BR112020014345B1 - Cetose 3-epimerase variante e método para produzir d- psicose - Google Patents
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Abstract
descobriu-se que ao substituir um aminoácido específico na sequência de aminoácidos de uma cetose 3-epimerase derivada de arthrobacter globiformis, obtém-se uma enzima variante com melhor estabilidade térmica, e que d-psicose pode ser eficientemente produzida.
Description
[001] A presente invenção refere-se a uma nova cetose 3- epimerase com uma estabilidade térmica melhorada e um método para produzir a mesma.
[002] A D-psicose é conhecida como um dos açúcares raros que só existem em quantidades muito pequenas na natureza. Como a doçura da D-psicose é cerca de 70% da do açúcar, a D-psicose é utilizada como adoçante. A D-psicose tem um valor calórico quase próximo de zero, e também é conhecida por ter várias funções fisiológicas, como a supressão de um aumento no nível de açúcar no sangue e, assim, está atraindo atenção como ingrediente alimentar funcional. Por esses motivos, a necessidade de um método eficiente e seguro para a produção de D-psicose está aumentando na indústria de alimentos.
[003] Por outro lado, uma vez que a D-psicose é um epímero da D-frutose, os métodos de produção pela reação de D-psicose 3- epimerase com D-frutose foram estabelecidos. Por exemplo, a cetose 3- epimerase originada de Arthrobacter globiformis M30 (literatura patentária 1) e D-psicose 3-epimerase originada de Agrobacterium tumefaciens (literatura patentária 2) são divulgadas. Além disso, são utilizadas para a produção de D-psicose uma psicose epimerase variante originada a partir de Agrobacterium tumefaciens (Literatura patentária 3) e D-psicose 3- epimerase variante originada a partir de Burkholderia (Literatura patentária 4) com uma melhor estabilidade térmica, através da qual a desnaturação das enzimas devido a temperatura é suprimida, mantendo a eficiência de produção.
[004] Literatura patentária 1: WO 2014/109254;
[005] Literatura patentária 2: JP-T-2008-541753;
[006] Literatura patentária 3: JP-T- 2016-518135;
[007] Literatura patentária 4: CNA106350498.
[008] Conforme descrito acima, os métodos para produzir D- psicose pela reação de enzimas como a D-psicose 3-epimerase foram desenvolvidos de várias maneiras; entretanto, ainda não foi estabelecido um método para produzir uma enzima com uma estabilidade térmica aprimorada que produz D-psicose originada de cepas bacterianas como Arthrobacter globiformis, que tenha sido confirmado como sendo seguro para alimentos. Além disso, existe um problema de que, embora a temperatura ideal da cetose 3-epimerase originada de Arthrobacter globiformis seja de 60 a 80 °C sob uma condição em que o magnésio (Mg2+) esteja presente, quando a reação é conduzida por um longo período de tempo na temperatura de reação que excede 50 °C, a atividade enzimática diminui gradualmente, diminuindo a produção de D-psicose.
[009] Como resultado de estudo dos métodos para a produção de D-psicose pela reação enzimática de várias maneiras, os presentes inventores descobriram que uma enzima variante com uma estabilidade térmica melhorada pode ser obtida substituindo um aminoácido específico na sequência de aminoácidos da cetose 3-epimerase originada de Arthrobacter globiformis, e descobriram que isto torna possível produzir a D-psicose de maneira eficiente. Mais especificamente, os presentes inventores verificaram que é possível obter uma cetose 3-epimerase variante compreendendo: pelo menos uma mutação de aminoácido em uma sequência de aminoácidos de uma cetose 3-epimerase tipo selvagem originada a partir de Arthrobacter globiformis representada pela SEQ ID NO: 1, em que a cetose 3-epimerase variante tem a característica de: (1) uma razão entre a atividade da enzima variante a 70 °C (t70) e àquela a 50 °C (t50), t70/t50, mais elevada do que para a enzima tipo selvagem; ou (2) uma atividade enzimática residual A da enzima variante a 50 °C, depois de ter sido tratada a 60 °C durante 1 hora em tampão de fosfato 50 mM (pH 8,0, contendo 2 mM de suspensão de sulfato de magnésio) quando uma atividade da enzima não tratada a 50 °C é fixada em 100, é maior do que a da cetose 3-epimerase tipo selvagem.
[010] Especificamente, a presente invenção foi concluída com base nas descobertas descritas acima e compreende os seguintes exemplos de realização de (1) a (9).
[011] (1) Uma cetose 3-epimerase variante, caracterizada por compreender: - pelo menos uma mutação de aminoácido em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, que é uma cetose 3-epimerase tipo selvagem originada de Arthrobacter globiformis, - em que a cetose 3-epimerase variante tem a seguinte característica: (1) uma razão entre a atividade da enzima variante a 70 °C (T70) e a atividade a 50 °C (T50), T70/T50 maior do que a da enzima tipo selvagem, ou (2) uma atividade enzimática residual A da enzima variante a 50 °C após ter sido tratada a 60 °C por 1 hora em suspensão de 50 mM de tampão fosfato (pH 8,0, contendo 2 mM de sulfato de magnésio) quando a atividade de uma enzima não tratada a 50 °C é definida como 100, é superior ao da cetose 3-epimerase tipo selvagem.
