TW201726916A - 新型多磷酸依存性葡萄糖激酶與使用其製備葡萄糖-6-磷酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本申請案是有關於一種穩定性優異的高溫性及耐熱性的新型多磷酸依存性葡萄糖激酶、包含所述葡萄糖激酶的組成物及使用所述葡萄糖激酶製備葡萄糖-6-磷酸的方法。

Description

新型多磷酸依存性葡萄糖激酶與使用其製備葡萄糖-6-磷酸的方法
本申請案是有關於一種新型多磷酸依存性葡萄糖激酶、包含所述葡萄糖激酶的組成物及使用所述葡萄糖激酶製備葡萄糖-6-磷酸的方法。
於生物體代謝中作為解糖途徑（糖酵解途徑（glycolysis pathway））及五碳糖磷酸途徑（pentose phosphate pathway）中的主要磷酸化化合物的葡萄糖-6-磷酸（D-glucose 6-phosphate）能夠轉換成各種代謝產物，因此於產業中是非常有用的化合物。對於欲利用自葡萄糖-6-磷酸產生的一系列的多種酶反應來生產高附加值化合物的生物製程來說，開發經濟性的製備葡萄糖-6-磷酸的方法是非常重要的。
至今為止，為了利用酶來直接製備葡萄糖-6-磷酸，已知有如下方法：使用作為葡萄糖原料及磷酸基供給物質而分別利用二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）或三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的ADP依存性葡萄糖激酶（ADP-dependent glucokinase，EC 2.7.1.147）或ATP依存性葡萄糖激酶（ATP-dependent glucokinase，EC 2.7.1.2），或使用利用作為葡萄糖原料及磷酸（phosphate）的聚合物的多磷酸（polyphosphate，Poly(Pi)n ）的多磷酸依存性葡萄糖激酶（Poly(Pi)n -dependent glucokinase，EC 2.7.1.63）。
使用ADP/ATP依存性葡萄糖激酶的方法是將ADP或ATP的磷酸基轉移至葡萄糖而生產葡萄糖-6-磷酸的方法，此方法的缺點為需要高價的ADP或ATP。作為欲解決該缺點的方法，已知有於單磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）或ADP中同時使用利用Poly(Pi)n 作為磷酸基供給物質的多磷酸-二磷酸腺苷磷酸轉移酶（polyphosphate-AMP/ADP phosphotransferase）而使ATP再生的方法（如以下反應式1所示），但因AMP、ADP及ATP的穩定性不高等問題而於實用化方面存在限制。
[反應式1]
相反地，使用多磷酸依存性葡萄糖激酶的方法是將Poly(Pi)n 的磷酸基轉移至葡萄糖而生產葡萄糖-6-磷酸的方法（如以下反應式2所示），此方法可使用低價且穩定的Poly(Pi)n 而直接生產葡萄糖-6-磷酸。因此，就製程的經濟實用化方面而言，可謂優於使用ADP/ATP依存性葡萄糖激酶來生產葡萄糖-6-磷酸的製備方法。
[反應式2]
[發明所欲解決之課題]
本申請案是有關於一種多磷酸依存性葡萄糖激酶、包含所述酶的組成物及使用所述葡萄糖激酶生產葡萄糖-6-磷酸的方法。對於特定化合物的酶的製備製程的效率化來說，酶的穩定性可謂非常重要的特性。然而，至今為止，與本申請案相關的已知多磷酸依存性葡萄糖激酶侷限於部分微生物中，這些經分離的酶大多是來源於中溫性微生物的酶，而被指出為熱穩定性較低（表1）。為解決該問題，本申請案欲提供一種源自嗜熱微生物的穩定性優異的高溫性及耐熱性的新型多磷酸依存性葡萄糖激酶、包含所述酶的組成物及使用所述葡萄糖激酶生產葡萄糖-6-磷酸的方法。
[表1]
於生物體代謝中作為解糖途徑（糖酵解途徑（glycolysis pathway））及五碳糖磷酸途徑（pentose phosphate pathway）中的磷酸化化合物的葡萄糖-6-磷酸（glucose-6-phosphate）能夠轉換成各種代謝產物，因此於產業中是非常有用的磷酸化化合物。於欲利用自葡萄糖-6-磷酸產生的一系列的多種酶反應來生產高附加值產物的製程中需要經濟性的製備葡萄糖-6-磷酸的方法。
通常，於生物體代謝中為了實現自葡萄糖至葡萄糖-6-磷酸的酶的轉換而使用ATP或ADP作為磷酸基供給化合物，就商業性而言，所述反應途徑因ATP或ADP的較高價格而限制葡萄糖-6-磷酸的酶的製備製程的開發。再者，由於藉由微生物發酵而生產的葡萄糖-6-磷酸無法穿透細胞膜，故此生產方法是不合適的。
由於作為磷酸基供給化合物的磷酸的聚合物（即Poly(Pi)n （Polyphosphate））大量存在於自然界，或可藉由化學製造法而經濟性地低價生產，因此可謂商業價值較高的化合物。因此，開發使用酶並利用此種Poly(Pi)n 來有效地製備自葡萄糖至葡萄糖-6-磷酸的方法，就商業性而言可謂非常重要。
[解決課題之手段]
本申請案欲提供一種來源於嗜熱微生物的穩定性優異的高溫性及耐熱性的新型多磷酸依存性葡萄糖激酶及使用其生產葡萄糖-6-磷酸的方法。
以下，詳細地對本申請案的各種實施方式進行說明。
