WO2019027173A2 - 신규한 싸이코스-6-인산 탈인산효소, 상기 효소를 포함하는 사이코스 생산용 조성물, 상기 효소를 이용하여 사이코스를 제조하는 방법 - Google Patents

신규한 싸이코스-6-인산 탈인산효소, 상기 효소를 포함하는 사이코스 생산용 조성물, 상기 효소를 이용하여 사이코스를 제조하는 방법 Download PDF

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    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01026—Beta-fructofuranosidase (3.2.1.26), i.e. invertase
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    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01041—Pullulanase (3.2.1.41)

Definitions

  • the present invention relates to a novel cuc-6-phosphate diphosphate, a composition for producing cucus containing the enzyme, and a method for producing cucosis using the enzyme.
  • D-psicose-3-epimerase EC 5.1.3.30
  • tagatose-3-epimerase EC 5.1.3.31
  • the present inventors have made an effort to develop a method that can increase the conversion rate of psicosyl, both economically and industrially.
  • sucrose or starch e.g., maltodextrin
  • ciccos-6-phosphate which is an economical raw material
  • 6-phosphate phosphatase 6-phosphate phosphatase
  • One object of the present application is to provide novel cis-6-phosphate dephosphate enzymes comprising motif A and motif B.
  • Another object of the present invention is to provide a nucleic acid encoding the cytosine-6-phosphate dephosphate as described herein, and a transformant comprising the nucleic acid.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for producing corycos, comprising an inositol-mono-phosphatase, a microorganism expressing the same, or a culture of the microorganism.
  • Still another object of the present application is to provide a method for producing a microorganism which comprises the step of converting inositol-mono-phosphatase, a microorganism expressing the same, or a culture of the microorganism into a cytokine- And to provide a method for producing a cucosis.
  • X a1 is W, F, V, I, or A is
  • X a2 is I, F, V, and A, or absent
  • X a3 is V, I, or L
  • X a4 is T Or S
  • Y a1 is W, Y, T, L or V
  • Y a2 is V, I, C, F or A
  • W a1 is AAG, AAS, SAG, APG, APF, AGG, APL, or AGA
  • Y a3 is W, I, P, M, V, Y, F, R, and L, T, or S
  • W a2 is LLV, LIV, LLI, LII, ILI, FIA, ALV, IIA, and VLV, VIL, TIG, NFC or PIF
  • Y a4 is E, R, S, T, L, K, or P
  • W a3 is EAGG, EGGG, EAKG, KAGG, AAGG, YVDG, EAGA, or RLGV.
  • X a1 is W or F
  • X a2 is I or V
  • X a3 is V or I
  • X a4 is T
  • Y a1 is W and Y and a2 is V, or I
  • W a1 is AAG and
  • Y a3 is W
  • I, or V is
  • W a2 is LLV, LIV, LII or LLI
  • Y a4 is E, R, or S
  • W a3 May be EAGG, or EGGG.
  • One or more amino acids may be contained between the motif A and the motif B, at the end of the motif A, or at the end of the motif B, and the amino acid sequences other than the motif A and the motif B may include known inositol-mono-phosphatase (For example, sequences other than motif A and motif B in the sequence of SEQ ID NOS: 1 to 20).
  • the motif A and / or motif B is an active site in the sequence of inositol-mono-phosphatase and is known as the binding site of inositol phosphate, which is the substrate of the enzyme (see Federation of European Biochemical Societies, Volume 294, number 1,2, 16-18, December 1991).
  • inositol-mono-phosphatase exhibits activity as a cytokine-6-phosphate dephosphate
  • the cytosine-6-phosphate dephosphate enzyme may be a psicose-6-phosphate phosphatase including the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 20 in the specific example.
  • the cytosine-6-phosphate dephosphate enzyme of the present application may be an enzyme known to function as a conventional inositol-monophosphatase enzyme.
  • the cytokine-6-phosphate dephosphorylase of the present application selectively dephosphorylates the cytokine-6-phosphate, and the glucose-1-phosphate, glucose-6-phosphate D-glucose-6-phosphate or D-fructose-6-phosphate.
  • the cytosine-6-phosphate dephosphate of the present application is obtained by transforming the above-mentioned enzyme itself or a DNA expressing the same (for example, SEQ ID NOS: 21 to 40 of the present application) into a strain and culturing it to obtain a culture,
  • the culture may be pulverized and purified through a column or the like.
  • the strain for transformation include Escherichia coli ( Escherichia coli ), Corynebacterium glutamicum ( Corynebacterum glutamicum ), Aspergillus oryzae Aspergillus oryzae ), Or Bacillus subtilis Bacillus subtilis ).
  • the cytokine-6-phosphate dephosphate of the present application is at least 90%, at least 95%, at least 97%, at least 99% or at least 100% homologous to the sequence of motif A and / Homology, homology, or identity, and exhibits an activity of cis-6-phosphate phosphatase.
  • At least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 97%, at least 99% or at least 100% May comprise a protein consisting of a sequence having homology, similarity or identity within the range defined by any two numbers.
  • amino acid sequence having the above homology, similarity, or identity and exhibiting an effect corresponding to the protein consisting of the amino acid sequence of any one of the above-mentioned cystine-6-phosphate dephosphate protein for example, , although some sequences may have amino acid sequences that are deleted, modified, substituted or added, they are included within the scope of the present application.
  • the present application provides, in another aspect, a nucleic acid encoding the cytokine-6-phosphate dephosphorylase of the present application.
  • nucleic acid in the present application has the meaning inclusive of DNA or RNA molecules, and the nucleotide, which is a basic constituent unit in a nucleic acid, may include natural nucleotides as well as analogs in which sugar or base sites are modified Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews, 90: 543-584 (1990)).
  • the nucleic acid encoding the cytosine-6-phosphate dephosphorylase of the present application may comprise a sequence comprising a respective nucleotide which can be translated into motif A and motif B, 90%, 95%, 97%, 99% or 100% identical to the respective nucleotides that can be translated into motif A and motif B of the present application, and more specifically, % Homology, similarity or identity, and which can be translated to exhibit the desired enzymatic activity.
  • a protein comprising the motif A and the motif B specifically a protein consisting of the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 1 to 20, or a protein having homology, similarity, or identity thereto, by codon degeneracy Gt; polynucleotides < / RTI > that can be used in the present invention also fall within the scope of the present application.
  • the enzyme including the motif A and the motif B of the present application may be an enzyme derived from a thermostable or expressible strain.
  • the enzyme consisting of the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 1 to 20 is also referred to as Thermus Mariners Rhodothermus marinus ), Surmo Moto Racing ( Thermotoga lettingae ), Mayo Summers Louver ( Meiothermus ruber ), Dick Togglemastaderm ( Dictyoglomus turgidum ), Pyrobaculum Perry Dunesense ( Pyrobaculum ferrireducens ), Thermo Nero Bertor Wisely ( Thermoanaerobacter wiegelii ), Summers Thermopillar ( Thermus thermophilus ), Thermococcus litoralis ( Thermococcus litoralis ), Geobacillus stearothermophilus ( Geobacillus stearothermophilus ), Aneoria thermophilia ( Ana
  • homology or " identity” in this application means the degree of association with two given amino acid sequences or base sequences and may be expressed as a percentage.
  • Sequence homology or identity of conserved polynucleotides or polypeptides is determined by standard alignment algorithms and default gap penalties established by the program used can be used together.
  • Substantially homologous or identical sequences generally have at least about 50%, 60%, 70%, 80% or 90% of the length of the sequence or the entire length of the sequence under moderate or high stringency conditions can be hybridized under stringent conditions.
  • Polynucleotides containing degenerate codons instead of codons in hybridizing polynucleotides are also contemplated.
  • BLAST Altschul, [S.] : 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994; and CARILLO ETA /. (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073)
  • BLAST or ClustalW, of the National Center for Biotechnology Information Database can be used to determine homology, similarity, or identity.
  • the homology, similarity or identity of polynucleotides or polypeptides is described, for example, in Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2: 482, for example, in Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48: 443, by comparing the sequence information using a GAP computer program.
  • the GAP program defines the total number of symbols in the shorter of the two sequences, divided by the number of similar aligned symbols (ie, nucleotides or amino acids).
  • the default parameters for the GAP program are (1) a linear comparison matrix (containing 1 for identity and 0 for non-identity) and Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp.
  • the present application provides, in another aspect, a vector comprising a nucleic acid encoding the cytosine-6-phosphate dephosphate described herein, or a nucleic acid encoding the cytosine-6-phosphate dephosphate of the present application, There is provided a transformant comprising a vector comprising a nucleic acid encoding a cytosine-6-phosphate dephosphate.
  • vector in this application refers to any medium for cloning and / or transfer of a base into an organism, such as a host cell.
  • a vector can be a replicon that can bring about the replication of a joined fragment of another DNA fragment.
  • replication unit refers to any genetic unit (e.g., plasmid, phage, cosmid, chromosome, virus) that functions in vivo as an autonomous unit of DNA replication, .
  • vector includes viral and non-viral mediators for introducing a base into an organism such as a host cell, in vitro, in vitro or in vivo.
  • vector may also include mini-spherical DNA.
  • the vector containing the nucleic acid encoding the cytosine-6-phosphate dephosphate of the present application is pET21a-CJ_Rma, pET21a-CJ_Tle, pET21a-CJ_Mrub, pET21a-CJ_Dtu, pET21a-CJ_Msi, pET21a-CJ_Mruf, pET21a- C-His-CJ_Tth, pBT7-C-His-CJ_Ti1, pBT7-C-His-CJ_Phe, pBT7-C-His-CJ_Twi, pBT7- C-His-CJ_Ath, pBT7-C-His-CJ_Sac, pBT7-C-His-CJ_Tta, pBT7-C-His-CJ_Pfu, pBT7- have.
  • transformation in the present application means introducing a vector comprising a nucleic acid encoding a target protein into a host cell so that the protein encoded by the nucleic acid can be expressed in the host cell.
  • the transformed nucleic acid may be either inserted into the chromosome of the host cell or located outside the chromosome, as long as it can be expressed in the host cell.
  • the nucleic acid includes DNA and RNA encoding the target protein.
  • the nucleic acid may be introduced in any form as long as it can be introduced into a host cell and expressed therefrom.
  • the nucleic acid may be introduced into the host cell in the form of an expression cassette, which is a gene construct containing all the elements necessary for its expression.
  • the expression cassette can typically include a promoter operably linked to the nucleic acid, a transcription termination signal, a ribosome binding site, and a translation termination signal.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self-replication.
  • the nucleic acid may be introduced into the host cell in its own form and operably linked to the sequence necessary for expression in the host cell, but is not limited thereto.
  • operably linked means that the gene sequence is functionally linked to a promoter sequence that initiates and mediates transcription of a nucleic acid encoding the protein of interest of the present application.
  • the method of transforming the vector of the present application includes any method of introducing a nucleic acid into a cell and may be carried out by selecting a suitable standard technique as known in the art depending on the host cell. For example, electroporation, calcium phosphate (CaPO 4 ) precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, retroviral infection, microinjection, polyethylene glycol (PEG) Tran method, cationic liposome method, and lithium acetate-DMSO method, but the present invention is not limited thereto.
  • the host cell it is preferable to use a host having a high efficiency of introducing DNA and a high efficiency of expression of the introduced DNA.
  • the host cell may be a Corynebacterium, an Escherichia genus or a Serratia genus, But is not limited to, E. coli .
  • E. coli BL21 (DE3) / pET21a-CJ_Rma E. coli _P1_CJ_Rma, KCCM12057P
  • E. coli BL21 (DE3) / pET21a-CJ_Tle E. coli _P2_CJ_Tle, KCCM12058P
  • E. coli BL21 (DE3) / pET21a-CJ_Mrub E. coli _P3_CJ_Mrub, KCCM12059P
  • E. coli BL21 (DE3) / pET21a-CJ_Dtu E. coli _P4_CJ_Dtu, KCCM12060P
  • E. coli _P8_CJ_Tli, KCCM12064P E. coli BL21 (DE3) / pBT7-C-His-CJ_Gst (E . coli _P9_CJ_Gst, KCCM12065P), E. coli BL21 (DE3) / pBT7-C-His-CJ_Ath (E. coli _P10_CJ_Ath, KCCM12066P), E. coli BL21 (DE3) / pBT7-C-His-CJ_Sac (E. coli E. coli BL21 (DE3) / pBT7-C-His-CJ_Tta ( E.
