KR20200134382A - 특정 모티프를 포함하는 신규 내열성 리불로스-인산 3-에피머화 효소 - Google Patents

특정 모티프를 포함하는 신규 내열성 리불로스-인산 3-에피머화 효소 Download PDF

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Abstract

본 출원은 과당-6-인산-3-에피머화 효소, 이를 포함하는 미생물 및 조성물, 이를 이용한 싸이코스-6-인산 또는 싸이코스 제조방법에 관한 것이다.

Description

특정 모티프를 포함하는 신규 내열성 리불로스-인산 3-에피머화 효소 {Novel thermostable ribulose-phosphate 3-epimerases comprising two motifs}
본 출원은 과당-6-인산을 싸이코스-6-인산으로 전환하는 신규 효소, 포함하는 싸이코스-6-인산 또는 싸이코스 생산용 조성물, 및 이를 이용하여 싸이코스-6-인산 또는 싸이코스를 제조하는 방법에 관한 것이다.
싸이코스(알룰로스)는 과당(fructose)의 3번 탄소의 에피머로써, 자연계에 극소량 존재하는 희소당(rare sugar)으로 알려진 단당류이다. 설탕의 약 70% 감미도를 가지고 있으나 거의 제로 칼로리에 가깝고, 혈당 상승 억제 및 지방 합성 억제 등의 기능으로 기능성 식품에 사용될 수 있는 새로운 식품원료로서 많은 관심을 받고 있다.
이러한 특징으로 싸이코스는 설탕 대체 감미료로 다양한 식품에 사용이 고려되고 있으나, 자연계에 극히 소량 존재하기 때문에 싸이코스를 효율적으로 제조할 수 있는 방법에 대한 필요성이 높아지고 있다.
싸이코스 제조방법 중 하나로, 포도당(glucose) 또는 포도당-1-인산(glucose-1-phosphate), 포도당-6-인산(glucose-6-phosphate) 및 과당-6-인산으로의 전환을 거쳐 싸이코스-6-인산을 생산하는 공정이 알려져 있으나(대한민국 공개 10-2018-0004023), 보다 효율적이고 경제적인 싸이코스 생산을 위한 기술 개발의 요구가 높아지고 있다.
이러한 배경하에서, 본 출원인은 과당-6-인산의 활성에 크게 영향을 미치는 신규 모티프들을 확인하였고, 상기 모티프를 포함하는 과당-6-인산 3-에피머화 효소는 과당-6-인산으로부터 싸이코스-6-인산으로의 높은 활성을 나타내는 것을 확인하였다.
본 출원의 하나의 목적은 리불로스-인산 3-에피머화 효소를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 리불로스-인산 3-에피머화 효소를 코딩하는 핵산을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 리불로스-인산 3-에피머화 효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 리불로스-인산 3-에피머화 효소, 이를 발현하는 미생물, 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 싸이코스-6-인산 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 과당-6-인산(fructose-6-phosphate)에 리불로스-인산 3-에피머화 효소, 이를 발현하는 미생물, 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시키는 단계를 포함하는 싸이코스-6-인산 제조방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 리불로스-인산 3-에피머화 효소, 이를 발현하는 미생물, 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 싸이코스 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 과당-6-인산(fructose-6-phosphate)에 리불로스-인산 3-에피머화 효소, 이를 발현하는 미생물, 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시키는 단계를 포함하는 싸이코스 제조방법을 제공하는 것이다.
이하, 본 출원 내용에 대하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시한 일 양태의 설명 및 실시형태는 공통된 사항에 대하여 다른 양태의 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 또한, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 더불어, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 하나의 양태는 리불로스-인산 3-에피머화 효소를 제공하는 것이다.
구체적으로, 본 출원의 리불로스-인산 3-에피머화 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 모티프 I; 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 모티프 II를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서, “리불로스-인산 3-에피머화 효소”는 리불로스-인산 3-에피머화 효소 활성이 공지되었거나 리불로스-인산 3-에피머화 효소 활성이 있는 효소를 의미하며, 특히, 과당-6-인산 3-에피머화 효소로 작용할 수 있는 것을 의미한다. 상기 리불로스-인산 3-에피머화 효소는 과당-6-인산 3-에피머화 효소 또는 싸이코스-6-인산 3-에피머화 효소 (psicose-6-phosphate 3-epimerase)의 활성을 갖는 경우 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열도 포함할 수 있다. 또한 본 출원의 리불로스-인산 3-에피머화 효소가 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 모티프 I; 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 모티프 II를 포함하는 것은 자연 상태에서 리불로스-인산 3-에피머화 효소가 모티프 I, II를 포함하는 것일 수 있고, 리불로스-인산 3-에피머화 효소에서 모티프 I, II를 포함하도록 서열을 추가, 삭제, 또는 변형한 것일 수 있다.
본 출원에서, “과당-6-인산 3-에피머화 효소”는 과당-6-인산을 싸이코스(또는, 알룰로스)-6-인산으로 전환하는 활성을 갖는 효소로서, 상기 리불로스-인산 3-에피머화 효소 중 과당-6-인산을 싸이코스(또는, 알룰로스)-6-인산으로 전환하는 활성을 가지며, 리불로스-인산 3-에피머화 효소는 본 출원에서 “효소”와 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
본 출원에서, “모티프”는 효소 서열 내 특정 서열을 갖는 부위(영역)를 의미하는 것으로, 단백질의 특정 기능 또는 활성을 갖는 서열을 의미할 수 있으며, 미생물 종 간 보존된 서열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 출원의 리불로스-인산 3-에피머화 효소는 모티프 I 및 모티프 II로 명명한 2개의 모티프를 포함할 수 있고, 상기 모티프 I 및 II는 리불로스-인산 3-에피머화 효소 가 과당-6-인산에 대해 높은 선택적 활성을 나타내도록 하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서, “모티프 I”는 하기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있으나, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 활성에 영향을 미치지 않는 무의미한 아미노산 잔기의 삽입, 치환, 결실 등을 포함하는 서열까지 본 출원의 모티프 I에 해당함은 자명하다.
모티프 I(서열번호 1): S-X-M/I-C (X는 임의의 아미노산 잔기)
상기 모티프 I은 리불로스-인산 3-에피머화 효소의 N-말단 영역에 포함되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 모티프는 리불로스-인산 3-에피머화 효소 의 N-말단의 첫 아미노산으로부터 5번 내지 20번, 보다 구체적으로, 7번 내지 19번 아미노산에 위치하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 즉, 상기 모티프 I의 첫 아미노산 잔기인 세린(S)은 리불로스-인산 3-에피머화 효소 의 N-말단의 첫 아미노산으로부터 7번 내지 16번 사이에 위치할 수 있고, 모티프 I의 마지막 잔기인 시스테인(C)는 10번 내지 19번 사이에 위치할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 모티프 I은 베타시트 이후 형성되는 것일 수 있으며, 구체적으로 베타시트 이후 형성되는 알파 헬릭스 구조에 상기 모티프 I의 서열 일부가 포함될 수 있다.
구체적으로, 상기 X에는 임의의 아미노산이 제한 없이 포함될 수 있고, 구체적으로 메티오닌, 이소류신, 류신, 또는 발린이 될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 보다 구체적으로, 상기 모티프 I은 SIMC(서열번호 40), SMMC(서열번호 41), SLMC(서열번호 42), SVMC(서열번호 43), 또는 SLIC(서열번호 44)의 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서, “모티프 II”는 하기 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있으나, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열의 활성에 영향을 미치지 않는 무의미한 아미노산 잔기의 삽입, 치환, 결실 등을 포함하는 서열까지 본 출원의 모티프 II에 해당함은 자명하다.
모티프 II(서열번호 2): G-X-X-X-X-F/L (X는 임의의 아미노산 잔기)
상기 모티프 II는 리불로스-인산 3-에피머화 효소 의 C-말단 영역에 포함되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 리불로스-인산 3-에피머화 효소 의 N-말단 아미노산으로부터 190 내지 210번, 보다 구체적으로, 196 내지 210 번 아미노산에 위치하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 즉, 상기 모티프 II의 첫 아미노산 잔기인 글리신(G)은 리불로스-인산 3-에피머화 효소의 N-말단의 첫 아미노산으로부터 196번 내지 205번 사이에 위치할 수 있고, 모티프 II의 마지막 잔기인 페닐알라닌(F)또는 류신(L)은 201번 내지 210번 사이에 위치할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 모티프 II는 베타시트 이후 형성되는 것일 수 있으며, 구체적으로 베타시트 이후 형성되는 알파 헬릭스 구조에 상기 모티프 II의 서열 일부가 포함될 수 있다.
구체적으로, 상기 모티프 II의 각 X는 서로 독립적으로, 쓰레오닌, 세린, 글리신, 류신, 시스테인, 이소류신, 아스파라긴, 라이신, 알라닌, 발린, 또는 글루타민이 될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 보다 구체적으로, 상기 모티프 II는 GNSGLF (서열번호 45), GSSGLF (서열번호 46), GSSSLF (서열번호 47), GSTSLF (서열번호 48), GTAGLF (서열번호 49), GTKGLF (서열번호 50), GTQSLF (서열번호 51), GTSCLF (서열번호 52), GTSGLF (서열번호 53), GTSSIF (서열번호 54), GTSGIF (서열번호 55), GTSSLF (서열번호 56), GTSSVF (서열번호 57), 또는 GTSSVL (서열번호 58)의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 모티프 I 또는 II에 포함되는 각 아미노산 잔기들은 서로 독립적으로 조합되어 모티프를 구성할 수 있다.
본 출원의 리불로스-인산 3-에피머화 효소 는 특정 모티프를 포함함으로써 과당-6-인산에 대해 높은 활성을 나타낼 수 있으며, 이는 과당-6-인산으로부터 싸이코스-6-인산을 높은 수율로 얻을 수 있음을 시사할 뿐만 아니라, 다른 효소(예를 들어, 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소)와의 조합을 통해 목적 물질(예를 들어, 싸이코스)을 생산하는 데 효과적으로 이용될 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 리불로스-인산 3-에피머화 효소 는 모티프 I 및/또는 II를 포함하지 않는 효소에 비해 최소 7배 이상의 높은 과당-6-인산의 싸이코스-6-인산으로의 전환 활성을 나타낼 수 있다. 또한, 상기 리불로스-인산 3-에피머화 효소는 과당-6-인산을 싸이코스-6-인산으로 전환하는 것으로서, 12시간 이내에 5%(w/w) 말토덱스트린을 싸이코스로 19.7% 이상 전환하는 복합 반응에 이용되는 것일 수 있으나, 싸이코스를 생산하는 복합 반응에 이용될 수 있다면 제한없이 본 출원에 포함될 수 있다.
본 출원의 알파 헬릭스(α-helix) 구조, 베타 시트(β-sheet) 구조, 코일(coil) 구조는 KwangsooKim et. al (Crystal Structure of d-Psicose 3-epimerase from Agrobacterium tumefaciens and its Complex with True Substrate d-FructoseVolume 361, Issue 5, 1 September 2006, Pages 920-931) 등에서 언급된 바와 같은 통상적인 정의로 이해할 수 있으며, 상기 알파 헬릭스는 Right handed alpha helix일 수 있다. 상기 구조는 NMR, X-ray crystallography 등 통상적으로 알려진 방법에 의해서 직접 수행하거나, 아미노산 서열을 바탕으로 Rosetta 또는 웹서버 (I-TASSER, ROBETTA 등) 를 이용하여 예측하여 얻을 수 있다.
또한, 본 출원에서 구조가 집합된 도메인은 구조1-구조2와 같은 형태로 표시할 수 있다.
또한, 본 출원의 리불로스-인산 3-에피머화 효소는 언에어로라이네 (Anaerolineae), 크쏘노모나스 (Chthonomonas), 지오바실러스 (Geobacillus), 마헬라 (Mahella), 페트로토가 (Petrotoga), 심비오박테리움 (Symbiobacterium), 써모언에어리어박터(Thermoanaerobacter), 테피다네로박터(Tepidanaerobacter), 퍼미큐츠(Firmicutes), 아덴티카테니아(Ardenticatenia), 애리바실러스 (Aeribacillus), 이풀로피시움 (Epulopiscium), 메틸로써마쎄 (Methylothermaceae), 써모플라비마이크로비움 (Thermoflavimicrobium), 써모언에어로박터라쎄 (Thermoanaerobacteraceae) 속에서 선택되는 어느 하나의 유래의 과당-6-인산 3-에피머화 활성을 가지는 효소일 수 있고, 보다 구체적으로, 언에어로라이네 박테리움 (Anaerolineae bacterium), 크쏘노모나스 칼리디로세아 (Chthonomonas calidirosea), 지오바실러스 속 8 (Geobacillus sp. 8), 지오바실러스 써모카테눌라투스 (Geobacillus thermocatenulatus), 마헬라 아우스트 랄리엔시스 (Mahella australiensis), 페트로토가 속 9T1HF07.CasAA.8.2 (Petrotoga sp. 9T1HF07.CasAA.8.2), 페트로토가 속 9PWA.NaAc.5.4 (Petrotoga sp. 9PWA.NaAc.5.4), 심비오박테리움 써모필룸 (Symbiobacterium thermophilum), 써모언에어로박터 써모하이드로썰퍼리쿠스 (Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus), 써모언에어로박테리움 속 PSU-2 (Thermoanaerobacterium sp. PSU-2), 테피다네로박터 신트로 피쿠스 (Tepidanaerobacter syntrophicus), 퍼미큐츠 박테리움 HGW-Firmicutes-5 (Firmicutes bacterium HGW-Firmicutes-5), 아덴티카테니아 박테리움 (Ardenticatenia bacterium), 애리바실러스 팔리두스 (Aeribacillus pallidus), 이풀로피시움 속 SCG-B05WGA-EpuloA1 (Epulopiscium sp. SCG-B05WGA-EpuloA1), 메틸로써마쎄 박테리아 B42 (Methylothermaceae bacteria B42), 써모플라비마 이크로비움 디초토미쿰 (Thermoflavimicrobium dichotomicum) 또는 써모언에어로박터라쎄 박테리움 (Thermoanaerobacteraceae bacterium) 유래인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 출원의 리불로스-인산 3-에피머화 효소는 서열번호 3 내지 22의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 것일 수 있고, 또는 서열번호 3 내지 22의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열로 구성되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 보다 구체적으로, 상기 효소는 서열번호 7, 12, 또는 15의 아미노산 서열로 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또는, 본 출원의 리불로스-인산 3-에피머화 효소는 모티프 I 및 II의 존재 여부가 효소 활성에 중요한 영향을 미치므로, 상기 모티프 영역을 제외한 효소 서열은 서열 간 동일성이 낮을 수 있다. 구체적으로, 상기 아미노산 서열 중 상기 모티프 I 및 상기 모티프 II를 제외한 영역과 34% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열로 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 더욱 구체적으로 상기 아미노산 서열 중 상기 모티프 I 및 상기 모티프 II를 제외한 영역과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한, 서열번호 1 내지 22 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이와 70% 이상의 상동성(homology) 또는 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 상기 아미노산은 서열번호 1 내지 22의 서열 및 상기 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
즉, 본 출원에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 '이라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, 상기 효소와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 상기 아미노산 서열 앞뒤에 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 추가, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation) 또는 보존적 치환을 제외하는 것이 아니며, 이러한 서열 추가 혹은 돌연변이를 가지는 경우에도 본 출원의 범위 내에 속하는 것이 자명하다.