[012] (2) A cetose 3-epimerase variante de acordo com (1), em que a razão T70/T50 é 1,0 ou mais.
[013] (3) A cetose 3-epimerase variante de acordo com (1) ou (2), em que a atividade enzimática residual A é de 40 ou mais.
[014] (4) A cetose 3-epimerase variante de acordo com qualquer exemplo de realização de (1) a (3), em que a pelo menos uma mutação de aminoácido na sequência de aminoácidos da cetose 3-epimerase tipo selvagem é(são) uma substituição(ões) de aminoácido em 1 a 10 posição(ões).
[015] (5) A cetose 3-epimerase variante de acordo com (1), em que a pelo menos uma mutação de aminoácido na sequência de aminoácidos da cetose 3-epimerase tipo selvagem está presente em qualquer uma das seguintes posições contadas a partir da extremidade amino-terminal de uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1: 6, 14, 22, 26, 34, 67, 68, 69, 70, 75, 91, 95, 100, 101, 110, 122, 137, 144, 160, 173, 177, 181, 200, 203, 214, 222, 226, 237, 261, 270, 271, 275, 278, 281, e 289.
[016] (6) Uma cetose 3-epimerase variante, em que a cetose 3-epimerase variante é selecionada a partir das variantes com mutações nas seguintes posições, contadas a partir da extremidade amino-terminal de uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
[017] (7) A cetose 3-epimerase variante de acordo com (6), em que a cetose 3-epimerase variante é adicionalmente selecionada a partir das seguintes variantes.
[018] (8) A cetose 3-epimerase variante de acordo com (1), em que a cetose 3-epimerase variante é adicionalmente selecionada a partir das seguintes variantes.
[019] (9) A cetose 3-epimerase variante de acordo com qualquer exemplo de realização de (1) a (8), em que a cetose 3-epimerase variante está imobilizada em um veículo/transportador imobilizado.
[020] (10) Um método para produzir D-psicose, compreendendo a reação da cetose 3-epimerase variante de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de (1) a (8) ou da cetose 3-epimerase variante imobilizada de acordo com o exemplo de realização (9) com D-frutose.
[021] A presente invenção é capaz de fornecer uma cetose 3- epimerase variante que possui uma estabilidade térmica aprimorada em comparação com a enzima tipo selvagem e que é uma enzima de produção de uma D-psicose originada de Arthrobacter globiformis que foi confirmada como segura para alimentos.
[022] Uma vez que a enzima cetose 3-epimerase variante com uma melhor estabilidade térmica originada do Arthrobacter globiformis da presente invenção é capaz de manter a atividade enzimática a uma temperatura superior a 50 °C durante um período de tempo relativamente longo, é possível produzir eficazmente D-psicose em comparação com a cetose 3-epimerase convencional (tipo selvagem) originada de Arthrobacter globiformis pela reação da enzima cetose 3-epimerase variante com D-frutose, que é um substrato.
[023] A Fig. 1 mostra uma atividade residual de cada enzima imobilizada no dia 42 a partir do início da operação de um reator de coluna.
[024] A enzima cetose 3-epimerase tipo selvagem utilizada na presente invenção é originada de Arthrobacter globiformis. Na indústria de alimentos, a segurança da Arthrobacter globiformis foi confirmada. Nos Estados Unidos, ela esta listada como “Glicose Isomerase a partir de Arthrobacter globiformis imobilizados” na base de dados EAFUS (Everything Added to Food in the United States): uma base de dados de aditivos alimentares da FDA. O uso desta bactéria é tal que as células bacterianas são imobilizadas na forma como estão, o que prova que a segurança das próprias células bacterianas é muito alta.
[025] Além disso, na Europa, o “Inventário de micro-organismos com histórico documentado de uso em alimentos”, elaborado pela EFFCA (European Food&Feed Cultures Association) e pelo IFD (International Federation for the Roofing Trade), afirma que é usado para “Fermentação de citros para remover limonina e reduzir a amargura”. Isto indica que, como levedura e semelhantes, esta cepa bacteriana é utilizada para a fermentação, o que por sua vez indica que esta cepa bacteriana tem uma consideravelmente elevada segurança.
[026] No Japão, o gênero Arthrobacter está listado na Lista de Aditivos Alimentares como um micro-organismo do qual se originam enzimas como “α-amilase, isomaltodextrase”.
[027] Como descrito acima, o gênero Arthrobacter tem um longo histórico de uso no Japão, Estados Unidos e Europa e pode ser considerado uma cepa bacteriana de alta segurança.