  • E. coli _P12_CJ_Tta, KCCM12068P E. coli BL21 (DE3) / pBT7-C- His- CJ_Pfu ( E. coli _P13_CJ_Pfu, KCCM12069P), E. coli BL21 (DE3) / pBT7-C-His-CJ_Afu ( E. coli _P14_CJ_Afu, KCCM12070 P), E. coli BL21 (DE3 ) / pBT7-C-His-CJ_Aac (E. coli _P15_CJ_Aac, KCCM12071P), E.
  • the present application provides, as yet another aspect, a method for producing an inositol-mono-phosphatase, which comprises culturing an inositol-mono-phosphatase, a microorganism expressing the inositol-mono-phosphatase or a microorganism expressing the inositol- A composition for producing a course is provided.
  • inositol-mono-phosphatase motif is X -X a1 a2 a3 -DPLDG -X-X a4 A; Y a1 and a2 -DY -W -Y a1 a2 a3 -W -Y a4 -W inositol comprising the B motif of a3-mono- phosphatase Oh and can best, in the motifs A, X a1 is W, F, X a2 is V, I, or A; X a2 is I, F, V, A, or none; X a3 is V, I, or L; X a4 is T or S; and in said motif B, Y a1 is and W, Y, T, L, or V, Y a2 is V, I, C, F, or A is, W a1 is AAG, AAS, SAG, APG, APF, AGG, APL, or
  • inositol-mono-phosphatase can be used in a compatible manner with a cicos-6-phosphate dephosphate, and thus the above description of cicoro- It can be applied to paratheses.
  • the inositol-mono-phosphatase may be an enzyme consisting of an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 1 to 20.
  • composition for producing a cysteine of the present application may be prepared by mixing an enzyme and / or a substrate [(i) a starch, maltodextrin, sucrose or a combination thereof; (ii) phosphate; (iii) fructose-6-phosphate-3-epimerase; (iv) Glucose-6-phosphate-isomerizing enzyme; (v) phosphoglucomutase or glucose phosphorylase; And / or (vi) a compound selected from the group consisting of? -Glucan phosphorylase, starch phosphorylase, maltodextrin phosphorylase, sucrose phosphorylase,?
  • the enzymes contained in the composition for producing a cytosine of the present application and the substrate used for the production of the cytosine are limited It does not.
  • the starch / maltodextrin phosphorylase (EC 2.4.1.1) and ⁇ -glucan phosphorylase of the present application phosphorylate phosphate to glucose and convert it into starch or maltodextrin from glucose-1-
  • Any protein that has activity to produce phosphoric acid may include any protein.
  • the protein having activity to produce glucose-1-phosphate from the starch or maltodextrin may be a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 59.
  • the protein having activity to produce glucose-1-phosphate from the starch or maltodextrin may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 60.
  • the sucrose phosphorylase (EC 2.4.1.7) of the present application may contain any protein as long as it is a protein having an activity of phosphorylating phosphate to glucose to produce glucose-1-phosphate from sucrose.
  • Amylase (EC 3.2.1.1), pullulanse (EC 3.2.1.41), glucoamylase (EC 3.2.1.3), and isoamylase, which are starch hydrolyzate enzymes of the present application, May contain any protein as long as it is a protein having an activity of converting starch or maltodextrin to glucose.
  • the sucrase (EC 3.2.1.26) of the present application may contain any protein as long as it is a protein having activity to convert sucrose to glucose.
  • the phosphoglucomutase (EC 5.4.2.2) of the present application may contain any protein as long as it is a protein having an activity of converting glucose-1-phosphate into glucose-6-phosphate.
  • the protein having the activity of converting glucose-1-phosphate into glucose-6-phosphate may be a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61.
  • the protein having the activity of converting glucose-1-phosphate into glucose-6-phosphate can be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 62.
  • Glucokinase may contain any protein that has the activity of converting phosphate into glucose and converting it to glucose-6-phosphate.
  • the glucose phosphorylase may be a polyphosphate-dependent glucose phosphorylase, and more specifically, a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 77 or 78.
  • the glucose-6-phosphate-isomerizing enzyme of the present application may contain any protein as long as it is a protein having an activity of converting glucose-6-phosphate into fructose-6-phosphate.
  • the glucose-6-phosphate-isomerizing enzyme may be a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 63.
  • the glucose-6-phosphate-isomerizing enzyme may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 64.
  • the fructose-6-phosphate-3-epimerase of the present application may contain any protein as long as it is a protein having an activity of converting fructose-6-phosphate into cytosine-6-phosphate.
  • the fructose-6-phosphate-3-epimerase of the present application may be a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 65.
  • the fructose-6-phosphate-3-epimerase of the present application can be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 66.
  • the composition for producing a psychotic composition of the present application may further comprise a protein (for example, 4-alpha-glucanotransferase, etc.) having an activity of converting glucose to starch, maltodextrin or sucrose.
  • the protein having the activity of converting glucose into starch, maltodextrin or sucrose may be an enzyme consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67, specifically, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 68.
  • the composition for producing a psycho-producing composition of the present invention may further comprise any suitable excipient conventionally used in the composition for producing the psycho-producing subject. Such excipients may include, but are not limited to, preservatives, wetting agents, dispersing agents, suspending agents, buffering agents, stabilizing agents and isotonic agents.
  • the composition for producing a cysticose of the present invention may further comprise a metal ion or a metal salt.
  • the metal ion may be a divalent cation, and specifically may be one or more metal ions selected from the group consisting of Ni, Mg, Mg, Ni, Co, Mn, Fe and Zn. More specifically, for Im course produce compositions of this application it can further comprise a metal salt, and more specifically, the metal salt than is NiSO 4, MgSO 4, MgCl 2 , NiCl 2, CoSO 4, CoCl 2, MnCl 2, FeSO 4, and ZnSO 4 .
  • the present application relates to a method of transforming cis-6-phosphate into cis-cis-6-phosphate by contacting the inositol-mono-phosphatase, a microorganism expressing it or a culture of the microorganism with the cis-
  • the method comprising the steps of:
  • Inositol in the production method of the present application - mono- phosphatase motif is X -X a1 a2 a3 -DPLDG -X-X a4 A; Y a1 and a2 -DY -W -Y a1 a2 a3 -W -Y a4 -W inositol comprising the B motif of a3-mono-O phosphatase may be best.
  • the method of the present application is characterized in that, prior to the step of converting ciccos-6-phosphate into ciccos, a step of adding fructose-6-phosphate-3-epimerase to fructose- 6-phosphate-3-epimerase or a culture of the microorganism expressing the fructose-6-phosphate-3-epimerase is brought into contact with the fructose-6-phosphate to convert the fructose- May be further included.
  • the method of the present application is characterized in that before the step of converting the fructose-6-phosphate into the ciccos-6-phosphate, the glucose-6-phosphate-isomerizing enzyme, the glucose- -Phosphate-isomerizing enzyme or a culture of a microorganism expressing the glucose-6-phosphate-isomerizing enzyme to convert the glucose-6-phosphate into fructose-6-phosphate .
  • the method of the present application is characterized in that before the step of converting the glucose-6-phosphate into fructose-6-phosphate, the phosphoglucomutase and the phosphoglucomutase are expressed in glucose-1-phosphate And converting the glucose-1-phosphate into glucose-6-phosphate by bringing into contact a microorganism or a culture of the microorganism expressing the phosphoglucosimetase.
  • the method of the present application is characterized in that before the step of converting the glucose-6-phosphate into fructose-6-phosphate, a glucose oxidase, a microorganism expressing the glucose phosphorylase, or a microorganism expressing the glucose phosphorylase Culture, and phosphate to convert the glucose to glucose-6-phosphate.
  • the method of the present application is characterized in that before the step of converting the glucose-1-phosphate into glucose-6-phosphate, starch, maltodextrin, sucrose or a combination thereof is mixed with? -Glucan phosphorylase, starch phosphorylase, maltodextrin Phosphorylase or sucrose phosphorylase; A microorganism expressing the phosphorylase; Or a culture of a microorganism expressing the phosphorylase, and a phosphate, and converting the starch, maltodextrin, sucrose or a combination thereof to glucose-1-phosphate.
  • the method of the present application is characterized in that the step of converting the glucose to glucose-6-phosphate is carried out before the step of converting the glucose into starch, maltodextrin, sucrose or a combination thereof with? -Amylase, pullulanase, glucoamylase, sucrose or isoamylase; A microorganism expressing the? -Amylase, the pullulanase, the glucoamylase, the sucrose or the isoamylase; Maltodextrin, sucrose or a combination thereof into glucose by bringing into contact a culture of a microorganism expressing said? -Amylase, pullulanase, glucoamylase, sucrose or isoamylase, can do.
  • the present application provides, in another aspect, a method of preparing a composition
  • a method of preparing a composition comprising (a) an inositol-mono-phosphatase; Fructose-6-phosphate-3-epimerase; Glucose-6-phosphate-isomerizing enzyme; Phosphoglucomutase or glucose phosphorylase; And ⁇ -glucan phosphorylase, starch phosphorylase, maltodextrin phosphorylase, sucrose phosphorylase, ⁇ -amylase, pullulanase, isoamylase, glucoamylase or sucrase; Or (b) contacting a microorganism expressing the enzyme of item (a) or a culture of the microorganism.
  • the contact of the present application can be carried out at a pH of 5.0 to 9.0, specifically at a pH of 6.0 to 8.0.
  • the contact of the present application can be carried out at a temperature of 40 ° C to 80 ° C, specifically 40 ° C to 60 ° C or 50 ° C to 60 ° C.
  • the contact of the present application can be conducted for 2 to 24 hours, specifically for 6 to 24 hours.
  • the contact of the present application can be carried out at a pH of 5.0 to 9.0, at a temperature of 40 to 80 ⁇ , and / or for 2 to 24 hours. Specifically, the contact may be carried out at a pH of 6.0 to 8.0, at a temperature of 40 ° C to 60 ° C, or at a temperature of 50 ° C to 60 ° C, and / or for a time of 6 hours to 24 hours.
  • the manufacturing method of the present application may further include a step of purifying the cucus.
  • the tablet of the present application is not particularly limited, and any method commonly used in the technical field of the present application may be used. Non-limiting examples include chromatography, fractional crystallization, and ion purification. Only one purification method may be performed, or two or more purification methods may be performed together. For example, it is possible to purify the reaction product by chromatography, and the separation of the sugar by the chromatography can be carried out by using the difference in the weak binding force between the sugar to be separated and the metal ion attached to the ionic resin have.
  • the present application may further include performing bleaching, desalting, or both before or after the purifying step of the present application.
  • performing bleaching, desalting, or both By performing the decolorization and / or desalting, a more refined cyacose reactant can be obtained without impurities.
  • Inositol-mono-phosphatase which is a novel ciccos-6-phosphate dephosphorylase of the present application, is thermostable and can industrially carry out a pathway for converting ciccos-6-phosphate into cyclosporin, Which enables the progression of the cucosynthesis pathway using glucose or starch (e.g., maltodextrin), which is an irreversible reaction pathway, and which enables the production of cucus by the cytokine-6-phosphate dephosphorylation reaction It is possible to remarkably increase the conversion rate of glucose or starch (e.g., maltodextrin), which is an irreversible reaction pathway, and which enables the production of cucus by the cytokine-6-phosphate dephosphorylation reaction It is possible to remarkably increase the conversion rate of glucose or starch (e.g., maltodextrin), which is an irreversible reaction pathway, and which enables the production of cucus by the cytokine-6-phosphate dephosphorylation reaction It
  • the result of the reaction may include a high concentration of cucus due to an increase in the conversion of the cucic acid, thereby simplifying or eliminating the separation and purification process. There is a simple and economical advantage.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of an enzymatic reaction pathway from which sucrose can be prepared from starch (e.g., maltodextrin) or glucose.