본 출원에서 용어, '상동성(homology)' 또는 '동일성(identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 서로 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다.
용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된 (conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상으로 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다. (GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol.48: 443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 일진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다. 따라서, 본 출원에서 사용된 것으로서, 용어 "상동성" 또는 "동일성"은 서열들간의 관련성(relevance)를 나타낸다.
한편, 본 출원의 리불로스-인산 3-에피머화 효소 는 내열성일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서, “내열성”은 고온 환경에서도 효소의 활성을 잃지 않고 본래의 활성을 나타낼 수 있는 성질을 의미하며, 효소의 내열성은 목적 산물을 생산하는 공정에서 다양한 이점을 갖는다. 구체적으로, 본 출원의 리불로스-인산 3-에피머화 효소 는 40℃ 이상, 보다 구체적으로 50℃ 이상, 더욱 구체적으로 60℃ 이상에서 과당-6-인산을 싸이코스-6-인산으로 전환하는 활성을 나타내는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 리불로스-인산 3-에피머화 효소 는 상기 효소 자체 또는 이를 발현하는 DNA를 균주에 형질전환시키고, 이를 배양하여 배양물을 수득하고, 상기 배양물을 파쇄하여, 컬럼 등을 통해 정제한 것일 수 있다. 상기 형질전환용 균주로는 대장균(Escherichia coli), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterum glutamicum), 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 피키아 패스토리스(Pichia pastoris)또는 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)가 있으나, 이에 제한되지 않으며, 향 후 GRAS(Generally Recognized as Safe) 균주 내 형질 전환 가능성이 있을 수 있다.
본 출원의 리불로스-인산 3-에피머화 효소 의 정제 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 본 출원의 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법을 사용할 수 있다. 비제한적인 예로, 크로마토그래피, 열처리, 흡착, 여과 및 이온 정제 등을 들 수 있다. 상기 정제 방법은 하나만 실시될 수도 있으며, 두 가지 이상의 방법을 함께 실시할 수도 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 리불로스-인산 3-에피머화 효소 를 코딩하는 핵산, 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 출원에서, "핵산"은 DNA 또는 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 천연 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체도 포함할 수 있다.
본 출원의 핵산은 단위체인 뉴클레오티드가 공유결합에 의해 연결된 DNA 또는 RNA 서열일 수 있고, 구체적으로, 서열번호 1 부터 22의 아미노산 서열의 DNA화 전환시(아미노산을 61개 codon으로 변형)에 가능한 모든 가지 수 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열일 수 있고, 보다 구체적으로 본 출원의 서열번호 1 내지 22의 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열로 번역될 수 있는 각각의 뉴클레오티드와 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상 또는 100%의 상동성, 유사성 또는 동일성을 가지면서, 번역되어 목적하는 효소 활성을 나타낼 수 있는 핵산을 포함할 수 있다. 코돈 축퇴성(codon degeneracy)에 의해 활성이 동일한 단백질, 번역(Transcription) 후 아미노산 서열이 동일한, 구체적으로 서열번호 1 내지 22중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 이와 상동성, 유사성, 또는 동일성을 가지는 단백질로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 본 출원의 범위에 포함될 수 있음은 자명하다. 보다 구체적으로, 본 출원의 핵산은 서열은 별도 표기하지 않으며, 서열번호 1 내지 22 아미노산 서열로 번역(translation) 가능한 모든 DNA 코돈 가지수로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, 본 출원의 효소를 코딩하는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다.
상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성(homology) 또는 동일성(identity)이 높은 유전자끼리, 80% 이상, 85% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1 X SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1 X SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1 X SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다.
본 출원에서, "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 변이형 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 본 출원의 효소를 코딩하는 핵산의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
본 출원은 또 다른 양태는 본 출원의 효소를 코딩하는 핵산 또는 본 출원의 효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.
본 출원에서, "효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 형질전환체" 또는 "효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 형질전환체"는, 본 출원의 리불로스-인산 3-에피머화 효소 가 발현되도록 재조합된 미생물을 의미할 수 있다. 예를 들어 리불로스-인산 3-에피머화 효소 를 코딩하는 핵산을 포함하거나, 또는 리불로스-인산 3-에피머화 효소 를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환되어 상기 리불로스-인산 3-에피머화 효소 를 발현할 수 있는 숙주세포 또는 미생물을 의미한다. 본 출원의 목적상, 상기 형질전환체가 발현하는 리불로스-인산 3-에피머화 효소 는 서열번호 3 내지 22 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 본 출원의 리불로스-인산 3-에피머화 효소 를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 핵산이 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 핵산은 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 핵산은 본 출원의 리불로스-인산 3-에피머화 효소 를 코딩하는 핵산을 암호화하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 핵산은 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 핵산은 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 핵산에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 핵산은 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 싸이코스-6-인산의 탈인산화 효소를 코딩하는 핵산의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
상기 핵산 또는 벡터의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동 재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 변이형 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원의 벡터를 형질전환 시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 레트로바이러스 감염(retroviral infection), 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 숙주 세포로는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주를 사용하는 것이 좋은데, 예를 들어 코리네속 미생물, 에스케리키아속 미생물, 세라티아속 미생물, 바실러스속 미생물, 사카로마이시스세레비제 속 미생물 또는 피키아속 미생물일 수 있고, 구체적으로 대장균(E. coli)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, GRAS 균주 모두에 적용 가능 하다.
보다 구체적으로, 본 출원의 형질전환체는 E.coil BL21(DE3)/pET-CJ-ef7, E.coil BL21(DE3)/pET-CJ-ef12, 또는 E.coil BL21(DE3)/pET-CJ-ef15 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 리불로스-인산 3-에피머화 효소, 이를 발현하는 미생물, 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 싸이코스-6-인산 생산용 조성물을 제공한다.
본 출원의 싸이코스-6-인산 생산용 조성물은 과당-6-인산을 싸이코스-6-인산으로 전환하는 활성을 나타내는 리불로스-인산 3-에피머화 효소, 이를 발현하는 미생물, 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하므로, 상기 조성물을 과당-6-인산과 접촉(반응)시킬 경우, 상기 과당-6-인산으로부터 싸이코스-6-인산을 생산할 수 있다.
구체적으로, 상기 조성물은 과당-6-인산을 기질로서 추가로 포함할 수도 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 싸이코스-6-인산 생산용 조성물은 싸이코스-6-인산 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 부형제에는, 예를 들어, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 및 등장화제 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 싸이코스-6-인산 생산용 조성물은 금속 이온 또는 금속염을 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 금속 이온은 2가 양이온일 수 있으며, 구체적으로 Ni, Mg, Ni, Co, Mn, Fe 및 Zn으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 금속 이온일 수 있다. 보다 구체적으로, 본 출원의 싸이코스-6-인산 생산용 생산용 조성물은 금속염을 추가로 포함할 수 있으며, 보다 더 구체적으로 상기 금속염은 NiSO4, MgSO4, MgCl2, NiCl2, CoSO4, CoCl2, MnCl2, MnSO4, FeSO4 및 ZnSO4로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 과당-6-인산(fructose-6-phosphate)에 리불로스-인산 3-에피머화 효소, 이를 발현하는 미생물, 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시키는 단계를 포함하는 싸이코스-6-인산 제조방법을 제공한다.
본 출원의 리불로스-인산 3-에피머화 효소 는 과당-6-인산을 싸이코스-6-인산으로 전환하는 활성을 나타내므로, 상기 리불로스-인산 3-에피머화 효소, 이를 발현하는 미생물, 또는 상기 미생물의 배양물을 과당-6-인산과 접촉시킬 경우, 상기 과당-6-인산으로부터 싸이코스-6-인산을 생산할 수 있다.
상기 과당-6-인산 및 싸이코스-6-인산을 접촉하여 반응시키는 조건은 기질 및 효소 등을 고려하여 당업자가 적절하게 선택하여 실시할 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 싸이코스-6-인산 생산 방법의 과당-6-인산 및 싸이코스-6-인산의 접촉은 pH 5.0 내지 9.0, 구체적으로 pH 6.0 내지 8.0에서 실시할 수 있다.
또한, 상기 접촉은 40℃ 내지 80℃ 온도, 구체적으로 40℃ 내지 60℃ 또는 50℃ 내지 60℃ 온도 에서 실시할 수 있다.
또한, 상기 접촉은 2시간 내지 24 시간, 구체적으로 6 내지 24시간 동안 실시할 수 있다.
또한, 상기 접촉은 pH 5.0 내지 9.0, 40℃ 내지 80℃ 온도, 및/또는 2시간 내지 24 시간 동안 수행되는 것일 수 있고, 보다 구체적으로는 pH 6.0 내지 pH 8.0, 40℃ 내지 60℃ 온도, 및/또는 20시간 내지 24 시간 동안 수행되는 것일 수 있고, 더욱 구체적으로는 pH 7.0, 50℃ 온도, 24 시간 에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 싸이코스-6-인산 제조방법은 제조된 싸이코스-6-인산을 수득 및/또는 정제하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 싸이코스-6-인산을 수득 및/또는 정제하는 단계는 당업계에 알려진 방법으로 수행될 수 있으며, 특정 방법에 제한되지 않는다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 리불로스-인산 3-에피머화 효소, 이를 발현하는 미생물, 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 싸이코스 생산용 조성물을 제공하는 것이다. 구체적으로, 상기 조성물은 과당-6-인산을 기질로서 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 싸이코스 생산용 조성물은 과당-6-인산으로부터 싸이코스-6-인산을 제조하는 리불로스-인산 3-에피머화 효소 외에, 싸이코스를 생산하는 데 필요한 효소, 예를 들어, 싸이코스-6-인산의 인산을 탈인산화 하여 싸이코스를 생산하는 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소를 추가로 포함함으로써 싸이코스를 생산하는 것일 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 싸이코스 생산용 조성물은 포도당-6-인산-이성화효소, 포스포글루코무타아제, 폴리포스페이트 포도당 인산화 효소, α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제 또는 수크로오스 포스포릴라아제, α-아밀라아제, 풀루란아제, 이소아밀레이즈, α-글루카노트랜스퍼라아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제, 및 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 효소, 이를 발현하는 미생물, 또는 상기 미생물의 배양물을 추가로 포함할 수 있고, 구체적으로 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로, 본 출원의 싸이코스 생산용 조성물은
(a) (i) 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합, 포도당, 포도당-1-인산, 포도당-6-인산, 또는　과당-6-인산; (ii) 포스페이트(phosphate); (iii) 싸이코스-6-인산　탈인산화 효소; (iv) 포도당-6-인산-이성화효소; (v) 포스포글루코무타아제 또는 포도당　인산화 효소; 및/또는 (vi) α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, α-아밀라아제, 풀루란아제, 이소아밀라아제, 글루코아밀라아제 또는 수크라아제; 또는
(b) 상기 항목 (a)의 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 항목 (a)의 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 추가적으로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
다만, 이는 예시적인 것으로 본 출원의 리불로스-인산 3-에피머화 효소를 이용하여 싸이코스를 생산할 수 있다면, 본 출원의 싸이코스 생산용 조성물에 포함되는 효소 및 싸이코스 생산에 이용되는 기질이 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 출원의 전분/말토덱스트린 포스포릴라아제(starch/maltodextrin phosphorylase, EC 2.4.1.1) 및 α-글루칸 포스포릴라아제는 포스페이트(phosphate)를 포도당에　인산화 전이시켜 전분 또는 말토덱스트린으로부터 포도당-1-인산을 생산하는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 상기 전분/말토덱스트린 포스포릴라아제(starch/maltodextrin phosphorylase, EC 2.4.1.1) 및 α-글루칸 포스포릴라아제는 포스페이트(phosphate)를 포도당에 인산화 전이시켜 전분 또는 말토덱스트린으로부터 포도당-1-인산을 생산하는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함 할 수 있다. 상기 수크로스 포스포릴라아제(sucrose phosphorylase, EC 2.4.1.7)는 포스페이트를 포도당에 인산화 전이시켜 수크로스로부터 포도당-1-인산을 생산하는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 상기 전분 액당화 효소인 α-아밀라아제(α-amylase, EC 3.2.1.1), 풀루란아제(pullulanse, EC 3.2.1.41), 이소아밀라아제(isoamylase, EC 3.2.1.68), 4-α-글루카노트렌스퍼레아제 (4-α-glucanotransferase, EC 2.4.1.25) 및 글루코아밀라아제(glucoamylase, EC 3.2.1.3) 는 전분 또는 말토덱스트린을 탈분지화된 말토올리고당 또는 포도당으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 상기 수크라제(sucrase, EC 3.2.1.26)는 수크로스를 포도당으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 본 출원의 포스포글루코무타아제(phosphoglucomutase, EC 5.4.2.2)는 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 폴리포스페이트 포도당인산화효소(polyphosphate glucokinase, EC 2.7.1.63)는 폴리포스페이트의 인산을 포도당에 전이시켜 포도당-6-인산으로 전환하는 활성을 가지는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 본 출원의 포도당-6-인산-이성화효소는 포도당-6-인산을　과당-6-인산으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 본 출원의 싸이코스-6-인산　탈인산화 효소는 싸이코스-6-인산을 싸이코스로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 싸이코스-6-인산　탈인산화 효소는 비가역적으로 싸이코스-6-인산을 싸이코스로 전환시키는 활성을 갖는 단백질일 수 있다.