[028] (1) A cetose 3-epimerase tipo selvagem usada na presente invenção é originada de Arthrobacter globiformis, de preferência originada de Arthrobacter globiformis M30 (número de acesso NITE: BP-1111) e possui a seguinte sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 1).
[029] Além disso, a cetose 3-epimerase tipo selvagem da presente invenção é preferencialmente uma cetose 3-epimerase que possui as seguintes especificidades de substrato (A) e (B), e possui as seguintes propriedades físico- químicas de (a) a (f), (SEQ ID NO: 1) 1 MKIGCHGLVW TGHFDAEGIR YSVQKTREAG FDLVEFPLMD PFSFDVQTAK 51 SALAEHGLAA SASLGLSDAT DVSSEDPAVV KAGEELLNRA VDVLAELGAT 101 DFCGVIYSAM KKYMEPATAA GLANSKAAVG RVADRASDLG INVSLEVVNR 151 YETNVLNTGR QALAYLEELN RPNLGIHLDT YHMNIEESDM FSPILDTAEA 201 LRYVHIGESH RGYLGTGSVD FDTFFKALGR IGYDGPVVFE SFSSSVVAPD 251 LSRMLGIWRN LWADNEELGA HANAFIRDKL TAIKTIELH.
[030] Especificidades de substrato da cetose 3-epimerase tipo selvagem: (A) A cetose 3-epimerase tipo selvagem epimeriza a posição 3 de uma D- ou L- cetose para gerar uma D- ou L-cetose correspondente; (B) A cetose 3-epimerase tipo selvagem tem a maior especificidade de substrato para uma D-frutose e D-psicose entre as D- ou L- cetoses.
[031] Propriedades Físico-Químicas da cetose 3-epimerase tipo selvagem:
[032] A cetose 3-epimerase tipo selvagem tem uma estrutura homotetramérica cuja subunidade tem peso molecular de 32 kDa, em que o peso molecular da subunidade medido por SDS-PAGE é de cerca de 32 kDa e o peso molecular medido por filtração em gel é de 120 kDa;
[033] O pH ótimo da cetose 3-epimerase tipo selvagem é de 6 a 11 sob a condição de presença de 20 mM de magnésio (Mg2+) na reação a 30 °C por 30 minutos;
[034] O pH ótimo da cetose 3-epimerase tipo selvagem é de 6 a 11 sob a condição de presença de 20 mM de magnésio (Mg2+) na reação a 30 °C por 30 minutos;
[035] A cetose 3-epimerase tipo selvagem é estável em um pH dentro da faixa de pH 5 a pH 11 sob a condição de ser mantida a 4 °C por 24 horas;
[036] A cetose 3-epimerase tipo selvagem é estável a cerca de 50 °C ou menos, sob a condição da presença de 4 mM de íon magnésio (Mg2+), e é estável a cerca de 40 °C ou menos, sob a condição de ausência de íon magnésio (Mg2+), em pH 7,5, quando mantido por 1 hora;
[037] A cetose 3-epimerase tipo selvagem é ativada por íons de manganês divalentes (Mn2+), íons de cobalto divalentes (Co2+), cálcio (Ca2+) e íons de magnésio (Mg2+).
[038] A cetose 3-epimerase variante da presente invenção é uma variante que compreende, pelo menos, uma mutação de aminoácido na sequência de aminoácidos de uma cetose 3-epimerase tipo selvagem originada a partir de Arthrobacter globiformis e representada pela SEQ ID NO: 1, em que a cetose 3-epimerase variante tem a característica de: (1) uma razão da atividade da enzima variante a 70 °C (t70) e a 50 °C (t50), t70/t50, é mais elevada do que a da enzima tipo selvagem; ou (2) uma atividade enzimática residual A da enzima variante a 50 °C, depois de ter sido tratada a 60 °C durante 1 hora em tampão de fosfato 50 mM (pH 8,0, contendo 2 mM de suspensão de sulfato de magnésio) quando uma atividade da enzima não tratada a 50 °C é fixada em 100, é maior do que a da cetose 3-epimerase tipo selvagem.
[039] A cetose 3-epimerase tipo variante da presente invenção é obtida com base na sequência de aminoácidos da cetose 3-epimerase tipo selvagem substituindo (mutando) parte da sequência de aminoácidos por uma sequência de aminoácidos específica.
[040] As enzimas variantes foram obtidas pela substituição de aminoácidos em diversas posições mostradas na Tabela 1, e a determinação de que a estabilidade térmica foi realmente melhorada foi testada para cada variante.