具體而言，本申請案的一實施方式可提供來源於奇異球菌（Deinococcus）屬的耐熱性的多磷酸依存性葡萄糖激酶。
具體而言，所述多磷酸依存性葡萄糖激酶可為包含序列號2的胺基酸序列的葡萄糖激酶，包含與所述序列具有70%以上、具體為80%以上、更具體為90%以上、進而具體為95%以上的相同性的胺基酸序列，未對所述多磷酸依存性葡萄糖激酶加以限制，只要是包含實質上具有與所述酶相同或類似的酶活性的多磷酸依存性葡萄糖激酶的蛋白質即可。也就是說，作為具有此種相同性的序列，只要是實質上顯示出多磷酸依存性葡萄糖磷酸化的功能的胺基酸序列即可，因此部分序列缺失、變化、置換或添加的蛋白質變異體亦包含於本發明的範圍內。
本申請案中的用語「相同性」意指可具有共同進化起源或並非共同進化起源的多肽（polypeptide）序列或多核苷酸（polynucleotide）的序列之間的同一性或相應性，並可由百分比表示。於本說明書中，由「相同性%」表示具有與多肽序列或多核苷酸序列相同或相似的活性的胺基酸序列的相同性序列。例如，可利用計算分數（score）、同一性（identity）、及相似性（similarity）等的媒介參數（parameter）的標準軟體，具體而言，利用BLAST 2.0或於指定的嚴格條件下藉由所實施的混合實驗來比較序列而進行確認，可藉由本領域技術人員所熟知的方法來決定指定的合適的混合條件（例如，薩姆布魯克等（Sambrook et al.），1989，以下參考）。於一實施例中，於兩個胺基酸序列中，多肽相對於胺基酸序列的特定長度的匹配度至少為21%（具體而言至少約為50%，特別是約為75%、90%、95%、96%、97%或99%）時，為「實質上相同」或「實質上相似」。
進而，本申請案的又一實施方式可提供一種編碼來源於奇異球菌（Deinococcus）屬的耐熱性的多磷酸依存性葡萄糖激酶的多核苷酸。具體而言，本申請案可提供一種包含由序列號2的胺基酸序列所記載而具有多磷酸依存性葡萄糖激酶活性的蛋白質的多核苷酸。
本發明中的用語「多核苷酸」是核苷酸單體藉由共價鍵而連接成鏈狀的核苷酸的聚合物，通常意指至少具有特定長度的DNA鏈或RNA鏈。
所述編碼具有多磷酸依存性葡萄糖激酶活性的蛋白質的多核苷酸序列可包含編碼所述序列號2的胺基酸的多核苷酸序列。考量到密碼子（codon）的退化性（degeneracy）或欲用於表達所述酶的生物所具有的密碼子偏好性，所述多核苷酸可於不使多肽的胺基酸序列發生變化的範圍內於編碼區域實現各種變化。例如，所述多核苷酸序列可具有序列號1的多核苷酸序列。再者，與所述序列70%以上、具體為80%以上、更具體為90%以上、進而具體為95%以上、尤其具體為98%以上的相同性的核苷酸序列可包含可編碼實質上具有多磷酸依存性葡萄糖磷酸化活性的多肽的多核苷酸。再者，應明白具有部分序列缺失、經變化、置換或添加的胺基酸序列的變異體亦包含於本發明的範圍內。
以組成物的整體容積為基準，葡萄糖為1重量%至3重量%、多磷酸為1重量%至10重量%、多磷酸依存性葡萄糖激酶為0.1 mg/ml至2.0 mg/ml及可選擇性添加鎂離子（例如：MgCl2 ）為1 mM至20 mM的條件下，所述多磷酸依存性葡萄糖激酶的轉換產率可為60%以上，可更具體為70%，可進而具體為80%以上。
於葡萄糖為1.5重量%、多磷酸為3重量%、多磷酸依存性葡萄糖激酶為0.3 mg/ml及鎂離子（例如：MgCl2 ）為10 mM的條件下，所述多磷酸依存性葡萄糖激酶的轉換產率可為60%以上，可更具體為70%，可進而具體為80%以上。
以組成物的整體容積為基準，葡萄糖為5重量%至20重量%、多磷酸為5重量%至10重量%、多磷酸依存性葡萄糖激酶為0.1 mg/ml至2.0 mg/ml及鎂離子（例如：MgCl2 ）為1 mM至20 mM的條件下，所述多磷酸依存性葡萄糖激酶的轉換產率可為50%以上，可更具體為60%，可進而具體為70%以上。
於葡萄糖為15重量%、多磷酸為7.5重量%、多磷酸依存性葡萄糖激酶為0.3 mg/ml及鎂離子（例如：MgCl2 ）為10 mM的條件下，所述多磷酸依存性葡萄糖激酶的轉換產率可為50%以上，可更具體為60%，可進而具體為70%以上。
所述多磷酸依存性葡萄糖激酶可於40℃至60℃下中顯示出活性，可更具體為於45℃至55℃下顯示出活性，可進而具體為於50℃下顯示出活性。
所述多磷酸依存性葡萄糖激酶可於pH7至pH9下顯示出活性，可更具體為於pH8下顯示出活性。
所述多磷酸依存性葡萄糖激酶的活性可於存在鎂離子的情形下增大。
所述鎂離子的濃度可具體為1 mM至20 mM，可更具體為5 mM至15 mM，可進而具體為10 mM。
本申請案的又一實施方式是有關於一種包含本申請案所揭示的多磷酸依存性葡萄糖激酶、葡萄糖及多磷酸的組成物。所述組成物可進一步包含鎂離子。所述組成物可用於製備葡萄糖-6-磷酸。於本實施方式中，對各成分及含量的詳細說明與上述實施方式或下述實施例中所說明的內容相同，因此省略對其的詳細的記載。
本申請案的又一實施方式可提供一種製備葡萄糖-6-磷酸的方法，其自包含多磷酸依存性葡萄糖激酶、葡萄糖及多磷酸的組成物製備葡萄糖-6-磷酸。
所述製備反應條件可為40℃至60℃的溫度、pH7至pH9的條件。
所述葡萄糖可使澱粉或纖維素（cellulose）液化或糖化。