본 출원의 싸이코스 생산용 조성물에 포함되는 효소는 복수의 효소 및 기질을 동시에 사용하는 동시효소반응(one-pot enzymatic conversion)에서 높은 싸이코스 전환율을 나타낼 수 있다.
본 출원의 싸이코스 생산용 조성물은 당해 싸이코스 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 부형제에는, 예를 들어, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 및 등장화제 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 싸이코스 생산용 조성물은 금속 이온 또는 금속염을 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 금속 이온은 2가 양이온일 수 있으며, 구체적으로 Ni, Mg, Ni, Co, Mn, Fe 및 Zn으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 금속 이온일 수 있다. 보다 구체적으로, 본 출원의 싸이코스 생산용 조성물은 금속염을 추가로 포함할 수 있으며, 보다 더 구체적으로 상기 금속염은 NiSO4, MgSO4, MgCl2, NiCl2, CoSO4, CoCl2, MnCl2, MnSO4, FeSO4 및 ZnSO4로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 과당-6-인산에 리불로스-인산 3-에피머화 효소, 이를 발현하는 미생물, 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시키는 단계를 포함하는 싸이코스 제조방법을 제공한다.
구체적으로, 본 출원의 싸이코스 제조방법은
과당-6-인산에 리불로스-인산 3-에피머화 효소, 상기 리불로스-인산 3-에피머화 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 리불로스-인산 3-에피머화 효소 를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 과당-6-인산을 싸이코스-6-인산으로 전환하는 단계; 및
상기 싸이코스-6-인산에 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소, 이를 발현하는 미생물, 또는 상기 미생물의 배양물을 싸이코스-6-인산과 접촉시켜 싸이코스-6-인산을 싸이코스로 전환하는 단계를 순차로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 출원의 싸이코스 제조방법은 상기 과당-6-인산을 싸이코스-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당-6-인산(Glucose-6-phosphate)에 포도당-6-인산-이성화효소, 상기 포도당-6-인산-이성화효소를 발현하는 미생물 또는 상기 포도당-6-인산-이성화효소를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 출원의 싸이코스 제조방법은 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당-1-인산(Glucose-1-phosphate)에 포스포글루코무타아제, 상기 포스포글루코무타아제를 발현하는 미생물 또는 상기 포스포글루코무타아제를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 출원의 싸이코스 제조방법은 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당(Glucose)에 폴리포스페이트 포도당인산화 효소, 상기 폴리포스페이트 포도당인산화 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 폴리포스페이트 포도당 인산화 효소를 발현하는 미생물의 배양물, 및 폴리포스페이트를 접촉시켜, 상기 포도당을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 출원의 싸이코스 제조방법은 상기 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제 또는 수크로오스 포스포릴라아제; 상기 포스포릴라아제를 발현하는 미생물; 또는 상기 포스포릴라아제를 발현하는 미생물의 배양물, 및 포스페이트를 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합을 포도당-1-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 출원의 싸이코스 제조방법은 상기 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합을 포도당-1-인산으로 전환하는 단계 이전, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-아밀라아제, 풀루란아제, 이소아밀라아제, 글루코아밀라아제 또는 수크라아제; 상기 α-아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제를 발현하는 미생물; 또는 상기 α-아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합을 포도당으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 출원의 싸이코스 제조 방법에 이용되는 리불로스-인산 3-에피머화 효소, 싸이코스-6-인산 탈인산효소, α-글루칸 포스포릴라아제, 포스포글루코뮤타아제(또는 포스포만노뮤타아제), 포도당-6-인산 이성화 효소, 싸이코스-6-인산-3-에피머화효소(또는 리불로스-5-인산-3-에피머화효소), 풀루라네이즈(또는 아이소아밀레이즈), 4-α-글루카노트렌스퍼레아제, 폴리포스페이트 포도당인산화효소 등은 최종 산물인 싸이코스에 대한 부반응이 없거나 적은 것일 수 있다.
본 출원의 싸이코스 제조 방법은 고농도 전분을 분해하여 인산당 전환 효소들과 복합적 조합으로 최적/최대의 싸이코스를 생산하는 것일 수 있고, 싸이코스의 최대 생산성 확보를 위하여 최대 8종류의 효소를 조합하여 사용할 수 있다.
첫번째로, 전분을 분해하며 포도당-1-인산을 생산하는 효소인 글루칸 포스포릴라아제(glucan phosphorylase, glycogen phosphorylase, EC 2.4.1.1)는 α-1,4 결합된 전분에 특이적으로 포도당-1-인산(glucose-1-phosphate)을 생성한다. 둘째로는 이렇게 생성된 포도당-1-인산을 포도당-6-인산(glucose-6-phosphate)으로 전환하는 포스포글루코뮤타아제(phosphoglucomutase, EC 2.7.5.1) 또는 포스포만노뮤타아제(phosphomannomutase, EC 5.4.2.8)가 중간 복합 효소 반응에 쓰이게 된다. 세번째 사용 효소로는 포도당-6인산을 과당-6-인산(fructose-6-phosphate)으로 전환하는 포도당-6-인산 이성화 효소(glucose-6-phosphate isomerase, EC 5.3.1.9)가 사용된다. 네번째로, 본 출원의 과당-6-인산에서 싸이코스-6-인산으로 전환하는 효소인 과당-6-인산-3-에피머화 효소를 활용하여 가역반응의 싸이코스-6-인산까지 생성 가능하다.
부가적으로 전분 이용율을 높이기 위하여 아밀로펙틴(amylopectin)의 α-1,4 외 α-1,6 결합의 가지(Branch) 결합을 분해하기 위하여 풀루라네이즈(pullulanase, EC 3.2.1.41) 또는 이소아밀레이즈(isoamylase EC 3.2.1.68) 효소가 같이 사용되며, 또한 글루칸 포스포릴라아제의 전분 활용을 높이기 위하여 글루카노트렌스퍼레아제(4-alpha-glucanotransferase, EC 2.4.1.25)를 활용할 수 있다. 상대적으로 활성이 낮은 기질인 맥아당(maltose) 또는 기타 올리고당에 α-1,4 결합형태로 올리고당을 결합하여 세분화된 전분기질의 이용율을 높일 수 있다. 추가적으로 폴리포스페이트 글루코카이네이즈(polyphosphate-glucose phosphotransferase, EC 2.7.1.63)을 사용하여 전분 사용 후 분해된 포도당에서 복합 효소반응을 통하여 추가적인 싸이코스 생산이 가능하다.
또한, 본 출원의 싸이코스 제조방법에 있어서, 본 출원의 접촉은 pH 5.0 내지 9.0, 구체적으로 pH 6.0 내지 8.0에서 실시할 수 있다.
본 출원의 싸이코스 제조방법에 있어서, 본 출원의 접촉은 40℃ 내지 80℃ 온도, 구체적으로 40℃ 내지 60℃ 또는 50℃ 내지 60℃ 온도 에서 실시할 수 있다.
본 출원의 싸이코스 제조방법에 있어서, 본 출원의 접촉은 2시간 내지 24 시간, 구체적으로 6 내지 24시간 동안 실시할 수 있다.
본 출원의 싸이코스 제조방법에 있어서, 본 출원의 접촉은 pH 5.0 내지 9.0, 40℃ 내지 80℃ 온도, 및/또는 2시간 내지 24 시간 동안 실시할 수 있다. 구체적으로, 상기 접촉은 pH 6.0 내지 8.0, 40℃ 내지 60℃ 또는 50℃ 내지 60℃ 온도, 및/또는 6시간 내지 24시간 동안 실시할 수 있다.
본 출원의 싸이코스 제조방법은 싸이코스를 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 출원의 정제는 특별히 제한되지 아니하며, 본 출원의 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법을 사용할 수 있다. 비제한적인 예로, 크로마토그래피, 분별 결정 및 이온 정제 등을 들 수 있다. 상기 정제 방법은 하나만 실시될 수도 있으며, 두 가지 이상의 방법을 함께 실시할 수도 있다. 예를 들어, 크로마토그래피를 통해 싸이코스 생성 반응물을 정제할 수 있으며, 상기 크로마토그래피에 의한 당의 분리는 분리하고자 하는 당과 이온 수지에 부착된 금속 이온 사이의 약한 결합력의 차이를 이용하여 수행될 수 있다.
또한, 본 출원은 본 출원의 정제하는 단계의 전 또는 후에 탈색, 탈염 또는 둘 다를 실시하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 탈색 및/또는 탈염을 실시함으로써, 불순물 없이 보다 정제된 싸이코스 반응물을 얻을 수 있다.
본 출원의 리불로스-인산 3-에피머화 효소 는 특정 모티프를 포함함으로써 높은 과당-6-인산의 전환 활성을 나타내는 동시에, 내열성을 가지므로 싸이코스를 생산하는 등의 산업적 활용에 이점을 갖는다.
이하, 본 출원을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하나, 이는 본 출원의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 출원의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원에서 아미노산은 아래와 같은 약어 또는 아미노산 명으로 표시될 수 있다:
아미노산 종류 약어 해당 아미노산으로
코딩 되는 DNA codon 		해당 아미노산으로
코딩 되는 RNA codon
알라닌(alanine) A GCT, GCC, GCA, GCG GCU, GCC, GCA, GCG
아르기닌(arginine) R AGA, AGG AGA, AGG
아스파라긴(asparagines) N AAT, AAC AAU, AAC
아스파르트산(aspartic acid) D GAT, GAC GAU, GAC
시스테인(cystein) C TGT, TGC UGU, UGC
글루탐산(glutamic acid) E GAA, GAG GAA, GAG
글루타민(glutamine) Q CAA, CAG CAA, CAG
글라이신(glycine) G GGT, GGC, GGA, GGG GGU, GGC, GGA, GGG
히스티딘(histidine) H CAC, CAT CAC, CAU
이소류신(isoleucine) I ATT, ATC, ATA AUU, AUC, AUA
류신(leucine) L TTA, TTG, CTT, CTC, CTA, CTG UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG
라이신(lycine) K AAA, AAG AAA, AAG
메티오닌(methionine) M ATG AUG
페닐알라닌(phenylalanine) F TTT, TTC UUU, UUC
프롤린(proline) P CCT, CCC, CCA, CCG CCU, CCC, CCA, CCG
세린(serine) S TCT, TCC, TCA, TCG UCU, UCC, UCA, UCG
트레오닌(threonine) T ACT, ACC, ACA, ACG ACU, ACC, ACA, ACG
트립토판(tryptophan) W TGG UGG
타이로신(tyrosine) Y TAT, TAC UAU, UAC
발린(valine) V GTT, GTC, GTA, GTG GUU, GUC, GUA, GUG
실시예 1: 각 효소의 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물의 제조
본 출원의 싸이코스 제조 경로에 필요한 각 효소를 제공하기 위하여 리불로스-인산 3-에피머화 효소로 알려진 내열성의 유전자를 선발하였으며, 이를 정리하면 하기 표 2과 같다.
서열번호 종 속 Genbank No.
3 Anaerolineae bacterium SM23_84 KPL22606
4 Chthonomonas calidirosea T49 -
5 Geobacillus sp. 8 WP_082829565
6 Geobacillus thermocatenulatus WP_025950644
7 Mahella australiensis 50-1 BON AEE96948
8 Petrotoga sp. 9T1HF07.CasAA.8.2 PNR87418
9 Petrotoga sp. 9PWA.NaAc.5.4 PNR96608
10 Symbiobacterium thermophilum IAM 14863 -
11 Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus WP_074665058
12 Thermoanaerobacterium sp. PSU-2 WP_085113038
13 Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum WP_094046601
14 Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum WP_094397369
15 Tepidanaerobacter syntrophicus WP_059031935
16 Firmicutes bacterium HGW-Firmicutes-5 PKM55438
17 Ardenticatenia bacterium PWH13270
18 Aeribacillus pallidus WP_117016900
19 Epulopiscium sp. SCG-B05WGA-EpuloA1 ONI38610
20 Methylothermaceae bacteria B42 KXJ40382
21 Thermoflavimicrobium dichotomicum WP_093231204
22 Thermoanaerobacteraceae bacterium SP2 WP_120768428
23 Bacillus lonarensis WP_090776060
24 Hydrogenivirga sp. 128-5-R1-1 WP_008287078
25 Bacillus WP_003181681
26 Bifidobacterium longum WP_007055745
27 Candida albicans WO-1 EEQ46827
28 Thermoclostridium stercorarium WP_015359713
29 Enterobacteriaceae WP_015369389
30 Escherichia fergusonii WP_000816279
31 Lactobacillus paracasei subsp. paracasei ATCC 25302 EEI67706
32 Oceanobacillus iheyensis WP_011065912
33 Odoribacter splanchnicus WP_013610595
34 Runella slithyformis WP_013930019
35 Schizosaccharomyces pombe NP_594005
36 Thermoanaerobacter mathranii WP_013150382
37 Thermoanaerobacter siderophilus SR4 EIW01046
38 Caldanaerobacter subterraneus WP_011025758
39 Thermoanaerobacterium xylanolyticum WP_013788157
상기 효소 서열 중 서열번호 4 및 10은 각각 Chthonomonas calidirosea T49 (Genbank No. CCW35830) 및 Symbiobacterium thermophilum IAM 14863 (Genbank No. BAD41323)의 효소에서 본 출원의 모티프 I 및 II의 중요성을 확인하고자 이용한 서열로, 알려진 리불로스-인산 3-에피머화 효소 서열에서 모티프 I 및 II를 제외한 효소의 일부 영역을 삭제하거나(서열번호 4), 또는, 모티프 I을 추가(서열번호 10)하여 모티프 I 및 II의 존재 유무에 따른 효소 활성을 확인하고자 이용 하였다.
