WO2019132556A1 - 신규 내열성 과당-6-인산 3-에피머화 효소 및 이를 이용한 알룰로스 제조방법 - Google Patents

신규 내열성 과당-6-인산 3-에피머화 효소 및 이를 이용한 알룰로스 제조방법 Download PDF

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WO2019132556A1
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fructose
epimerase
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glucose
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김양희
김정은
박을수
김수진
김성보
양성재
최은정
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씨제이제일제당 주식회사
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    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
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    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/24—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an isomerase, e.g. fructose

Definitions

  • the present application relates to fructose-6-phosphate 3-epimerase and a method for producing alulose using the same.
  • D-psicose 3-epimerase (EC 5.1.3.30) and D-tagatose 3-epimerase (EC 5.1.3.31) produced D-fructose in the presence of 3-epimerase (3-epimerization, 3-carbon epimerization), which is known as an enzyme capable of producing aluloses.
  • 3-epimerase 3-epimerization, 3-carbon epimerization
  • the present inventors have made an effort to develop a method that can increase the conversion rate to aluloses economically and industrially.
  • glucose or glucose-1-phosphate, glucose-6-phosphate and fructose-6-phosphate from glucose, starch or maltodextrin which are economical raw materials.
  • alulose-6-phosphate it is possible to produce alululose using allulose-6-phosphate phosphatase, which performs an irreversible reaction pathway, Considering that alululose can be produced by one-pot enzymatic conversions in which a plurality of enzymes involved in the production pathway of aluloses can be used at the same time and the conversion rate to alulose can be remarkably increased, -Phosphoric acid into allylulose-6-phosphate, the present application has been completed.
  • One object of the present application is to provide a fructose-6-phosphate 3-epimerase comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Another object of the present application is to provide a nucleic acid encoding the fructose-6-phosphate 3-epimerase of the present application.
  • Another object of the present invention is to provide a transformant comprising a nucleic acid encoding the fructose-6-phosphate 3-epimerase of the present application.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for producing allulose comprising the fructose-6-phosphate 3-epimerase of the present application, a microorganism expressing the same, or a culture of the microorganism.
  • the heat-resistant fructose-6-phosphate 3-epimerase of the present application has heat resistance and can be industrially carried out to convert fructose-6-phosphate into allylulose-6-phosphate, and using an economical raw material, It is possible to proceed the synthesis pathway, and it is possible to produce aluloses by the allylulose-6-phosphate dephosphorylation reaction, which is an irreversible reaction pathway, so that the conversion to alulose can be markedly increased.
  • the method for producing aluloses using the fructose-6-phosphate 3-epimerase of the present application can increase the conversion rate to aluloses, so that the resultant reaction can include allylose at a high concentration to simplify or eliminate the separation and purification process
  • the bar has a simple and economical manufacturing method.
  • Figure 1 shows the reaction pathways in which aluloses can be prepared from starch (e.g., maltodextrin), sucrose or glucose.
  • starch e.g., maltodextrin
  • sucrose e.g., glucose
  • FIG. 2 shows the results of analysis of the molecular weight of the fructose-6-phosphate 3-epimerase (FP3E) of the present application by protein electrophoresis (SDS-PAGE).
  • FIG. 3 shows the conversion activity of fructose-6-phosphate 3-epimerase of the present application from fructose-6-phosphate to alulose-6-phosphate.
  • Fig. 4 shows the activity of the fructose-6-phosphate 3-epimerase of the present application according to pH.
  • FIG. 5 shows the activity of the fructose-6-phosphate 3-epimerase of the present application according to the temperature.
  • Fig. 6 shows the activity of the fructose-6-phosphate 3-epimerase of the present application upon addition of a metal ion.
  • the present application provides, as one embodiment, a fructose-6-phosphate 3-epimerase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the fructose-6-phosphate 3-epimerase of the present application may comprise a polypeptide having at least 80%, 90%, 95%, 97% or 99% homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO:
  • a protein having an activity corresponding to the fructose-6-phosphate 3-epimerase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 of the present application it may be added to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a naturally occurring mutation, Or a silent mutation thereof, and the protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is also within the scope of the present application.
  • the fructose-6-phosphate 3-epimerase may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and may be at least 80%, 90%, 95% , 97%, or 99% homologous to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO. It is obvious that a polynucleotide capable of being translated into a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a protein having homology thereto by codon degeneracy can also be included in the scope of the present application.
  • the term "homology” means the degree to which a given amino acid sequence or base sequence is consistent and can be expressed as a percentage.
  • its homologous sequence having the same or similar activity as a given amino acid sequence or base sequence is referred to as "% homology ".
  • standard software for calculating parameters such as score, identity and similarity, specifically BLAST 2.0, or by sequential hybridization experiments under defined stringent conditions, And the appropriate hybridization conditions to be defined are within the skill of the art and can be determined by methods well known to those skilled in the art (for example, J.
  • &quot stringent conditions " as used herein refers to conditions that allow specific hybridization between polynucleotides. For example, these conditions are specifically described in the literature (e.g., J. Sambrook et al., Same as above).
  • the stringent conditions can be adjusted to ascertain homology.
  • hybridization conditions of low stringency corresponding to a Tm value of 55 ° C, may be used, for example, 5XSSC, 0.1% SDS, 0.25% milk, and formamide; Or 30% formamide, 5XSSC, 0.5% SDS conditions may be used.
  • Hybridization conditions of mild stringency correspond to high Tm values, for example 40% formamide with 5X or 6X SSC can be used.
  • High stringency hybridization conditions correspond to the highest Tm values, for example, 50% formamide, 5X or 6XSSC conditions may be used.
  • the present invention is not limited to the above example.
  • Hybridization requires that two nucleic acids have a complementary sequence, although mismatches between bases are possible, depending on the severity of hybridization.
  • complementary is used to describe the relationship between nucleotide bases capable of hybridizing with each other. For example, with respect to DNA, adenosine is complementary to thymine and cytosine is complementary to guanine.
  • the present application may also include substantially similar nucleic acid sequences as well as isolated nucleic acid fragments complementary to the entire sequence.
  • polynucleotides having homology can be detected using hybridization conditions including the hybridization step at a Tm value of 55 ° C and using the conditions described above.
  • the Tm value may be 60 ° C, 63 ° C, or 65 ° C, but is not limited thereto and may be suitably adjusted by those skilled in the art according to the purpose.
  • the appropriate stringency of hybridizing the polynucleotide depends on the length and complementarity of the polynucleotide, and the variables are well known in the art. The greater the similarity or degree of homology between two nucleotide sequences, the larger the Tm value for hybrids of polynucleotides with such sequences.
  • the relative stability of the hybridization of the polynucleotide decreases in the following order: RNA: RNA, DNA: RNA, DNA: DNA.
  • the Tm calculation formula is known (see Sambrook et al., Supra, 9.50-9.51).
  • Oligonucleotides mismatch positions can be more important and the length of oligonucleotides can determine their specificity (Sambrook et al., Supra, 11.7-11.8 Reference).