所述多磷酸作為磷酸供給體（donor），其例如可為六偏磷酸鈉（sodium hexametaphosphate）、三聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate）、六偏磷酸鉀（potassium hexametaphosphate）等，但當然並不限定於此，亦可使用市售的多磷酸。
所述葡萄糖-6-磷酸的製備可於40℃至60℃下進行，可更具體為於45℃至55℃下進行，可尤其具體為於50℃下進行。
所述多磷酸依存性葡萄糖激酶的分子量可為10 kDa至100 kDa，可具體為20 kDa至50 kDa。
於製備所述葡萄糖-6-磷酸時，可進一步包含鎂離子，例如可進一步包含MgCl2 或MgSO4 。
以所述組成物的體積為基準，所述多磷酸依存性葡萄糖激酶的含量可為0.1 mg/ml至0.5 mg/ml，可更具體為0.2mg/ml至0.4 mg/ml，可尤其具體為0.3 mg/ml。
以整體組成物的重量為基準，所述葡萄糖可為1重量%至30重量%，可更具體為1重量%至20重量%，可尤其具體為3重量%至15重量%。
以整體組成物的重量為基準，所述多磷酸可為1重量%至15重量%，可更具體為1重量%至10重量%，可尤其具體為1.5重量%至7.5重量%。
本申請案的又一實施方式提供一種方法，其於利用本申請案所述的多磷酸依存性葡萄糖激酶製造葡萄糖-6-磷酸時添加鎂離子，藉此增大葡萄糖-6-磷酸的轉換活性。
於葡萄糖-6-磷酸生產用組成物中，所述鎂離子可具體為1 mM至20 mM，可更具體為5 mM至15 mM，可進而具體添加為10 mM的濃度。
MgCl2 或MgSO4等可作為所用的鎂離子，但本發明不現於此，只要是可於組成物中提供鎂離子的鎂鹽形態皆可。
本申請案的又一實施方式可提供一種製備葡萄糖-6-磷酸的方法，其自包含多磷酸依存性葡萄糖激酶、糖化酶、澱粉及多磷酸的組成物來製備葡萄糖-6-磷酸。
所述製備反應條件可為40℃至60℃的溫度、pH7至pH9的條件。
所述糖化酶可為α澱粉酶（alpha-amylase）、葡萄糖澱粉酶（glucoamylase）及α葡萄糖苷酶（alpha-glcosidase）中的一種以上。
作為又一實施方式，本申請案可提供生產所述多磷酸依存性葡萄糖激酶的微生物，具體而言，可提供大腸桿菌屬（Escherichia sp. ）微生物。
本發明中的用語「生產多磷酸依存性葡萄糖激酶的微生物」表示於生物體內可生產所述酶的原核或真核微生物菌株，具體而言，意指可藉由遺傳操作或藉由自發突變而培養或於微生物體內累積所述酶的微生物。
具體而言，所述微生物只要是能表達序列號2的多肽的微生物即可，並不特別限定其種類，且可為原核細胞或真核細胞，但可具體為原核細胞。例如，可包含屬於大腸桿菌（Escherichia ）屬、伊文氏桿菌（Erwinia ）屬、鋸桿菌（Serratia ）屬、普羅威登斯菌（Providencia ）屬、棒狀桿菌（Corynebacterium ）屬及短桿菌（Brevibacterium ）屬的微生物菌株，具體而言，可為屬於大腸桿菌（Escherichia ）屬的微生物，例如可為大腸桿菌（Eschrichia coli ），但並不限定於此。
於本發明中的用語「表達（expression）」能藉由對可操作地（operably）包含編碼本發明的多肽的多核苷酸的重組載體（vector）進行轉型，或藉由將編碼多肽的所述多核苷酸插入至染色體內而達成，但本發明不限於此。
本發明中的用語「轉型（transformation）」意指可將包含編碼目標蛋白質的多核苷酸的載體導入至宿主細胞內而於宿主細胞內表達所述多核苷酸所編碼的蛋白質。只要是能於宿主細胞內表達經轉型的多核苷酸，則不論是插入至宿主細胞的染色體內或是位於染色體外均包含在本發明的範圍內。再者，所述多核苷酸包含編碼目標蛋白質的DNA及RNA。能以任意形態將所述多核苷酸導入所述宿主細胞內，只要所述多核苷酸能被導入至所述宿主細胞並被表達即可。例如，所述多核苷酸自我表達，但能以作為包含所需要的所有要素的遺傳基因結構的表達盒（expression cassette）的形態導入至宿主細胞，且並不限定於此。通常所述表達盒可包含以可操作的方式連接於所述多核苷酸的啟動子（promoter）、轉錄終止訊號、核糖酶（ribozyme）結合部位及轉譯終止訊號。所述表達盒可為可自我複製的表達載體的形態。再者，所述多核苷酸亦可為以自身形態導入至宿主細胞而以可操作的方式與宿主細胞中表達所需要的序列連接的多核苷酸。
再者，上述中的用語「以可操作的方式連接」意指將對編碼本發明的目標蛋白質的多核苷酸的轉錄加以起始及媒介的啟動子序列與所述遺傳基因序列功能性連接。