  • starch e.g., maltodextrin
  • glucose e.g., glucose
  • 2A to 2C are schematic diagrams of the purified recombinant enzymes (pET21a-CJ_Rma, pET21a-CJ_Tle, pET21a-CJ_Mrub, pET21a-CJ_Dtu, pBT7-C- His-CJ_Pfe, pBT7- His-CJ_Tth, pBT7-C-His-CJ_Ti1, pBT7-C-His-CJ_Gst, pBT7-C- His-CJ_Ath, pBT7- (SDS-PAGE) analysis of the molecular weights of CJ_Pfu, pBT7-C-His-CJ_Afu, pBT7-C-His-CJ_Aac, pET21a-CJ_Msi, pET21a-CJ_Mruf, pET21a-CJ_Mta, pET21a-C
  • Figure 3A shows the effect of the inositol-mono-phosphatase (pET21a-CJ_Rma, pET21a-CJ_Tle, pET21a-CJ_Mrub, pET21a-CJ_Dtu, pBT7-C- His-CJ_Pfe, pBT7- His-CJ_Tth, pBT7-C-His-CJ_Ti1, pBT7-C-His-CJ_Gst, pBT7-C- His-CJ_Ath, pBT7- Relative activity (%, left Y-axis, bar graph) and glucose-6-phosphate, glucose-1-phosphate, fructose- (%, Right Y-axis, square dots) in the mixture of 6-phosphate and thiocos-6-phosphate diphosphoric acid.
  • 3B shows the results of comparison of the relative activity (%) of the inositol-mono-phosphatase (pET21a-CJ_Mrub, pET21a-CJ_Msi, pET21a-CJ_Mruf, pET21a-CJ_Mta, pET21a-CJ_Mch, pET21a-CJ_Mce) to be.
  • FIG. 4A is a graph showing the activity of the enzyme activity of ⁇ -glucan phosphorylase, phosphoglucomutase, glucose-6-phosphate-isomerizing enzyme, 4- ⁇ -glucanotransferase, 6-phosphate dephosphorylase was added to the reaction mixture to produce ciccos from maltodextrin.
  • FIG. 4B shows that the inositol-mono-phosphatase of the present application is also effective in the combination reaction of glucose-1-phosphate, glucose-6-phosphate, fructose-6-phosphate and cystic- Of the present invention was selectively dephosphorylated to produce ciccos.
  • Example 1 Preparation of Recombinant Expression Vector of Inositol-Mono-Phosphatase and Transformed Microorganism
  • the heat-stable inositol-mono-phosphatase gene was selected to provide the cytosine-6-phosphate dephosphorylase necessary for the pathway for the production of the cucus of the present application.
  • Rhodothermus registered at Genbank, marinus
  • Thermotoga lettingae Meiothermus ( Meiothermus) ruber
  • Dictyoglomus turgidum Pyrobaculum ferrireducens
  • Thermoanaerobacter, wiegelii Thermus thermophilus , Thermococcus litoralis
  • Geobacillus stearothermophilus Geobacillus stearothermophilus
  • Anneria thermophilia Anaerolinea thermophila , Sulfolobus acidocaldarius , Thermosulfidibacter takaii , Pyrococcus falciparum , Pyrococcus falciparum , fungi
  • Rhodothermus marinus Rhodothermus marinus
  • Thermotoga lettingae Meiothermus ruber
  • Dictyoglomus turgidum
  • Meiothermus silvanus Meiothermus rufus
  • Meiothermus taiwanensis Mayo sseomeoseu governing aroyl pillar's
  • Mayo sseomeoseu theta Beretta mouse (Meiothermus Each of the genes was amplified from the chromosomal DNA of E.
  • Caldari Earth (Alicyclobacillus acidocaldarius) the origin of inositol-mono Force Fateh rise gene (Pfe, Twi, Tth, Tli , Gst, Ath, Sac 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 and 35 in the order of the above genes, (Bioneer), based on the amino acid sequence [SEQ ID NOS: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 and 15] pBT7-C-His-CJ_Tth, pBT7-C-His-CJ_Tli, and pBT7-C-His inserted in pBT7-C-His (Bioneer) C-His-CJ_Ath, pBT7-C-His-CJ_Sac, pBT7-C-His-CJ_Tta, pBT7-C-His-CJ_Pfu, pBT7- Lt; / RTI &gt
  • Such expression vectors can be obtained by conventional transformation methods (see Sambrook et al. 1989] in Escherichia coli (E. coli) BL21 (DE3) strains respectively transformed to E. coli BL21 (DE3) / pET21a -CJ_Rma (E. coli _P1_CJ_Rma, KCCM12057P), E. coli BL21 (DE3) / pET21a-CJ_Tle (E. coli _P2_CJ_Tle, KCCM12058P), E. coli BL21 (DE3) / pET21a-CJ_Mrub (E. coli _P3_CJ_Mrub, KCCM12059P), E.
  • E. coli BL21 (DE3) / pET21a-CJ_Dtu E. coli _P4_CJ_Dtu, KCCM12060P
  • E. coli BL21 (DE3) / pBT7 -C-His-CJ_Pfe E. coli _P5_CJ_Pfe, KCCM12061P
  • E. coli BL21 (DE3) / pBT7-C-His-CJ_Twi E. coli _P6_CJ_Twi, KCCM12062P
  • E. coli BL21 (DE3) / pBT7-C -His-CJ_Tth E.
  • E. coli _P7_CJ_Tth, KCCM12063P E. coli BL21 (DE3) / pBT7-C-His-CJ_Tli (E. coli _P8_CJ_Tli, KCCM12064P), E. coli BL21 ( DE3) / pBT7-C-His -CJ_Gst (E. coli _P9_CJ_Gst, KCCM12065P), E. coli BL21 (DE3) / pBT7-C-His-CJ_Ath (E. coli _P10_CJ_Ath, KCCM12066P), E.
  • coli BL21 (DE3) / pBT7-C-His-CJ_Sta E. coli P11_CJ_Sac, KCCM12067P
  • E. coli BL21 (DE3) / pBT7-C- His-CJ_TTA E. coli_P12_CJ_Tta, KCCM12068P
  • E. coli BL21 -C-His-CJ_Pfu E. coli _P13_CJ_Pfu, KCCM12069P
  • E. coli BL21 (DE3) / pB T7-C-His-CJ_Afu E.
  • E. coli _P14_CJ_Afu, KCCM12070P E. coli BL21 (DE3) / pBT7-C-His-CJ_Aac (E. coli _P15_CJ_Aac, KCCM12071P), E. coli BL21 (DE3) / pET21a- CJ_Msi ( E. coli _P16_CJ_Msi, KCCM12072P), E. coli BL21 (DE3) / pET21a-CJ_Mruf ( E. coli _P17_CJ_Mruf, KCCM12073P), E.
  • E. coli BL21 (DE3) / pET21a-CJ_Mta E. coli _P18_CJ_Mta, KCCM12074P
  • E. coli BL21 (DE3) / pET21a-CJ_Mch E. coli _P19_CJ_Mch, KCCM12075P
  • E. coli BL21 (DE3) / pET21a-CJ_Mce E E. coli _P20_CJ_Mce, KCCM12076P was prepared.
  • the above-mentioned transformant strain was deposited under the Budapest Treaty with the Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) on July 10, 2017, and received the accession numbers KCCM 12057P to KCCM 12076.
  • sequence ID No. 60, 62, 64 and 66 respectively in the order of the enzymes described above
  • amino acid sequence amino acid sequence
  • reverse primers SEQ ID NOS: 70, 72, 74 and 76
  • PCR polymerase chain reaction
  • Each amplified enzyme gene was inserted into E. coli expression plasmid vector pET21a (Novagen) using restriction enzymes Nde I and Xho I to obtain recombinant expression named pET21a-CJ_ct1, pET21a-CJ_ct2, pET21a-CJ_tn1 and pET21a-CJ_fp3e Vector.
  • the recombinant expression vector was transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) strain by a conventional transformation method (Sambrook et al. 1989) to prepare transformed microorganism, and E. coli BL21 (DE3) / pET21a-CJ_ct1 (KCCM11990P ), E.
  • coli BL21 (DE3) / pET21a-CJ_ct2 (KCCM11991P), E. coli BL21 (DE3) / pET21a-CJ_tn1 (KCCM11992P) and E. coli BL21 (DE3) / CJ_tn_fp3e (KCCM11848P).
  • the strain was deposited with the Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) on June 23, 2016 under the Treaty of Budapest and received a deposit number.
  • each of the transforming microorganisms prepared in Examples 1 and 2 was inoculated into a culture tube containing 5 ml of LB liquid medium and cultured at 37 ° C in a shaking incubator at an absorbance of 2.0 at 600 nm Seed culture was performed.
  • the cultured medium was cultured in a culture flask containing LB liquid medium.
  • 1 mM IPTG was added to induce expression of the recombinant enzyme.
  • the stirring speed during the culturing was 180 rpm and the incubation temperature was kept at 37 ⁇ .
  • the culture broth was centrifuged at 8,000 ⁇ g for 20 minutes at 4 ° C., and the cells were recovered.
  • the recovered cells were washed twice with 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) buffer solution, suspended in the same buffer solution, and then disrupted using an ultrasonic cell crusher. The cell lysate was centrifuged at 13,000 x g for 20 minutes at 4 ° C, and only the supernatant was taken. The recombinant enzyme was purified from the supernatant using His-tag affinity chromatography, dialyzed with 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) buffer, and used for the reaction.
  • the molecular weight was confirmed by SDS-PAGE analysis, and the purified enzyme name and molecular weight (FIG. 2A to FIG. 2C) prepared by each transforming microorganism were as follows:
  • Enzymes (designated as RMA) prepared from E. coli BL21 (DE3) / pET21a-CJ_Rma ( E. coli _P1_CJ_Rma) were 30.3 kDa,
  • Enzymes (designated by TLE) prepared from E. coli BL21 (DE3) / pET21a-CJ_Tle ( E. coli _P2_CJ_Tle) were 28.5 kDa,
  • the enzyme (described as MRUB) prepared from E. coli BL21 (DE3) / pET21a-CJ_Mrub ( E. coli P3_CJ_Mrub) was 28 kDa,
  • Enzymes (designated DTU) prepared from E. coli BL21 (DE3) / pET21a-CJ_Dtu ( E. coli _P4_CJ_Dtu) showed 30.2 kDa,
  • Enzymes (designated by PFE) prepared from E. coli BL21 (DE3) / pBT7-C-His-CJ_Pfe ( E. coli_P5_CJ_Pfe)
  • Enzymes (designated TWI) prepared from E. coli BL21 (DE3) / pBT7-C-His-CJ_Twi ( E. coli P6_CJ_Twi)
  • TTH The enzyme (described as TTH) prepared from E. coli BL21 (DE3) / pBT7-C-His-CJ_Tth ( E. coli P7_CJ_Tth)
  • Enzymes (designated TLI) prepared from E. coli BL21 (DE3) / pBT7-C-His-CJ_Tli ( E. coli P8_CJ_Tli)
  • the enzyme (expressed as GST) prepared from E. coli BL21 (DE3) / pBT7-C-His-CJ_Gst ( E. coli P9_CJ_Gst)
  • Enzymes (designated ATH) prepared from E. coli BL21 (DE3) / pBT7-C-His-CJ_Ath ( E. coli P10_CJ_Ath)
  • the enzyme (designated SAC) prepared from E. coli BL21 (DE3) / pBT7-C-His-CJ_Sac ( E. coli P11_CJ_Sac)
  • TTA The enzyme (described as TTA) prepared from E. coli BL21 (DE3) / pBT7-C-His-CJ_Tta ( E. coli P12_CJ_Tta)
  • Enzymes (designated by PFU) prepared from E. coli BL21 (DE3) / pBT7-C-His-CJ_Pfu ( E. coli _P13_CJ_Pfu)
  • Enzymes (designated AFU) prepared from E. coli BL21 (DE3) / pBT7-C-His-CJ_Afu ( E. coli P14_CJ_Afu)
  • the enzyme (designated as AAC) prepared from E. coli BL21 (DE3) / pBT7-C-His-CJ_Aac ( E. coli _P15_CJ_Aac)
  • Enzymes (designated by MSI) prepared from E. coli BL21 (DE3) / pET21a-CJ_Msi ( E. coli P16_CJ_Msi) were 28.1 kDa,
  • the enzyme (described as MRUF) prepared from E. coli BL21 (DE3) / pET21a-CJ_Mruf ( E. coli P17_CJ_Mruf) was 28 kDa,
  • the enzyme (described as MTA) prepared from E. coli BL21 (DE3) / pET21a-CJ_Mta ( E. coli P18_CJ_Mta) had 28.1 kDa,
  • Enzymes (designated as MCH) prepared from E. coli BL21 (DE3) / pET21a-CJ_Mch ( E. coli P19_CJ_Mch) were 28.4 kDa,
  • the enzyme (described as MCE) prepared from E. coli BL21 (DE3) / pET21a-CJ_Mce ( E. coli _P20_CJ_Mce) had 28.1 kDa,
  • E. coli Enzymes (designated CT1) prepared from BL21 (DE3) / pET21a-CJ_ct1 (KCCM11990P)
  • E. coli Enzymes (designated as CT2) prepared from BL21 (DE3) / pET21a-CJ_ct2 (KCCM11991P)
  • E. coli Enzymes (designated as TN1) prepared from BL21 (DE3) / pET21a-CJ_tn1 (KCCM11992P)
  • E. coli Enzyme (described as FP3E) prepared from BL21 (DE3) / CJ_tn_fp3e (KCCM11848P).