구체적으로 수정된 모티프 I 및 II의 위치는 서열번호 4 의 효소에서는 모티프 I 이 효소의 N-말단으로부터 8 부터 11 번 사이에 위치하도록 하였고, 모티프 II 는 효소의 N-말단으로부터 198 부터 203 까지 위치하도록 하였으며, 서열번호 10의 효소에서는 모티프 I 이 효소의 N-말단으로부터 8 부터 11 번 사이에 위치하도록 하였고, 모티프 II 는 효소의 N-말단으로부터 195 부터 200 까지 위치하도록 하였다.
상기 선발한 아미노산의 유전자는 유전자 합성 또는 각 분양 균주의 염색체 DNA (genomic DNA)로부터 각각의 유전자를 중합효소 연쇄반응(PCR)을 이용하여 증폭하고, 증폭된 각각의 DNA는 DNA assembly methods 를 사용하여 대장균 발현용 플라스미드 벡터 pET21a (Novagen사)에 삽입하였고, 재조합 발현벡터를 제작 하였다. 상기 발현벡터는 통상적인 형질전환 방법[참조: Sambrook et al. 1989]으로 대장균(E. coli) BL21(DE3) 균주에 각각 형질 전환하여 형질전환 미생물을 제조하였다.
구체적으로, 서열번호 7, 12 및 15의 리불로스-인산 3-에피머화 효소 를 대장균 (E. coli) BL21(DE3) 균주에 각각 형질 전환하여 E.coil BL21(DE3)/pET-CJ-ef7, E.coil BL21(DE3)/pET-CJ-ef12, E.coil BL21(DE3)/pET-CJ-ef15 로 명명된 형질전환 미생물을 제조하였다.
상기 제조된 형질전환 미생물들을 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 2019년 4월 16일자로 기탁하여 KCCM12491P (E.coil BL21(DE3)/pET-CJ-ef7), KCCM12492P (E.coil BL21(DE3)/pET-CJ-ef12), KCCM12493P (E.coil BL21(DE3)/pET-CJ-ef15) 의 기탁 번호를 각각 부여 받았다.
실시예 2: 재조합 효소의 제조
재조합 효소를 제조하기 위해, 실시예 1에서 제조한 각 형질전환 미생물을 LB 액체배지 5 ml를 포함하는 배양 튜브에 접종하고, 600 nm에서 흡광도가 2.0 이 될 때까지 37 ℃의 진탕 배양기에서 종균 배양을 하였다. 본 종균 배양된 배양액을 LB 액체배지를 포함하는 배양 플라스크에 접종하여 본 배양을 진행하였다. 600 nm에서의 흡광도가 2.0이 될 때 1 mM IPTG를 첨가하여 재조합 효소의 발현생산을 유도하였다. 상기 배양 과정 중의 교반 속도는 180 rpm이며 배양 온도는 37 ℃가 유지되도록 하였다. 배양액은 8,000×g로 4 ℃에서 20분 동안 원심분리 후 균체를 회수하였다. 회수된 균체는 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액으로 2회 세척하였고, 동일 완충용액으로 현탁 후 초음파 세포파쇄기를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄물은 13,000×g로 4 ℃에서 20분 동안 원심분리 후 상등액만을 취하였다. 상기 상등액으로부터 His-tag 친화 크로마토그래피를 사용하여 재조합 효소를 정제하고, 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액으로 투석한 후 반응에 사용하였다.
실시예 3: 리불로스-인산 3-에피머화 효소 활성 분석
상기 실시예 2에서 제조된 35종(서열번호 3, 5 내지 9, 서열번호 11 내지 39)의 리불로스-인산 3-에피머화 효소 의 과당-6-인산의 싸이코스-6-인산으로의 전환 활성을 다음과 같이 2가지 방법으로 확인하고자 하였다:
1) 과당-6-인산을 본 출원의 리불로스-인산 3-에피머화 효소와 반응시켜 싸이코스-6-인산을 제조하고, 생산된 싸이코스-6-인산을 싸이코스-6-인산 탈인산 효소와 추가적으로 반응시켜 싸이코스를 생산한 후, 싸이코스 생산량 확인; 또는
2) 포도당-1-인산을 최초 기질로 하여, 포도당-1-인산으로부터, 포도당-6-인산, 과당-6-인산을 제조하고, 상기 생산된 과당-6-인산을 본 출원의 리불로스-인산 3-에피머화 효소 와 반응시켜, 싸이코스-6-인산을 거쳐 싸이코스를 생산한 후, 싸이코스 생산량 확인.
상기 방법은 기질에 따라 포도당-1-인산을 포도당-6-인산(glucose-6-phosphate)으로 전환하는 포스포글루코뮤타아제 (phosphoglucomutase, EC 2.7.5.1) 또는 포스포만노뮤타아제 (phosphomannomutase, EC 5.4.2.8); 포도당-6인산을 과당-6-인산 (fructose-6-phosphate)으로 전환하는 포도당-6-인산 이성화 효소(glucose-6-phosphate isomerase, EC 5.3.1.9); 및 싸이코스 생성을 위한 싸이코스-6-인산 탈인산 효소와 추가적으로 반응시켜 싸이코스를 생산 및 검출하여 효소의 활성을 측정하였다. 구체적으로 상기 사용된 효소들은 포스포글루코뮤타아제, 포스포만노뮤타아제, 포도당-6-인산 이성화 효소는 대한민국 특허 출원 제10-2017-0167873호에서 사용된 것과, 싸이코스-6-인산 탈인산 효소는 대한민국 특허 출원 제10-2018-0159351호에 개시된 탈인산화 효소를 이용하였다.
구체적으로, 50 mM 과당-6-인산 또는 20 mM 포도당-1-인산을 50 mM Tris-HCl(pH 7.0) 또는 50 mM Sodium-posphate (pH 6~7) 또는 50 mM Potassium-posphate (pH 6~7) 완충용액에 현탁한 후, 포스포글루코뮤타아제 또는 포스포만노뮤타아제와 포도당-6-인산 이성화 효소와 싸이코스-6-인산 탈인산 효소 및 실시예 2에서 제조한 재조합 리불로스-인산 3-에피머화 효소 35종을 각각 0.1 unit/ml 첨가하고, 45℃~70℃에서 1~24 시간 동안 반응시켰다.
이후, HPLC를 이용하여 포도당, 과당, 싸이코스 생성 여부를 분석하였으며, HPLC 분석은 SP_0810(Shodex사) 컬럼과 Aminex HPX-87C (Bio-RAD사) 컬럼을 사용하여 80℃에서 이동상으로 0.6 ml/min 유속으로 흘려 주면서 수행하였으며, Refractive Index Detector(RID)로 검출하였다.
그 결과, 모든 35종 효소 중 서열번호 3, 5 내지 9, 11 내지 22의 18개 효소에서 과당-6-인산에 대해 높은 과당-6-인산 3-에피머화 활성을 확인하였으며, 18개 효소에서 과당-6-인산의 약한 전환 활성을 확인 하였다. 해당 결과는 하기 표 3과 같이 정리 하였다.
서열번호 NCBI No. Motif I (S-X-M/I -C) Motif II (G-X-X-X-X-F/L) Activity
3 KPL22606 O O E
5 WP_082829565 O O E
6 WP_025950644 O O E
7 AEE96948 O O E
8 PNR87418 O O E
9 PNR96608 O O E
11 WP_074665058 O O E
12 WP_085113038 O O E
13 WP_094046601 O O E
14 WP_094397369 O O E
15 WP_059031935 O O E
16 PKM55438 O O D
17 PWH13270 O O E
18 WP_117016900 O O D
19 ONI38610 O O E
20 KXJ40382 O O C
21 WP_093231204 O O D
22 WP_120768428 O O D
23 WP_090776060 X X A
24 WP_008287078 X X A
25 WP_003181681 X X A
26 WP_007055745 X X A
27 EEQ46827 X X A
28 WP_015359713 X X A
29 WP_015369389 X X A
30 WP_000816279 X X A
31 EEI67706 X X A
32 WP_011065912 X X A
33 WP_013610595 X X A
34 WP_013930019 X X A
35 NP_594005 X X A
36 WP_013150382 X X A
37 EIW01046 X X A
38 WP_011025758 X X A
39 WP_013788157 X X A
A = 매우 낮은 활성 (과당-6-인산에서 싸이코스-6-인산 전환 상대 활성이 1% 이상 10% 미만)
B = 낮은 활성 (과당-6-인산에서 싸이코스-6-인산 전환 상대 활성이 10% 이상 30% 미만)
C = 중간 활성 (과당-6-인산에서 싸이코스-6-인산 전환 상대 활성이 30% 이상 50% 미만)
D = 높은 활성 (과당-6-인산에서 싸이코스-6-인산 전환 상대 활성이 50% 이상 80% 미만)
E = 매우 높은 활성 (과당-6-인산에서 싸이코스-6-인산 전환 상대 활성이 80% 이상 100% 이하)
상기 상대 활성은 효소의 반응 상대 속도(단위 시간당 '반응/전환'하는 상대 활성)를 의미하는 것으로서, 다음과 같은 식으로 계산하였다.
Figure pat00001
* 상기 표3 에서 사용된 리불로스-인산 3-에피머화 활성을 갖는 효소
** 1 내지 24 시간
특정 모티프 I 및 II를 포함하고 있는 효소가 모티프를 포함하지 않은 효소에 비해 최소 13배 이상(매우 낮은 활성(A) 효소 vs. 매우 높은 활성 (E) 효소), 또는 최소 7배 이상(매우 낮은 활성(A) 효소 vs. 높은 활성 (D) 효소) 높은 싸이코스-6-인산 전환 단위 활성을 나타내는 것을 확인하였다.
이는 본 출원의 모티프 I 및 II를 포함하는 리불로스-인산 3-에피머화 효소 가 싸이코스-6-인산 및 이로부터 생산되는 싸이코스의 생산 수율을 높일 수 있음을 시사한다.
실시예 4: 모티프 I 및 II의 존재가 효소 활성에 미치는 영향 확인
상기 실시예 1에서 모티프 I 및 II의 존재에 따른 영향을 확인하고자 제조한 서열번호 4 및 10의 아미노산 서열을 갖는 효소의 활성을 추가로 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 효소 활성을 확인하였으며, 그 결과는 다음과 같다.
서열번호 NCBI No. Motif I (S-X-M /I-C) Motif II (G-X-X-X-X-F/L) Activity
4 아미노산 서열 1 O O E
10 아미노산 서열 2 O O E
한편, 모티프 I 및 II를 포함하고 있는 효소 간 동일성은 최소 30 %이나, 상기 효소 모두 과당-6-인산의 싸이코스-6-인산으로의 전환 활성이 높은 점을 보아 리불로스-인산 3-에피머화 활성을 갖는 효소에서 모티프 I 및 II를 포함할 시 과당-6-인산을 싸이코스-6-인산으로 전환될 것임을 예상할 수 있다. 또한 모티프 I을 S-X-M-C로 포함하는 경우 해당 서열을 S-X-I-C로 포함하는 경우보다 활성이 증가함을 확인하였다.
상기와 같은 결과로부터 모티프 I 및 II의 유무가 과당-6-인산을 싸이코스-6-인산으로 전환하는 활성에 큰 영향을 미치는 것을 다시 한 번 확인하였다.
실시예 5: 복합효소(다중효소) 반응을 통한 싸이코스 생산 활성 분석
말토덱스트린으로부터 싸이코스를 생산하기 위해 글루칸 포스포릴레이즈, 풀루라네이즈, 4-알파-글루카노트렌스퍼레이즈, 포스포글루코뮤테이즈, 글루코스-6-포스페이트 아이소머레이즈, 싸이코스-6-인산 탈인산 효소, 및 본 출원의 과당-6-인산-3-에피머화 효소를 동시에 (one-pot) 반응시켰다.
　 가 나
One-Pot 반응시 싸이코스 전환율 (%) 3.8 65.8
가 : 서열번호 38 (WP_011025758) 사용시
나 : 서열번호 6 (WP_025950644) 사용시
구체적으로, 1~5 mM MgCl2, 10~50 mM의 인산나트륨(Sodium phosphate pH 7.0)에 5 %(w/v) 말토덱스트린을 첨가한 용액에 상기 7종의 효소 각 0.1 unit/ml를 첨가하여 온도 50℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 상기 사용된 포스포글루코뮤타아제, 포스포만노뮤타아제, 포도당-6-인산 이성화 효소는 대한민국 출원 제10-2017-0167873호에서 사용된 것과, 싸이코스-6-인산 탈인산 효소는 대한민국 출원 제10-2018-0159351호에 개시된 탈인산화 효소를 사용하였다.