[041] Como resultado, cada variante compreende pelo menos uma mutação de aminoácido na sequência de aminoácidos da cetose 3- epimerase tipo selvagem originada a partir de Arthrobacter globiformis e representada pela SEQ ID NO: 1, em que a cetose 3-epimerase variante tem a característica: (1) uma razão entre a atividade da enzima variante a 70 °C (t70) e a 50 °C (t50), t70/t50, é mais elevada do que a da enzima tipo selvagem; ou (2) uma atividade enzimática residual A da enzima variante a 50 °C, depois de ter sido tratada a 60 °C durante 1 hora em tampão de fosfato 50 mM (pH 8,0, contendo 2 mM de suspensão de sulfato de magnésio) quando uma atividade da enzima não tratada a 50 °C é fixada em 100, é maior do que a da cetose 3- epimerase tipo selvagem.
[042] (1) Para a razão entre a atividade da enzima a 70 °C (T70) e a atividade da enzima a 50 °C (T50), T70/T50, a atividade epimerase pode ser obtida, por exemplo, pela reação da cetose 3-epimerase a 50 °C ou 70 °C durante 10 minutos, utilizando D-psicose (solução tampão de ácido fosfórico 50 mM (pH 8,0) contendo 2 mM de Mg2SO4) como substrato e medindo a D-frutose, que é um produto da reação. Mais especificamente, depois que a reação é interrompida, o líquido da reação é carregado em um instrumento HPLC e a atividade enzimática pode ser calculada a partir da razão da área de pico entre D-psicose, que é o substrato, e D-frutose, que é o produto da reação, a 50 °C e 70 °C. A razão T70/T50 da cetose 3-epimerase tipo variante descrita acima calculada é preferencialmente de 0,70 ou mais, mais preferencialmente de 0,80 ou mais, ainda mais preferencialmente de 1,0 ou mais e mais preferencialmente ainda de 1,5 ou mais.
[043] (2) uma atividade enzimática residual A da enzima variante a 50 °C após ter sido tratada a 60 °C por 1 hora em suspensão de 50 mM de tampão fosfato (pH 8,0, contendo 2 mM de sulfato de magnésio) quando uma atividade de enzima não tratada a 50 °C é estabelecida como 100 pode ser obtida, por exemplo, tratando a enzima a 60 °C por 1 hora na suspensão de 50 mM de ácido fosfórico (pH 8,0, contendo 2 mM de sulfato de magnésio), em seguida reagindo a enzima tratada a 50 °C por 10 minutos usando D-psicose como substrato e medindo a atividade da epimerase. Mais especificamente, depois da reação ser interrompida, o líquido da reação é carregado em um instrumento de HPLC, e a atividade enzimática da enzima não tratada e da enzima tratada a 60 °C durante uma hora pode ser calculada a partir da razão de área de pico entre D-psicose, que é o substrato, e D-frutose, que é o produto da reação.
[044] No caso em que a atividade enzimática da cetose 3- epimerase tipo selvagem representada pela SEQ ID NO: 1 é definida como 100, a atividade enzimática residual A da cetose 3-epimerase tipo variante descrita acima é preferencialmente de 40 ou mais, mais preferencialmente de 50 ou mais, ainda mais preferencialmente de 60 ou mais e mais preferencialmente ainda de 70 ou mais.
[045] Assim, a mutação de aminoácido na sequência de aminoácidos da cetose 3-epimerase tipo selvagem originada a partir de Arthrobacter globiformis e representada por SEQ ID NO: 1 pode ser pelo menos uma mutação, desde que a atividade descrita acima seja exibida, mas, além disso, a mutação de aminoácido é preferencialmente uma substituição(ões) de aminoácido(s) em 1 a 10 posição(ões), e de modo mais preferido, uma substituição(ões) de aminoácido(s) em 1 a 8 posição(ões).
[046] Além disso, a pelo menos uma mutação de aminoácido na sequência de aminoácidos da cetose 3-epimerase tipo selvagem está preferencialmente presente em qualquer uma das seguintes posições contadas a partir da extremidade amino-terminal da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1: Posições: 6, 14, 22, 26, 34, 67, 68, 69, 70, 75, 91, 95, 100, 101, 110, 122, 137, 144, 160, 173, 177, 181, 200, 203, 214, 222, 226, 237, 261, 270, 271, 275, 278, 281, e 289.
[047] Adicionalmente, a pelo menos uma mutação de aminoácido na sequência de aminoácidos da cetose 3-epimerase tipo selvagem está mais preferencialmente presente em qualquer uma das seguintes posições contadas a partir da extremidade amino-terminal da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1: Posições: 6, 14, 22, 26, 34, 67, 68, 69, 70, 75, 91, 95, 100, 101, 110, 122, 137, 144, 160, 173, 177, 200, 214, 222, 237, 261, 270, 271, 275, 278, 281 e 289.
[048] O tipo de aminoácido inserido em cada posição pela substituição pode ser qualquer aminoácido desde que seja satisfeita a razão T70/T50 ou a atividade enzimática residual A, tal como descrito acima. Normalmente, é preferível substituir um aminoácido por outro aminoácido, mas na porção carboxi-terminal, um aminoácido pode ser substituído por 1 a 10 aminoácidos contínuos.