  • the polynucleotide can be detected using a hybridization condition that is lower than the 500 mM salt and includes at least a hybridization step at 37 ° C, and a washing step at 2X SSPE at least 63 ° C.
  • the hybridization conditions may be lower than 200 mM salt and may include a hybridization step of at least 37 < 0 > C.
  • the hybridization conditions may include 63 ° C and 2XSSPE in both the hybridization and washing steps.
  • the length of the hybridizing nucleic acid can be, for example, at least about 10 nucleotides, 15 nucleotides, 20 nucleotides, or at least 30 nucleotides.
  • those skilled in the art will be able to adjust the temperature and wash solution salt concentration as needed depending on factors such as the length of the probe.
  • the fructose-6-phosphate 3-epimerase of the present application may be an enzyme derived from the genus Thermotoga , and specifically, thermotoga but are not limited to, enzymes derived from petrophilia .
  • the fructose-6-phosphate 3-epimerase of the present application has a pH of 5.0 to 10.0, 5.0 to 9.0, 5.0 to 8.0, 5.0 to 7.5, 6.0 to 10.0, 6.0 to 9.0, 6.0 to 8.0, 6.0 to 7.5, 6.5 to 10.0 , 90-99.9% relative to the maximum activity in the range of 6.5 to 9.0, 6.5 to 8.0, 6.5 to 7.5, 7.0 to 10.0, 7.0 to 9.0, 7.0 to 8.0, 7.0 to 7.5 or 7.5.
  • the fructose-6-phosphate 3-epimerase of the present application may be used in an amount of from 40 to 90, 40 to 80, 40 to 70, 40 to 60, 50 to 90, 50 to 80, 50 to 70, 50 to 60, 55 to 90, 60 to 99.9%, 70 to 99.9%, 80 to 99.9%, or 90 to 99.9% of the maximum activity at 55 to 80, 55 to 70, 55 to 65, 58 to 63, .
  • the fructose-6-phosphate 3-epimerase of the present application may be one whose activity increases in the presence of Mn, Mg or Ni ions.
  • the present application provides, in another aspect, a nucleic acid encoding the fructose-6-phosphate 3-epimerase of the present application.
  • the present application provides, as yet another embodiment, a transformant comprising a nucleic acid encoding the fructose-6-phosphate 3-epimerase of the present application.
  • transformation in the present application means introducing a vector comprising a nucleic acid encoding a target protein into a host cell so that the protein encoded by the nucleic acid can be expressed in the host cell.
  • the transformed nucleic acid may be either inserted into the chromosome of the host cell or located outside the chromosome, as long as it can be expressed in the host cell.
  • the nucleic acid includes DNA and RNA encoding the target protein.
  • the nucleic acid may be introduced in any form as long as it can be introduced into a host cell and expressed therefrom.
  • the nucleic acid may be introduced into the host cell in the form of an expression cassette, which is a gene construct containing all the elements necessary for its expression.
  • the expression cassette can typically include a promoter operably linked to the nucleic acid, a transcription termination signal, a ribosome binding site, and a translation termination signal.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self-replication.
  • the nucleic acid may be introduced into the host cell in its own form and operably linked to the sequence necessary for expression in the host cell, but is not limited thereto.
  • operably linked means that the gene sequence is functionally linked to a promoter sequence that initiates and mediates transcription of a nucleic acid encoding the protein of interest of the present application.
  • the method of transforming the vector of the present application includes any method of introducing a nucleic acid into a cell and may be carried out by selecting a suitable standard technique as known in the art depending on the host cell. For example, electroporation, calcium phosphate (CaPO 4 ) precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, microinjection, polyethylene glycol (PEG) method, DEAE-dextran method, A lithium acetate-DMSO method, and the like, but are not limited thereto.
  • the host cell it is preferable to use a host having a high efficiency of introducing DNA and a high efficiency of expression of the introduced DNA.
  • a host having a high efficiency of introducing DNA and a high efficiency of expression of the introduced DNA.
  • it may be E. coli, but is not limited thereto.
  • a method for producing a fructose-6-phosphate 3-epimerase of the present application a microorganism expressing the fructose-6-phosphate 3-epimerase of the present application, 3-epimerase, and a culture of a microorganism expressing the 3-epimerase.
  • the composition for producing an alulose of the present application may be prepared by using an enzyme involved in an alulose production route (see FIG. 1) of the present application, a microorganism expressing an enzyme participating in the alulose production route of the present application, A culture of a microorganism expressing an enzyme participating in the pathway may be additionally included.
  • an enzyme involved in an alulose production route see FIG. 1 of the present application
  • a microorganism expressing an enzyme participating in the alulose production route of the present application A culture of a microorganism expressing an enzyme participating in the pathway may be additionally included.
  • the fructose-6-phosphate-epimerizing enzyme of the present application as an example, it is possible that the enzymes contained in the composition for producing aluloses of the present application and the substrate used for the production of aluloses are limited It does not.
  • composition for the production of aluloses of the present application is composed of alulose-6-phosphate dephosphorylase, a microorganism expressing the alulose-6-phosphate dephosphorylase or the alulose-6- A culture of a microorganism expressing the phosphorylase may be additionally included.
  • composition for producing aluloses of the present application comprises (a) (i) a starch, maltodextrin, sucrose or a combination thereof, glucose, glucose-1-phosphate, glucose-6-phosphate or fructose-6-phosphate; (ii) phosphate; (iii) alulose-6-phosphate dephosphorylase; (iv) Glucose-6-phosphate-isomerizing enzyme; (v) phosphoglucomutase or glucose phosphorylase; And / or (vi) a compound selected from the group consisting of? -Glucan phosphorylase, starch phosphorylase, maltodextrin phosphorylase, sucrose phosphorylase,?
  • the starch / maltodextrin phosphorylase (EC 2.4.1.1) and? -Glucan phosphorylase of the present application phosphorylate phosphate to glucose and convert starch or maltodextrin to glucose -1-phosphate. ≪ / RTI >
  • the sucrose phosphorylase (EC 2.4.1.7) of the present application may contain any protein as long as it is a protein having an activity of phosphorylating phosphate to glucose to produce glucose-1-phosphate from sucrose.
  • Amylase (EC 3.2.1.1), pullulanse (EC 3.2.1.41), glucoamylase (EC 3.2.1.3), and isoamylase, which are starch hydrolyzate enzymes of the present application, May contain any protein as long as it is a protein having an activity of converting starch or maltodextrin to glucose.
  • the sucrase (EC 3.2.1.26) of the present application may contain any protein as long as it is a protein having activity to convert sucrose to glucose.
  • the phosphoglucomutase (EC 5.4.2.2) of the present application may contain any protein as long as it is a protein having an activity of converting glucose-1-phosphate into glucose-6-phosphate.
  • Glucokinase may contain any protein that has the activity of converting phosphate into glucose and converting it to glucose-6-phosphate.