반응이 완료된 후 HPLC를 이용하여 반응 결과물에서 싸이코스를 분석하였다. HPLC 분석은 Aminex HPX-87C(Bio-RAD사) 컬럼을 사용하여 80℃에서 이동상으로 0.6 ml/min 유속으로 흘려 주면서 수행하였으며, Refractive Index Detector로 검출하였다. 그 결과, 복합효소반응에 의하여 말토덱스트린으로부터 싸이코스가 생성됨을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국미생물보존센터 KCCM12491P 20190416 한국미생물보존센터 KCCM12492P 20190416 한국미생물보존센터 KCCM12493P 20190416
<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Novel thermostable fructose-6-phosphate 3-epimerases comprising two motifs <130> KPA190171-KR <160> 58 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Xaa=any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) <223> Xaa=Met or Ile <400> 1 Ser Xaa Xaa Cys 1 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif II <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(5) <223> Xaa=any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> Xaa=Phe or Leu <400> 2 Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 3 <211> 227 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anaerolineae bacterium SM23_84 <400> 3 Met Ile Lys Val Ala Pro Ser Ile Met Cys Ala Asp Leu Thr Cys Leu 1 5 10 15 Gly Asp Gln Val Gln Ala Leu Glu Gln Ala Gly Ala Asp Leu Phe His 20 25 30 Phe Asp Ile Met Asp Gly His Phe Val Glu Asn Phe Thr Leu Ser Pro 35 40 45 Thr Ile Leu Ala Ala Ile Arg Glu Leu Thr Val Val Pro Ile Glu Ala 50 55 60 His Leu Met Ile Ser Glu Pro Arg Arg Tyr Leu Gln Met Cys Ala Asp 65 70 75 80 Ala Gly Ala Asn Ile Ile Thr Val His Val Glu Val Cys Pro Arg Pro 85 90 95 Tyr Gln Val Leu Ala Lys Ile Lys Asp Leu Gly Cys Val Pro Ala Leu 100 105 110 Ala Leu Asn Pro Ala Thr Pro Leu Cys Phe Leu Asp Tyr Val Leu Gln 115 120 125 Glu Ala Gly Ile Val Val Ile Met Thr Val Asp Pro Gly Phe Ala Gly 130 135 140 Gln Glu Phe Ile Ala Ala Thr Leu Pro Lys Ile Arg Glu Leu Arg Glu 145 150 155 160 Arg Ile Asp Gln Leu Asn Leu Asp Val Glu Ile Gln Val Asp Gly His 165 170 175 Ile Asn Arg Glu Thr Ile Pro Leu Val Val Glu Ala Gly Ala Asp Ile 180 185 190 Leu Val Leu Gly Thr Ser Gly Leu Phe Ser Leu Pro Gly Thr Leu Arg 195 200 205 Glu Asn Ile Glu Ala Val Lys Gln Gln Ala Ala Ser Leu Leu Glu Arg 210 215 220 Gln Lys Gly 225 <210> 4 <211> 234 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Chthonomonas calidirosea T49 <400> 4 Met Thr Val Arg Val Ala Pro Ser Met Met Cys Ala Asp Gln Ala His 1 5 10 15 Leu Ala Asp Glu Val Arg Glu Leu Glu Met Leu Gly Val Asp Trp Leu 20 25 30 His Met Asp Ile Met Asp Thr His Phe Val Pro Asn Met Pro Leu Gly 35 40 45 Leu Thr Thr Val Glu His Leu Arg Ser Leu Thr Arg Leu Pro Phe Asp 50 55 60 Val His Leu Met Val Glu His Asn Glu Leu Phe Ile Glu Arg Leu Ala 65 70 75 80 Lys Ile Gly Val Gln Ser Ile Ser Val His Ala Glu Ser Thr Arg His 85 90 95 Leu Asp Arg Val Leu Ser Leu Ile Arg Ala His Gly Ile Gln Ala Gly 100 105 110 Val Ala Leu Asn Pro Ala Thr Pro Leu Ser Ala Leu Glu Tyr Val Arg 115 120 125 Glu Leu Ile Asp Phe Val Leu Ile Met Thr Val Asn Pro Gly Phe Ala 130 135 140 Gly Gln Leu Leu Thr Ala Ser Ala Ile Arg Lys Ile Glu Asp Cys Arg 145 150 155 160 Arg Trp Leu Asp Glu Arg Gly Leu Ser Gln Leu Pro Ile Gln Val Asp 165 170 175 Gly Asn Val Ser Phe Thr Asn Ile Ala Arg Met Val Ala Ala Gly Ala 180 185 190 Asp Ile Leu Val Val Gly Ser Ser Ser Leu Phe Ala Ser Glu Arg Pro 195 200 205 Arg Leu Glu Asn Met Arg Arg Ile Glu Gln Ala Ile Glu Glu Gly Met 210 215 220 Arg Leu Arg Gln Glu Arg Ser Arg Lys Pro 225 230 <210> 5 <211> 228 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Geobacillus sp. 8 <400> 5 Met Thr Met Ile Gly Pro Ser Leu Met Cys Ala Asp Met Gly Asn Leu 1 5 10 15 Lys Met Asp Val Gln Glu Leu Asp Gln Ala Gly Val Asp Phe Phe His 20 25 30 Ile Asp Ile Met Asp Gly Ser Phe Val Pro Asn Phe Thr Met Gly Pro 35 40 45 Asp Met Val Asn Val Ile Arg Ala Ala Thr Asp Lys Pro Leu Asp Ile 50 55 60 His Leu Met Ile Met Arg Pro Glu Glu His Ile Asn Leu Phe Ala Asp 65 70 75 80 Ala Gly Ala Asp Met Ile Ser Val His Ile Glu Ser Thr Ile His Leu 85 90 95 Gln Arg Val Leu Gln Thr Ile Lys Ser Lys Gly Ile Lys Ala Gly Val 100 105 110 Ala Leu Asn Pro Ser Thr Pro Ile Glu Ser Ile Glu Tyr Val Met Asp 115 120 125 Val Ile Asp Tyr Val Thr Leu Met Thr Val Asn Pro Gly Phe Ala Gly 130 135 140 Gln Lys Phe Ile Pro Thr Met Tyr Asn Lys Ile Lys Lys Leu His Gln 145 150 155 160 Leu Ile Glu Lys Glu Ser Tyr Asn Ile Leu Ile Gln Val Asp Gly Asn 165 170 175 Ile Gly Tyr Glu Thr Ile Pro Lys Val Leu Glu Asn Gly Ala Lys Met 180 185 190 Leu Val Cys Gly Thr Ser Ser Leu Phe Lys Ser Lys Gly Ser Leu His 195 200 205 Asp Ala Val Ile His Leu Arg Gln Phe Ile Glu Gly Thr Ala Lys Val 210 215 220 Lys Thr Gly Asp 225 <210> 6 <211> 232 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Geobacillus thermocatenulatus <400> 6 Met Ile Leu Ile Gly Pro Ser Leu Met Cys Ala Asp Met Gly Asn Leu 1 5 10 15 Arg Asp Asn Val Ile Arg Leu Asp Lys Ala Gly Val Asp Tyr Phe His 20 25 30 Phe Asp Ile Met Asp Gly Lys Phe Val Pro Asn Phe Thr Met Gly Pro 35 40 45 Asp Ile Ile Arg Ala Leu Arg Asn Phe Thr Asn Lys Pro Phe Asp Val 50 55 60 His Leu Met Ile Glu Lys Pro Glu Glu His Leu Gly Leu Phe Ile Asp 65 70 75 80 Ala Gly Ala Asp Met Ile Ser Val His Val Glu Ala Thr Leu His Leu 85 90 95 Gln Arg Thr Leu Gln Lys Ile Arg Asp Ser Gly Leu Lys Ala Gly Val 100 105 110 Ala Leu Asn Pro Ser Thr Pro Ile Ser Thr Ile Glu Tyr Val Leu Asp 115 120 125 Thr Val Asp Tyr Ile Thr Val Met Thr Val Asn Pro Gly Phe Ala Gly 130 135 140 Gln Lys Phe Ile Pro Leu Met Lys Lys Lys Ile Ser Lys Leu Lys Glu 145 150 155 160 Leu Ile Thr Glu Ala Asp Tyr Asp Val Asn Ile Gln Val Asp Gly Asn 165 170 175 Ile Gly Tyr Gln Thr Met Thr Ala Val Leu Glu Asn Gly Ala Asn Met 180 185 190 Leu Val Leu Gly Thr Ser Cys Leu Phe Lys Lys Glu Leu Ala Leu Glu 195 200 205 Asp Ala Val Leu Arg Leu Arg Gln Phe Ile Asp Ser Phe Gln Ile Gln 210 215 220 Ser Ser Leu Arg Ser Lys Glu Lys 225 230 <210> 7 <211> 224 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Mahella australiensis 50-1 BON <400> 7 Met Lys Ala Lys Ile Ser Pro Ser Met Met Cys Ala Asp Phe Gly Arg 1 5 10 15 Leu Glu Asp Glu Ile Arg Ile Leu Glu Lys Ala Gly Val Asp Tyr Leu 20 25 30 His Ile Asp Val Met Asp Gly His Phe Val Pro Asn Phe Ala Ile Gly 35 40 45 Pro Asp Leu Thr Arg Ser Ile Arg Arg Leu Thr Asp Ile Pro Leu Asp 50 55 60 Ile His Leu Met Val Glu Arg Pro Glu Asn Tyr Ile Asp Leu Phe Glu 65 70 75 80 Pro Arg Leu Gly Asp Ile Val Ser Val His Gln Glu Ala Thr Val His 85 90 95 Leu Glu Arg Thr Leu Gln Ile Ile Lys Ala Ala Gly Ala Lys Thr Gly 100 105 110 Val Ala Val Asn Pro Ala Thr Pro Ala Ile Met Ile Lys Pro Val Ile 115 120 125 Asp Glu Ala Asp Val Val Leu Val Met Thr Val Asn Pro Gly Phe Ala 130 135 140 Gly Gln Lys Leu Val Pro Ser Thr Leu Ser Lys Ile Arg Glu Val Lys 145 150 155 160 Glu Met Ile Gln Glu Ser Cys Ala Ser Ala Glu Ile Glu Val Asp Gly 165 170 175 Asn Val Ser Phe Glu Asn Ala Phe Lys Met Leu Ala Ala Gly Ala Asp 180 185 190 Ile Phe Val Ala Gly Thr Ser Ser Ile Phe Asn Ala Asp Met Asp Lys 195 200 205 Leu Glu Ala Ala Tyr Lys Leu Lys Gln Ile Leu Ser Val Lys Glu Gly 210 215 220 <210> 8 <211> 226 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Petrotoga sp. 9T1HF07.CasAA.8.2 <400> 8 Met Ser Ile Leu Phe Ser Ala Ser Val Met Cys Ala Asp Phe Thr Asp 1 5 10 15 Leu Lys Asn Gln Leu Lys Lys Leu Glu Glu Ile Gly Ile His Arg Leu 20 25 30 His Tyr Asp Ile Met Asp Gly Ile Phe Val Pro Asn Ile Thr Leu Gly 35 40 45 Ile Asp Met Ile Arg Asp Ile Thr Lys Val Cys Ser Leu Pro Ile Asp 50 55 60 Val His Leu Met Val Thr Glu Pro Ala Asn Phe Leu Glu Met Leu Ile 65 70 75 80 Lys Tyr Lys Ile Asp Ser Ile Ser Phe His Val Glu Ser Asn Pro Asn 85 90 95 Glu Ala Phe Arg Met Val Asp Trp Leu His Asp His Asn Ile Lys Ala 100 105 110 Gly Ile Ala Ile Ser Pro Ile Thr Pro Val Ser Gln Ile Glu Leu Ile 115 120 125 Leu Gly Arg Val Asp Ile Ile Thr Val Met Thr Val Asp Pro Gly Phe 130 135 140 Ala Gly Gln His Phe Ile Pro Val Val Leu Lys Lys Ile Asp Ala Leu 145 150 155 160 Arg Lys Ile Arg Glu Glu Asn Asn Phe Lys Tyr Thr Ile Met Val Asp 165 170 175 Gly Ser Val Asn Leu Lys Thr Ile Pro Glu Ile Met Thr His Ser Pro 180 185 190 Asp Ile Leu Ile Leu Gly Asn Ser Gly Leu Phe Gly Asp Ser Glu Gly 195 200 205 Leu Glu Ala Ala Tyr Lys Lys Ile Leu Thr Leu Pro Glu Val Lys Thr 210 215 220 Ser Leu 225 <210> 9 <211> 229 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Petrotoga sp. 9PWA.NaAc.5.4 <400> 9 Met Ser Leu Leu Phe Ser Ala Ser Val Met Cys Met Asp Phe Ser Asn 1 5 10 15 Leu Ser Asn Gln Leu Lys Glu Ile Glu Glu Ile Gly Ile Asn Arg Leu 20 25 30 His Tyr Asp Ile Met Asp Gly Lys Phe Val Pro Asn Ile Thr Leu Gly 35 40 45 Phe Asp Met Ile Lys Asp Ile Thr Lys Ile Ser Thr Leu Pro Ile Asp 50 55 60 Val His Leu Met Ile Glu Asn Pro Ser Lys Phe Ile Asn Ile Leu Lys 65 70 75 80 Asn Tyr Gln Val Asp Ser Ile Thr Phe His Val Glu Asn Thr Ile Asn 85 90 95 Glu Ala Phe Arg Ile Val Glu Leu Ile His Asn Asn Asn Ile Lys Ala 100 105 110 Gly Ile Ala Leu Ser Pro Leu Thr Pro Ile Thr Leu Ile Glu Leu Ile 115 120 125 Leu Gly Arg Leu Asp Phe Ile Thr Ile Met Thr Val Asp Pro Gly Phe 130 135 140 Ala Gly Gln Gln Phe Ile Pro Glu Thr Leu Lys Lys Ile Asp Phe Leu 145 150 155 160 Arg Asn Val Lys Glu Lys Asn Asn Tyr Ser Tyr Ser Ile Met Ile Asp 165 170 