本發明中的用語「載體」是指用以向宿主細胞複製（cloning）及/或轉移鹼基的任意媒介物。載體可為如下複製子（replicon）：能與其他的DNA片段結合而實現經結合的片段的複製。所謂「複製子」是指於生物體內作為DNA複製的自我單元而發揮功能的（即藉由自我調節而可複製的）任意的遺傳單位（例如，質體（plasmid）、噬菌體（phage）、黏接質體（cosmid）、染色體、病毒（virus））。「載體」可包含於試管內、生物體外或生物體內，用以向宿主細胞導入鹼基的病毒及非病毒媒介物，再者，可包含微球形狀的DNA。例如，所述載體可為無細菌（bacteria）DNA序列的質體。為了減少轉殖基因表達默化（silencing）而實現自質體DNA載體更持久的表達，實施CpG區域中所富含的細菌DNA序列的去除（例如，艾哈德等（Ehrhardt，A. et.al.）（2003）人類基因療法（HumGene Ther）10:215-25；耶提（Yet，N.S）（2002）分子治療（Mol Ther）5:731-38；陳等（Chen，Z.Y. et al.）（2004）基因療法（Gene Ther）11:856-64）。再者，所述載體可包含轉位子（transposon）（遺傳學年評（Annu Rev Genet.）2003；37:3-29.），又可包含人工染色體。具體而言，可於pACYC177、pACYC184、pCL1920、pECCG117、pUC19、pBR322及pMW118載體或其等中使用使啟動子等變異的變異載體，但並不限定於此。
特別是，於本申請案中載體可為DNA製造物，以能於適宜的宿主內表達目標蛋白質。所述DAN製造物含有編碼以可操作的方式連接於適宜的表達調節序列的所述目標蛋白質的多核苷酸的鹼基序列。所述表達調節序列可包含可起始轉錄的啟動子、用以調節所述轉錄的任意的操作子（operator）序列、編碼適宜的mRNA核糖酶結合部位的序列及調節轉錄與解讀的終止的序列。向合適的宿主細胞內進行轉型之後，載體可不干涉宿主基因組（genome）而發揮複製的功能，且基因組可整合於所述載體自身。
於本發明中所使用的載體，只要是可於宿主細胞內進行複製的載體即可，則並不特別地限定，可使用本業界所熟知的任意的載體。作為通常所使用的載體的示例，可為天然狀態或重組狀態的質體、黏接質體、病毒及噬菌體（bacteriophage）。例如，pWE15、M13等噬菌體載體或λWE15、λE15、λE15、E15、M13等噬菌體載體及/或Charon21A等可作為噬菌體載體或黏接質體載體，但並不限定於此。可使用pBR類、pUC類、pBluescriptII類、pGEM類、pTZ類、pCL類、及pET類作為質體載體，但並不限定於此。
可提供包含編碼所述多磷酸依存性葡萄糖激酶的基因的重組表達載體。
可提供一種大腸桿菌BL21 DE3 CJ pET21a-Dg_ppgk（大腸桿菌 BL21 DE3 CJ pET21a-Dg_ppgk）（委託機構：韓國微生物保藏中心，委託日：2015.12.17，委託編號：KCCM11793P），其特徵在於利用所述重組表達載體進行轉型。
可提供藉由使用本申請案的酶及具有其他功能的酶（α澱粉酶（α-amylase）、葡萄糖澱粉酶（glucoamylase）、α葡萄糖苷酶（α-glucosidase）、異構酶（isomerase）、丁醛醇酶（aldolase）、合成酶（synthase）、激酶（kinase）、磷酸酶（phosphate）等）的共鍋酶反應（one-pot enzymatic conversions）而自多磷酸及葡萄糖或澱粉經濟性地製備下述各種化合物的方法。
於產業中有用的各種化合物為葡萄糖-1-磷酸（D-glucose 1-phosphate）、果糖-6-磷酸（D-fructose 6-phosphate）、果糖-1,6-二磷酸（D-fructose 1,6-bisphosphate）、肌醇-3-磷酸（myo-inositol 3-phosphate）、肌醇（myo-inositol）、葡萄糖醛酸（D-glucuronate）、葡萄糖胺-6-磷酸（D-glucosamine 6-phosphate）、葡萄糖胺（D-glucosamine）、N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸（N-acetyl-D-glucosamine 6-phosphate）、N-乙醯葡萄糖胺（N-acetyl-D-glucosamine）、N-乙醯甘露糖胺-6-磷酸（N-acetyl-D-manosamine 6-phosphate）、N-乙醯甘露糖胺（N-acetyl-D-manosamine）、N-乙醯神經胺糖酸（N-acetylneuraminic acid，sialic acid）、甘露糖-6-磷酸（D-mannose 6-phosphate）、甘露糖（D-mannose）、塔格糖-6-磷酸（D-tagatose 6-phosphate）塔格糖（D-tagatose）、阿洛酮糖-6-磷酸（D-allulose 6-phosphate）、阿洛酮糖（D-allulose）、甘油醛-3-磷酸（D-glyceraldehyde 3-phosphate）、二羥丙酮磷酸（dihydroxyacetone phosphate）等，但當然並不限定於此，可包含利用葡萄糖-6-磷酸的各種化合物等。
[發明的效果]
本申請案的酶可於高溫下發生酶反應，故而可於高溫下的酶反應製程中增加基質（Poly(Pi)n 、葡萄糖）的溶解度，因此能以高濃度使用基質，且因物質的擴散速度增加、反應速度增加、反應時間縮短等而可提高單位產率。而且，因於高溫下進行的酶反應製程而可最大限度地減少因外部的微生物引起的製程污染。再者，具有如下優點：若於中溫性微生物中將本發明的酶進行重組並大量表達後利用耐熱性的特性，則可實現高溫熱處理而可對來源於中溫性微生物中的蛋白質選擇性地進行變性與去除。