  • the glucose phosphoinase may be a polyphosphate-dependent glucose phosphorylase, and more specifically, a dephosphorylated enzyme such as Deinococcus of amino acid sequence number 5 and base sequence number 7 geothermalis derived polyphosphate-dependent kinases glucose or amino acid SEQ ID NO: 6 and nucleotide SEQ ID NO: 8 of Anaerolinea thermophila- derived polyphosphate-dependent glucose phosphorylase.
  • the glucose-6-phosphate-isomerizing enzyme of the present application may contain any protein as long as it is a protein having an activity of converting glucose-6-phosphate into fructose-6-phosphate.
  • the allyl-6-phosphate dephosphorylase of the present application may contain any protein as long as the protein has an activity of converting alulos-6-phosphate to alulose. More specifically, the alulose-6-phosphate dephosphorylase may be a protein irreversibly active in converting alulose-6-phosphate into alulose.
  • a fructose-6-phosphate 3-epimerase comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, fructose-6-phosphate 3- 6-phosphate is converted to allulose-6-phosphate by contacting a microorganism expressing the epimerase or a culture of the microorganism expressing the fructose-6-phosphate 3-epimerase
  • the method comprises the steps of:
  • the production method of the present application is characterized in that after converting the fructose-6-phosphate of the present application to alululose-6-phosphate, alulose-6-phosphate dephosphorylase , Contacting the microorganism expressing the alulose-6-phosphate dephosphorylase or a culture of the microorganism expressing the alulos-6-phosphate dephosphorylase to convert the alulos-6-phosphate into alulose Step < / RTI >
  • the production method of the present application is also characterized in that glucose-6-phosphate isomerase is added to glucose-6-phosphate before the step of converting fructose-6-phosphate into alulose-6- 6-phosphate isomerizing enzyme or a culture of the microorganism expressing the glucose-6-phosphate isomerizing enzyme is brought into contact with the glucose-6-phosphate isomerizing enzyme to convert the glucose-6-phosphate isomer into fructose- .
  • the production method of the present application is characterized in that, prior to the step of converting the glucose-6-phosphate of the present application into fructose-6-phosphate, a phosphoglucomutase is added to glucose-
  • the method may further comprise the step of bringing into contact a microorganism expressing glucomutase or a culture of a microorganism expressing the phosphoglucosimetase to convert the glucose-1-phosphate into glucose-6-phosphate.
  • the production method of the present application is characterized in that, prior to the step of converting glucose-6-phosphate of the present application into fructose-6-phosphate, glucose glucose oxidase, a microorganism expressing the glucose phosphorylase, , And converting the glucose to glucose-6-phosphate by contacting the culture with a phosphate and a culture of a microorganism expressing the glucose.
  • the production method of the present application can be carried out before the step of converting glucose-1-phosphate of the present application into glucose-6-phosphate, starch, maltodextrin, sucrose or a combination thereof with? -Glucan phosphorylase, Lyase, maltodextrin phosphorylase or sucrose phosphorylase; A microorganism expressing the phosphorylase; Or a culture of a microorganism expressing the phosphorylase, and a phosphate, and converting the starch, maltodextrin, sucrose or a combination thereof to glucose-1-phosphate.
  • the production method of the present application can also be carried out before the step of converting the glucose of the present application into glucose-6-phosphate, or by adding ⁇ -amylase, Isoamylase; A microorganism expressing the amylase, the pluranase or the sucrase; Or converting the starch, maltodextrin, sucrose, or a combination thereof into glucose by contacting the amylase, the plurasease or sucrase with a culture of the microorganism.
  • the production method of the present application is characterized in that 4- ⁇ -glucanotransferase, a microorganism expressing the 4- ⁇ -glucanotransferase, or a culture of the microorganism expressing the 4- ⁇ -glucanotransferase To convert the glucose to starch, maltodextrin or sucrose.
  • the 'contact' of the present application can be carried out at a pH of 5.0 to 10.0, 50 to 90 ° C, and / or 1 minute to 24 hours.
  • the contact of the present application is carried out at a pH of 5.0 to 10.0, 5.0 to 9.0, pH 5.0 to 8.0, pH 5.0 to 7.0, pH 5.0 to 6.0, pH 6.0 to 10.0, pH 6.0 to 9.0, pH 6.0 to 8.0, 7.0, pH 7.0 to 10.0, pH 7.0 to 9.0, pH 7.0 to 8.0, pH 8.0 to 10.0, pH 8.0 to 9.0, or pH 9.0 to 10.0.
  • the contact of the present application can be carried out at 50 ⁇ to 90 ⁇ , 55 ⁇ to 90 ⁇ , 60 ⁇ to 90 ⁇ , 60 ⁇ to 75 ⁇ , 65 ⁇ to 75 ⁇ , or 60 ⁇ to 70 ⁇ .
  • the contact of the present application may be carried out for a period of 1 minute to 12 hours, 1 minute to 6 hours, 1 minute to 3 hours, 1 minute to 1 hour, 5 minutes to 24 hours, 5 minutes to 12 hours, 5 minutes to 6 hours, 5 Min to 3 hours, 5 minutes to 1 hour, 10 minutes to 24 hours, 10 minutes to 12 hours, 10 minutes to 6 hours, 10 minutes to 3 hours, or 10 minutes to 1 hour.
  • the manufacturing method of the present application may further include the step of adding Mn, Mg or Ni ions.
  • the present application provides, in yet another embodiment, a method of producing a starch, maltodextrin, sucrose, or a combination thereof, and (a) an allylose-6-phosphate dephosphorylase in a phosphate; A fructose-6-phosphate 3-epimerase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; Glucose-6-phosphate-isomerizing enzyme; Phosphoglucomutase or glucose phosphorylase; And ⁇ -glucan phosphorylase, starch phosphorylase, maltodextrin phosphorylase, sucrose phosphorylase, ⁇ -amylase, pullulanase, isoamylase, glucoamylase or sucrase; Or (b) contacting a microorganism expressing the enzyme of the item (a) or a culture of the microorganism.
  • Example 1 fructose-6-phosphate 3- Epimerization Preparation of Recombinant Expression Vector and Transforming Microorganism Containing Genes of Enzymes
  • thermophilic microorganism a thermophilic microorganism, petrophila
  • recombinant expression vectors and transforming microorganisms were prepared.
  • Genbank selects the gene fp3e expected to be a fructose-6-phosphate 3-epimerase based on the petrofilament gene sequences, and the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) and the nucleotide sequence 2 (SEQ ID NO: 3) and reverse primer (SEQ ID NO: 4) were designed and synthesized based on the information.
  • Thermo was subjected to polymerase chain reaction (PCR) using a genomic DNA as a template, and plasmid vector pET24a (Novagen) for expression of E. coli was digested with restriction enzymes NdeI and XhoI.
  • CJ_tp_fp3e To prepare a recombinant expression vector named CJ_tp_fp3e.
  • CJ_tp_fp3e was transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) strain by a conventional transformation method (Sambrook et al. 1989) to prepare a microorganism transformed with a recombinant vector containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and E. coli BL21 (DE3) / CJ_tp_fp3e.
  • the strain E. coli BL21 (DE3) / CJ_tp_fp3e was deposited under the Budapest Treaty with the Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) on September 19, 2017, and received the deposit number KCCM12116P.