  • 6-phosphate was produced from fructose-6-phosphate, it was confirmed that the activity of producing inositol-mono-phosphatase-producing cicosaccharide was improved.
  • fructose-6-phosphate was suspended in 50 mM Tris-HCl (pH 7.0) buffer, and then the fructose-6-phosphate-3-epimerase (FP3E)
  • F3E fructose-6-phosphate-3-epimerase
  • Each of 20 kinds of inositol-mono-phosphatase was added in an amount of 0.1 unit / ml and reacted at 70 ° C for 1 hour.
  • the HPLC analysis was performed using a SP_0810 (Shodex) column and an Aminex HPX-87C (Bio-RAD) column at a flow rate of 0.6 ml / min to the mobile phase at 80 ° C. And detected by Refractive Index Detector (RID).
  • SP_0810 Shodex
  • Aminex HPX-87C Bio-RAD
  • the CT1, CT2, TN1, FP3E and MRUB enzymes were simultaneously reacted for the production of cytosine from maltodextrin.
  • Each enzyme was used in 0.1 unit / ml, and 5% (w / v) maltodextrin was added to 5 mM MgCl 2 , 20 mM sodium phosphate pH 7.0 and reacted at 50 ° C for 12 hours. And the result was analyzed by HPLC.
  • HPLC analysis was carried out using a Aminex HPX-87C (Bio-RAD) column at a flow rate of 0.6 ml / min at 80 ° C with a mobile phase and detected with a Refractive Index Detector.
  • cytosine was generated from maltodextrin by a complex enzyme reaction (Fig. 4A).

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Abstract

본 출원은 모티프 A 및 모티프 B를 포함하는 싸이코스-6-인산 탈인산효소, 상기 효소를 포함하는 싸이코스 생산용 조성물, 상기 효소를 이용하여 싸이코스를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

신규한 싸이코스-6-인산 탈인산효소, 상기 효소를 포함하는 사이코스 생산용 조성물, 상기 효소를 이용하여 사이코스를 제조하는 방법
본 출원은 신규한 싸이코스-6-인산 탈인산효소, 상기 효소를 포함하는 싸이코스 생산용 조성물, 상기 효소를 이용하여 싸이코스를 제조하는 방법에 관한 것이다.
싸이코스-3-에피머화효소(D-psicose-3-epimerase, EC 5.1.3.30) 및 타가토스-3-에피머화효소(D-tagatose-3-epimerase, EC 5.1.3.31)는 과당(D-fructose)을 3-에피머화(3-epimerization, 3번 탄소 에피머화)하여 싸이코스(D-psicose)를 생산할 수 있는 효소로 알려져 있다. 상기 효소를 이용하는 단일 효소반응으로 싸이코스를 생산하는 경우, 기질인 과당과 산물인 싸이코스 간에 일정 수준의 반응평형(reaction equilibrium)이 존재한다(산물/기질 = 약 20% 내지 35%). 따라서, 고순도의 싸이코스를 제조하기 위해서는 효소 반응 결과물로부터 비교적 고농도의 과당을 분리하여 제거해야 하는 추가 정제공정이 요구되는 문제점이 있다.
한편, Chan 등(2008. Biochemistry. 47:9608-9617)은 과당-6-인산(D-fructose-6-phosphate) 및 싸이코스-6-인산(D-psicose-6-phosphate)에 대해서 3-에피머화 반응을 수행할 수 있는 스트렙토코커스 파이로제네스( Streptococcus pyogenes) 유래의 리불로스-5-인산-3-에피머화효소(D-ribulose-5-phosphate-3-epimerase, EC 5.1.3.1) 및 E. coli 유래의 싸이코스-6-인산-3-에피머화효소(D-psicose 6-phosphate-3-epimerase, EC 5.1.3.-)를 보고한 바 있으나, 상기 효소들은 내열성을 갖지 못하여 산업적으로 이용이 불가능한 문제점이 있다..
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 경제적이면서 산업적으로 사이코스로의 전환율을 높일 수 있는 방법을 개발하기 위해 예의 노력하였다. 그 결과, 경제적 원료인 수크로스 또는 전분(예컨대, 말토덱스트린)을 싸이코스-6-인산으로 전환시킨 후, 상기 싸이코스-6-인산에 특이적이면서 비가역 반응경로를 수행하는 본 출원의 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소(psicose-6-phosphate phosphatase)를 이용하여 싸이코스를 생산하는 경우, 싸이코스 생산 경로에 관여하는 복수의 효소를 동시에 사용 가능한 동시효소반응(one-pot enzymatic conversions)이 가능하고, 싸이코스 전환율을 현저히 높일 수 있음을 확인함으로써 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 일 목적은 모티프 A 및 모티프 B를 포함하는 신규한 싸이코스-6-인산 탈인산효소를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 일 목적은 본원에 기술된 싸이코스-6-인산 탈인산효소를 암호화하는 핵산과, 상기 핵산을 포함하는 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 일 목적은 이노시톨-모노-포스파타아제, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 싸이코스 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 일 목적은 싸이코스-6-인산에 이노시톨-모노-포스파타아제, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜 상기 싸이코스-6-인산을 싸이코스로 전환하는 단계를 포함하는 싸이코스 제조방법을 제공하는 것이다.
이하, 본 출원 내용에 대하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시한 일 양태의 설명 및 실시형태는 공통된 사항에 대하여 다른 양태의 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 또한, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 더불어, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
출원의 목적을 달성하기 위하여, 본 출원은 하나의 양태로서,
X a1-X a2-X a3-DPLDG-X a4의 모티프 A; 및
Y a1-D-Y a2-W a1-Y a3-W a2-Y a4-W a3의 모티프 B를 포함하는 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소를 제공하며,
상기 모티프 A에서, X a1는 W, F, V, I, 또는 A이고, X a2는 I, F, V, A, 또는 없음이고, X a3는 V, I, 또는 L이고, X a4 는 T 또는 S이고,
상기 모티프 B에서, Y a1는 W, Y, T, L, 또는 V이고, Y a2는 V, I, C, F, 또는 A이고, W a1은 AAG, AAS, SAG, APG, APF, AGG, APL, 또는 AGA이고, Y a3은 W, I, P, M, V, Y, F, R, L, T, 또는 S이고, W a2는 LLV, LIV, LLI, LII, ILI, FIA, ALV, IIA, VLV, VIL, TIG, NFC 또는 PIF이고, Y a4는 E, R, S, T, L, K, 또는 P이고, W a3은 EAGG, EGGG, EAKG, KAGG, AAGG, YVDG, EAGA, 또는 RLGV이다.
구체적으로 상기 모티프 A에서, X a1는 W 또는 F이고, X a2는 I 또는 V이고, X a3는 V, 또는 I이고, X a4 는 T이고, 상기 모티프 B에서, Y a1는 W이고, Y a2는 V, 또는 I이고, W a1은 AAG 이고, Y a3은 W, I, 또는 V이고, W a2는 LLV, LIV, LII 또는 LLI 이고, Y a4는 E, R, 또는 S이고, W a3은 EAGG, 또는 EGGG일 수 있다.
상기 모티프 A와 상기 모티프 B 사이, 상기 모티프 A의 말단, 또는 상기 모티프 B의 말단에는 1개 이상의 아미노산이 포함될 수 있으며, 모티프 A와 모티프 B 이외의 아미노산 서열은 공지된 이노시톨-모노-포스파타아제의 서열(예컨데, 서열번호 1 내지 20의 서열 중 모티프 A와 모티프 B를 제외한 서열)로부터 정의될 수 있다.
상기 모티프 A 및/또는 모티프 B는 이노시톨-모노-포스파타아제의 서열 중 활성 부위로, 상기 효소의 기질인 이노시톨 포스페이트의 결합 부위로 알려져 있다(참조문헌: Federation of European Biochemical Societies, Volume 294, number 1,2, 16-18, December 1991). 본 출원에서는 이노시톨-모노-포스파타아제가 싸이코스-6-인산 탈인산효소로서의 활성을 나타냄을 밝혀내었으며, 이노시톨-모노-포스파타아제의 모티프 A 및/또는 모티프 B는 또한 상기 탈인산효소의 기질 결합 부위일 수 있음을 밝혀내었다.
싸이코스-6-인산 탈인산효소는 구체예에서 서열번호 1 내지 20 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 싸이코스-6-인산 탈인산효소(psicose-6-phosphate phosphatase)일 수 있다.
본 출원의 싸이코스-6-인산 탈인산효소는 종래 이노시톨-모노포스파테이즈 효소로 기능이 공지된 효소일 수 있다.
본 출원의 싸이코스-6-인산 탈인산효소는 싸이코스-6-인산에 보다 선택적으로 탈인산화 반응을 하며, 포도당-1-인산(D-glucose-1-phosphate), 포도당-6-인산(D-glucose-6-phosphate) 또는 과당-6-인산(D-fructose-6-phosphate)에는 비특이적일 수 있다.
본 출원의 싸이코스-6-인산 탈인산효소는 상기 효소 자체 또는 이를 발현하는 DNA(예컨대, 본 출원의 서열번호 21 내지 40)를 균주에 형질전환시키고, 이를 배양하여 배양물을 수득하고, 상기 배양물을 파쇄하여, 컬럼 등을 통해 정제한 것일 수 있다. 상기 형질전환용 균주로는 대장균( Escherichia coli), 코리네박테리움 글루타미쿰( Corynebacterum glutamicum), 아스퍼질러스 오리제( Aspergillus oryzae), 또는 바실러스 섭틸리스( Bacillus subtilis) 등이 있다.
