CN114395547B

CN114395547B - 一种β-半乳糖苷酶的突变体及其在牛奶中的应用

Info

Publication number: CN114395547B
Application number: CN202210151251.4A
Authority: CN
Inventors: 喻晓蔚; 徐岩; 时新
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2022-02-16
Filing date: 2022-02-16
Publication date: 2023-06-13
Anticipated expiration: 2042-02-16
Also published as: CN114395547A

Abstract

本发明公开了一种β‑半乳糖苷酶的突变体及其在牛奶中的应用，属于基因工程技术领域以及酶工程技术领域。本发明通过将来源于Aspergillus oryzae的β‑半乳糖苷酶第132位氨基酸突变为苯丙氨酸构建得到Y132F突变株，使得最适pH提升至5.5、受到产物抑制的程度低于野生型，并具有更好的乳糖水解效果，适于在食品加工等领域的应用。

Description

一种β-半乳糖苷酶的突变体及其在牛奶中的应用

技术领域

本发明涉及一种β-半乳糖苷酶的突变体及其在牛奶中的应用，具体涉及利用重组米曲霉β-半乳糖苷酶突变体基因的毕赤酵母菌株产β-半乳糖苷酶来水解牛奶中的乳糖，属于基因工程技术领域以及酶工程技术领域。

背景技术

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)，俗称乳糖酶，全称β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(EC3.2.1.23)。该酶在食品行业具有广泛的应用，是目前工业上生产无乳糖牛奶的主要用酶。目前全球大约有70％的人口患有乳糖不耐受，主要集中在亚洲和非洲，而目前我国乳糖不耐受人群占总人口的85％。无乳糖牛奶作为应对该病症的主要产品对于国民健康具有重要意义。

目前经FDA认证安全的可以用于食品行业的β-半乳糖苷酶主要来源于真菌，包括克鲁维酵母属和曲霉属。来源于克鲁维酵母属的中性β-半乳糖苷酶，是无乳糖牛奶生产的主要用酶，其在中性pH条件下具有很好的催化能力。但是，由于其无法胞外分泌，工业上在下游纯化步骤需要破碎菌体，工艺复杂成本高。因此亟需开发能够胞外分泌的中性β-半乳糖苷酶。目前中性β-半乳糖苷酶的主要几大供应商均来自于日本和荷兰，国内缺口较大。通过基因工程技术构建性能优良的β-半乳糖苷酶能够进一步降低工业成本，更好的弥补我国在乳品行业的缺口。

目前，已有不少针对克鲁维酵母β-半乳糖苷酶胞外释放方法的研究，包括构建渗透压敏感型酵母宿主以及将该中性β-半乳糖苷酶的部分片段和其他胞外分泌β-半乳糖苷酶的基因片段进行杂合等等。这些方法对克鲁维酵母β-半乳糖苷酶的胞外释放都几乎没有实质性的提升。

目前关于β-半乳糖苷酶的最适pH改造的研究很少，本发明所使用的来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的β-半乳糖苷酶，其最适pH在酸性，中性条件下催化乳糖水解的能力较低，目前在食品行业主要用于酸性乳清等废弃物处理。但是其具有良好的胞外分泌特性，如何提高其在中性条件下的水解活力，使其更适用于中性条件，将会有利于降低酶的工业生产成本。

发明内容

本发明的第一个目的是提供了一种β-半乳糖苷酶及其突变体，该突变体是将米曲霉(Aspergillus oryzae)的β-半乳糖苷酶(Genebank：XP_001727461.1)的氨基酸残基进行替换，通过基因工程手段将突变基因转化入毕赤酵母X33中，得到产β-半乳糖苷酶突变体的菌株。

本发明提供了一种β-半乳糖苷酶突变体，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示的β-半乳糖苷酶第132位取代得到的。

在一种实施方式中，将将氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的β-半乳糖苷酶第132位的酪氨酸取代为苯丙氨酸。

在一种实施方式中，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明提供了编码所述突变体的基因。

本发明他提供了携带所述基因的表达载体。

在一种实施方式中，所述表达载体包括但不限于pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K或pPIC9K系列载体。

优选地，所述表达载体为pPICZαA。

本发明提供了表达所述突变体、含有所述的基因或所述表达载体的微生物细胞。

在一种实施方式中，所述微生物细胞包括原核微生物和真核微生物。

优选地，所述微生物细胞以毕赤酵母为出发菌株。

本发明提供了所述微生物细胞的制备方法，具体为：

(1)构建表达质粒pPICZαA-lacA；

(2)以pPICZαA-lacA为模板，通过全质粒PCR的方式构建Y132F单点突变质pPICZαA-lacAY132F；

(3)将pPICZαA-lacA质粒和pPICZαA-lacAY132F质粒分别转化入毕赤酵母X33，验证获得重组毕赤酵母X33-pPICZαA-lacA和X33-pPICZαA-lacAY132F。