[049] É mais preferível que a cetose-3-epimerase variante seja selecionada a partir das variantes com substituição de aminoácidos nas seguintes posições.
[050] É mais preferível que a cetose-3-epimerase variante seja selecionada a partir das variantes com substituição de aminoácidos nas seguintes posições.
[051] De modo ainda mais preferível, as variantes que exibiram estabilidade térmica melhorada em relação à enzima tipo selvagem têm as seguintes substituições de aminoácidos. No relatório descritivo, por exemplo, R160A indica que a arginina (R) na posição 160 a partir do amino-terminal na SEQ ID NO: 1 é substituída por alanina (A). H289VSARHKP indica que a histidina (H) na posição 289 a partir do amino-terminal na SEQ ID NO: 1 é substituída pela sequência VSARHKP.
[052] Entre as variantes listadas acima, as cetose 3-epimerase variantes preferidas são PM3, PM4, PM5, PM9, PM12, PM14, PM17, PM18, PM19, PM23, PM26, PM28, PM29, PM31, PM32, PM33, PM38, PM39, PM41, PM43, PM44, PM45, PM46, PM48, PM51, PM55, PM56, PM57, PM58, PM59, PM60, PM61, PM62, PM63, PM64 e PM65.
[053] Entre as variantes listadas acima, as cetoses 3-epimerase variantes ainda mais preferidas são PM4, PM17, PM18, PM23, PM26, PM29, PM32, PM33, PM38, PM39, PM41, PM43, PM44, PM45, PM48, PM51, PM55, PM57, PM58, PM60, PM61, PM63 e PM65.
[054] Entre as variantes listadas acima, são particularmente preferidas as PM17, PM23, PM26, PM29, PM32, PM38, PM39, PM41, PM43, PM51, PM51, PM57, PM60, PM61 e PM65.
[055] A cetose 3-epimerase variante da presente invenção pode ser obtida por substituição apropriada usando um método conhecido publicamente em qualquer posição de pelo menos um aminoácido na sequência de aminoácidos da cetose 3-epimerase tipo selvagem (mais especificamente, em pelo menos um aminoácido na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1). Por exemplo, uma variante sujeita à substituição de aminoácidos na posição alvo pode ser obtida por uma abordagem de engenharia genética publicamente conhecida.
[056] Além disso, a cetose 3-epimerase variante da presente invenção pode ser produzida, por exemplo, pela incorporação dentro de um vetor plasmidial de uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos de cada variante, ou um fragmento de DNA no qual uma mutação da cetose 3-epimerase foi introduzida seguida pela transformação em Escherichia coli (hospedeiro) ou similar com o vetor plasmidial para, desse modo, preparar um transformante desejado. O tipo do vetor recombinante a ser usado não é particularmente limitado e pode ser um vetor normalmente utilizado no estado da técnica. Além disso, podem ser utilizados como recombinante para a produção da cetose 3-epimerase, a Escherichia coli, bacilo, levedura ou agrobacterium.
[057] Para a cetose 3-epimerase variante da presente invenção, uma enzima bruta ou uma enzima purificada pode ser usada como uma solução enzimática, mas pode ser transformada e usada como uma enzima imobilizada utilizando um método de imobilização publicamente conhecido, por exemplo, o método de ligação com transportador, método de reticulação, método de aprisionamento em gel ou similares.
[058] No caso em que o método de ligação com veículo/transportador é utilizado, um veículo imobilizado conhecido publicamente, por exemplo, uma resina de troca iônica, um adsorvente sintetizado, carvão ativado, vidro poroso ou sílica gel pode ser usado. No caso em que uma resina de troca iônica é usada como veículo imobilizado, por exemplo, pode ser usada uma resina de troca iônica de base fraca de gel à base de fenol ou uma resina de troca iônica de base fraca macroporosa à base de estireno. Na presente invenção, podem ser utilizados produtos comerciais dessas resinas de troca iônica, e os produtos comerciais da resina de troca iônica de base fraca em gel à base de fenol incluem Duolite A 561, Duolite A 568, Duolite PWA 7 (fabricados pela Dow DuPont) e similares. Além disso, os produtos comerciais da resina de troca iônica de base fraca macroporosa à base de estireno incluem Amberlite FPA 95, Amberlite IRA 904, Amberlite XE 583 (fabricados pela Dow DuPont), Purolite A 111 S, Purolite A 103 S (fabricados pela Purolite), DIAION WA 20, DIAION WA 30 (fabricados pela Mitsubishi Chemical Corporation), e similares.
[059] Ao utilizar a cetose 3-epimerase variante da presente invenção ou a cetose 3-epimerase imobilizada variante da presente invenção, é possível produzir eficientemente D-psicose.