본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 싸이코스-6-인산 탈인산효소는 모티프 A 및/또는 모티프 B의 서열과 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상 또는 100%의 상동성, 유사성 또는 동일성을 가지며 싸이코스-6-인산 탈인산효소 활성을 나타내는 효소를 포함할 수 있다. 추가로 모티프 A 및 모티프 B를 제외한 서열과는 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는 효소일 수 있다. 구체예에서 서열번호 1 내지 20 중 모티프 A 및/또는 모티프 B의 서열과 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상 또는 100%의 상동성, 유사성, 또는 동일성을 가지면서, 모티프 A 및/또는 모티프 B 이외의 부분과는 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상 또는 100%, 또는 상기 수치 중 임의의 2개의 수치에 의해 정해지는 범위 내의 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는 서열로 이루어진 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 상동성, 유사성 또는 동일성을 가지며 상기 싸이코스-6-인산 탈인산효소 단백질, 예컨데 상기 서열번호 1 내지 20중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지더라도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
또한, 본 출원의 모티프 A 및 모티프 B를 포함하는 싸이코스-6-인산 탈인산효소와 상응하는 활성을 가지는 단백질이라면, 상기 모티프 A 및 상기 모티프 B의 서열 중 서열 앞뒤의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 특히 서열번호 1 내지 20의 어느 하나의 아미노산 서열 앞뒤의 무의미한 서열 추가 또는 자연 발생 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이를 제외하는 것은 아니고, 모티프 A 및 모티프 B를 포함하는 단백질 또는 서열번호 1 내지 20의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또한 본 출원의 범위 내에 속한다.
본 출원은 다른 하나의 양태로서, 본 출원의 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소를 암호화하는 핵산을 제공한다.
본 출원에서 용어, "핵산"은 DNA 또는 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 천연 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체도 포함할 수 있다(참조문헌: Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
구체적으로, 본 출원의 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소를 암호화하는 핵산은 모티프 A 및 모티프 B로 번역될 수 있는 각각의 뉴클레오티드를 포함하는 서열을 포함할 수 있고, 구체예에서 서열번호 21 내지 40 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 본 출원의 모티프 A 및 모티프 B로 번역될 수 있는 각각의 뉴클레오티드와 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상 또는 100%의 상동성, 유사성 또는 동일성을 가지면서, 번역되어 목적하는 효소 활성을 나타낼 수 있는 핵산을 포함할 수 있다. 구체적으로 서열번호 21 내지 40 중 모티프 A 및 모티프 B로 번역될 수 있는 각각의 뉴클레오티드와 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상 또는 100%의 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는 핵산을 포함할 수 있고, 이에 추가하여 서열번호 21 내지 40 중 모티프 A 및 모티프 B 이외의 부분으로 번역될 수 있는 뉴클레오티드와 적어도 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99%의 상동성, 유사성 또는 동일성을 가지는 핵산일 수 있다. 코돈 축퇴성(codon degeneracy)에 의해 상기 모티프 A 및 모티프 B를 포함하는 단백질, 구체적으로 서열번호 1 내지 20 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 이와 상동성, 유사성, 또는 동일성을 가지는 단백질로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 본 출원의 범위에 포함될 수 있음은 자명하다.
본 출원의 모티프 A 및 모티프 B를 포함하는 효소는 내열성을 갖거나 호열성인 균주로부터 유래된 효소일 수 있다. 구체적으로 서열번호 1 내지 20 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 효소는 각각 로도써머스 마리너스( Rhodothermus marinus), 써모토가 레팅게( Thermotoga lettingae), 메이오써머스 루버( Meiothermus ruber), 딕토글로머스 터기덤( Dictyoglomus turgidum), 파이로바쿨럼 페리듄센스( Pyrobaculum ferrireducens), 써모어네로박터 위제리( Thermoanaerobacter wiegelii), 써머스 써모필러스( Thermus thermophilus), 써모코커스 리토랄리스( Thermococcus litoralis), 지오바실러스 스테레아써모필러스( Geobacillus stearothermophilus), 어네오리아 써모필리아( Anaerolinea thermophila), 썰폴로보스 에씨도칼다리어스( Sulfolobus acidocaldarius), 써모썰피디박터 타카이( Thermosulfidibacter takaii), 파이로코커스 퓨리어스( Pyrococcus furiosus), 아키오글로버스 퓰지더스( Archaeoglobus fulgidus), 알리시슬로바실러스 에씨도칼다리어스( Alicyclobacillus acidocaldarius), 메이오써머스 실바너스( Meiothermus silvanus), 메이오써머스 루퍼스( Meiothermus rufus), 메이오써머스 타이완네시스( Meiothermus taiwanensis), 메이오써머스 치리아로필러스( Meiothermus chliarophilus), 또는 메이오써머스 쎄베레우스( Meiothermus cerbereus) 유래 효소일 수 있다.
본 출원에서 용어, "상동성" 또는 "동일성"은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다.
용어 "유사성" 및 "동일성"은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된 (conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 따라 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다. (GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol.48 : 443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 일진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 것으로서, 용어 "상동성" 또는 "동일성"은 서열들간의 관련성(relevance)를 나타낸다.
본 출원은 또 다른 양태로서, 본원에 기재된 싸이코스-6-인산 탈인산효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 본 출원의 싸이코스-6-인산 탈인산효소를 암호화하는 핵산 또는 본 출원의 싸이코스-6-인산 탈인산효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.
본 출원에서 용어 "벡터"는 유기체, 예컨대 숙주세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. 여기서, "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 용어 "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 유기체, 예컨대, 숙주 세포로 염기를 도입하기 위한 바이러스 및 비바이러스 매개물을 포함한다. 용어 "벡터"는 또한 미니구형 DNA를 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 싸이코스-6-인산 탈인산효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터는 pET21a-CJ_Rma, pET21a-CJ_Tle, pET21a-CJ_Mrub, pET21a-CJ_Dtu, pET21a-CJ_Msi, pET21a-CJ_Mruf, pET21a-CJ_Mta, pET21a-CJ_Mch, pET21a-CJ_Mce, pBT7-C-His-CJ_Pfe, pBT7-C-His-CJ_Twi, pBT7-C-His-CJ_Tth, pBT7-C-His-CJ_Tli, pBT7-C-His-CJ_Gst, pBT7-C-His-CJ_Ath, pBT7-C-His-CJ_Sac, pBT7-C-His-CJ_Tta, pBT7-C-His-CJ_Pfu, pBT7-C-His-CJ_Afu, 또는 pBT7-C-His-CJ_Aac일 수 있다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 암호화하는 핵산 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 핵산이 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 핵산은 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 핵산은 표적 단백질을 암호화하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 핵산은 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 핵산은 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 핵산에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 핵산은 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 암호화하는 핵산의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본원에서 아미노산은 아래와 같은 약어 또는 아미노산 명으로 표시될 수 있다:
알라닌(alanine) A
아르기닌(arginine) R
아스파라긴(asparagines) N
아스파르트산(aspartic acid) D
시스테인(cystein) C
글루탐산(glutamic acid) E
글루타민(glutamine) Q
글라이신(glycine) G
히스티딘(histidine) H
이소류신(isoleucine) I
류신(leucine) L
라이신(lycine) K
메티오닌(methionine) M
페닐알라닌(phenylalanine) F
프롤린(proline) P
세린(serine) S
트레오닌(threonine) T
트립토판(tryptophan) W
타이로신(tyrosine) Y
발린(valine) V
본 출원의 벡터를 형질전환 시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO 4) 침전, 염화칼슘(CaCl 2) 침전, 레트로바이러스 감염(retroviral infection), 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 숙주 세포로는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주를 사용하는 것이 좋은데, 예를 들어 코리네속 미생물, 에스케리키아속 미생물 또는 세라티아속 미생물일 수 있고, 구체적으로 대장균( E. coli)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 형질전환체는 E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Rma( E. coli_P1_CJ_Rma, KCCM12057P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Tle( E. coli_P2_CJ_Tle, KCCM12058P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mrub( E. coli_P3_CJ_Mrub, KCCM12059P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Dtu( E. coli_P4_CJ_Dtu, KCCM12060P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Pfe( E. coli_P5_CJ_Pfe, KCCM12061P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Twi( E. coli_P6_CJ_Twi, KCCM12062P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tth( E. coli_P7_CJ_Tth, KCCM12063P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tli( E. coli_P8_CJ_Tli, KCCM12064P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Gst( E. coli_P9_CJ_Gst, KCCM12065P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Ath( E. coli_P10_CJ_Ath, KCCM12066P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Sac( E. coli_P11_CJ_Sac, KCCM12067P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tta( E. coli_P12_CJ_Tta, KCCM12068P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Pfu( E. coli_P13_CJ_Pfu, KCCM12069P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Afu( E. coli_P14_CJ_Afu, KCCM12070P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Aac( E. coli_P15_CJ_Aac, KCCM12071P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Msi( E. coli_P16_CJ_Msi, KCCM12072P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mruf( E. coli_P17_CJ_Mruf, KCCM12073P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mta( E. coli_P18_CJ_Mta, KCCM12074P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mch( E. coli_P19_CJ_Mch, KCCM12075P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mce( E. coli_P20_CJ_Mce, KCCM12076P)일 수 있다.
본 출원은 또 다른 하나의 양태로서, 이노시톨-모노-포스파타아제, 상기 이노시톨-모노-포스파타아제를 발현하는 미생물 또는 상기 이노시톨-모노-포스파타아제를 발현하는 미생물의 배양물을 포함하는 싸이코스 생산용 조성물을 제공한다.
본 출원의 이노시톨-모노-포스파타아제는 X a1-X a2-X a3-DPLDG-X a4의 모티프 A; 및 Y a1-D-Y a2-W a1-Y a3-W a2-Y a4-W a3의 모티프 B를 포함하는 이노시톨-모노-포스파타아제일 수 있으며, 상기 모티프 A에서, X a1는 W, F, V, I, 또는 A이고, X a2는 I, F, V, A, 또는 없음이고, X a3는 V, I, 또는 L이고, X a4 는 T 또는 S이고, 상기 모티프 B에서, Y a1는 W, Y, T, L, 또는 V이고, Y a2는 V, I, C, F, 또는 A이고, W a1은 AAG, AAS, SAG, APG, APF, AGG, APL, 또는 AGA이고, Y a3은 W, I, P, M, V, Y, F, R, L, T, 또는 S이고, W a2는 LLV, LIV, LLI, LII, ILI, FIA, ALV, IIA, VLV, VIL, TIG, NFC 또는 PIF이고, Y a4는 E, R, S, T, L, K, 또는 P이고, W a3은 EAGG, EGGG, EAKG, KAGG, AAGG, YVDG, EAGA, 또는 RLGV이다. 즉, 본 출원에서 이노시톨-모노-포스파타아제는 싸이코스-6-인산 탈인산효소와 호환되어 사용될 수 있으며, 따라서 싸이코스-6-인산 탈인산효소에 대한 전술한 설명은 이노시톨-모노-포스파타아제에 적용될 수 있다. 구체예에서 이노시톨-모노-포스파타아제는 서열번호 1 내지 20 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 효소일 수 있다.
본 출원의 싸이코스 생산용 조성물은, 본 출원의 싸이코스 제조 경로(도 1 참고)에 관여하는 효소 및/또는 기질[(i) 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합; (ii) 포스페이트(phosphate); (iii) 과당-6-인산-3-에피머화 효소; (iv) 포도당-6-인산-이성화효소; (v) 포스포글루코무타아제 또는 포도당 인산화 효소; 및/또는 (vi) α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, α-아밀라아제, 풀루란아제, 이소아밀라아제, 글루코아밀라아제 또는 수크라아제]; 상기 싸이코스 제조 경로에 관여하는 효소를 발현하는 미생물; 또는 상기 싸이코스 제조 경로에 관여하는 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 추가적으로 포함할 수 있다. 다만, 이는 예시적인 것으로 본 출원의 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소를 이용하여 싸이코스를 생산할 수 있다면, 본 출원의 싸이코스 생산용 조성물에 포함되는 효소 및 싸이코스 생산에 이용되는 기질이 제한되지 않는다.
본 출원의 전분/말토덱스트린 포스포릴라아제(starch/maltodextrin phosphorylase, EC 2.4.1.1) 및 α-글루칸 포스포릴라아제는 포스페이트(phosphate)를 포도당에 인산화 전이시켜 전분 또는 말토덱스트린으로부터 포도당-1-인산을 생산하는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 전분 또는 말토덱스트린으로부터 포도당-1-인산을 생산하는 활성을 갖는 단백질은 서열번호 서열번호 59의 아미노산 서열로 이루어진 단백질일 수 있다. 또한, 상기 전분 또는 말토덱스트린으로부터 포도당-1-인산을 생산하는 활성을 갖는 단백질은 서열번호 60의 염기서열에 의해 암호화될 수 있다.