如今，來源於澱粉或纖維素的葡萄糖是較低價的碳源且可大量生產，為了生產化學、醫學、化妝品及食品產業中有用的各種化合物，其被用作化學或生物學的轉換製程的基礎原料。
然而，特別是於生物製程中的酶轉換製程中，作為基礎原料的磷酸化葡萄糖因如今的高價格而使用十分有限。
於產業方面，作為於葡萄糖代謝中非常重要的代謝產物的葡萄糖-6-磷酸於利用存在於自然界（生物體）的各種代謝酶時，可作為能誘導非常有用的反應的基礎原料來使用。
因此，本申請案欲提供一種可自葡萄糖及多磷酸經濟性地生產作為可生產產業中各種有用的化合物的原料的葡萄糖-6-磷酸的酶及酶的製備方法。
再者，欲提供一種於運用本申請案的所製備的葡萄糖-6-磷酸及製備方法時，可利用酶製備於醫藥、化妝品及食品產業中的高附加功能性化合物。
[實施例]
實施例1：包含多磷酸依存性葡萄糖激酶的基因的重組表達載體及轉型微生物的製備
為了提供本申請案的新型高溫性及耐熱性多磷酸依存性葡萄糖激酶（polyphosphate-dependent glucokinase）的酶而對來源於作為微生物的中度嗜熱菌（Deinococcus geothermalis）的多磷酸依存性葡萄糖激酶的基因Dg_ppgk進行了分離。
具體而言，以於基因銀行（Genbank）所註冊的基因序列為對象，對與本申請案的酶相關的基因序列進行了一次篩選，於其中最終只選定了來源於嗜熱微生物的基因序列。以對基因鹼基序列[序列號1]與註冊為胺基酸序列[序列號2]的中度嗜熱菌的基因的鹼基序列進行比較分析的結果為基礎，研發出正向引子（Forward Primer，序列號3）、反向引子（Reverse Primer、序列號4）。藉由經合成的引子而自中度嗜熱菌的染色體DNA（genomic DNA）利用聚合酶連鎖反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）來擴大該基因（藉由正向引子及反向引子而擴大的基因）。經擴大的多磷酸依存性葡萄糖激酶的基因使用限制酶NdeI及XhoI而插入至用於表達大腸桿菌的質體載體pET21a（諾維根（Novagen）公司的製品），從而製備出pET21a-Dg_ppgk的重組表達載體。如上所述般所獲得的重組表達載體利用普遍的轉型方法（參考：薩姆布魯克等（Sambrook et al.）1989）而於大腸桿菌BL21（DE3）菌株進行轉型來製備出轉型微生物。
實施例2：重組多磷酸依存性葡萄糖激酶的製備
為了製備重組多磷酸依存性葡萄糖激酶，將轉型微生物接種至包含5 ml的LB液體培養基的培養管（tube），於37℃的振盪培養器中進行菌種培養，直至於600 nm中吸光度為2.0為止。將培養有該菌種的培養液添加至盛裝有LB液體培養基的燒瓶（flask）而進行其培養。於600 nm中的吸光度為2.0時，添加1 mM的1PTG而誘導重組酶的表達生產。此時，所述過程中的攪拌速度保持為200 rpm、培養溫度保持為37℃。
如上所述，過表達而生產的重組酶於4℃下對所述經轉型的菌株的培養液以8,000×g進行20分鐘的離心分離，利用50 mM Tris-CL（pH7.5）的緩衝液進行二次清洗後，利用超音波細胞破碎機而破碎細胞。於4℃下對所述細胞破碎物以13,000×g進行20分鐘的離心分離後，僅提取上清液並使用His-Tag親和色層分析法（chromatography）進行精製。利用活性測定用緩衝液（50 mM Tris-CL，pH7.5）對湧出精製的重組酶進行透析後，使用酶的特性分析。
圖4的M是尺寸標註（size marker）、CE是細胞破碎後的助酶液（粗萃（Crude extract））、NE是未誘導基因表達的酶（負控制（Negative control））、及PE是基因表達後精製的酶（純化酶（Purified enzyme））。藉由SDS-PAGE可確認到經精製的多磷酸依存性葡萄糖激酶約為30 kDa（圖4）。
實施例3：重組多磷酸依存性葡萄糖激酶的活性分析
對來源於以於基因銀行所註冊的基因序列分析的結果為基礎而製造的基因的經精製的重組多磷酸依存性葡萄糖激酶的活性進行了分析。
對於反應組成物，使用包含2 %（w/v）的葡萄糖、10 mM的MgCl2 、1.5 %（w/v）的六偏磷酸鈉（sodium hexametaphosphate）、0.3 mg/ml的精製酶的50 mM的Tris-HCL（pH7.5），於40℃下進行30分鐘的酶反應後，利用高效液相層析法（High Performance Liquid Chromatography）進行分析。HPLC分析條件是使用安美納斯（Aminex）HPX-87C（伯樂（Bio-Rad））色譜柱（column），於80℃下以移動的方式給予5 nM的H2 SO4 溶液0.6 ml/min的流速來進行，利用折射率偵檢器（Refractive Index Detector）檢測分析葡萄糖-6-磷酸。因此，於來源於基因的重組蛋白質中檢測出活性。
實施例4：pH及溫度對重組多磷酸依存性葡萄糖激酶的活性的影響的分析
4-1.pH影響性分析