[060] Mais especificamente, por exemplo, quando a cetose 3- epimerase variante imobilizada da presente invenção é usada, é possível produzir uma solução aquosa de D-psicose de alta pureza passando continuamente uma solução aquosa de D-frutose através de um reator de coluna embalada com a cetose 3-epimerase imobilizada variante para obter uma solução aquosa mista de D-frutose e D-psicose em que parte de D-frutose é convertida em D-psicose, e depois disso executar decolorização, dessalinação, fracionamento cromatográfico por métodos publicamente conhecidos. Além disso, depois disso, o cristal de D-psicose também pode ser produzido por um método conhecido publicamente.
[061] Quando a solução aquosa de D-frutose é passada através do reator de coluna, a solução aquosa de D-frutose é desejavelmente aquecida entre 50 a 80 °C, e desejavelmente tem uma concentração de 30 a 70% em peso e é desejavelmente ajustada para pH 6 a 9 por um ajustador de pH, tal como soda cáustica. Além disso, a velocidade de fluxo quando a solução aquosa de D-frutose é passada através do reator de coluna é desejavelmente ajustada de modo que a taxa de conversão de D-frutose em D-psicose seja de 20% ou mais, o que está próximo do equilíbrio de reação da enzima. Além disso, diversos íons, por exemplo, 10 a 100 ppm de íons magnésio e 50 a 500 ppm de íons de ácido sulfuroso podem estar contidos como um ativador e estabilizador para a enzima.
[062] A seguir, a presente invenção é descrita em mais detalhes usando Exemplos; entretanto, o teor da presente invenção não está limitado a tais exemplos.
[063] Em primeiro lugar, a fim de selecionar sequências de aminoácidos relacionadas com a atividade e estabilidade térmica da cetose 3- epimerase, as estruturas primárias (sequências de aminoácidos) possuindo elevada homologia com a cetose 3-epimerase originada a partir desta cepa são procuradas por pesquisa Blast. Como resultado, a informação de estrutura primária em 12 enzimas possuindo elevada homologia com a cetose 3-epimerase foi obtida. Como a conformação da enzima originária dessa cepa não é determinada, não há informações disponíveis sobre isso. Em vista disso, as enzimas cujas conformações foram reveladas foram selecionadas entre as 12 enzimas descritas acima, e o modelo estimado de conformação da enzima alvo foi construído usando o SWISS-MODEL e o cálculo de minimização de energia. Ao comparar este modelo de conformação com a estrutura de uma enzima semelhante, porções que contribuem para a estabilidade estrutural nesta enzima são procuradas e selecionadas, e a substituição dos aminoácidos que foram considerados fisico-quimicamente capazes de estabilizar termicamente a conformação da enzima foi conduzida.
[064] Como posições das sequências de aminoácidos específicas esperadas para melhorar a estabilidade térmica, as posições mostradas na Tabela 1 foram selecionados para serem substituídas pelas sequências de aminoácidos específicas.
[065] Como conversão em sequências de aminoácidos específicas, foram feitas substituições de sequências de aminoácidos que devem ser eficazes, por exemplo, na melhora da interação hidrofóbica, na estabilização da estrutura em alça da cadeia peptídica principal, na introdução de ligação covalente entre aminoácidos por ligações de bissulfeto, na melhora na densidade espacial e na estabilização de montagem atribuível à extensão do C-terminal da proteína (Tabela 1).TABELA 1
[066] Primeiro, a mutação foi conduzida pelo método de PCR ou pelo serviço de síntese gênica (Thermo Fisher Scientific) com base no DNA da cetose 3-epimerase contendo 1 ou 2 ou mais sequências de aminoácidos substituídas descritas na Tabela 1. Os fragmentos de DNA sujeitos a mutagênese foram incorporados no vetor pQE60 (Qiagen) para expressão em Escherichia coli para transformar Escherichia coli (hospedeiro). Os sítios mutados foram confirmados por uma análise de sequência.
[067] Primeiro, uma transformante (Escherichia coli) que expressa a enzima cetose 3-epimerase variante foi cultivada em um meio de crescimento LB (solução de cultura) contendo 100 μg/mL de ampicilina e 50 μg/mL de canamicina e foi pré-cultivada a 37 °C por 16 horas. Esta solução de pré-cultura foi adicionada a um volume de 10 a 100 vezes de uma solução de cultura principal contendo IPTG 0,1 mM e foi cultivada a 20 °C por 24 horas para derivar a expressão da enzima alvo. Em seguida, a solução principal de cultura foi centrifugada a 4 °C e 5.500 x g por 20 minutos em uma centrífuga. Após a centrifugação, o sobrenadante foi removido e as células bacterianas foram coletadas. As células bacterianas coletadas foram suspensas em uma quantidade apropriada de tampão de ácido fosfórico 50 mM (pH 8,0, contendo 2 mM de sulfato de magnésio) e submetidas a 6 ciclos de fragmentação ultrassônica cada por 15 segundos, em um intervalo de 45 segundos. Em seguida, a centrifugação foi realizada a 4 °C e 5.500 x g por 20 minutos para retirar o sobrenadante e obter uma solução de enzima bruta. A solução de enzima bruta de cada enzima variante na Tabela 1 foi obtida no método descrito acima e usada para avaliar a atividade enzimática.