본 출원의 수크로스 포스포릴라아제(sucrose phosphorylase, EC 2.4.1.7)는 포스페이트를 포도당에 인산화 전이시켜 수크로스로부터 포도당-1-인산을 생산하는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다.
본 출원의 전분 액당화 효소인 α-아밀라아제(α-amylase, EC 3.2.1.1), 풀루란아제(pullulanse, EC 3.2.1.41), 글루코아밀라아제(glucoamylase, EC 3.2.1.3) 및 이소아밀라아제(isoamylase)는 전분 또는 말토덱스트린을 포도당으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다.
본 출원의 수크라제(sucrase, EC 3.2.1.26)는 수크로스를 포도당으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다.
본 출원의 포스포글루코무타아제(phosphoglucomutase, EC 5.4.2.2)는 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질은 서열번호 서열번호 61의 아미노산 서열로 이루어진 단백질일 수 있다. 또한, 상기 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질은 서열번호 62의 염기서열에 의해 암호화될 수 있다.
포도당인산화효소(glucokinase)는 포도당에 인산을 전이시켜 포도당-6-인산으로 전환하는 활성을 가지는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 포도당인산화효소는 폴리포스페이트 의존형 포도당인산화 효소일 수 있고 보다 구체적으로, 서열번호 77 또는 78의 아미노산 서열로 이루어진 단백질일 수 있다. 본 출원의 포도당-6-인산-이성화효소는 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 포도당-6-인산-이성화효소는 서열번호 63의 아미노산 서열로 이루어진 단백질일 수 있다. 또한, 상기 포도당-6-인산-이성화효소는 서열번호 64의 염기서열에 의해 암호화될 수 있다.
본 출원의 과당-6-인산-3-에피머화 효소는 과당-6-인산을 싸이코스-6-인산으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 과당-6-인산-3-에피머화 효소는 서열번호 65의 아미노산 서열로 이루어진 단백질일 수 있다. 또한, 본 출원의 과당-6-인산-3-에피머화 효소는 서열번호 66의 뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화될 수 있다.
본 출원의 싸이코스 생산용 조성물은 포도당을 전분, 말토덱스트린 또는 수크로스로 전환시키는 활성을 가지는 단백질(예컨대, 4-α-글루카노트랜스퍼라아제 등)을 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 포도당을 전분, 말토덱스트린 또는 수크로스로 전환시키는 활성을 가지는 단백질은 서열번호 67의 아미노산 서열로 이루어진 효소일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 68의 뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화될 수 있다. 본원의 싸이코스 생산용 조성물은 당해 싸이코스 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 부형제에는, 예를 들어, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 및 등장화제 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원의 싸이코스 생산용 조성물은 금속 이온 또는 금속염을 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 금속 이온은 2가 양이온일 수 있으며, 구체적으로 Ni, Mg, Mg, Ni, Co, Mn, Fe 및 Zn으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 금속 이온일 수 있다. 보다 구체적으로, 본 출원의 싸이코스 생산용 조성물은 금속염을 추가로 포함할 수 있으며, 보다 더 구체적으로 상기 금속염은 NiSO 4, MgSO 4, MgCl 2, NiCl 2, CoSO 4, CoCl 2, MnCl 2, FeSO 4 및 ZnSO 4로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 출원은 또 다른 하나의 양태로서, 싸이코스-6-인산에 이노시톨-모노-포스파타아제, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜 상기 싸이코스-6-인산을 싸이코스로 전환하는 단계를 포함하는 싸이코스 제조방법을 제공한다.
본 출원의 제조방법에서 이노시톨-모노-포스파타아제는 X a1-X a2-X a3-DPLDG-X a4의 모티프 A; 및 Y a1-D-Y a2-W a1-Y a3-W a2-Y a4-W a3의 모티프 B를 포함하는 이노시톨-모노-포스파타아제일 수 있다. 본 출원에서 이노시톨-모노-포스파타아제는 싸이코스-6-인산 탈인산효소와 호환되어 사용될 수 있으며, 따라서 싸이코스-6-인산 탈인산효소에 대한 전술한 양태에서의 설명은 이노시톨-모노-포스파타아제에 적용될 수 있다.
본 출원의 방법은 싸이코스-6-인산을 싸이코스로 전환하는 단계 이전, 과당-6-인산(fructose-6-phosphate)에 과당-6-인산-3-에피머화 효소, 상기 과당-6-인산-3-에피머화 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 과당-6-인산-3-에피머화 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 과당-6-인산을 싸이코스-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 출원의 방법은 상기 과당-6-인산을 싸이코스-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당-6-인산(Glucose-6-phosphate)에 포도당-6-인산-이성화효소, 상기 포도당-6-인산-이성화효소를 발현하는 미생물 또는 상기 포도당-6-인산-이성화효소를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 출원의 방법은 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당-1-인산(Glucose-1-phosphate)에 포스포글루코무타아제, 상기 포스포글루코무타아제를 발현하는 미생물 또는 상기 포스포글루코무타아제를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 출원의 방법은 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당(Glucose)에 포도당 인산화 효소, 상기 포도당 인산화 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 포도당 인산화 효소를 발현하는 미생물의 배양물, 및 포스페이트를 접촉시켜, 상기 포도당을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 출원의 방법은 상기 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제 또는 수크로오스 포스포릴라아제; 상기 포스포릴라아제를 발현하는 미생물; 또는 상기 포스포릴라아제를 발현하는 미생물의 배양물, 및 포스페이트를 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합을 포도당-1-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 출원의 방법은 상기 포도당을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제; 상기 α-아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제를 발현하는 미생물; 또는 상기 α-아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합을 포도당으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 출원은 또 다른 일 양태로서, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합, 및 포스페이트에 (a) 이노시톨-모노-포스파타아제; 과당-6-인산-3-에피머화효소; 포도당-6-인산-이성화효소; 포스포글루코무타아제 또는 포도당 인산화 효소; 및 α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, α-아밀라아제, 풀루란아제, 이소아밀라아제, 글루코아밀라아제 또는 수크라아제; 또는 (b) 상기 항목 (a)의 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시키는 단계를 포함하는, 싸이코스 제조방법을 제공한다.
본 출원의 제조방법에 있어서, 본 출원의 접촉은 pH 5.0 내지 9.0, 구체적으로 pH 6.0 내지 8.0에서 실시할 수 있다.
본 출원의 제조방법에 있어서, 본 출원의 접촉은 40℃ 내지 80℃ 온도, 구체적으로 40℃ 내지 60℃ 또는 50℃ 내지 60℃ 온도에서 실시할 수 있다.
본 출원의 제조방법에 있어서, 본 출원의 접촉은 2시간 내지 24시간, 구체적으로 6 시간 내지 24시간 동안 실시할 수 있다.
본 출원의 제조방법에 있어서, 본 출원의 접촉은 pH 5.0 내지 9.0, 40℃ 내지 80℃ 온도, 및/또는 2 시간 내지 24 시간 동안 실시할 수 있다. 구체적으로, 상기 접촉은 pH 6.0 내지 8.0, 40℃ 내지 60℃ 또는 50℃ 내지 60℃ 온도, 및/또는 6시간 내지 24시간 동안 실시할 수 있다.
본 출원의 제조방법은 싸이코스를 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 출원의 정제는 특별히 제한되지 아니하며, 본 출원의 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법을 사용할 수 있다. 비제한적인 예로, 크로마토그래피, 분별 결정 및 이온 정제 등을 들 수 있다. 상기 정제 방법은 하나만 실시될 수도 있으며, 두 가지 이상의 방법을 함께 실시할 수도 있다. 예를 들어, 크로마토그래피를 통해 싸이코스 생성 반응물을 정제할 수 있으며, 상기 크로마토그래피에 의한 당의 분리는 분리하고자 하는 당과 이온 수지에 부착된 금속 이온 사이의 약한 결합력의 차이를 이용하여 수행될 수 있다.
또한, 본 출원은 본 출원의 정제하는 단계의 전 또는 후에 탈색, 탈염 또는 둘 다를 실시하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 탈색 및/또는 탈염을 실시함으로써, 불순물 없이 보다 정제된 싸이코스 반응물을 얻을 수 있다.
본 출원의 신규한 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소인 이노시톨-모노-포스파타아제는 내열성이 있어 싸이코스-6-인산을 싸이코스로 전환하는 경로를 산업적으로 수행할 수 있고, 경제적인 원료인 포도당 또는 전분(예컨대, 말토덱스트린)을 사용하여 싸이코스 합성 경로의 진행을 가능하게 하며, 비가역 반응 경로인 싸이코스-6-인산 탈인산화 반응에 의하여 싸이코스 생산을 가능하게 하는바 싸이코스로의 전환율을 현저히 높일 수 있다.
또한, 본 출원의 이노시톨-모노-포스파타아제를 이용한 싸이코스 제조방법은 싸이코스 전환율 상승에 의하여 반응 결과물이 고농도의 싸이코스를 포함하여 분리정제 공정을 단순화 또는 제거할 수 있는바, 제조방법이 간단하면서도 경제적인 이점이 있다.
도 1은 전분(예컨대, 말토덱스트린) 또는 포도당으로부터 싸이코스를 제조할 수 있는 효소반응 경로의 일 모식도이다.
도 2a 내지 2c는 본 출원의 정제된 재조합 효소들(pET21a-CJ_Rma, pET21a-CJ_Tle, pET21a-CJ_Mrub, pET21a-CJ_Dtu, pBT7-C-His-CJ_Pfe, pBT7-C-His-CJ_Twi, pBT7-C-His-CJ_Tth, pBT7-C-His-CJ_Tli, pBT7-C-His-CJ_Gst, pBT7-C-His-CJ_Ath, pBT7-C-His-CJ_Sac, pBT7-C-His-CJ_Tta, pBT7-C-His-CJ_Pfu, pBT7-C-His-CJ_Afu, pBT7-C-His-CJ_Aac, pET21a-CJ_Msi, pET21a-CJ_Mruf, pET21a-CJ_Mta, pET21a-CJ_Mch 및 pET21a-CJ_Mce)의 분자량을 단백질 전기영동(SDS-PAGE) 분석결과이다. M은 단백질 크기 측정 마커(size marker), S는 발현된 조효소, E는 각각의 효소를 나타낸다.
도 3a는 본 출원의 이노시톨-모노-포스파타아제(pET21a-CJ_Rma, pET21a-CJ_Tle, pET21a-CJ_Mrub, pET21a-CJ_Dtu, pBT7-C-His-CJ_Pfe, pBT7-C-His-CJ_Twi, pBT7-C-His-CJ_Tth, pBT7-C-His-CJ_Tli, pBT7-C-His-CJ_Gst, pBT7-C-His-CJ_Ath, pBT7-C-His-CJ_Sac, pBT7-C-His-CJ_Tta, pBT7-C-His-CJ_Pfu, pBT7-C-His-CJ_Afu, pBT7-C-His-CJ_Aac)의 싸이코스 탈인산 상대활성(%, 왼쪽 Y축, 막대그래프)과 포도당-6-인산, 포도당-1-인산, 과당-6-인산 및 싸이코스-6-인산 탈인산 혼합액에서의 싸이코스 선택적 탈인산율(%, 오른쪽 Y축, 사각 도트)을 나타낸 결과이다.
도 3b는 본 출원의 이노시톨-모노-포스파타아제(pET21a-CJ_Mrub, pET21a-CJ_Msi, pET21a-CJ_Mruf, pET21a-CJ_Mta, pET21a-CJ_Mch, pET21a-CJ_Mce)의 싸이코스 탈인산 상대활성(%) 비교 결과이다.