175 Gly Ser Val Asn Leu Lys Thr Leu Pro Thr Ile Met Lys His Leu Pro 180 185 190 Asp Ile Leu Ile Leu Gly Asn Ser Gly Leu Phe Gly Asn Pro Glu Gly 195 200 205 Leu Lys Ala Thr Phe Tyr Lys Ile Thr Asn Ile Pro Glu Val Lys Asn 210 215 220 Asn Tyr Gly Ala Lys 225 <210> 10 <211> 222 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Symbiobacterium thermophilum IAM 14863 <400> 10 Met Ser Val Leu Leu Cys Pro Ser Met Met Cys Ala His Phe Gly Asn 1 5 10 15 Leu Ala His Glu Val Ala Glu Leu Glu Ala Ala Gly Ile Asp Met Phe 20 25 30 His Leu Asp Val Met Asp Gly Arg Phe Val Pro Asn Phe Gly Met Gly 35 40 45 Leu Gln Asp Ile Glu Phe Ile Ala Ala His Ala Thr Lys Pro Ala Asp 50 55 60 Val His Leu Met Ile Glu Asp Pro Gly Asn Tyr Val Glu Lys Phe Ala 65 70 75 80 Lys Leu Gly Ile Lys Val Ile Tyr Thr His Pro Glu Ala Asp Tyr His 85 90 95 Pro Ala Arg Thr Leu Leu Lys Ile Ala Asp Ala Gly Ala Ala Pro Gly 100 105 110 Ile Ala Ile Asn Pro Gly Thr Pro Val Glu Ala Ile Glu Pro Leu Leu 115 120 125 His Leu Ala Gln Tyr Val Leu Val Met Thr Val Asn Pro Gly Phe Ala 130 135 140 Gly Gln Pro Tyr Leu Ser Phe Val Asp Glu Lys Val Asp Arg Leu Ala 145 150 155 160 Glu Leu Lys Glu Arg Tyr Gly Tyr Arg Ile Val Ile Asp Gly Ala Cys 165 170 175 Thr Ala Ala Val Val Glu Arg Leu Ala Pro Arg Gly Val Asp Gly Phe 180 185 190 Val Leu Gly Thr Lys Gly Leu Phe Gly Arg Gly Lys Pro Tyr Gly Glu 195 200 205 Val Ile Ala Glu Leu Arg Ser Arg Ser Gly Asp Cys Arg Arg 210 215 220 <210> 11 <211> 220 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus <400> 11 Met Ile Lys Ile Cys Pro Ser Leu Met Cys Ala Asp Phe Thr Lys Leu 1 5 10 15 Lys Glu Glu Ile Leu Glu Leu Glu Ser Ala Gly Ala Asp Met Phe His 20 25 30 Leu Asp Ile Met Asp Gly Asn Phe Val Pro Asn Phe Ala Leu Gly Leu 35 40 45 Glu Asp Val Lys Ala Val Ser Lys Ile Thr Ser Ile Pro Tyr Asp Val 50 55 60 His Leu Met Ile Asn Glu Pro Glu Arg Phe Ile Glu Lys Phe Ala Ala 65 70 75 80 Tyr Gly Cys Glu Ile Ile Tyr Val His Leu Glu Thr Cys Lys His Ile 85 90 95 Ser Arg Thr Leu Leu Lys Ile Lys Glu Ser Lys Val Lys Ser Gly Val 100 105 110 Ala Leu Asn Pro Gly Thr Pro Ile Asn Leu Ile Glu Glu Val Leu Gly 115 120 125 Asp Val Asp Tyr Val Leu Ile Met Ala Val Asn Pro Gly Phe Ala Gly 130 135 140 Gln Asn Phe Ile Glu Ser Thr Val Asp Lys Val Ala Arg Leu Lys Lys 145 150 155 160 Met Ile Asp Lys Lys Gly Tyr His Ile Lys Ile Ala Ile Asp Gly Gly 165 170 175 Ile Asn Glu Met Asn Ile Pro Lys Leu Tyr Ser Ala Gly Ala Glu Tyr 180 185 190 Phe Val Val Gly Thr Ala Gly Leu Phe Asn Lys Asn Gly Lys Tyr Lys 195 200 205 Glu Asn Ile Ser Lys Leu Lys Asn Ser Ile Phe Lys 210 215 220 <210> 12 <211> 222 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Thermoanaerobacterium sp. PSU-2 <400> 12 Met Lys Glu Ile Lys Ile Val Pro Ser Leu Met Cys Cys Asp Phe Leu 1 5 10 15 Asn Leu Asn Asn Glu Ile Lys Asp Leu Glu Lys Ser Gly Val Asp Leu 20 25 30 Phe His Ile Asp Ile Met Asp Gly Asn Phe Val Asp Asn Phe Ala Met 35 40 45 Ser Gly Thr Glu Ile Lys Ser Ile Lys Arg Ile Thr Asn Ile Pro Leu 50 55 60 Asp Val His Leu Met Val Lys Glu Pro Leu Arg Tyr Ile Lys Tyr Phe 65 70 75 80 Val Asp Ala Gly Ala Asp Ile Ile Thr Val His Ile Glu Ala Cys Thr 85 90 95 His Leu Asn Arg Thr Leu Gln Glu Ile Lys Asn Asn Asn Val Lys Val 100 105 110 Gly Ile Ala Leu Asn Pro Gly Thr Ser His Leu Leu Leu Glu Pro Ile 115 120 125 Val Asp Tyr Leu Asp Ile Val Leu Ile Met Ala Val Asn Pro Gly Phe 130 135 140 Ala Gly Gln Asp Phe Ile Pro Ser Thr Val Asn Lys Val Lys Lys Thr 145 150 155 160 Arg Asp Phe Leu Asn Ser Leu Gly Phe Asn Asn Val Glu Ile Glu Val 165 170 175 Asp Gly His Ile Asp Ile Gln Thr Ile Pro Pro Leu Tyr Asp Ala Gly 180 185 190 Ala Arg Ile Phe Val Ala Gly Thr Ala Gly Leu Phe Tyr Gly Asp Arg 195 200 205 Asn Tyr Glu Glu Asn Val Lys Lys Leu Arg Ser Cys Val Tyr 210 215 220 <210> 13 <211> 218 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum <400> 13 Met Ile Lys Ile Cys Pro Ser Leu Met Cys Ala Asp Phe Thr Lys Leu 1 5 10 15 Lys Asp Glu Ile Leu Glu Leu Glu Arg Ala Gly Ala Asp Met Phe His 20 25 30 Leu Asp Ile Met Asp Gly Asn Phe Val Pro Asn Phe Ala Leu Gly Ile 35 40 45 Glu Asp Val Lys Ala Val Ser Lys Ile Ala Ser Ile Pro Tyr Asp Ile 50 55 60 His Leu Met Ile Glu Glu Pro Glu Arg Tyr Val Glu Lys Phe Ser Lys 65 70 75 80 Tyr Gly Cys Lys Ile Met Tyr Val His Leu Glu Thr Cys Lys His Ile 85 90 95 Ser Arg Thr Leu Leu Lys Ile Lys Glu Arg Asn Val Lys Ala Gly Leu 100 105 110 Ala Leu Asn Pro Gly Thr Pro Ile Ser Phe Ala Glu Glu Val Leu Ser 115 120 125 Asp Val Glu Tyr Ile Leu Ile Met Ala Val Asn Pro Gly Phe Ala Gly 130 135 140 Gln Ser Phe Ile Glu Ser Thr Val Asp Lys Val Ser Arg Leu Lys Asp 145 150 155 160 Leu Ile Asp Lys Lys Gly Tyr Asp Ile Lys Ile Ala Val Asp Gly Cys 165 170 175 Ile 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SCG-B05WGA-EpuloA1 <400> 19 Met Lys Lys Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Met Cys Leu Asp Leu Met Glu 1 5 10 15 Ala Lys Asn Gly Ile Ile Ala Leu Glu Gln Val Gly Met Asp Tyr Phe 20 25 30 His Met Asp Val Met Asp Asn His Phe Val Pro Asn Phe Ser Leu Ser 35 40 45 Ser Asp Phe Ile Lys Val Thr Arg Lys Cys Thr Gln Val Pro Leu Asp 50 55 60 Ile His Leu Met Ile Glu Asn Pro Glu Asn Ser Leu His Leu Phe Asp 65 70 75 80 Gly Ala Asn Glu Gly Asp Ile Leu Ser Ile His Tyr Glu Ser Thr Lys 85 90 95 His Val Gln Lys Val Leu Ser Glu Ile Arg Lys Met Gly Tyr Lys Ala 100 105 110 Gly Ile Ala Leu Asn Pro Ala Thr Pro Leu Asn Val Leu Glu Glu Val 115 120 125 Ile Glu Asp Leu Asp Met Val Leu Ile Met Thr Val Asn Pro Gly Phe 130 135 140 Ala Gly Gln Lys Leu Ile Pro Ser Thr Leu Gly Lys Ile Gln Lys Cys 145 150 155 160 Lys Asp Phe Leu Val Lys Val Gly Ala Glu Asn Ile Leu Ile Glu Val 165 170 175 Asp Gly Asn Val Ser Phe Glu Asn Ala Val Lys Met Asn Lys Met Gly 180 185 190 Ala Asp Ile Phe Val Ala Gly Thr Ser Ser Val Phe Ser Lys Glu Gly 195 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<220> <223> Bifidobacterium longum <400> 26 Met Ser Asn Ile Ala Ile Ala Pro Ser Ile Leu Ser Ala Asp Phe Cys 1 5 10 15 Asn Leu Glu Arg Asp Leu Lys Ala Ile Ala Asn Ala Asp Leu Val His 20 25 30 Val Asp Val Met Asp His His Phe Val Pro Asn Leu Thr Leu Gly Glu 35 40 45 Pro Ile Val Gly Arg Ile Cys Gln Val Thr Asp Leu Pro Val Asp Val 50 55 60 His Leu Met Ile Glu Asp Pro Asp Arg Trp Ala Pro Glu Tyr Ala Lys 65 70 75 80 Leu Gly Ala Ala Ser Val Ser Phe His Met Gly Ala Thr His Ala Pro 85 90 95 Val Arg Leu Ala Arg Gln Leu Arg Glu Met Gly Cys Lys Ala Cys Phe 100 105 110 Ala Val Arg Pro Ala Glu Pro Val Glu Pro Ile Phe Asp Ile Leu Asp 115 120 125 Glu Phe Asp Met Val Leu Ile Met Thr Val Glu Pro Gly Phe Gly Gly 130 135 140 Gln Lys Phe Leu Asp Asn Gln Met Ser Lys Val Arg Arg Leu Arg Asp 145 150 155 160 Glu Ile Thr Arg Arg Gly Leu Lys Thr Arg Ile Gln Val Asp Gly Gly 165 170 175 Val Ser Pro Lys Thr Ala His Ile Val Ala Glu Ala Gly Ala Asp Val 180 185 190 Leu Val Ala Gly Ser Ala Val Tyr Gly Ala Glu Asn Pro 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175 Gln Val Asp Gly Gly Leu Gly Lys Asp Thr Ile Gln Pro Ala Ala Asp 180 185 190 Ala Gly Ala Asn Val Ile Val Ala Gly Thr Ser Val Phe Lys Pro Glu 195 200 205 Asp Pro Lys Pro Val Val Gln His Leu Lys Gln Thr Val Ala Asp Ala 210 215 220 Ile Gln Ala Arg Asn Lys 225 230 <210> 28 <211> 232 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Thermoclostridium stercorarium <400> 28 Met Lys Thr Asp Thr Asp Lys Arg Glu Ile Ile Ile Ala Pro Ser Ile 1 5 10 15 Leu Ser Ser Asp Phe Thr Arg Leu Lys Glu Ala Leu Asp Thr Ile Lys 20 25 30 Asp Ser Gly Ala Asp Trp Val His Val Asp Val Met Asp Gly His Phe 35 40 45 Val Pro Asn Ile Thr Ile Gly Pro Pro Val Ile Lys Cys Ile Arg Arg 50 55 60 Gln Thr Asp Leu Phe Met Asp Val His Leu Met Ile Glu Lys Pro Glu 65 70 75 80 Leu Leu Leu Asn Asp Phe Ile Glu Ala Gly Ala Asp Met Ile Thr Val 85 90 95 His Ala Glu Ala Cys Thr His Leu Asn Arg Thr Leu Gln Ile Ile Arg 100 105 110 Gln Ser Gly Ile Arg Ala Gly Val Ala Leu Asn Pro Ala Thr Pro Leu 115 120 125 Asn Val Leu Asp Tyr Ser Leu Glu Leu Val Asp Met Val Leu Ile Met 130 135 140 Thr Val Asn Pro Gly Phe Gly Gly Gln Lys Tyr Ile Pro Gln Met Thr 145 150 155 160 Ala Lys Ile Lys Ala Met Arg Asp Arg Ile Asn Glu Gln Ala Pro Asn 165 170 175 Val Leu Leu Gln Ile Asp Gly Gly Ile Ser Thr Asp Asn Ile Ala Glu 180 185 190 Val Thr Ala Ala Gly Ala Asn Val Ile Val Ala Gly Ser Ala Phe Phe 195 200 205 Asn Ala His Asp Lys Ala Trp Phe Val Ser Glu Leu Arg Lys Lys Ser 210 215 220 Ala Phe Gly Gly Lys Val Gln Ile 225 230 <210> 29 <211> 225 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Enterobacteriaceae <400> 29 Met Lys Gln Tyr Leu Ile Ala Pro Ser Ile Leu Ser Ala Asp Phe Ala 1 5 10 15 Arg Leu Gly Glu Asp Thr Ala Lys Ala Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val 20 25 30 Val His Phe Asp Val Met Asp Asn His Tyr Val Pro Asn Leu Thr Ile 35 40 45 Gly Pro Met Val Leu Lys Ser Leu Arg Asn Tyr Gly Ile Thr Ala Pro 50 55 60 Ile Asp Val His Leu Met Val Lys Pro Val Asp Arg Ile Ile Pro Asp 65 70 75 80 Phe Ala Glu Ala Gly Ala Ser Ile Ile Thr Phe His Pro Glu Ala Ser 85 90 95 Glu His Val Asp Arg Ser Leu Gln Leu Ile Lys Glu His Gly Cys Lys 100 105 110 Ala Gly Leu Val Phe Asn Pro Ala