  • E. coli BL21 (DE3) / CJ_tp_fp3e was inoculated into a culture tube containing 5 ml of LB liquid medium and shaken at 37 ° C until the absorbance at 600 nm reached 2.0
  • the seed culture was performed in an incubator.
  • the cultured medium was cultured in a culture flask containing LB liquid medium.
  • 1 mM IPTG was added to induce the expression of FP3E.
  • the seed culture and main culture were carried out at a stirring speed of 200 rpm and a temperature of 37.
  • the culture was centrifuged at 8,000 xg for 4 to 20 minutes, and the cells were recovered.
  • Cells recovered with 50 mM Tris-HCl (pH 7.0) buffer solution were washed twice, suspended in the same buffer solution, and then disrupted using an ultrasonic cell crusher.
  • the cell lysate was centrifuged at 13,000 x g for 4 to 20 minutes and then only the supernatant was taken and FP3E was purified from the supernatant using His-tag affinity chromatography.
  • the purified recombinant enzyme solution was dialyzed with 50 mM Tris-HCl (pH 7.0) buffer solution and used for characterization of the enzyme.
  • the molecular weight was confirmed by SDS-PAGE analysis, and it was confirmed that the molecular weight of the purified FP3E was about 25 kDa (FIG. 2).
  • alulose-6-phosphate phosphatase 6-phosphate was converted to alulose using phytase, and then the conversion activity was measured by whether or not alulose was produced. Specifically, after completion of the reaction, 10 units / ml of phytase was added and reacted at 37 ° C for 1 hour to dephosphorylate both the substrate fructose-6-phosphate and the product alululose-6-phosphate. The fructose and allylose were then analyzed by HPLC.
  • HPLC analysis was performed using Aminex HPX-87C (Bio-rad) column at 80 ° C with water flowing at a flow rate of 0.5 ml / min to the mobile phase, and fructose and alulose were detected with a Refractive Index Detector.
  • Example 4 Alulous Using substrates and enzymes required for the production pathway Alulous Manufacturing Confirmation
  • fructose-6-phosphate which is a substrate of the enzyme of the present application as a starch, maltodextrin, sucrose, glucose-1-phosphate, glucose and glucose-6-phosphate.
  • a starch maltodextrin
  • sucrose sucrose
  • glucose-1-phosphate glucose-1-phosphate
  • glucose-6-phosphate sucrose
  • glucose-1-phosphate glucose-1-phosphate
  • glucose-6-phosphate glucose-6-phosphate
  • sucrose a-glucan phosphorylase
  • the prepared glucose was treated with Deinococcus geothermalis- derived heat-resistant glucose phosphorylase (SEQ ID NO: 10) and Anaerolinea thermophila- derived heat-resistant glucose oxidase (SEQ ID NO: 11) 0.0 > Thermotoga < / RTI > Neapolitana- derived phosphoglucomutase (SEQ ID NO: 12) was transformed into glucose-6-phosphate, respectively. Then, it was confirmed that fructose-6-phosphate was produced by treating heat-resistant glucose-6-phosphate-isomerase (SEQ ID NO: 13) derived from Thermotoga maritima in the glucose-6-phosphate prepared above.
  • SEQ ID NO: 13 heat-resistant glucose-6-phosphate-isomerase
  • FP3E of the present application was treated as described in Example 3 to produce alulose-6-phosphate, and alulose-6-phosphate was produced by using allylose-6-phosphate dephosphorylase Ross.
  • aluloses could be prepared from various substrates and enzymes through the above pathway.
  • Example 5 pH, temperature and metal ion addition FP3E Verify Active

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Abstract

본 출원은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 과당-6-인산 3-에피머화 효소 (fructose-6-phosphate 3-epimerase), 상기 과당-6-인산 3-에피머화 효소를 암호화하는 핵산 및 상기 핵산을 포함하는 형질전환체에 관한 것이다. 또한, 본 출원은 본 출원의 과당-6-인산 3-에피머화 효소를 포함하는 알룰로스(allulose) 생산용 조성물 및 본 출원의 과당-6-인산 3-에피머화 효소를 이용한 알룰로스 제조방법에 관한 것이다.

Description

신규 내열성 과당-6-인산 3-에피머화 효소 및 이를 이용한 알룰로스 제조방법
본 출원은 과당-6-인산 3-에피머화 효소 및 이를 이용한 알룰로스 제조방법에 관한 것이다.
싸이코스 3-에피머화 효소(D-psicose 3-epimerase, EC 5.1.3.30) 및 타가토스 3-에피머화 효소(D-tagatose 3-epimerase, EC 5.1.3.31)는 과당(D-fructose)을 3-에피머화(3-epimerization, 3번 탄소 에피머화)함으로써 알룰로스를 생산할 수 있는 효소로 알려져 있다. 상기 효소를 이용하여 단일 효소 반응으로 과당에서 알룰로스를 생산하는 경우, 기질인 과당과 산물인 알룰로스 간에 일정 수준의 반응평형(reaction equilibrium)이 존재한다(산물/기질 = 약 20% 내지 35%). 따라서, 상기 단일 효소 반응을 이용하여 고순도의 알룰로스를 제조하는 경우, 반응 결과물에서 고농도의 과당을 분리하여 제거하는 추가 정제공정이 요구된다.
한편, Chan 등(2008. Biochemistry. 47:9608-9617)은 과당-6-인산(D-fructose 6-phosphate) 및 알룰로스 6-인산(D-allulose 6-phosphate)에 대해서 3-에피머화 반응을 수행할 수 있는 Streptococcus pyogenes 유래의 리블로스-5-인산 3-에피머화 효소(D-ribulose-5-phosphate 3-epimerase, EC 5.1.3.1) 및 E. coli 유래의 알룰로스-6-인산 3-에피머화 효소(D-allulose 6-phosphate 3-epimerase, EC 5.1.3.-)를 보고한 바 있으나, 상기 효소들은 내열성을 갖지 못하여 산업적으로 이용이 불가능한 문제점이 있다.