도 4a는 α-글루칸 포스포릴라이제, 포스포글루코무타아제, 포도당-6-인산-이성화효소, 4-α-글루카노트랜스퍼라아제, 과당-6-인산-3-에피머화효소 및 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소가 첨가된 복합효소반응을 이용하여 말토덱스트린으로부터 싸이코스가 생성됨을 확인한 HPLC 크로마토그래피 결과이다.
도 4b는 본 출원의 이노시톨-모노-포스파타아제가 포도당-1-인산, 포도당-6-인산, 과당-6인산 및 싸이코스-6-인산이 혼재된 복합 반응액에서도 싸이코스-6-인산을 선택적으로 탈인산화하여 싸이코스를 생성함을 확인한 HPLC 크로마토그래피 결과이다.
이하, 본 출원을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하나, 이는 본 출원의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 출원의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 이노시톨-모노-포스파타아제의 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물의 제조
본 출원의 싸이코스 제조 경로에 필요한 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소를 제공하기 위하여 내열성의 이노시톨-모노-포스파타아제 유전자를 선발하였다. 구체적으로, Genbank에 등록된 로도써머스 마리너스( Rhodothermus marinus), 써모토가 레팅게( Thermotoga lettingae), 메이오써머스 루버( Meiothermus ruber), 딕토글로머스 터기덤( Dictyoglomus turgidum), 파이로바쿨럼 페리듄센스( Pyrobaculum ferrireducens), 써모어네로박터 위제리( Thermoanaerobacter wiegelii), 써머스 써모필러스( Thermus thermophilus), 써모코커스 리토랄리스( Thermococcus litoralis), 지오바실러스 스테레아써모필러스( Geobacillus stearothermophilus), 어네오리아 써모필리아( Anaerolinea thermophila), 썰폴로보스 에씨도칼다리어스( Sulfolobus acidocaldarius), 써모썰피디박터 타카이( Thermosulfidibacter takaii), 파이로코커스 퓨리어스( Pyrococcus furiosus), 아키오글로버스 퓰지더스( Archaeoglobus fulgidus), 알리시슬로바실러스 에씨도칼다리어스( Alicyclobacillus acidocaldarius), 메이오써머스 실바너스( Meiothermus silvanus), 메이오써머스 루퍼스( Meiothermus rufus), 메이오써머스 타이완네시스( Meiothermus taiwanensis), 메이오써머스 치리아로필러스( Meiothermus chliarophilus), 메이오써머스 쎄베레우스( Meiothermus cerbereus) 유전체 서열들을 대상으로 이노시톨-모노-포스파타아제 유전자(Rma, Tle, Mrub, Dtu, Msi, Mruf, Mta, Mch 및 Mce)를 선발하였다.
상기 선발한 유전자의 염기서열[상기 유전자의 순서대로 각각 서열번호 21, 22, 23, 24, 36, 37, 38, 39, 40]과 아미노산 서열[상기 유전자의 순서대로 각각 서열번호 1, 2, 3, 4, 16, 17, 18, 19, 내지 20] 정보를 바탕으로 정방향 프라이머(forward primer, 서열번호 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57) 및 역방향 프라이머(reverse primer, 서열번호 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58)를 고안하였다. 합성된 프라이머를 이용하여 각 로도써머스 마리너스( Rhodothermus marinus), 써모토가 레팅게( Thermotoga lettingae), 메이오써머스 루버( Meiothermus ruber), 딕토글로머스 터기덤( Dictyoglomus turgidum), 메이오써머스 실바너스( Meiothermus silvanus), 메이오써머스 루퍼스( Meiothermus rufus), 메이오써머스 타이완네시스( Meiothermus taiwanensis), 메이오써머스 치리아로필러스( Meiothermus chliarophilus), 메이오써머스 쎄베레우스( Meiothermus cerbereus)의 염색체 DNA(genomic DNA)로부터 각각의 유전자를 중합효소 연쇄반응(PCR)을 이용하여 증폭하고, 증폭된 각각의 이노시톨-모노-포스파타아제를 제한효소 NdeⅠ 및 XhoⅠ 또는 Sal I을 사용하여 대장균 발현용 플라스미드 벡터 pET21a(Novagen사)에 삽입하여 각각 pET21a-CJ_Rma(Nde I/Xho I), pET21a-CJ_Tle(Nde I/Xho I), pET21a-CJ_Mrub(Nde I/Xho I), pET21a-CJ_Dtu(Nde I/Xho I), pET21a-CJ_Msi(Nde I/Sal I), pET21a-CJ_Mruf(Nde I/Sal I), pET21a-CJ_Mta(Nde I/Sal I), pET21a-CJ_Mch(Nde I/Sal I), pET21a-CJ_Mce(Nde I/Sal I) 이라 명명된 재조합 발현벡터를 제작하였다.
추가적으로 파이로바쿨럼 페리듄센스( Pyrobaculum ferrireducens), 써모어네로박터 위제리( Thermoanaerobacter wiegelii), 써머스 써모필러스( Thermus thermophilus), 써모코커스 리토랄리스( Thermococcus litoralis), 지오바실러스 스테레아써모필러스( Geobacillus stearothermophilus), 어네오리아 써모필리아( Anaerolinea thermophila), 썰폴로보스 에씨도칼다리어스( Sulfolobus acidocaldarius), 써모썰피디박터 타카이( Thermosulfidibacter takaii), 파이로코커스 퓨리어스( Pyrococcus furiosus), 아키오글로버스 퓰지더스( Archaeoglobus fulgidus), 알리시슬로바실러스 에씨도칼다리어스( Alicyclobacillus acidocaldarius) 유래 이노시톨-모노포스파테이즈 유전자(Pfe, Twi, Tth, Tli, Gst, Ath, Sac, Tta, Pfu, Afu, Aac)를 선발하고, 상기 유전자의 각 염기서열[상기 유전자의 순서대로 각각 서열번호 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35]과 아미노산 서열[상기 유전자의 순서대로 각각 서열번호 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15] 정보를 바탕으로 DNA를 합성을 의뢰하여(바이오니아社), 벡터 pBT7-C-His(바이오니아사)에 삽입한 각각 pBT7-C-His-CJ_Pfe, pBT7-C-His-CJ_Twi, pBT7-C-His-CJ_Tth, pBT7-C-His-CJ_Tli, pBT7-C-His-CJ_Gst, pBT7-C-His-CJ_Ath, pBT7-C-His-CJ_Sac, pBT7-C-His-CJ_Tta, pBT7-C-His-CJ_Pfu, pBT7-C-His-CJ_Afu, pBT7-C-His-CJ_Aac이라 명명된 재조합 발현벡터를 제작하였다.
상기 발현벡터는 통상적인 형질전환 방법[참조: Sambrook et al. 1989]으로 대장균( E. coli) BL21(DE3) 균주에 각각 형질 전환하여 E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Rma( E. coli_P1_CJ_Rma, KCCM12057P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Tle( E. coli_P2_CJ_Tle, KCCM12058P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mrub( E. coli_P3_CJ_Mrub, KCCM12059P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Dtu( E. coli_P4_CJ_Dtu, KCCM12060P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Pfe( E. coli_P5_CJ_Pfe, KCCM12061P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Twi( E. coli_P6_CJ_Twi, KCCM12062P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tth( E. coli_P7_CJ_Tth, KCCM12063P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tli( E. coli_P8_CJ_Tli, KCCM12064P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Gst( E. coli_P9_CJ_Gst, KCCM12065P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Ath( E. coli_P10_CJ_Ath, KCCM12066P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Sac( E. coli_P11_CJ_Sac, KCCM12067P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tta( E. coli_P12_CJ_Tta, KCCM12068P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Pfu( E. coli_P13_CJ_Pfu, KCCM12069P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Afu( E. coli_P14_CJ_Afu, KCCM12070P), E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Aac( E. coli_P15_CJ_Aac, KCCM12071P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Msi( E. coli_P16_CJ_Msi, KCCM12072P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mruf( E. coli_P17_CJ_Mruf, KCCM12073P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mta( E. coli_P18_CJ_Mta, KCCM12074P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mch( E. coli_P19_CJ_Mch, KCCM12075P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mce( E. coli_P20_CJ_Mce, KCCM12076P)이라 명명된 형질전환 미생물을 제조하였다.
상기 형질전환균주를 부다페스트 조약 하에 2017년 7월 10일자로 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 기탁하여 기탁번호 KCCM12057P 내지 KCCM12076P를 부여 받았다.
실시예 2: 싸이코스 제조 경로에 필요한 효소의 제조
써모토가 네아폴리타나 유래 본 출원의 싸이코스 제조 경로에 필요한 내열성 효소인 α-글루칸 포스포릴라아제(α-glucan phosphorylase), 포스포글루코무타아제(phosphoglucomutase), 포도당-6-인산-이성화효소(glucose-6-phosphate-isomerase) 및 과당-6-인산-3-에피머화효소(fructose-6-phosphate-3-epimerase)를 제공하기 위하여 상기 효소들로 예상되는 유전자(상기 효소들의 기재 순서대로 각각 ct1, ct2, tn1 및 fp3e)를 선발하였다.
상기 선발한 유전자의 염기서열[상기 효소들의 기재 순서대로 각각 서열번호 60, 62, 64 및 66] 및 아미노산 서열[상기 효소들의 기재 순서대로 각각 서열번호 59, 61, 63 및 65]을 기반으로 정방향 프라이머(forward primer, 서열번호 69, 71, 73 및 75) 및 역방향 프라이머(reverse primer, 서열번호 70, 72, 74 및 76)를 고안하여 합성하고, 이를 이용하여 써모토가 네아폴리타나의 염색체 DNA(genomic DNA)를 주형으로 중합효소 연쇄반응(PCR)을 이용하여 95℃에서 30초 동안 변성, 55℃에서 30초 동안 어닐링 및 68℃에서 2분 동안 중합하였고, 상기 반응들은 25회 반복한 조건을 사용하여 각 효소의 유전자를 증폭하였다. 증폭된 각 효소 유전자는 제한효소 NdeⅠ 및 XhoⅠ을 사용하여 대장균 발현용 플라스미드 벡터 pET21a(Novagen사)에 삽입하여 각각 pET21a-CJ_ct1, pET21a-CJ_ct2, pET21a-CJ_ tn1 및 pET21a-CJ_ fp3e라 명명된 재조합 발현벡터를 제작하였다. 상기 재조합 발현벡터를 통상적인 형질전환 방법(참조: Sambrook et al. 1989)으로 대장균 BL21(DE3) 균주에 형질 전환하여 형질전환된 미생물을 제조하고 E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct1(KCCM11990P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct2(KCCM11991P), E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn1(KCCM11992P) 및 E. coli BL21(DE3)/CJ_tn_fp3e(KCCM11848P)로 명명하였다. 균주는 부다페스트 조약 하에 2016년 6월 23일자로 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 기탁하여 기탁번호를 부여 받았다.
실시예 3: 재조합 효소의 제조
재조합 효소를 제조하기 위해, 실시예 1 및 2에서 제조한 각 형질전환 미생물을 LB 액체배지 5 ml를 포함하는 배양 튜브에 접종하고, 600 nm에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37 ℃의 진탕 배양기에서 종균 배양을 하였다. 본 종균 배양된 배양액을 LB 액체배지를 포함하는 배양 플라스크에 접종하여 본 배양을 진행하였다. 600 nm에서의 흡광도가 2.0이 될 때 1 mM IPTG를 첨가하여 재조합 효소의 발현생산을 유도하였다. 상기 배양 과정 중의 교반 속도는 180 rpm이며 배양 온도는 37 ℃가 유지되도록 하였다. 배양액은 8,000×g로 4 ℃에서 20분 동안 원심분리 후 균체를 회수하였다. 회수된 균체는 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액으로 2회 세척하였고, 동일 완충용액으로 현탁 후 초음파 세포파쇄기를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄물은 13,000×g로 4 ℃에서 20분 동안 원심분리 후 상등액만을 취하였다. 상기 상등액으로부터 His-tag 친화 크로마토그래피를 사용하여 재조합 효소를 정제하고, 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액으로 투석한 후 반응에 사용하였다.