Thr Pro Leu Ser Tyr Leu Asp Tyr 115 120 125 Val Met Asp Lys Leu Asp Val Ile Leu Leu Met Ser Val Asn Pro Gly 130 135 140 Phe Gly Gly Gln Ser Phe Ile Pro His Thr Leu Glu Lys Leu Arg Gln 145 150 155 160 Val Arg Gln Leu Ile Asp Gln Ser Gly Tyr Asp Ile Arg Leu Glu Val 165 170 175 Asp Gly Gly Val Lys Ala Ser Asn Ile Gly Glu Ile Ala Ala Ala Gly 180 185 190 Ala Asp Met Phe Val Ala Gly Ser Ala Ile Phe Gly Gln Pro Asp Tyr 195 200 205 Lys Lys Val Ile Asp Gln Met Arg Ser Glu Leu Ala Lys Val Ser His 210 215 220 Gly 225 <210> 30 <211> 225 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Escherichia fergusonii <400> 30 Met Lys Gln Tyr Leu Ile Ala Pro Ser Ile Leu Ser Ala Asp Phe Ala 1 5 10 15 Arg Leu Gly Glu Asp Thr Ala Lys Ala Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val 20 25 30 Val His Phe Asp Val Met Asp Asn His Tyr Val Pro Asn Leu Thr Ile 35 40 45 Gly Pro Met Val Leu Lys Ser Leu Arg Asn Tyr Gly Ile Thr Ala Pro 50 55 60 Ile Asp Val His Leu Met Val Lys Pro Val Asp Arg Ile Val Pro Asp 65 70 75 80 Phe Ala Ala Ala Gly Ala Ser Ile Ile Thr Phe His Pro Glu Ala Ser 85 90 95 Glu His Val Asp Arg Thr Leu Gln Leu Ile Lys Glu Asn Gly Cys Lys 100 105 110 Ala Gly Leu Val Phe Asn Pro Ala Thr Pro Leu Ser Tyr Leu Asp Tyr 115 120 125 Val Met Asp Lys Leu Asp Val Ile Leu Leu Met Ser Val Asn Pro Gly 130 135 140 Phe Gly Gly Gln Ser Phe Ile Pro Gln Thr Leu Asp Lys Leu Arg Glu 145 150 155 160 Val Arg Arg Arg Ile Asp Glu Ser Gly Phe Asp Ile Arg Leu Glu Val 165 170 175 Asp Gly Gly Val Lys Val Asn Asn Ile Gly Glu Ile Ala Ala Ala Gly 180 185 190 Ala Asp Met Phe Val Ala Gly Ser Ala Ile Phe Asp Gln Pro Asp Tyr 195 200 205 Lys Lys Val Ile Asp Asp Met Arg Ser Glu Leu Ala Lys Val Ser His 210 215 220 Glu 225 <210> 31 <211> 221 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Lactobacillus paracasei subsp. paracasei ATCC 25302 <400> 31 Met Glu Glu Ile Val Met Lys Ile Ala Pro Ser Ile Leu Ser Ala Asp 1 5 10 15 Phe Ala His Leu Ala Arg Asp Val Glu Lys Val Glu Lys Ala Gly Ala 20 25 30 Asp Leu Leu His Val Asp Val Met Asp Gly His Phe Val Ser Asn Leu 35 40 45 Thr Phe Gly Pro Leu Val Val Gln Ala Leu Arg Pro Val Thr Ser Leu 50 55 60 Pro Leu Glu Val His Leu Met Val Ser Asp Pro Ala Ala Trp Val Ala 65 70 75 80 Asp Phe Ala Glu Ala Gly Ala Asp Thr Ile Leu Val His Glu Glu Ala 85 90 95 Thr Asp His Leu Tyr Gly Val Leu Gln His Val Ile Glu Lys Gly Val 100 105 110 Arg Ala Gly Val Val Ile Asn Pro Gly Thr Pro Leu Ser Ser Leu Glu 115 120 125 Glu Val Leu Pro Leu Val Asp Gln Val Leu Val Met Thr Val Asn Pro 130 135 140 Gly Phe Gly Gly Gln Lys Phe Leu Thr Pro Met Val Asp Lys Val Asp 145 150 155 160 Arg Leu Tyr Gln Leu Arg Lys Ala Arg Lys Leu His Phe Asp Ile Glu 165 170 175 Val Asp Gly Gly Ile Asn Asn Gln Thr Val Lys Ala Ala Ala Asp Ala 180 185 190 Gly Thr Asp Ile Phe Val Ala Gly Ser Tyr Val Phe Gly Ser Lys Asn 195 200 205 Val Gly Asp Ala Met Asn Ser Leu Arg Glu Ala Val Lys 210 215 220 <210> 32 <211> 218 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Oceanobacillus iheyensis <400> 32 Met Thr Lys Ile Ala Pro Ser Ile Leu Ser Ala Asp Phe Ala Lys Leu 1 5 10 15 Gly Gln Glu Ile Lys Glu Val Glu Glu Ala Gly Ala Asp Tyr Ile His 20 25 30 Val Asp Val Met Asp Gly His Phe Val Pro Asn Ile Thr Ile Gly Pro 35 40 45 Leu Val Val Glu Ala Ile Arg Pro Ile Thr Asp Leu Pro Leu Asp Val 50 55 60 His Leu Met Ile Glu Asn Pro Asp Ala Tyr Ile Pro Ala Phe Ala Glu 65 70 75 80 Ala Gly Ala Ser Ile Ile Thr Val His Gln Glu Ala Cys Val His Leu 85 90 95 His Arg Thr Leu Gln Leu Ile Arg Ser His Gly Val Lys Pro Gly Val 100 105 110 Val Ile Asn Pro Ala Thr Pro Val Glu Met Ile Lys Pro Ile Leu Ala 115 120 125 Glu Val Asp Leu Ile Leu Ile Met Thr Val Asn Pro Gly Phe Gly Gly 130 135 140 Gln Ser Phe Ile Gln Glu Thr Thr Ser Lys Ile Lys Gln Leu Ala Asp 145 150 155 160 Trp Arg Glu Lys Tyr Lys Leu Ser Tyr Glu Ile Glu Val Asp Gly Gly 165 170 175 Val Asn Glu Lys Thr Ala Gly Ile Cys Thr Thr Ser Gly Ala Asp Val 180 185 190 Leu Val Ala Gly Ser Ala Ile Phe Asn His Glu Asn Arg Lys Gln Ala 195 200 205 Ile Glu Leu Leu Arg Glu Lys Ala Lys Val 210 215 <210> 33 <211> 219 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Odoribacter splanchnicus <400> 33 Met Ser Val Ile Val Ser Pro Ser Leu Leu Ala Ala Asp Phe Met Asn 1 5 10 15 Leu Gly Lys Asp Val Glu Met Val Asp Arg Ser Lys Ala Asp Trp Ile 20 25 30 His Leu Asp Ile Met Asp Gly Val Phe Val Pro Asn Ile Ser Tyr Gly 35 40 45 Leu Pro Val Val Ser Gln Ile Lys Lys Ile Ala Arg Lys Pro Leu Asp 50 55 60 Val His Leu Met Ile Val Gln Pro Glu Arg Tyr Ile Glu Ala Phe His 65 70 75 80 Lys Ala Gly Ala Asp Ile Leu Thr Val His Leu Glu Ala Ser Thr His 85 90 95 Leu His Arg Thr Leu Gln Gln Ile Lys Ala Ser Gly Met Lys Ala Gly 100 105 110 Val Ala Leu Asn Pro His Thr Pro Val Ser Leu Leu Glu Asp Ile Ile 115 120 125 Gln Asp Ile Asp Val Val Leu Ile Met Ser Val Asn Pro Gly Phe Gly 130 135 140 Gly Gln Ser Phe Ile Glu His Ser Leu Glu Lys Val Lys Lys Leu Lys 145 150 155 160 Ala Leu Ile Gln Ala Thr His Ser His Thr Leu Ile Glu Ile Asp Gly 165 170 175 Gly Val Asn Phe Glu Thr Gly Arg Glu Leu Val Thr Ala Gly Ala Asp 180 185 190 Ala Leu Val Ala Gly Ser Phe Val Phe Lys Ser Glu Asp Pro Glu Ala 195 200 205 Thr Ile Ala Gly Leu Lys Asn Leu Lys Thr Glu 210 215 <210> 34 <211> 218 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Runella slithyformis <400> 34 Met Asn Ala Pro Leu Ile Ala Pro Ser Val Leu Ala Ala Asp Phe Ala 1 5 10 15 Asn Leu Gln Arg Asp Val Glu Met Leu Asn Arg Ser Ala Ala Asp Trp 20 25 30 Ile His Val Asp Ile Met Asp Gly Val Phe Val Pro Asn Ile Ser Phe 35 40 45 Gly Leu Pro Val Thr Ala Ala Ile Lys Lys His Ala Gln Lys Pro Leu 50 55 60 Asp Val His Leu Met Ile Val Gln Pro Glu Arg Tyr Leu Glu Ala Phe 65 70 75 80 Arg Asp Ala Gly Ala Asp Ile Leu Thr Val His Tyr Glu Ala Cys Pro 85 90 95 His Leu His Arg Thr Ile Gln Gln Ile Lys Ser Leu Gly Ala Lys Ala 100 105 110 Gly Val Ala Leu Asn Pro His Thr Pro Val Gln Leu Leu Gln Asp Val 115 120 125 Ile Ala Asp Leu Asp Leu Val Leu Ile Met Ser Val Asn Pro Gly Phe 130 135 140 Gly Gly Gln Lys Phe Ile Glu Arg Thr Tyr Glu Arg Val Arg Gln Thr 145 150 155 160 Ala Ala Met Ile Ala Glu Ala Gly Ser Asn Ala Ile Ile Glu Ile Asp 165 170 175 Gly Gly Val Asn Gln Ser Asn Ala Ala Leu Leu Tyr His Ala Gly Ala 180 185 190 Arg Ala Leu Val Ala Gly Asn Phe Val Phe Thr Ala Ala Asp Pro Val 195 200 205 Gln Thr Ile Ala Glu Leu Lys Lys Val Trp 210 215 <210> 35 <211> 228 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Schizosaccharomyces pombe <400> 35 Met Val Gln Ala Lys Ile Ala Pro Ser Leu Leu Ala Gly Asp Phe Ala 1 5 10 15 Asn Leu Glu Lys Glu Val Gly Arg Met Leu Lys Tyr Gly Ser Asp Trp 20 25 30 Leu His Val Asp Val Met Asp Ala Gln Phe Val Pro Asn Leu Thr Ile 35 40 45 Gly Pro Ile Val Val Lys Ala Met Arg Asn His Tyr Thr Lys Glu Glu 50 55 60 Ala Phe Phe Asp Cys His Leu Met Val Ile Glu Pro Glu Arg Tyr Ile 65 70 75 80 Asp Gln Leu Ala Asp Ala Gly Ala Ser Leu Phe Cys Phe His Tyr Glu 85 90 95 Ala Thr Glu Lys His Glu Glu Ile Ile Ser Arg Ala His Glu Lys Gly 100 105 110 Met Leu Val Gly Cys Ala Leu Lys Pro Lys Thr Pro Val Glu Val Ile 115 120 125 Leu Pro Phe Val Glu Lys Leu Asp Met Val Leu Val Met Thr Val Glu 130 135 140 Pro Gly Lys Gly Gly Gln Ser Phe Met Pro Glu Cys Leu Pro Lys Val 145 150 155 160 Glu Phe Leu Arg Lys Lys Tyr Pro Thr Leu Asn Val Glu Val Asp Gly 165 170 175 Gly Leu Ser Leu Lys Thr Val Asp Ala Ala Ala Asp Ala Gly Ala Asn 180 185 190 Val Ile Val Ala Gly Thr Ala Val Phe His Ala Gln Ser Pro Glu Glu 195 200 205 Val Ile Ser Gly Leu Arg Asn Ser Val Met Lys Ala Gln Glu Thr Lys 210 215 220 Pro Trp Phe Lys 225 <210> 36 <211> 216 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Thermoanaerobacter mathranii <400> 36 Met Lys Ile Ala Pro Ser Ile Leu Ser Ala Asn Phe Ala Asn Leu Leu 1 5 10 15 Glu Asp Val Lys Lys Ile Glu Lys Asp Ala Asp Leu Leu His Ile Asp 20 25 30 Val Met Asp Gly His Phe Val Pro Asn Ile Thr Ile Gly Pro Val Val 35 40 45 Val Lys Ser Leu Arg Lys Phe Phe Ser Ile Pro Phe Asp Val His Leu 50 55 60 Met Ile Glu Asn Pro Asp Leu Tyr Ile Glu Asn Phe Val Asn Ser Gly 65 70 75 80 Ala Asp Ile Ile Thr Val His Gln Glu Ala Cys Ile His Leu His Arg 85 90 95 Thr Ile Gln Lys Ile Lys Ser Tyr Gly Lys Lys Ala Gly Val Ser Leu 100 105 110 Asn Pro Ala Thr Pro Leu Glu Ser Ile Lys Tyr Val Leu Gln Asp Ile 115 120 125 Asp Met Val Leu Ile Met Thr Val Asn Pro Gly Phe Gly Gly Gln Lys 130 135 140 Phe Ile Asp Ser Met Leu Lys Lys Ile Glu Glu Ile Lys Lys Met Arg 145 150 155 160 Glu Asp Leu Gly Leu Asn Phe Glu Ile Glu Val Asp Gly Gly Ile Asn 165 170 175 Leu Tyr Asn Val Lys Glu Val Val Glu Ala Gly Thr Asp Ile Ile Val 180 185 190 Ala Gly Ser Ser Ile Phe Glu Ser Ser Asp Pro Ala Gln Thr Ile Lys 195 200 205 Glu Phe Arg Lys Ala Val Lys Arg 210 215 <210> 37 <211> 216 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Thermoanaerobacter siderophilus SR4 <400> 37 Met Lys Ile Ala Pro Ser Ile Leu Ser Ala Asn Phe Ala Asn Leu Leu 1 5 10 15 Glu Asp Ile Lys Lys Ile Glu Lys Asp Ala Asp Leu Leu His Ile Asp 20 25 30 Val Met Asp Gly His Phe Val Pro Asn Ile Thr Ile Gly Pro Val Val 35 40 45 Val Lys Ser Leu Arg Lys Phe