본 발명자들은 경제적이면서 산업적으로 알룰로스로의 전환율을 높일 수 있는 방법을 개발하기 위해 예의 노력하였다. 그 결과, 경제적 원료인 수크로스, 전분 또는 말토덱스트린으로부터 포도당(glucose) 또는 포도당-1-인산(glucose-1-phosphate), 포도당-6-인산(glucose-6-phosphate) 및 과당-6-인산으로의 전환을 거쳐 알룰로스-6-인산을 생산하는 경우, 이후 비가역 반응경로를 수행하는 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소(allulose-6-phosphate phosphatase)를 이용하여 알룰로스를 생산할 수 있어, 알룰로스 생산 경로에 관여하는 복수의 효소를 동시에 사용 가능한 동시효소반응(one-pot enzymatic conversions)으로 알룰로스를 생산할 수 있고, 알룰로스로의 전환율을 현저히 높일 수 있음에 착안하여, 상기 과당-6-인산을 알룰로스-6-인산으로 전환하는 경로에 적용할 수 있는 신규한 내열성 효소를 발굴함으로써 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 하나의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 과당-6-인산 3-에피머화 효소(fructose-6-phosphate 3-epimerase)를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은 본 출원의 과당-6-인산 3-에피머화 효소를 암호화하는 핵산을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 본 출원의 과당-6-인산 3-에피머화 효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 본 출원의 과당-6-인산 3-에피머화 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 알룰로스(allulose) 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 본 출원의 과당-6-인산 3-에피머화 효소를 이용한 알룰로스 제조방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 내열성 과당-6-인산 3-에피머화 효소는 내열성이 있어 과당-6-인산을 알룰로스-6-인산으로 전환하는 경로를 산업적으로 수행할 수 있고, 경제적인 원료를 사용하여 알룰로스 합성 경로의 진행을 가능하게 하며, 비가역 반응 경로인 알룰로스-6-인산 탈인산화 반응에 의하여 알룰로스 생산을 가능하게 하는바, 알룰로스로의 전환율을 현저히 높일 수 있다.
또한, 본 출원의 과당-6-인산 3-에피머화 효소를 이용한 알룰로스 제조방법은 알룰로스로의 전환율 상승에 의하여 반응 결과물이 고농도의 알룰로스를 포함하여 분리정제 공정을 단순화 또는 제거할 수 있는바, 제조 방법이 간단하면서도 경제적인 이점이 있다.
도 1은 전분(예컨대, 말토덱스트린), 수크로스 또는 포도당으로부터 알룰로스를 제조할 수 있는 반응 경로를 나타낸 것이다.
도 2는 본 출원의 과당-6-인산 3-에피머화 효소(FP3E)의 분자량을 단백질 전기영동(SDS-PAGE)으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 출원의 과당-6-인산 3-에피머화 효소의 과당-6-인산에서 알룰로스-6-인산으로의 전환 활성을 확인한 것이다.
도 4는 본 출원의 과당-6-인산 3-에피머화 효소의 pH에 따른 활성을 확인한 것이다.
도 5는 본 출원의 과당-6-인산 3-에피머화 효소의 온도에 따른 활성을 확인한 것이다.
도 6은 본 출원의 과당-6-인산 3-에피머화 효소의 금속 이온 첨가에 따른 활성을 확인한 것이다.
이하, 본 출원 내용에 대하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시한 일 양태의 설명 및 실시형태는 공통된 사항에 대하여 다른 양태의 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 또한, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 더불어, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 출원의 목적을 달성하기 위하여, 본 출원은 하나의 양태로서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 과당-6-인산 3-에피머화 효소(fructose-6-phosphate 3-epimerase)를 제공한다.
또한, 본 출원의 과당-6-인산 3-에피머화 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 상동성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 상동성을 가지며, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지더라도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
또한, 본 출원의 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 과당-6-인산 3-에피머화 효소와 상응하는 활성을 가지는 단백질이라면 서열번호 1의 아미노산 서열 앞뒤의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또한 본 출원의 범위 내에 속한다.
나아가, 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 과당-6-인산 3-에피머화 효소는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있고, 또한 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다. 코돈 축퇴성(codon degeneracy)에 의해 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 이와 상동성을 가지는 단백질로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 본 출원의 범위에 포함될 수 있음은 자명하다.
상기에서 용어 "상동성"은 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다. 상기에서 용어 “엄격한 조건”이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 예를 들어, 이러한 조건은 문헌(예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다.
본 출원에서 상기 엄격한 조건은 상동성을 확인하기 위해 조절될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 간의 상동성을 확인하기 위하여, 55℃의 Tm 값에 대응하는, 낮은 엄격도의 혼성화 조건이 이용될 수 있는데, 예를 들어, 5XSSC, 0.1% SDS, 0.25% 밀크, 및 무 포름아미드; 또는 30% 포름아미드, 5XSSC, 0.5% SDS 조건이 이용될 수 있다. 온화한 엄격도의 혼성화 조건은 높은 Tm 값에 대응하며, 예를 들어, 5X 또는 6XSSC를 갖는 40% 포름아미드가 사용될 수 있다. 높은 엄격도의 혼성화 조건은 가장 높은 Tm 값에 대응하며, 예를 들어, 50% 포름아미드, 5X 또는 6XSSC 조건이 이용될 수 있다. 다만, 상기 예에 제한되는 것은 아니다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다. 두 뉴클레오티드 서열 사이의 유사성 또는 상동성 정도가 더 클수록, 그러한 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 하이브리드에 대한 Tm 값은 더 커질 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 혼성화의 상대적 안정성(더 높은 Tm 값에 대응하는)은 하기 순서로 감소한다: RNA : RNA, DNA : RNA, DNA : DNA. 길이가 100 뉴클레오티드 보다 큰 하이브리드에 대하여, Tm 값 계산 수식은 공지되어 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51 참조). 더 짧은 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드와의 혼성화에 대하여, 미스매치 위치는 보다 더 중요할 수 있고, 올리고뉴클레오티드의 길이가 그 특이성을 결정할 수 있다(Sambrook et al., supra, 11.7-11.8 참조).
구체적으로, 폴리뉴클레오티드는 500 mM 염보다 낮고 적어도 37℃의 혼성화 단계, 및 적어도 63℃의 2XSSPE에서의 세척 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하여 탐지될 수 있다. 상기 혼성화 조건은 200 mM 염보다 낮고 적어도 37℃의 혼성화 단계를 포함할 수 있다. 또는 상기 혼성화 조건은 혼성화 및 세척 단계 모두에서 63℃ 및 2XSSPE를 포함할 수 있다.
혼성화 핵산의 길이는 예를 들면, 적어도 약 10 뉴클레오티드, 15 뉴클레오티드, 20 뉴클레오티드, 또는 적어도 30 뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 당업자는 온도 및 세척 용액 염 농도를 프로브의 길이와 같은 요소에 따라 필요할 경우 조절할 수 있다.
본 출원의 과당-6-인산 3-에피머화 효소는 써모토가(Thermotoga) 속 유래의 효소일 수 있으며, 구체적으로 써모토가 페트로필라(Thermotoga petrophila) 유래의 효소일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 과당-6-인산 3-에피머화 효소는 pH 5.0 내지 10.0, 5.0 내지 9.0, 5.0 내지 8.0, 5.0 내지 7.5, 6.0 내지 10.0, 6.0 내지 9.0, 6.0 내지 8.0, 6.0 내지 7.5, 6.5 내지 10.0, 6.5 내지 9.0, 6.5 내지 8.0, 6.5 내지 7.5, 7.0 내지 10.0, 7.0 내지 10.0, 7.0 내지 9.0, 7.0 내지 8.0, 7.0 내지 7.5 또는 7.5에서 최대 활성 대비 90 내지 99.9%의 활성을 갖는 것일 수 있다.