本发明提供了一种水解乳糖的方法，所述方法是在水解体系中加入所述突变体，在pH5.5～7.0、30℃～40℃条件下反应。

在一种实施方式中，在150～250rpm下反应不少于3h。

在一种实施方式中，所述突变体在水解体系中的添加量不少于5U/mL。

在一种实施方式中，所述乳糖来源于哺乳动物的乳汁。

本发明提供了所述突变体，或所述基因，或所述微生物细胞在水解乳糖中的应用。

本发明的有益效果：

本发明构建了一株β-半乳糖苷酶突变体Y132F，通过在Aspergillus oryzae的β-半乳糖苷酶的活性中心周围引入氨基酸残基的突变，与野生型的β-半乳糖苷酶相比：

(1)突变体Y132F的最适pH从4.5提高到了5.5；

(2)通过终产物半乳糖抑制实验发现，构建的Y132F突变株受到产物抑制的程度低于野生型，在半乳糖浓度0-20mg/mL的条件下，随着半乳糖浓度的提高，Y132F剩余活力的下降幅度明显低于野生型；

(3)在牛奶中乳糖水解应用中，Y132F突变株的水解效率高于野生型，反应3h，就能水解60％的乳糖，较野生型的42％提升了42.86％。

附图说明

图1为重组质粒pPICZαA-lacA的图谱。

图2为野生型和Y132F突变体蛋白表达的SDS-PAGE验证结果图；M：为蛋白分子量标准(44.3kDa-200kDa)；1：毕赤酵母X33野生菌诱导后发酵上清液；2：毕赤酵母X33 pPICZαA空载体重组菌诱导后的发酵上清液；3：毕赤酵母X33-pPICZαA-lacA重组菌诱导后的发酵上清液；4：毕赤酵母X33-pPICZαA-lacAY132F重组菌诱导后的发酵上清液。

图3为野生型和Y132F突变体pH-酶活力曲线图。

图4为野生型和Y132F突变体在不同半乳糖浓度下的剩余活力图。

图5为Y132F、Y132V、Y132A、Y132L突变体在按照同等质量(终浓度200μg/mL)加入牛奶后水解乳糖的能力图。

图6为野生型和Y132F突变株在按照同等酶活力(终浓度10U/mL)加入牛奶后水解乳糖的能力图。

具体实施方式

实施例1：基因的合成及野生型重组质粒的构建

β-半乳糖苷酶基因的合成和表达载体的构建：

根据NCBI报道的米曲霉乳糖酶的氨基酸序列(Genebank号：XP_001727461.1)，去除了序列中原始的信号肽(改造后的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)，按照毕赤酵母密码子偏好性交由生工生物工程(上海)股份有限公司优化合成编码基因，在编码基因的上下游分别引入KpnⅠ和NotⅠ并插入pPICZαA的相应位点，合成所得的质粒命名为pPICZαA-lacA(见图1)。

实施例2：突变体酶Y132F的制备

具体步骤如下：

根据pPICZαA-lacA质粒的碱基序列设计如下引物：

正向引物Y132F.F：5’-TTATCAATGCCGAGGTCTCAGGCGGT-3’，

反向引物Y132F.R：5’-CTCGGCATTGATAAACGAACCGGGGCGGGCGATCA-3’。

PCR的体系为：Takara公司PrimerSTAR^TM MAX premix(2×)25μL，模板DNA：pPICZαA-lacA 1μL，Y132F.F引物(20μM)1μL，Y132F.R引物(20μM)1μL，双蒸水22μL。

PCR扩增条件：98℃预变性1min；而后进行30个循环(98℃，30s；58℃，15s；72℃，2min)；72℃，10min；16℃保温5min。

PCR产物经Dpn I(购于Takara公司)消化，热激转化大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布于LLB固体培养基(0.5％氯化钠，0.5％酵母提取物，1％胰蛋白胨，2％琼脂粉，含有30μg/mL的Zeocin抗性)，37℃过夜培养。挑取单克隆LLB试管培养，提取质粒进行测序，突变质粒测序正确。突变质粒命名为pPICZαA-lacAY132F。