為了調查pH對所述酶的影響性，對於反應組成物，使用包含2 %（w/v）的葡萄糖、10 mM的MgCl2 、1.5 %（w/v）的六偏磷酸鈉、0.3 mg/ml的精製酶的50 mM的緩衝液（乙酸鈉（sodium acetate），pH4-6；磷酸鉀（potassium phosphate），pH6-8；Tris-HCL，pH7-8），於40℃下進行30分鐘的酶反應後，利用HPLC進行分析。結果如圖5所示，可確認到於接近pH8時顯示出最大活性。再者，於各個pH所對應的緩衝液中，於Tris-HCL緩衝液中的活性顯示為最大，因此可確認到於該緩衝液中顯示出最高的活性。
4-2.溫度影響性分析
為了確認對應於溫度變化的酶的活性，對於反應組成物，使用包含2 %（w/v）的葡萄糖、10 mM的MgCl2 、1.5 %（w/v）的六偏磷酸鈉、0.3 mg/ml的精製酶的50 mM的Tris-HCL，以pH7.5，於30℃至65℃下進行30分鐘的酶反應後，利用HPLC進行分析。
結果如圖6所示，可確認到接近50℃時顯示出最高的活性。
實施例5：重組多磷酸依存性葡萄糖激酶的金屬離子的要求性分析
已知現有的多磷酸依存性葡萄糖激酶需要金屬離子。為了調查不同種類的金屬離子對本申請案的多磷酸依存性葡萄糖激酶的活性的影響性，利用10 mM的乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic acid，ETDA）處理後，使用經透析的酶樣品。
對於反應組成物，使用包含2 %（w/v）的葡萄糖、5 mM的金屬離子（NiSO4 、CuSO4 、MnSO4 、CaCl2 、ZnSO4 、MgSO4 、MgCl2 、FeSO4 、NaCl、LiCl、KCl、CoCl2 ）、1.5 %（w/v）的六偏磷酸鈉、0.3 mg/ml的不含金屬離子的酶樣品的50 mM的Tris-HCL（pH7.5），於50℃下進行30分鐘的酶反應後，利用HPLC進行分析。
使用未經金屬離子處理的反應組成物作為對照組，並比較經金屬離子處理的各反應組成物與對照組的酶活性。結果如圖7所示，於所分析的金屬鹽中，鎂對藉由來源於中度嗜熱菌的多磷酸依存性葡萄糖激酶的葡萄糖-6-磷酸的生產最有效，特別是，於添加MgCl2 的情況下，可確認到最大活性。額外對MgCl2 的添加濃度進行實驗，結果顯示於10 mM的濃度中增加活性（圖8）。
實施例6：溫度穩定性
為了調查多磷酸依存性葡萄糖激酶的溫度穩定性，藉由於溫度40℃至70℃的範圍內經6個小時的熱處理的酶來測定殘餘活性，從而進行比較分析。
對於反應組成物，使用包含2 %（w/v）的葡萄糖、10 mM的MgCl2 、1.5 %（w/v）的六偏磷酸鈉、0.3 mg/ml的精製酶的50 mM的Tris-HCL（pH7.5），於50℃下進行30分鐘的酶反應後，利用HPLC進行分析。
結果如圖9所示，可確認到當於40℃下經過6個小時以上或於50℃以上的溫度經過1個小時的處理時，酶的活性減半。
實施例7.對應於不同濃度的基質的轉換產率的分析
為了確認利用本申請案的精製酶的葡萄糖-6-磷酸的產率，以不同濃度的基質對葡萄糖-6-磷酸的轉換產率進行分析。
對於反應組成物，使用包含3 %（w/v）或5 %（w/v）的葡萄糖、10 mM的MgCl2 、1.5 %（w/v）或7.5 %（w/v）的六偏磷酸鈉、0.3 mg/ml的精製酶的50 mM的Tris-HCL（pH8.0），於50℃下進行不同時間段的酶反應後，利用HPLC進行分析。
結果顯示，使用3 %（w/v）及1.5 %（w/v）的六偏磷酸鈉的情況下，於0.8小時反應後顯示出88.5%的轉換產率，使用15%的葡萄糖及7.5 %（w/v）的六偏磷酸鈉的情況下，於24小時反應後顯示出74.2%的轉換產率。
無
圖1是利用流程圖（flow-chart）來表示本發明的製備方法。 圖2是ATP自身與葡萄糖反應的反應式。 圖3是多磷酸與葡萄糖反應的反應式。 圖4是於SDS-PAGE凝膠（gel）中進行的尺寸標註（Marker，M）、細胞破碎後的助酶液（粗萃（Crude Extract，CE））、未誘導基因表達的酶液（負控制（Negative Control，NE））、及基因表達後精製的酶液（純化酶（Purified Enzyme，PE））的電泳分析圖片。 圖5是表示重組多磷酸依存性葡萄糖激酶對應於pH的活性的曲線圖（graph）。 圖6是表示表示重組多磷酸依存性葡萄糖激酶對應於溫度的活性的曲線圖。 圖7是表示表示重組多磷酸依存性葡萄糖激酶對應於金屬粒子的種類的活性的曲線圖。 圖8是表示表示重組多磷酸依存性葡萄糖激酶對應於MgCl2 的濃度的活性的曲線圖。 圖9是表示表示重組多磷酸依存性葡萄糖激酶對應於酶的熱處理溫度的活性的曲線圖。
國外寄存資訊 寄存國家：韓國 寄存機構：韓國微生物保藏中心 寄存編號：KCCM11793P 寄存日期：20151217