본 출원의 과당-6-인산 3-에피머화 효소는 40 내지 90, 40 내지 80, 40 내지 70, 40 내지 60, 50 내지 90, 50 내지 80, 50 내지 70, 50 내지 60, 55 내지 90, 55 내지 80, 55 내지 70, 55 내지 65, 58 내지 63 또는 60℃에서 최대 활성 대비 50 내지 99.9%, 60 내지 99.9%, 70 내지 99.9%, 80 내지 99.9%, 또는 90 내지 99.9%의 활성을 갖는 것일 수 있다.
본 출원의 과당-6-인산 3-에피머화 효소는 Mn, Mg 또는 Ni 이온의 존재 하에 활성이 증가하는 것일 수 있다.
본 출원은 다른 하나의 양태로서, 본 출원의 과당-6-인산 3-에피머화 효소를 암호화하는 핵산을 제공한다.
본 출원은 또 다른 하나의 양태로서, 본 출원의 과당-6-인산 3-에피머화 효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 형질전환체를 제공한다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 암호화하는 핵산 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 핵산이 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 핵산은 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 핵산은 표적 단백질을 암호화하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 핵산은 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 핵산은 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 핵산에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 핵산은 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 암호화하는 핵산의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 출원의 벡터를 형질전환 시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌 글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 숙주 세포로는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주를 사용하는 것이 좋은데, 예를 들어 대장균일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원은 또 다른 하나의 양태로서, 본 출원의 과당-6-인산 3-에피머화 효소, 본 출원의 과당-6-인산 3-에피머화 효소를 발현하는 미생물 또는 본 출원의 과당-6-인산 3-에피머화 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 포함하는 알룰로스 생산용 조성물을 제공한다.
본 출원의 알룰로스 생산용 조성물은, 본 출원의 알룰로스 제조 경로(도 1 참고)에 관여하는 효소, 본 출원의 알룰로스 제조 경로에 관여하는 효소를 발현하는 미생물, 또는 본 출원의 알룰로스 제조 경로에 관여하는 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 추가적으로 포함할 수 있다. 다만, 이는 예시적인 것으로 본 출원의 과당-6-인산-에피머화 효소를 이용하여 알룰로스를 생산할 수 있다면, 본 출원의 알룰로스 생산용 조성물에 포함되는 효소 및 알룰로스 생산에 이용되는 기질이 제한되지 않는다.
본 출원의 알룰로스 생산용 조성물은 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소(allulose-6-phosphate phosphatase), 상기 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 출원의 알룰로스 생산용 조성물은 (a) (i) 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합, 포도당, 포도당-1-인산, 포도당-6-인산, 또는 과당-6-인산; (ii) 포스페이트(phosphate); (iii) 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소; (iv) 포도당-6-인산-이성화효소; (v) 포스포글루코무타아제 또는 포도당 인산화 효소; 및/또는 (vi) α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, α-아밀라아제, 풀루란아제, 이소아밀라아제, 글루코아밀라아제 또는 수크라아제; 또는 (b) 상기 항목 (a)의 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 상기 항목 (a)의 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 추가적으로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 출원의 전분/말토덱스트린 포스포릴라아제(starch/maltodextrin phosphorylase, EC 2.4.1.1) 및 α-글루칸 포스포릴라아제는 포스페이트(phosphate)를 포도당에 인산화 전이시켜 전분 또는 말토덱스트린으로부터 포도당-1-인산을 생산하는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 본 출원의 수크로스 포스포릴라아제(sucrose phosphorylase, EC 2.4.1.7)는 포스페이트를 포도당에 인산화 전이시켜 수크로스로부터 포도당-1-인산을 생산하는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 본 출원의 전분 액당화 효소인 α-아밀라아제(α-amylase, EC 3.2.1.1), 풀루란아제(pullulanse, EC 3.2.1.41), 글루코아밀라아제(glucoamylase, EC 3.2.1.3) 및 이소아밀라아제(isoamylase)는 전분 또는 말토덱스트린을 포도당으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 본 출원의 수크라제(sucrase, EC 3.2.1.26)는 수크로스를 포도당으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 본 출원의 포스포글루코무타아제(phosphoglucomutase, EC 5.4.2.2)는 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 포도당인산화효소(glucokinase)는 포도당에 인산을 전이시켜 포도당-6-인산으로 전환하는 활성을 가지는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 포도당인산화효소는 폴리포스페이트 의존형 포도당인산화 효소일 수 있으며, 보다 구체적으로 아미노산 서열번호 5 및 염기 서열번호 7의 Deinococcus geothermalis 유래 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소 또는 아미노산 서열번호 6 및 염기 서열번호 8의 Anaerolinea thermophila 유래 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소일 수 있다. 본 출원의 포도당-6-인산-이성화효소는 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 본 출원의 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소는 알룰로스-6-인산을 알룰로스로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소는 비가역적으로 알룰로스-6-인산을 알룰로스로 전환시키는 활성을 갖는 단백질일 수 있다.
본 출원은 또 다른 하나의 양태로서, 과당-6-인산(fructose-6-phosphate)에 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 과당-6-인산 3-에피머화 효소, 상기 과당-6-인산 3-에피머화 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 과당-6-인산 3-에피머화 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜 과당-6-인산을 알룰로스-6-인산(allulose-6-phosphate)으로 전환하는 단계를 포함하는 알룰로스 제조방법을 제공한다.
본 출원의 제조방법은 본 출원의 과당-6-인산을 알룰로스-6-인산으로 전환하는 단계 이후, 알룰로스-6-인산(allulose-6-phosphate)에 알룰로스-6-인산 탈인산화효소, 상기 알룰로스-6-인산 탈인산화효소를 발현하는 미생물 또는 상기 알룰로스-6-인산 탈인산화효소를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 알룰로스-6-인산을 알룰로스로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 출원의 제조방법은 본 출원의 과당-6-인산을 알룰로스-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당-6-인산(Glucose-6-phosphate)에 포도당-6-인산 이성화효소, 상기 포도당-6-인산 이성화효소를 발현하는 미생물 또는 상기 포도당-6-인산 이성화효소를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 출원의 제조방법은 본 출원의 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당-1-인산(Glucose-1-phosphate)에 포스포글루코무타아제, 상기 포스포글루코무타아제를 발현하는 미생물 또는 상기 포스포글루코무타아제를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 출원의 제조방법은 본 출원의 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당(Glucose)에 포도당 인산화 효소, 상기 포도당 인산화 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 포도당 인산화 효소를 발현하는 미생물의 배양물, 및 포스페이트를 접촉시켜, 상기 포도당을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 출원의 제조방법은 본 출원의 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제 또는 수크로오스 포스포릴라아제; 상기 포스포릴라아제를 발현하는 미생물; 또는 상기 포스포릴라아제를 발현하는 미생물의 배양물, 및 포스페이트를 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합을 포도당-1-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 출원의 제조방법은 본 출원의 포도당을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제; 상기 아밀라아제, 플루란아제 또는 수크라아제를 발현하는 미생물; 또는 상기 아밀라아제, 플루란아제 또는 수크라아제를 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합을 포도당으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 출원의 제조방법은 포도당에 4-α-글루카노트랜스퍼라아제, 상기 4-α-글루카노트랜스퍼라아제를 발현하는 미생물 또는 상기 4-α-글루카노트랜스퍼라아제를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당을 전분, 말토덱스트린 또는 수크로스로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 출원의 제조방법에 있어서, 본 출원의 '접촉'은 pH 5.0 내지 10.0, 50℃ 내지 90℃, 및/또는 1분 내지 24시간 동안 실시할 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 접촉은 pH 5.0 내지 10.0, 5.0 내지 9.0, pH 5.0 내지 8.0, pH 5.0 내지 7.0, pH 5.0 내지 6.0, pH 6.0 내지 10.0, pH 6.0 내지 9.0, pH 6.0 내지 8.0, pH 6.0 내지 7.0, pH 7.0 내지 10.0, pH 7.0 내지 9.0, pH 7.0 내지 8.0, pH 8.0 내지 10.0, pH 8.0 내지 9.0, 또는 pH 9.0 내지 10.0에서 실시할 수 있다. 또한, 본 출원의 접촉은 50℃ 내지 90℃, 55℃ 내지 90℃, 60℃ 내지 90℃, 60℃ 내지 75℃, 65℃ 내지 75℃, 또는 60℃ 내지 70℃에서 실시할 수 있다. 더불어, 본 출원의 접촉은 1분 내지 12시간, 1분 내지 6시간, 1분 내지 3시간, 1분 내지 1시간, 5분 내지 24시간, 5분 내지 12시간, 5분 내지 6시간, 5분 내지 3시간, 5분 내지 1시간, 10분 내지 24시간, 10분 내지 12시간, 10분 내지 6시간, 10분 내지 3시간, 또는 10분 내지 1시간 동안 실시할 수 있다.