Phe Ser Leu Pro Phe Asp Val His Leu 50 55 60 Met Ile Glu Asn Pro Asp Leu Tyr Ile Glu Glu Phe Ala Asn Ser Gly 65 70 75 80 Ala Asp Ile Ile Thr Val His Gln Glu Ala Cys Ile His Leu His Arg 85 90 95 Thr Ile Gln Lys Ile Lys Gly Tyr Gly Lys Lys Ala Gly Val Ser Leu 100 105 110 Asn Pro Ala Thr Ser Leu Glu Thr Leu Lys Tyr Ile Leu Gln Asp Val 115 120 125 Asp Met Val Leu Ile Met Thr Val Asn Pro Gly Phe Gly Gly Gln Lys 130 135 140 Phe Ile Asp Ser Met Leu Lys Lys Ile Glu Glu Leu Asn Lys Leu Arg 145 150 155 160 Glu Thr Leu Lys Leu Asp Phe Lys Ile Glu Val Asp Gly Gly Ile Asn 165 170 175 Ile His Asn Val Lys Glu Val Val Arg Ala Gly Ala Asp Ile Ile Val 180 185 190 Ala Gly Ser Ala Ile Phe Asp Ser Ser Asn Pro Ala Gln Thr Ile Lys 195 200 205 Glu Phe Arg Glu Ala Ile Glu Lys 210 215 <210> 38 <211> 216 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Caldanaerobacter subterraneus <400> 38 Met Lys Ile Ala Pro Ser Ile Leu Ser Ala Asp Phe Ala Asn Leu Leu 1 5 10 15 Gln Asp Val Lys Glu Ile Glu Glu Asp Ala Asp Leu Leu His Ile Asp 20 25 30 Val Met Asp Gly His Phe Val Pro Asn Ile Thr Ile Gly Ser Val Val 35 40 45 Val Lys Ala Leu Arg Gln Tyr Thr Ser Leu Pro Phe Asp Val His Leu 50 55 60 Met Ile Glu Asn Pro Asp Leu Tyr Ile Glu Asp Phe Val Lys Ala Gly 65 70 75 80 Ala Asp Ile Ile Thr Val His Gln Glu Ala Cys Val His Leu His Arg 85 90 95 Thr Ile Gln Arg Ile Lys Gly His Glu Val Lys Ala Gly Val Ala Leu 100 105 110 Asn Pro Ala Thr Pro Leu Glu Thr Leu Lys Tyr Ile Leu Glu Tyr Val 115 120 125 Asp Leu Val Leu Val Met Thr Val Asn Pro Gly Phe Gly Gly Gln Lys 130 135 140 Phe Ile Asp Ser Met Leu Lys Lys Ile Lys Glu Leu Asp Glu Met Arg 145 150 155 160 Lys Glu Met Asn Leu Ser Phe Glu Ile Glu Val Asp Gly Gly Ile Asn 165 170 175 Ile Lys Asn Ile Lys Gln Val Val Glu Ala Gly Ala Asp Ile Ile Val 180 185 190 Ala Gly Ser Ala Ile Phe Glu Ser Pro Asp Pro Ser Ser Thr Ile Lys 195 200 205 Glu Phe Arg Glu Ala Val Gly Thr 210 215 <210> 39 <211> 217 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Thermoanaerobacterium xylanolyticum <400> 39 Met Glu Ile Ser Pro Ser Ile Leu Ser Ala Asp Phe Gly Asn Leu Leu 1 5 10 15 Ser Asp Ile Gln Lys Val Glu Thr Glu Lys Pro Glu Tyr Leu His Ile 20 25 30 Asp Ile Met Asp Gly His Phe Val Pro Asn Ile Thr Ile Gly Pro Leu 35 40 45 Val Leu Asn Ala Leu Lys Gly Lys Thr Glu Ile Pro Phe Asp Val His 50 55 60 Leu Met Ile Glu Glu Pro Asp Lys Tyr Ile Lys Glu Phe Val Asp Ala 65 70 75 80 Gly Ala Lys Asn Ile Thr Val His Gln Glu Ala Cys Val His Leu Asp 85 90 95 Arg Thr Leu Gln Leu Ile Lys Ser Met Gly Ile Asn Ala Ser Val Ala 100 105 110 Leu Asn Pro Ala Thr Ser Leu Asp Thr Leu Arg Tyr Val Leu Ser Ser 115 120 125 Val Asp Met Val Leu Ile Met Thr Val Asn Pro Gly Phe Gly Gly Gln 130 135 140 Val Phe Ile Asn Gly Met Tyr Glu Lys Ile Arg Glu Leu Ala Ser Ile 145 150 155 160 Arg Asn Glu Arg Gly Leu Asn Phe Lys Ile Glu Val Asp Gly Gly Ile 165 170 175 Asn Ile Asp Asn Ile Lys Asp Val Val Leu Ala Gly Ala Asp Val Ile 180 185 190 Val Ala Gly Ser Phe Ile Phe Ala Asn Gly Asp Pro Gly Glu Asn Leu 195 200 205 Lys Lys Leu Arg Glu Ala Ala Leu Lys 210 215 <210> 40 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif I <400> 40 Ser Ile Met Cys 1 <210> 41 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif I <400> 41 Ser Met Met Cys 1 <210> 42 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif I <400> 42 Ser Leu Met Cys 1 <210> 43 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif I <400> 43 Ser Val Met Cys 1 <210> 44 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif I <400> 44 Ser Leu Ile Cys 1 <210> 45 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif II <400> 45 Gly Asn Ser Gly Leu Phe 1 5 <210> 46 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif II <400> 46 Gly Ser Ser Gly Leu Phe 1 5 <210> 47 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif II <400> 47 Gly Ser Ser Ser Leu Phe 1 5 <210> 48 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif II <400> 48 Gly Ser Thr Ser Leu Phe 1 5 <210> 49 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif II <400> 49 Gly Thr Ala Gly Leu Phe 1 5 <210> 50 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif II <400> 50 Gly Thr Lys Gly Leu Phe 1 5 <210> 51 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif II <400> 51 Gly Thr Gln Ser Leu Phe 1 5 <210> 52 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif II <400> 52 Gly Thr Ser Cys Leu Phe 1 5 <210> 53 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif II <400> 53 Gly Thr Ser Gly Leu Phe 1 5 <210> 54 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif II <400> 54 Gly Thr Ser Ser Ile Phe 1 5 <210> 55 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif II <400> 55 Gly Thr Ser Gly Ile Phe 1 5 <210> 56 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif II <400> 56 Gly Thr Ser Ser Leu Phe 1 5 <210> 57 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif II <400> 57 Gly Thr Ser Ser Val Phe 1 5 <210> 58 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif II <400> 58 Gly Thr Ser Ser Val Leu 1 5

Claims (17)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 모티프 I; 및
    서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 모티프 II를 포함하는,
    리불로스-인산 3-에피머화 효소.
  2. 제1항에 있어서, 상기 모티프 I은 리불로스-인산 3-에피머화 효소의 N-말단 아미노산으로부터 5 내지 20 번 위치에 포함되는 것인, 리불로스-인산 3-에피머화 효소.
  3. 제1항에 있어서, 상기 모티프 II는 리불로스-인산 3-에피머화 효소의 N-말단 아미노산으로부터 190 내지 210 번 위치에 포함되는 것인, 리불로스-인산 3-에피머화 효소.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 리불로스-인산 3-에피머화 효소는 과당-6-인산을 싸이코스-6-인산으로 전환하는 것으로서, 싸이코스-6-인산으로의 전환 속도가 모티프 I 또는 II가 없는 리불로스-인산 3-에피머화 효소와 비교시 최소 7배 이상인 리불로스-인산 3-에피머화 효소.
  5. 제1항에 있어서, 상기 리불로스-인산 3-에피머화 효소는 언에어로라이네 (Anaerolineae), 크쏘노모나스 (Chthonomonas), 지오바실러스 (Geobacillus), 마헬라 (Mahella), 페트로토가 (Petrotoga), 심비오박테리움 (Symbiobacterium), 써모언에어리어박터(Thermoanaerobacter), 테피다네로박터(Tepidanaerobacter), 퍼미큐츠(Firmicutes), 아덴티카테니아(Ardenticatenia), 애리바실러스 (Aeribacillus), 이풀로피시움 (Epulopiscium), 메틸로써마쎄 (Methylothermaceae), 써모플라비마이크로비움 (Thermoflavimicrobium), 및 써모언에어로박터라쎄 (Thermoanaerobacteraceae) 속으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유래인 것인, 리불로스-인산 3-에피머화 효소.
  6. 제5항에 있어서, 상기 리불로스-인산 3-에피머화 효소는 언에어로라이네 박테리움 (Anaerolineae bacterium), 크쏘노모나스 칼리디로세아 (Chthonomonas calidirosea), 지오바실러스 속 8 (Geobacillus sp. 8), 지오바실러스 써모카테눌라투스 (Geobacillus thermocatenulatus), 마헬라 아우스트 랄리엔시스 (Mahella australiensis), 페트로토가 속 9T1HF07.CasAA.8.2 (Petrotoga sp. 9T1HF07.CasAA.8.2), 페트로토가 속 9PWA.NaAc.5.4 (Petrotoga sp. 9PWA.NaAc.5.4), 심비오박테리움 써모필룸 (Symbiobacterium thermophilum), 써모언에어로박터 써모하이드로썰퍼리쿠스 (Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus), 써모언에어로박테리움 속 PSU-2 (Thermoanaerobacterium sp. PSU-2), 테피다네로박터 신트로 피쿠스 (Tepidanaerobacter syntrophicus), 퍼미큐츠 박테리움 HGW-Firmicutes-5 (Firmicutes bacterium HGW-Firmicutes-5), 아덴티카테니아 박테리움 (Ardenticatenia bacterium), 애리바실러스 팔리두스 (Aeribacillus pallidus), 이풀로피시움 속 SCG-B05WGA-EpuloA1 (Epulopiscium sp. SCG-B05WGA-EpuloA1), 메틸로써마쎄 박테리아 B42 (Methylothermaceae bacteria B42), 써모플라비마 이크로비움 디초토미쿰 (Thermoflavimicrobium dichotomicum) 및 써모언에어로박터라쎄 박테리움 (Thermoanaerobacteraceae bacterium)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유래인 것인, 리불로스-인산 3-에피머화 효소.
  7. 제1항에 있어서, 상기 효소는 서열번호 3 내지 21의 아미노산 서열, 및 상기 아미노산 서열 중 상기 모티프 I 및 상기 모티프 II를 제외한 영역과 적어도 34% 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열로 구성되는 것인, 리불로스-인산 3-에피머화 효소.
  8. 제1항에 있어서, 상기 리불로스-인산 3-에피머화 효소는 내열성인 것인,리불로스-인산 3-에피머화 효소.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 리불로스-인산 3-에피머화 효소를 코딩하는 핵산.
  10. 제9항의 핵산을 포함하는 형질전환체.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 리불로스-인산 3-에피머화 효소, 이를 발현하는 미생물, 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 싸이코스-6-인산 생산용 조성물.
  12. 과당-6-인산(fructose-6-phosphate)에 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 리불로스-인산 3-에피머화 효소, 이를 발현하는 미생물, 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시키는 단계를 포함하는 싸이코스-6-인산 제조방법.
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 리불로스-인산 3-에피머화 효소, 이를 발현하는 미생물, 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 싸이코스 생산용 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 조성물은 포도당-6-인산-이성화효소, 포스포글루코무타아제, 폴리포스페이트 포도당 인산화 효소, α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제 또는 수크로오스 포스포릴라아제, α-아밀라아제, 풀루란아제, 이소아밀레이즈, α-글루카노트랜스퍼라아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제, 및 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 효소; 이를 발현하는 미생물; 또는 상기 미생물의 배양물을 추가로 포함하는 것인, 싸이코스 생산용 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 조성물은 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소, 이를 발현하는 미생물, 또는 상기 미생물의 배양물을 추가로 포함하는 것인, 싸이코스 생산용 조성물.
  16. 과당-6-인산(fructose-6-phosphate)에 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 리불로스-인산 3-에피머화 효소, 이를 발현하는 미생물, 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜 과당-6-인산을 제조하는 단계; 및
    상기 제조된 싸이코스-6-인산을 싸이코스-6-인산 탈인산화 효소, 이를 발현하는 미생물, 또는 상기 미생물의 배양물과 접촉시키는 단계를 포함하는 싸이코스 제조방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 제조방법은 싸이코스-6-인산으로부터 제조된 싸이코스를 수득하는 단계를 추가로 포함하는, 제조방법.
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