＜110＞ CJ第一製糖股份有限公司 ＜120＞ 新型多磷酸依存性葡萄糖激酶與使用其製備葡萄糖-6-磷酸的方法 ＜130＞ P16-6264 ＜150＞ KR 2016/0005463 ＜151＞ 2016-01-15 ＜160＞ 4 ＜170＞ KopatentIn 2.0 ＜210＞ 1 ＜211＞ 813 ＜212＞ DNA ＜213＞ 耐輻射奇異球菌 ＜400＞ 1 atgctggcag ccagtgacag cagccagcat ggcgggaagg ctgttacgct atctcccatg 60 agcgtgatcc tcgggattga cataggtggg agcggcatca agggggcccc tgtggacacg 120 gcaaccggga agctggtggc cgagcgccac cgcatcccca cgcccgaggg cgcgcaccca 180 gacgcggtga aggacgtggt ggttgagctg gtgcggcatt ttgggcatgc ggggccagtc 240 ggcatcactt tccctggcat cgtgcagcac ggccataccc tgagcgcagc caatgtggat 300 aaagcctgga ttggcctgga cgccgacacg ctttttactg aggcgaccgg tcgcgacgtg 360 accgtgatca acgacgcaga tgccgcgggg ctagcggagg cgaggttcgg ggccggggca 420 ggtgtgccgg gcgaggtgtt gctgttgacc tttgggacag gcatcggcag cgcgctgatc 480 tataacggcg tgctggtgcc caacaccgag tttgggcatc tgtatctcaa gggcgacaag 540 cacgccgaga catgggcgtc cgaccgggcc cgtgagcagg gcgacctgaa ctggaagcag 600 tgggccaaac gggtcagccg gtacctccag tatctggaag gtctcttcag tcccgatctc 660 tttatcatcg gtgggggcgt gagcaagaag gccgacaagt ggcagccgca cgtcgcaaca 720 acacgtaccc gcctggtgcc cgctgccctc cagaacgagg ccggaatcgt gggggccgcg 780 atggtggcgg cgcagcggtc acagggggac taa 813 ＜210＞ 2 ＜211＞ 270 ＜212＞ PRT ＜213＞ 耐輻射奇異球菌 ＜400＞ 2 Met Leu Ala Ala Ser Asp Ser Ser Gln His Gly Gly Lys Ala Val Thr 1 5 10 15 Leu Ser Pro Met Ser Val Ile Leu Gly Ile Asp Ile Gly Gly Ser Gly 20 25 30 Ile Lys Gly Ala Pro Val Asp Thr Ala Thr Gly Lys Leu Val Ala Glu 35 40 45 Arg His Arg Ile Pro Thr Pro Glu Gly Ala His Pro Asp Ala Val Lys 50 55 60 Asp Val Val Val Glu Leu Val Arg His Phe Gly His Ala Gly Pro Val 65 70 75 80 Gly Ile Thr Phe Pro Gly Ile Val Gln His Gly His Thr Leu Ser Ala 85 90 95 Ala Asn Val Asp Lys Ala Trp Ile Gly Leu Asp Ala Asp Thr Leu Phe 100 105 110 Thr Glu Ala Thr Gly Arg Asp Val Thr Val Ile Asn Asp Ala Asp Ala 115 120 125 Ala Gly Leu Ala Glu Ala Arg Phe Gly Ala Gly Ala Gly Val Pro Gly 130 135 140 Glu Val Leu Leu Leu Thr Phe Gly Thr Gly Ile Gly Ser Ala Leu Ile 145 150 155 160 Tyr Asn Gly Val Leu Val Pro Asn Thr Glu Phe Gly His Leu Tyr Leu 165 170 175 Lys Gly Asp Lys His Ala Glu Thr Trp Ala Ser Asp Arg Ala Arg Glu 180 185 190 Gln Gly Asp Leu Asn Trp Lys Gln Trp Ala Lys Arg Val Ser Arg Tyr 195 200 205 Leu Gln Tyr Leu Glu Gly Leu Phe Ser Pro Asp Leu Phe Ile Ile Gly 210 215 220 Gly Gly Val Ser Lys Lys Ala Asp Lys Trp Gln Pro His Val Ala Thr 225 230 235 240 Thr Arg Thr Arg Leu Val Pro Ala Ala Leu Gln Asn Glu Ala Gly Ile 245 250 255 Val Gly Ala Ala Met Val Ala Ala Gln Arg Ser Gln Gly Asp 260 265 270 ＜210＞ 3 ＜211＞ 31 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 引子 ＜400＞ 3 ctgacatatg ctggcagcca gtgacagcag c 31 ＜210＞ 4 ＜211＞ 31 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 引子 ＜400＞ 4 ctgacatatg ctggcagcca gtgacagcag c 31

