucose)에 포도당 인산화 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물, 및 포스페이트를 접촉시켜, 상기 포도당을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함하는, 싸이코스 제조방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 방법은 상기 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제 또는 수크로오스 포스포릴라아제; 이를 발현하는 미생물; 또는 상기 미생물의 배양물, 및 포스페이트를 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합을 포도당-1-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함하는, 싸이코스 제조방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 방법은 상기 포도당을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제; 이를 발현하는 미생물; 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합을 포도당으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함하는, 싸이코스 제조방법.
  18. 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합, 및 포스페이트에 (a) 제1항의 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소; 과당-6-인산-3-에피머화효소; 포도당-6-인산-이성화효소; 포스포글루코무타아제 또는 포도당 인산화 효소; 및 α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, α-아밀라아제, 풀루란아제, 이소아밀라아제, 글루코아밀라아제 또는 수크라아제; 또는 (b) 상기 항목 (a)의 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시키는 단계를 포함하는, 싸이코스 제조방법.
  19. 제10항 및 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉은 pH 5.0 내지 9.0, 40℃ 내지 80℃ 온도, 및/또는 2시간 내지 24 시간 동안 실시하는, 싸이코스 제조방법.
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