본 출원의 제조방법은 Mn, Mg 또는 Ni 이온을 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 출원은 또 다른 하나의 양태로서, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합, 및 포스페이트에 (a) 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소; 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 과당-6-인산 3-에피머화 효소; 포도당-6-인산-이성화효소; 포스포글루코무타아제 또는 포도당 인산화 효소; 및 α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, α-아밀라아제, 풀루란아제, 이소아밀라아제, 글루코아밀라아제 또는 수크라아제; 또는 (b) 상기 항목 (a)의 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시키는 단계를 포함하는, 알룰로스 제조방법을 제공한다.
이하 본 출원을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.
실시예 1: 과당-6-인산 3- 에피머화 효소의 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 형질전환 미생물의 제조
신규 내열성의 과당-6-인산 3-에피머화 효소를 발굴하기 위해 호열성 미생물인 써모토가 페트로필라(Thermotoga petrophila)에서 유전자를 분리하였고, 재조합 발현벡터 및 형질전환 미생물을 제조하였다.
구체적으로, Genbank에 등록된 써모토가 페트로필라 유전자 서열들을 대상으로 과당-6-인산 3-에피머화 효소로 예상되는 유전자 fp3e를 선발하고, 이의 아미노산 서열(서열번호 1)과 염기 서열(서열번호 2) 정보를 바탕으로 정방향 프라이머(서열번호 3) 및 역방향 프라이머(서열번호 4)를 고안하여 합성하였다. 상기 합성된 프라이머를 이용하여 써모토가 페트로필라 염색체 DNA(genomic DNA)를 주형으로 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하고, 제한효소 NdeI 및 XhoI을 사용하여 대장균 발현용 플라스미드 벡터 pET24a(Novagen사)에 삽입하여 CJ_tp_fp3e라 명명된 재조합 발현벡터를 제작하였다. CJ_tp_fp3e는 통상적인 형질전환 방법(참조: Sambrook et al. 1989)으로 대장균 BL21(DE3) 균주에 형질 전환하여 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 제조하고 E. coli BL21(DE3)/CJ_tp_fp3e로 명명하였다.
상기 E. coli BL21(DE3)/CJ_tp_fp3e 균주를 부다페스트 조약 하에 2017년 9월 19일자로 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 기탁하여 기탁번호 KCCM12116P를 부여 받았다.
실시예 2: 재조합 효소의 제조
재조합 효소(이하, FP3E)를 제조하기 위해, E. coli BL21(DE3)/CJ_tp_fp3e를 LB 액체배지 5 ml를 포함하는 배양 튜브에 접종하고, 600 nm에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃의 진탕 배양기에서 종균 배양을 하였다. 이후, 종균 배양된 배양액을 LB 액체배지를 포함하는 배양 플라스크에 접종하여 본 배양을 진행하였다. 이후, 600 nm에서의 흡광도가 2.0이 될 때 1 mM IPTG를 첨가하여 FP3E의 발현생산을 유도하였다. 상기 종균 배양 및 본 배양은 교반 속도 200 rpm, 온도 37에서 실시하였다. 배양 완료 후, 배양액을 8,000 x g로 4에서 20분 동안 원심분리 후 균체를 회수하였다. 50 mM Tris-HCl(pH 7.0) 완충용액으로 회수된 균체를 2회 세척하고, 동일 완충용액으로 현탁 후 초음파 세포파쇄기를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄물은 13,000 x g로 4에서 20분 동안 원심분리 후 상등액 만을 취하고, His-tag 친화 크로마토그래피를 사용하여 상기 상등액으로부터 FP3E를 정제하였다. 정제된 재조합 효소액은 50 mM Tris-HCl(pH 7.0) 완충용액으로 투석 후 효소의 특성 분석에 사용하였다.
SDS-PAGE 분석을 통하여 분자량을 확인하였으며, 그 결과 상기 정제된 FP3E의 분자량은 약 25 kDa인 것을 확인하였다(도 2).
실시예 3: FP3E의 활성 확인
FP3E의 과당-6-인산에서 알룰로스-6-인산으로의 전환 활성 분석을 위하여 50 mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충용액에 50 mM 과당-6-인산을 현탁하고, 이에 0.15 mg/ml 의 정제된 FP3E를 첨가하여 50℃에서 3시간 동안 반응시켰다.
현재시점에서 알룰로스-6-인산 표준물질이 존재하지 않아 알룰로스-6-인산 생성 여부의 측정이 불가능한 바, 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소(alullose-6-phosphate phosphatase)인 파이테이즈(phytase)를 사용하여 알룰로스-6-인산을 알룰로스로 전환한 후 알룰로스의 생성 여부로 상기 전환 활성을 측정하였다. 구체적으로, 상기 반응 완료 후, 10 unit/ml 파이테이즈를 첨가하고 37℃에서 1 시간 동안 반응시켜 기질인 과당-6-인산과 산물인 알룰로스-6-인산을 모두 탈인산화 하였다. 이후, 과당 및 알룰로스를 HPLC로 분석하였다. HPLC 분석은 Aminex HPX-87C(Bio-rad사) 컬럼을 사용하여 80℃에서 이동상으로 물을 0.5 ml/min 유속으로 흘려 주면서 수행하였으며, 과당 및 알룰로스는 Refractive Index Detector로 검출하였다.