Claims (22)

  1. 一種來源於奇異球菌屬的耐熱性的多磷酸依存性葡萄糖激酶。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的來源於奇異球菌屬的耐熱性的多磷酸依存性葡萄糖激酶，其中所述多磷酸依存性葡萄糖激酶由序列號1的DNA序列表達。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的來源於奇異球菌屬的耐熱性的多磷酸依存性葡萄糖激酶，其中所述多磷酸依存性葡萄糖激酶具有序列號2的胺基酸序列。
  4. 一種葡萄糖-6-磷酸製備用組成物，其包含來源於奇異球菌屬的耐熱性的多磷酸依存性葡萄糖激酶、葡萄糖及多磷酸。
  5. 如申請專利範圍第4項所述的葡萄糖-6-磷酸製備用組成物，其中以所述組成物的整體容積為基準，包含1重量%至3重量%的所述葡萄糖、1重量%至10重量%的所述多磷酸、0.1 mg/ml至2.0 mg/ml的所述多磷酸依存性葡萄糖激酶，藉此葡萄糖-6-磷酸的轉換產率為60%以上。
  6. 如申請專利範圍第4項所述的葡萄糖-6-磷酸製備用組成物，其中以所述組成物的整體容積為基準，包含5重量%至20重量%的所述葡萄糖、5重量%至10重量%的所述多磷酸、0.1 mg/ml至2.0 mg/ml的所述多磷酸依存性葡萄糖激酶，藉此葡萄糖-6-磷酸的轉換產率為50%以上。
  7. 如申請專利範圍第5項或第6項所述的葡萄糖-6-磷酸製備用組成物，其中所述組成物進一步包含鎂離子。
  8. 如申請專利範圍第7項所述的葡萄糖-6-磷酸製備用組成物，其中所述鎂離子的濃度為1 mM至20 mM。
  9. 如申請專利範圍第4項所述的葡萄糖-6-磷酸製備用組成物，其中於40℃至60℃的溫度、及/或pH7至pH9的條件下製備葡萄糖-6-磷酸。
  10. 一種製備葡萄糖-6-磷酸的方法，其自包含來源於奇異球菌屬的耐熱性的多磷酸依存性葡萄糖激酶、葡萄糖及多磷酸的組成物來製備葡萄糖-6-磷酸。
  11. 如申請專利範圍第10項所述的製備葡萄糖-6-磷酸的方法，其中所述葡萄糖使澱粉或纖維素液化或糖化。
  12. 如申請專利範圍第10項所述的製備葡萄糖-6-磷酸的方法，其中所述多磷酸為六偏磷酸鈉。
  13. 如申請專利範圍第10項所述的製備葡萄糖-6-磷酸的方法，其中於40℃至60℃的溫度、及/或pH7至pH9的條件下進行所述葡萄糖-6-磷酸的製備。
  14. 如申請專利範圍第10項所述的製備葡萄糖-6-磷酸的方法，其中所述組成物進一步包含鎂離子。
  15. 如申請專利範圍第10項所述的製備葡萄糖-6-磷酸的方法，其中所述多磷酸依存性葡萄糖激酶的含量為0.1 mg/ml至0.5 mg/ml。
  16. 如申請專利範圍第10項所述的製備葡萄糖-6-磷酸的方法，其中以所述組成物的體積為基準，所述葡萄糖為1重量%至30重量%。
  17. 如申請專利範圍第10項所述的製備葡萄糖-6-磷酸的方法，其中以所述組成物的體積為基準，所述多磷酸為1重量%至10重量%。
  18. 一種製備葡萄糖-6-磷酸的方法，其自包含來源於奇異球菌屬的耐熱性的多磷酸依存性葡萄糖激酶葡萄糖激酶、糖化酶、澱粉及多磷酸的組成物來製備葡萄糖-6-磷酸的方法。
  19. 如申請專利範圍第18項所述的製備葡萄糖-6-磷酸的方法，其中所述糖化酶為α澱粉酶、葡萄糖澱粉酶及α葡萄糖苷酶中的至少一者。
  20. 一種重組表達載體，其包含編碼有如申請專利範圍第3項所述的多磷酸依存性葡萄糖激酶的基因。
  21. 一種大腸桿菌BL21 DE3 CJ pET21a-Dg_ppgk，其寄存標號為KCCM11793P，其利用如申請專利範圍第20項所述的重組表達載體進行轉型。
  22. 一種藉由來源於奇異球菌屬的耐熱性的多磷酸依存性葡萄糖激酶、葡萄糖或澱粉、多磷酸及追加酶產生反應而生產葡萄糖-1-磷酸、果糖-6-磷酸、果糖-1,6-二磷酸、肌醇-3-磷酸、肌醇、葡萄糖醛酸、葡萄糖胺-6-磷酸、葡萄糖胺、N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸、N-乙醯葡萄糖胺、N-乙醯甘露糖胺-6-磷酸、N-乙醯甘露糖胺、N-乙醯神經胺糖酸、甘露糖-6-磷酸、甘露糖、塔格糖-6-磷酸、塔格糖、阿洛酮糖-6-磷酸、阿洛酮糖、甘油醛-3-磷酸、二羥丙酮磷酸中的任一種的方法。
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