将pPICZαA-lacA以及测序正确的pPICZαA-lacAY132F质粒经过Bgl II(购于Takara公司)进行线性化，电转化入毕赤酵母X33感受态细胞，涂布于YPD固体培养基(含有100μg/mL的Zeocin抗性)，30℃培养72h，挑取单克隆，菌落PCR验证，获得阳性克隆。

实施例3：野生型和突变体酶Y132F的诱导表达及纯化

将X33-pPICZαA-lacA及X33-pPICZαA-lacAY132F重组菌分别接种到25mL BMGY培养基中，30℃，200rpm培养16h。将菌体经过4℃，6000rpm离心收集，菌体沉淀在100mLBMMY培养基中进行重悬。重悬后加入1mL甲醇诱导(1％BMMY培养基体积分数)。每隔24h补加1mL甲醇，诱导持续5天。

将上述诱导表达的重组菌培养液4℃，6000rpm离心15min，上清液即为粗酶液。粗酶液转移到透析袋中，透析袋置于pH 7.0、25mM PBS缓冲液中4℃透析48h，除去粗酶液中的盐离子和部分杂质。透析后的上清液可以通过阴离子交换柱(DEAE)。首先用洗脱液平衡阴离子交换柱(pH 7.0 25mM PBS)，将粗酶液负载上柱；用10倍柱体积的洗脱液(pH 7.025mMPBS 50mM NaCl)洗脱杂蛋白，接着用一定量的洗脱液(pH 7.0 25mM PBS 100mM NaCl)洗脱目的蛋白，进行SDS-PAGE电泳分析(见图2)，收集目的蛋白经超滤浓缩后用于后续实验。

实施例4：野生型和突变体酶Y132F在不同pH条件下的活力测定

以乳糖为底物测定酶活力，一个乳糖酶的酶活力单位定义为：在37℃、pH 4.5条件下，每分钟水解产生1μmol葡萄糖所需要的酶量为一个乳糖酶活力单位(U)。

各个pH条件下，酶活力的测定：分别取100μL适当稀释的酶液和900μL 0.2M乳糖(pH 3.0-8.0)，混匀，同时开始计时，用100℃加热10min失活的酶作为空白。反应15min后，加入4℃预冷的1mL 2M高氯酸终止反应，冰水浴放置3min。加入2mL 1M氢氧化钾使反应液的pH接近中性。反应液利用葡萄糖浓度测定试剂盒(购于Megazyme公司)测定葡萄糖含量，具体操作是用酶标仪(购于赛默飞世尔科技有限公司)测定320nm处的吸光度A₃₂₀。

β-半乳糖苷酶比酶活力＝5.05×A₃₂₀×β-半乳糖苷酶稀释倍数/β-半乳糖苷酶质量，单位U/mg。其中纯化后的野生型和Y132F突变株的蛋白浓度通过Nanodrop 2000c(购于赛默飞世尔科技有限公司)测定。

由图3可知，野生型乳糖酶的最适pH为4.5，而Y132F突变体的最适pH为5.5，相较于野生型提高了1个pH单位。

实施例5：反应终产物半乳糖浓度的抑制效果测定

具体步骤如下：

如实施例4所示测定酶活力的方法，测定的pH调整为6.5，同时在反应体系中分别加入不同浓度的半乳糖(0-20mg/mL)，以半乳糖浓度为0时的酶活作为100％，测定不同半乳糖浓度下的剩余酶活力。

如图4可知，在半乳糖浓度为20mg/mL时，野生型仅有10％残余活力，而Y132F的剩余活力为26％。

实施例6：牛奶中乳糖水解能力的测定

具体步骤如下：

按照同等酶活力加入酶，在无菌操作台中，向250mL的锥形瓶中加入50mL纯牛奶(购于蒙牛乳业股份有限公司，pH6.5～6.7)，向其中加入500U(pH 6.5，37℃条件下酶活力)的酶，37℃，摇床转速为200rpm，进行乳糖水解反应，每隔1h取样，共反应3h利用葡萄糖含量测定试剂盒(购于Megazyme公司)测定水解的葡萄糖含量。

牛奶中乳糖水解率＝水解的葡萄糖质量×1.9/水解前乳糖总质量×100％；

其中，1.9为水解释放的葡萄糖质量换算成水解乳糖质量的换算因子。

如图6所知，在按照同等酶活力(终浓度10U/mL)加入酶的条件下，经过了3h的反应，野生型水解了42％牛奶中的乳糖，Y132F水解了60％牛奶中的乳糖。

对比例1

具体实施方式参见实施例2，区别在于，将第132位突变为Val、Ala、Leu，构建得到突变酶Y132V、Y132A、Y132L，将构建得到的突变体酶Y132V、Y132A、Y132L按照牛奶乳糖水解(实施例6)方法，分别加入相同质量的突变体，测定水解能力，如图5所知，Y132V，Y132A，Y132L在加入牛奶中反应20h后，分别水解了59％，54％，57％牛奶中的乳糖，而Y132F加入反应20h后，水解了92％牛奶中的乳糖。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种β-半乳糖苷酶的突变体及其在牛奶中的应用