[068] A reação enzimática da cetose 3-epimerase é uma reação de equilíbrio de D-psicose:D-frutose = 30:70 sob uma condição de equilíbrio. Por esse motivo, é fácil medir a quantidade de D-frutose gerada no caso em que a D-psicose é usada como substrato. Portanto, a avaliação da atividade da cetose 3-epimerase foi realizada medindo a quantidade de D-frutose gerada no caso em que a reação enzimática foi realizada com D-psicose como substrato.
[069] Especificamente, a reação enzimática foi conduzida usando cada solução de enzima bruta obtida pelo método descrito acima nas condições de reação mostradas na Tabela 2. Depois que a reação foi interrompida, o líquido da reação foi purificado por dessalinização usando uma resina de troca iônica, foi submetido a filtragem e foi carregado em HPLC (sistema HPLC (fabricado pela Tosoh Corporation), MCIGEL CK08EC (fabricado pela Mitsubishi Chemical Corporation)). A área de pico da D-frutose medida por HPLC foi calculada, e cada atividade da enzima foi calculada a partir da razão da área de pico de 50 °C e 70 °C. Aqui, 1 unidade de atividade enzimática é definida pela quantidade da enzima que epimeriza D-psicose sob cada condição para gerar 1 μmol de D- frutose em 1 minuto. Os resultados obtidos são mostrados na Tabela 4.TABELA 2
[070] Como resultado da medição, as enzimas variante possuindo razão T70/T50 maior do que o valor de atividade (0,7±0,1) da enzima tipo selvagem foram confirmadas a partir de Tabela 4. Sugere-se que tais enzimas variantes tenham estabilidade térmica melhorara.
[071] Conforme descrito anteriormente, como posições nas sequências de aminoácidos específicas que devem melhorar a estabilidade térmica, cada posição mostrada na Tabela 1 foi selecionada para conduzir a substituição na sequência de aminoácidos. No entanto, entre as variantes criadas, havia variantes cujas propriedades térmicas não foram alteradas ou reduzidas, o que foi um resultado inesperado.(ii) Comparação da atividade enzimática residual A a 50 °C da mesma enzima tratada a 60 °C durante 1 hora em Suspensão de 50 mM de tampão de ácido fosfórico (pH 8,0, contendo 2 mM de Sulfato de Magnésio) no caso em que a atividade a 50 °C de enzima não tratada foi definida como 100.
[072] Em seguida, foi medida a atividade residual da enzima após tratamento térmico, onde a enzima foi deixada em repouso a 60 °C por 1 hora. A enzima após o tratamento térmico foi reagida usando D-psicose como substrato nas condições mostradas na Tabela 3 abaixo usando a solução de enzima bruta obtida acima. Depois que a reação enzimática foi interrompida, o líquido da reação foi resfriado por 10 minutos em uma água gelada e purificado por dessalinização usando uma resina de troca iônica e carregado no HPLC. A área de pico de D-psicose medida por HPLC foi calculada, e a atividade enzimática a 50 °C após o tratamento térmico e da enzima não tratada foram calculadas. A atividade enzimática residual após o tratamento térmico foi calculada como uma atividade relativa no caso em que a atividade enzimática não tratada foi definida como 100. Os resultados obtidos são mostrados na Tabela 4.TABELA 3
[073] Como resultado, cada enzima variante com uma atividade enzimática residual A superior ao valor da atividade enzimática residual da enzima tipo selvagem foi confirmada na Tabela 4. Sugere-se que cada uma destas enzimas tenha alta estabilidade térmica.TABELA 4
[074] Entre as variantes descritas acima, as variantes PM3, PM4, PM5, PM9, PM12, PM14, PM17, PM18, PM19, PM23, PM26, PM28, PM29, PM31, PM32, PM33, PM38, PM39, PM41, PM43, PM44, PM45, PM46, PM48, PM51, PM55, PM56, PM57, PM58, PM59, PM60, PM61, PM62, PM63, PM64 e PM65 em particular tiveram resultados mais excelentes na razão T70/T50 ou na atividade enzimática residual A do que a enzima tipo selvagem.
[075] Além disso, entre estas, as variantes PM4, PM17, PM18, PM23, PM26, PM29, PM32, PM33, PM38, PM39, PM41, PM43, PM43, PM44, PM45, PM48, PM51, PM55, PM55, PM57, PM58, PM60, PM61, PM63 e PM65, em particular, tiveram uma T70/T50 de 1,0 ou mais, ou atividade enzimática residual A de 40 ou mais, e tiveram resultados mais excelentes do que a tipo selvagem.