SDS-PAGE 분석을 통하여 분자량을 확인하였으며, 각 형질전환미생물에 의하여 제조한 정제된 효소명 및 분자량(도 2a 내지 도 2c)은 하기와 같다:
E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Rma( E. coli_P1_CJ_Rma)로부터 제조된 효소(RMA로 기재)는 30.3 kDa,
E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Tle( E. coli_P2_CJ_Tle)로부터 제조된 효소(TLE로 기재)는 28.5 kDa,
E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mrub( E. coli_P3_CJ_Mrub)로부터 제조된 효소(MRUB로 기재)는 28 kDa,
E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Dtu( E. coli_P4_CJ_Dtu)로부터 제조된 효소(DTU로 기재)는 30.2 kDa,
E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Pfe( E. coli_P5_CJ_Pfe)로부터 제조된 효소(PFE로 기재)는 27.2 kDa,
E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Twi( E. coli_P6_CJ_Twi)로부터 제조된 효소(TWI로 기재)는 28.8 kDa,
E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tth( E. coli_P7_CJ_Tth)로부터 제조된 효소(TTH로 기재)는 28.6 kDa,
E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tli( E. coli_P8_CJ_Tli)로부터 제조된 효소(TLI로 기재)는 28 kDa,
E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Gst( E. coli_P9_CJ_Gst)로부터 제조된 효소(GST로 기재)는 29.6 kDa,
E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Ath( E. coli_P10_CJ_Ath)로부터 제조된 효소(ATH로 기재)는 28.7 kDa,
E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Sac( E. coli_P11_CJ_Sac)로부터 제조된 효소(SAC로 기재)는 29.9 kDa,
E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Tta( E. coli_P12_CJ_Tta)로부터 제조된 효소(TTA로 기재)는 28.6 kDa,
E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Pfu( E. coli_P13_CJ_Pfu)로부터 제조된 효소(PFU로 기재)는 27.9 kDa,
E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Afu( E. coli_P14_CJ_Afu)로부터 제조된 효소(AFU로 기재)는 28 kDa,
E. coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_Aac( E. coli_P15_CJ_Aac)로부터 제조된 효소(AAC로 기재)는 29 kDa,
E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Msi( E. coli_P16_CJ_Msi)로부터 제조된 효소(MSI로 기재)는 28.1 kDa,
E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mruf( E. coli_P17_CJ_Mruf)로부터 제조된 효소(MRUF로 기재)는 28 kDa,
E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mta( E. coli_P18_CJ_Mta)로부터 제조된 효소(MTA로 기재)는 28.1 kDa,
E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mch( E. coli_P19_CJ_Mch)로부터 제조된 효소(MCH로 기재)는 28.4 kDa,
E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_Mce( E. coli_P20_CJ_Mce)로부터 제조된 효소(MCE로 기재)는 28.1 kDa,
E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct1(KCCM11990P)로부터 제조된 효소(CT1로 기재),
E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct2(KCCM11991P)로부터 제조된 효소(CT2로 기재),
E. coli BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn1(KCCM11992P)로부터 제조된 효소(TN1로 기재),
E. coli BL21(DE3)/CJ_tn_fp3e(KCCM11848P)로부터 제조된 효소(FP3E로 기재).
실시예 4: 이노시톨-모노-포스파타아제의 활성 분석
4-1. 싸이코스 -6-인산 탈인산 효소 활성 분석
싸이코스-6-인산의 구입이 어려운바, 과당-6-인산으로부터 싸이코스-6-인산을 제조한 후 이노시톨-모노-포스파타아제에 의한 싸이코스 생산 활성을 확인하였다.
구체적으로, 50 mM 과당-6-인산을 50 mM Tris-HCl(pH 7.0) 완충용액에 현탁한 후, 실시예 3에서 제조한 과당-6-인산-3-에피머화효소(이하, FP3E) 및 이노시톨-모노-포스파타아제 20종을 각각 0.1 unit/ml 첨가하고, 70℃에서 1시간 동안 반응시켰다. HPLC를 이용하여 싸이코스 생성 여부를 분석하였으며, HPLC 분석은 SP_0810(Shodex사) 컬럼과 Aminex HPX-87C(Bio-RAD사) 컬럼을 사용하여 80℃에서 이동상으로 0.6 ml/min 유속으로 흘려 주면서 수행하였으며, Refractive Index Detector(RID)로 검출하였다.
그 결과, 모든 20종의 이노시톨-모노-포스파타아제에서 싸이코스-6-인산의 탈인산 역가를 확인하였다(도 3a 및 3b).
4-2. 싸이코스 -6-인산 특이적 탈인산화 활성 분석
포도당-6-인산, 포도당-1-인산, 과당-6-인산 및 싸이코스-6-인산의 혼합액에서 각 이노시톨-모노-포스파타아제의 싸이코스-6-인산 특이적 탈인산화율을 측정하였다.
구체적으로, 0.1 unit/ml의 각각의 이노시톨-모노-포스파타아제 및 5 mM MgCl 2을 1 %(w/v) 포도당-6-인산, 포도당-1-인산, 과당-6-인산 및 싸이코스-6-인산의 혼합액에 첨가하여 50℃에서 12시간 반응시킨 후, HPLC를 이용하여 반응물을 분석하였다. HPLC 분석은 Aminex HPX-87C(Bio-RAD사) 컬럼을 사용하여 80℃에서 이동상으로 0.6 ml/min 유속으로 흘려 주면서 수행하였고 Refractive Index Detector로 생성된 싸이코스 및 기타당(과당 및 포도당)을 검출하였다.
그 결과, MRUB 효소 싸이코스-6-인산 특이적 탈인산화율이 가장 높음을 확인하였다(도 3a).
실시예 5: 복합효소 반응을 통한 싸이코스 생산 활성 분석
말토덱스트린으로부터 싸이코스 생산을 위해 및 CT1, CT2, TN1, FP3E 및 MRUB 효소를 동시에 반응시켰다. 각 효소는 0.1 unit/ml을 사용하였고, 5 mM MgCl 2, 20 mM의 인산나트륨(Sodium phosphate pH 7.0)에 5 %(w/v) 말토덱스트린을 첨가하여 온도 50℃에서 12시간 반응 후 HPLC를 이용하여 반응 결과물에서 싸이코스를 HPLC를 이용하여 분석하였다. HPLC 분석은 Aminex HPX-87C(Bio-RAD사) 컬럼을 사용하여 80℃에서 이동상으로 0.6 ml/min 유속으로 흘려 주면서 수행하였으며, Refractive Index Detector로 검출하였다.
그 결과, 복합효소반응에 의하여 말토덱스트린으로부터 싸이코스가 생성됨을 확인하였다(도 4a).
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
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Claims (19)

  1. X a1-X a2-X a3-DPLDG-X a4의 아미노산 서열을 갖는 모티프 A; 및
    Y a1-D-Y a2-W a1-Y a3-W a2-Y a4-W a3의 아미노산 서열을 갖는 모티프 B를 포함하는 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소로,
    상기 모티프 A에서, X a1는 W, F, V, I, 또는 A이고, X a2는 I, F, V, A, 또는 없음이고, X a3는 V, I, 또는 L이고, X a4 는 T 또는 S이고,
    상기 모티프 B에서, Y a1는 W, Y, T, L, 또는 V이고, Y a2는 V, I, C, F, 또는 A이고, W a1은 AAG, AAS, SAG, APG, APF, AGG, APL, 또는 AGA이고, Y a3은 W, I, P, M, V, Y, F, R, L, T, 또는 S이고, W a2는 LLV, LIV, LLI, LII, ILI, FIA, ALV, IIA, VLV, VIL, TIG, NFC 또는 PIF이고, Y a4는 E, R, S, T, L, K, 또는 P이고, W a3은 EAGG, EGGG, EAKG, KAGG, AAGG, YVDG, EAGA, 또는 RLGV인 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소.
  2. 제1항에 있어서, 상기 모티프 A에서, X a1는 W 또는 F이고, X a2는 I 또는 V이고, X a3는 V, 또는 I이고, X a4 는 T이고, 상기 모티프 B에서, Y a1는 W이고, Y a2는 V, 또는 I이고, W a1은 AAG 이고, Y a3은 W, I, 또는 V이고, W a2는 LLV, LIV, LII 또는 LLI 이고, Y a4는 E, R, 또는 S이고, W a3은 EAGG, 또는 EGGG인 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소.
  3. 제1항에 있어서, 상기 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19,서열번호 20의 아미노산 또는 이와 상기 모티프 A 및 상기 모티프 B를 이외의 부분에서 85% 이상의 상동성을 갖는 서열을 포함하는 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소(psicose-6-phosphate phosphatase).
  4. 제3항에 있어서, 상기 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19 또는 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 싸이코스-6-인산 탈인산 효소는 각각 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39 또는 서열번호 40의 뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화되는 것인, 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항의 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소를 암호화하는 핵산.
  6. 제5항의 핵산을 포함하는 형질전환체.
  7. 이노시톨-모노-포스파타아제(inositol-mono-phosphatase), 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 싸이코스 생산용 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 이노시톨-모노-포스파타아제는 제1항 내지 제4항의 중 어느 하나의 항의 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소인, 싸이코스 생산용 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 싸이코스 생산용 조성물은,
    (a) (i) 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합; (ii) 포스페이트(phosphate); (iii) 과당-6-인산-3-에피머화 효소; (iv) 포도당-6-인산-이성화효소; (v) 포스포글루코무타아제 또는 포도당 인산화 효소; 및
    (vi) α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, α-아밀라아제, 풀루란아제, 이소아밀라아제, 글루코아밀라아제 또는 수크라아제; 또는
    (b) 상기 항목 (a)의 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 추가적으로 포함하는, 싸이코스 생산용 조성물.
  10. 싸이코스-6-인산에 제1항 내지 제4항의 효소 또는 이노시톨-모노-포스파타아제, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜 상기 싸이코스-6-인산을 싸이코스로 전환하는 단계를 포함하는 싸이코스 제조방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 이노시톨-모노-포스파타아제는 제1항 내지 제4항의 효중 어느 하나의 항에 따른 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소인, 싸이코스 제조방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 방법은 싸이코스-6-인산을 싸이코스로 전환하는 단계 이전, 과당-6-인산(fructose-6-phosphate)에 과당-6-인산-3-에피머화 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 과당-6-인산을 싸이코스-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함하는, 싸이코스 제조방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 방법은 상기 과당-6-인산을 싸이코스-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당-6-인산(Glucose-6-phosphate)에 포도당-6-인산-이성화효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함하는, 싸이코스 제조방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 방법은 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당-1-인산(Glucose-1-phosphate)에 포스포글루코무타아제, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함하는, 싸이코스 제조방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 방법은 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당(Glucose)에 포도당 인산화 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물, 및 포스페이트를 접촉시켜, 상기 포도당을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함하는, 싸이코스 제조방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 방법은 상기 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제 또는 수크로오스 포스포릴라아제; 이를 발현하는 미생물; 또는 상기 미생물의 배양물, 및 포스페이트를 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합을 포도당-1-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함하는, 싸이코스 제조방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 방법은 상기 포도당을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제; 이를 발현하는 미생물; 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합을 포도당으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함하는, 싸이코스 제조방법.
  18. 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합, 및 포스페이트에 (a) 제1항의 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소; 과당-6-인산-3-에피머화효소; 포도당-6-인산-이성화효소; 포스포글루코무타아제 또는 포도당 인산화 효소; 및 α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, α-아밀라아제, 풀루란아제, 이소아밀라아제, 글루코아밀라아제 또는 수크라아제; 또는 (b) 상기 항목 (a)의 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시키는 단계를 포함하는, 싸이코스 제조방법.
  19. 제10항 및 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉은 pH 5.0 내지 9.0, 40℃ 내지 80℃ 온도, 및/또는 2시간 내지 24 시간 동안 실시하는, 싸이코스 제조방법.
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