<130> BAA211904A

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 998

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Glu Phe Thr Trp Pro Ser Arg Pro Ser Arg Ile Gly Thr Ser Ile Lys

1 5 10 15

His Arg Leu Asn Gly Phe Thr Ile Leu Glu His Pro Asp Pro Ala Lys

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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85 90 95

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Pro Phe Phe Asp Ala Ala Lys Glu Ala Gly Ile Tyr Leu Ile Ala Arg

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Pro Gly Ser Tyr Ile Asn Ala Glu Val Ser Gly Gly Gly Phe Pro Gly

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Trp Leu Gln Arg Val Asn Gly Thr Leu Arg Ser Ser Asp Glu Pro Phe

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Leu Lys Ala Thr Asp Asn Tyr Ile Ala Asn Ala Ala Ala Ala Val Ala

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Gly Phe Glu Lys Cys Tyr Ala Leu Val Asn His Glu Phe Ser Arg Phe

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Tyr Arg Asn Asp Leu Ser Phe Gly Val Ser Thr Phe Asn Leu Tyr Met

325 330 335

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Ile His Val Val Asp Tyr Asn Val Ser Gly Thr Asn Ile Ile Tyr Ser

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Thr Ala Glu Val Phe Thr Trp Lys Lys Phe Asp Gly Asn Lys Val Leu

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Asp Gly Asn Ser Thr Tyr Lys Leu Ser Gln Leu Glu Ser Gly Lys Asn

770 775 780

Tyr Val Ile Thr Val Val Ile Asp Asn Leu Gly Leu Asp Glu Asn Trp

785 790 795 800

Thr Val Gly Glu Glu Thr Met Lys Asn Pro Arg Gly Ile Leu Ser Tyr

805 810 815

Lys Leu Ser Gly Gln Asp Ala Ser Ala Ile Thr Trp Lys Leu Thr Gly

820 825 830

Asn Leu Gly Gly Glu Asp Tyr Gln Asp Lys Val Arg Gly Pro Leu Asn

835 840 845

Glu Gly Gly Leu Tyr Ala Glu Arg Gln Gly Phe His Gln Pro Gln Pro

850 855 860

Pro Ser Glu Ser Trp Glu Ser Gly Ser Pro Leu Glu Gly Leu Ser Lys

865 870 875 880

Pro Gly Ile Gly Phe Tyr Thr Ala Gln Phe Asp Leu Asp Leu Pro Lys

885 890 895

Gly Trp Asp Val Pro Leu Tyr Phe Asn Phe Gly Asn Asn Thr Gln Ala

900 905 910

Ala Arg Ala Gln Leu Tyr Val Asn Gly Tyr Gln Tyr Gly Lys Phe Thr

915 920 925

Gly Asn Val Gly Pro Gln Thr Ser Phe Pro Val Pro Glu Gly Ile Leu

930 935 940

Asn Tyr Arg Gly Thr Asn Tyr Val Ala Leu Ser Leu Trp Ala Leu Glu

945 950 955 960

Ser Asp Gly Ala Lys Leu Gly Ser Phe Glu Leu Ser Tyr Thr Thr Pro

965 970 975

Val Leu Thr Gly Tyr Gly Asn Val Glu Ser Pro Glu Gln Pro Lys Tyr

980 985 990

Glu Gln Arg Lys Gly Ala Tyr

995

Claims

1. 一种β-半乳糖苷酶突变体，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的β-半乳糖苷酶第132位的酪氨酸取代为苯丙氨酸得到的。

2.编码权利要求1所述突变体的基因。

3.携带权利要求2所述基因的表达载体。

4.表达权利要求1所述突变体、含有权利要求2所述的基因或权利要求3所述表达载体的微生物细胞。

5.根据权利要求4所述的微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞为原核微生物细胞或真核微生物细胞。

6.一种水解乳糖的方法，其特征在于，在水解体系中加入权利要求1所述突变体，在pH5.5~7.0、30℃~40℃条件下反应。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述突变体在水解体系中的添加量不少于5U/mL。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述乳糖来源于哺乳动物的乳汁。

9.权利要求1所述突变体，或权利要求2所述基因，或权利要求4或5所述微生物细胞在水解乳糖中的应用。