[076] Além disso, as variantes PM17, PM23, PM26, PM29, PM32, PM38, PM39, PM41, PM43, PM51, PM57, PM60, PM61 e PM65 tiveram uma atividade duas vezes ou mais o valor numérico de T70/T50 ou atividade enzimática residual A em relação à enzima tipo selvagem e foram particularmente excelentes.
[077] 1. Soluções das enzimas brutas PM38/41/43/51/tipo selvagem (doravante, WT) foram obtidas pelo mesmo método descrito na seção “Preparação De Solução De Enzima Bruta” descrita acima.
[078] A atividade enzimática de cada solução de enzima bruta foi medida usando o método e as condições descritas na seção “Avaliação da Atividade da Solução de Enzima Bruta” e na “Tabela 2” descritas acima.
[079] 2. Um veículo imobilizado (resina de troca iônica Amberlite FPA95 ou Duolite A568 (ambos fabricados pela DowDuPont)) equilibrado por lavagem com um tampão de fosfato a 50 mM (pH 8,0) contendo 2 mM de sulfato de magnésio e a solução de enzima bruta foram misturados em um frasco em uma proporção de um 630U de atividade enzimática da solução de enzima bruta para 1 mL do veículo imobilizado, que foram misturados por inversão durante 24 horas ou mais.
[080] 3. As enzimas imobilizadas preparadas pelo método descrito acima foram lavadas com um tampão fosfato 50 mM (pH 8,0) contendo sulfato de magnésio 2 mM e armazenadas em geladeira a 4 °C até a utilização.
[081] O seguinte procedimento experimental foi conduzido de acordo com a norma JIS K 7002: 1988 (glicose isomerase industrial).
[082] 1. 29 mL de enzima imobilizada foi empacotada em um reator de coluna (Φ18 mm x L 400 mm) aquecida a 55 °C e a matéria-prima da reação (contendo 50% em peso de frutose, 240 ppm de MgSO4, e 150 ppm de Na2SO3) foi carregada no reator de coluna.
[083] 2. O líquido fluiu para fora do reator de coluna e foi reunido todos os dias e a análise por HPLC (o mesmo método utilizado na seção “Avaliação da Atividade da Solução de Enzima Bruta”) foi realizada e áreas APsi e AFru de psicose e frutose no cromatograma por HPLC foi calculada.
[084] 3. A velocidade de fluxo da matéria-prima da reação foi ajustada conforme apropriado, de modo que a taxa de isomerização x expressa pela equação (1) se tornasse de 20% ou mais.
[085] 4. A atividade enzimática “a” de cada enzima imobilizada foi calculada pela equação (2),em que F representa a velocidade de fluxo do substrato, CS representa a concentração do substrato, xe representa a velocidade de reação de equilíbrio aparente (0,29), e V representa o volume de leito da enzima imobilizada.
[086] A razão entre a atividade enzimática no 42° dia (a42) desde o início da operação do reator de coluna e a atividade enzimática no primeiro dia (a1) desde o início da operação (doravante, atividade residual no 42° dia) é mostrada na FIG. 1. A atividade residual da WT no 42° dia foi de aproximadamente 60%, e as atividades residuais da PM38/41/43/51 no 42° dia foram de aproximadamente 80%. Portanto, a taxa de diminuição da atividade enzimática devido à operação por 42 dias foi pequena. Isso indica que a diminuição da atividade é lenta.
[087] Na produção real de psicose, o reator de coluna é frequentemente operado por um longo período de tempo (aproximadamente vários meses a vários anos) em uma temperatura de 50 °C ou mais. Nesse caso, a atividade enzimática diminui gradualmente, de modo que a quantidade de psicose produzida diminui. As variantes apresentadas nos Exemplos são industrialmente úteis uma vez que a diminuição da atividade é lenta, de modo que é improvável que a quantidade de psicose produzida também diminua.
[088] A partir dos resultados descritos acima, a enzima variante da presente invenção torna possível produzir eficientemente D-psicose, mantendo a atividade da enzima na temperatura ideal, melhorando a estabilidade térmica em comparação com a enzima convencional tipo selvagem.
Claims (3)
1. CETOSE 3-EPIMERASE VARIANTE, caracterizada por compreender pelo menos uma mutação de aminoácido em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, que é uma cetose 3-epimerase tipo selvagem originada de Arthrobacter globiformis, selecionada a partir das seguintes variantes possuindo as seguintes mutações:
2. CETOSE 3-EPIMERASE VARIANTE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por estar imobilizada em um veículo imobilizado.
3. MÉTODO PARA PRODUZIR D-PSICOSE, caracterizado por compreender o tratamento da D-frutose com a cetose 3-epimerase variante, conforme definida na reivindicação 1, ou a cetose 3-epimerase variante imobilizada conforme definida na reivindicação 2.
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