그 결과, FP3E의 반응 결과물에서 과당 및 알룰로스가 검출되었는바(도 3), FP3E가 과당-6-인산을 3-에피머화하여 알룰로스-6-인산을 생성하는 활성이 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 알룰로스 제조 경로에 필요한 기질 및 효소를 이용한 알룰로스 제조 확인
상기 활성을 확인한 FP3E를 포함하여 도 1에 기재된 경로를 통한 알룰로스의 제조를 확인하기 위하여, 각종 기질 및 효소로부터 알룰로스 제조를 확인하였다.
전분, 말토덱스트린, 수크로스, 포도당-1-인산, 포도당, 포도당-6-인산으로터 본 출원의 효소의 기질인 과당-6-인산을 수득할 수 있는바, 상기 기질 간에 전환이 가능하다는 것은 당업자에게 알려져 있다. 이에 다양한 기질을 토대로 과당-6-인산 생성을 확인하고, 본 출원의 FP3E를 이용하여 알룰로스-6-인산 생성 이후 최종적으로 알룰로스의 생산을 확인하였다.
구체적으로, 수크로스에 수크라아제 등 효소를 처리하여 포도당으로 전환하는 과정은 이미 공지되어 있는바, 써모토가 네아폴리타나(Thermotoga neapolitana) 유래 내열성의 a-글루칸 포스포릴라아제(서열번호 9)를 이용하여 전분 및 말토덱스트린으로부터 포도당-1-인산 제조를 확인 하였다.
상기 제조된 포도당에 데이노코커스 지오써말리스(Deinococcus geothermalis) 유래 내열성 포도당인산화효소(서열번호 10), 언에어로리네 써모필라(Anaerolinea thermophila) 유래 내열성 포도당인산화효소(서열번호 11)를 처리하였고, 포도당-1-인산에 써모토가 네아폴리타나(Thermotoga neapolitana) 유래 내열성의 포스포글루코무타아제(서열번호 12)를 처리하여, 각각 포도당-6-인산으로 전환되는 것을 확인하였다. 이후 상기 제조된 포도당-6-인산에 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima) 유래 내열성의 포도당-6-인산-이성화효소(서열번호 13)를 처리하여 과당-6-인산이 생성되는 것을 확인하였다.
이후, 상기 실시예 3에서 확인한 바와 같이 본 출원의 FP3E를 처리하여 알룰로스-6-인산을 생성하고 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소인 파이테이즈를 사용하여 알룰로스-6-인산을 알룰로스로 전환하였다.
그 결과, 상기와 같이 알룰로스가 검출됨을 확인함으로써, 상기 경로를 통하여 각종 기질 및 효소로부터 알룰로스를 제조할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 5: pH, 온도, 금속이온 첨가에 따른 FP3E의 활성 확인
5-1. pH에 따른 활성 확인
FP3E에 대한 pH 영향성을 조사하기 위하여, pH 6.5~8.0의 20 mM 완충용액(6.5, 인산 칼륨: pH 7.0-8.0, Tris-HCl)에 현탁된 20 mM 과당-6-인산에 0.15 mg/ml의 정제된 FP3E를 첨가하여 50℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 이후, 실시예 3과 동일한 조건으로 파이테이즈와 반응시킨 후 HPLC를 이용하여 알룰로스를 정량 분석하였다.
그 결과, FP3E는 pH 7.0에서 최대 활성을 보였고, pH 6.5~pH 7.5의 범위에서 최대 활성 대비 90% 이상의 활성이 유지됨을 확인할 수 있었다(도 4).
5-2. 온도에 따른 활성 확인
온도에 따른 FP3E의 활성 분석을 위하여, 20 mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충용액에 현탁된 20 mM 과당-6-인산에 0.15 mg/ml의 정제된 FP3E를 첨가하여 40℃, 50℃, 60℃ 및 70℃에서 10분 동안 반응시켰다. 이후, 실시예 3과 동일 조건으로 파이테이즈와 반응시킨 후 HPLC를 이용하여 알룰로스를 정량 분석하였다.
그 결과, FP3E는 60℃에서 최대 활성을 나타내고, 40 내지 70℃에서 최대 활성의 50% 이상의 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다(도 5).
5-3. 금속 이온 첨가에 따른 활성 확인
금속 이온 첨가가 FP3E의 활성에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 20 mM Tris-HCl(pH 7.0) 완충용액에 현탁된 20 mM 과당-6-인산에 각각의 금속이온(NiSO4, CuSO4, MnSO4, ZnSO4, MgSO4)을 최종농도 0.5 mM로 첨가하였다. 이에, 금속 이온 제거를 위하여 10 mM EDTA를 처리하여 투석한 FP3E를 0.15 mg/ml 첨가하고, 50℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 이후, 실시예 3과 동일 조건으로 파이테이즈와 반응시킨 다음, HPLC를 이용하여 알룰로스를 정량 분석하였다.
그 결과, FP3E는 Mn, Mg 또는 Ni 이온 첨가 시 활성이 증가함을 확인할 수 있었다(도 6).
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2018016798-appb-I000001

Claims (13)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 과당-6-인산 3-에피머화 효소 (fructose-6-phosphate 3-epimerase).
  2. 제1항에 있어서, 상기 효소는 pH 5.0 내지 10.0에서 최대 활성 대비 90 내지 99.9%의 활성을 갖는 것인, 과당-6-인산 3-에피머화 효소.
  3. 제1항에 있어서, 상기 효소는 40℃ 내지 90℃에서 최대 활성 대비 50 내지 99.9%의 활성을 갖는 것인, 과당-6-인산 3-에피머화 효소.
  4. 제1항에 있어서, 상기 효소는, Mn, Mg 또는 Ni 이온의 존재 하에 활성이 증가하는 것인, 과당-6-인산 3-에피머화 효소.
  5. 제1항의 과당-6-인산 3-에피머화 효소를 암호화하는 핵산.
  6. 제5항의 핵산을 포함하는 형질전환체.
  7. 제1항의 과당-6-인산 3-에피머화 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 알룰로스(allulose) 생산용 조성물.
  8. 과당-6-인산(fructose-6-phosphate)에 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 과당-6-인산 3-에피머화 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜 과당-6-인산을 알룰로스-6-인산(allulose-6-phosphate)으로 전환하는 단계를 포함하는 알룰로스 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 제조방법은 pH 5.0 내지 10.0에서 수행되는 것인, 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 제조방법은 40℃ 내지 90℃에서 수행되는 것인, 방법.
  11. 제8항에 있어서, Mn, Mg 또는 Ni 이온을 첨가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉은 pH 5.0 내지 10.0, 온도 40℃ 내지 90℃, 및 1분 내지 24시간 동안 실시하는, 알룰로스 제조방법.
  13. 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합, 및 포스페이트에 (a) 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소; 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 과당-6-인산 3-에피머화 효소; 포도당-6-인산 이성화효소; 포스포글루코무타아제 또는 포도당 인산화 효소; 및 α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, α-아밀라아제, 풀루란아제, 이소아밀라아제, 글루코아밀라아제 또는 수크라아제; 또는 (b) 상기 항목 (a)의 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시키는 단계를 포함하는, 알룰로스 제조방법.
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