KR100861437B1

KR100861437B1 - 아라비돕시스로부터의 베타1,2-크실로실트랜스퍼라제-유전자

Info

Publication number: KR100861437B1
Application number: KR1020027011341A
Authority: KR
Inventors: 요세프 그뢰슬; 리차드 스트라세르; 잔 무카; 루카스 마크; 프리드리히 알트만; 아인 비. 윌슨; 헤르타 스타인켈너
Original assignee: 요세프 그뢰슬
Priority date: 2000-03-03
Filing date: 2001-03-02
Publication date: 2008-10-02
Also published as: KR101185123B1; ATA3552000A; KR100859919B1; ES2252208T5; KR20030030987A; AU781010B2; JP2013116113A; KR20080077296A; ES2460672T3; EP1263968A1; JP5279976B2; AT409381B; KR20100119005A; PT1621633E; DE60115863T2; EP1263968B1; CA2402015A1; US20040121325A1; US7205137B2; EP1621633A2

Abstract

염기쌍 227로부터 염기쌍 1831까지 개방 판독 프레임을 갖거나, 상기 서열에 50% 이상의 상동성을 갖거나, 엄격한 조건하에 상기 서열과 잡종을 형성하거나, 유전 코드 때문에 상기 지시된 DNA 서열에 따라 변성된 서열을 포함하는 SEQ ID NO:8에 따른 서열을 포함하는 DNA 분자가 제공되며, 서열 코딩은 β1,2-크실로실트랜스퍼라제 활성을 갖거나 그것에 상보적인 식물 단백질을 위한 것이다.

Description

아라비돕시스로부터의 베타 1,2-크실로실트랜스퍼라제-유전자 {BETA 1,2-XYLOSYLTRANSFERASE-GENE FROM ARABIDOPSIS}

본 발명은 β1,2-크실로실트랜스퍼라제를 코딩하는 폴리누클레오티드에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 이러한 폴리누클레오티드를 포함하는 벡터, 각각 폴리누클레오티드 또는 그로부터 유도된 DNA로 트랜스펙션된 재조합 숙주 세포, 식물 및 곤충 뿐만 아니라 이러한 시스템에서 생산된 당단백질에 관한 것이다.

당단백질은 다양하고 복잡한 탄수화물 단위를 나타내고, 탄수화물의 조성 및 배열은 다양한 유기체의 특성이다. 당단백질의 올리고당류 단위는 많은 과업을 가지며, 예를 들어 그들은 대사를 조절하는데 중요하고, 그들은 세포-세포 상호작용을 전달하는데 관여하며, 그들은 순환하는 단백질의 순환 주기를 결정하고, 그들은 항원-항체 반응에서 에피토프를 인식하는데 결정적이다.

당단백질의 당화(glycosylation)는 세포질(endoplasmatic) 세망(ER)에서 시작되며, 여기에서 올리고당류은 N-글리코시드 결합에 의해 아스파라긴 측쇄에 결합되거나, O-글리코시드 결합에 의해 세린 또는 트레오닌 측쇄에 결합된다. N-결합된 올리고당류은 3개의 만노오스 및 2개의 N-아세틸 글루코오스 아민 잔기로 구성된 펜타-당류 단위로부터의 공통 중심을 포함한다. 탄수화물 단위를 추가로 개질하기 위하여, 단백질은 ER로부터 골지(Golgi) 복합체로 수송된다. 당단백질의 N-결합된 올리고당류 단위의 구조는 그들의 형태 및 그들이 프로세싱되는 골지 구획의 글리코실트랜스퍼라제의 조성에 의해 결정된다.

몇몇 식물의 N-글리칸의 중심 펜타-당류 단위는 β1,2-결합된 크실로오스 및 α1,3-결합된 푸코오스에 의해 치환되는 것으로 밝혀졌다[참고문헌: Lerouge et al., 1998, Plant Mol. Biol. 38, 31-48; Rayon et al., 1998, J. Exp. Bot. 49, 1463-1472]. 헵타 당류 "MMXF³"은 식물에서 주된 올리고당류 유형을 구성한다[참고문헌: Kurosaka et al., 1991, J. Biol. Chem., 266, 4168-4172; Wilson and Altmann, 1998, Glycoconj. J. 15, 1055-1070]. 또한, 이러한 구조는 복합 N-글리칸 또는 만노오스-결핍 또는 절단된 N-글리칸으로 각각 명명된다. α-만노실 잔기는 추가로 GlcNAc에 의해 치환될 수 있으며, 거기에 갈락토오스 및 푸코오스가 결합되어 인간 루이스 a-에피토프에 상응하는 구조가 형성된다[참고문헌: Melo et al., 1997, FEBS Lett 415, 186-191; Fitchette-Laine et al., 1997, Plant J. 12, 1411-1417].

β1,2-크실로오스나 α1,3-결합된 푸코오스는 포유류 당단백질내에 존재하지 않는다. α1,3-푸코오스와 함께 β1,2-크실로오스는 식물 N-결합된 올리고당류에 대해 유도된 항체의 에피토프 인식에 중요한 역할을 하고, 그리하여 이러한 올리고당류에 대한 인간 또는 동물체내의 면역 반응을 촉발시키는 것으로 밝혀졌다[참고문헌: Faye et al., 1993, Anal. Biochem. 209, 104-108]. 게다가, β1,2-크실로오스 및/또는 α1,3-푸코오스 함유 N-글리칸은 다양한 식물 및 곤충 알레르겐 사이에서 광범위한 알레르기 교차 반응성에 대한 주요한 원인 중 하나인 것 같고, 또한 "교차-반응성 탄수화물 결정인자"(CCD: Cross-reactive Carbohydrate Determinant)로 명명된다. 면역학적 교차 반응의 빈번한 발생 때문에, CCD는 더욱 더 알레르기 진단을 저지한다.

식물 단백질에 의해 인체내에 촉발되는 면역 반응은 식물에서 생산된 재조합 인간 단백질의 의약적 사용에 주된 문제가 된다. 이러한 문제를 회피하고자, α1,3-푸코실화와 함께 β1,2-크실로실화가 방지되어야 한다. 연구에 따르면, 식물 아라비돕시스 탈리아나(arabidopsis thaliana)의 돌연변이체가 분리되었으며, 이러한 돌연변이체의 경우 복합 글리칸의 생합성에서의 제 1효소인 N-아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라제 Ⅰ의 활성이 결핍되어 있다. 따라서, 이러한 돌연변이체내에서의 복합 당단백질의 생합성이 방해된다. 그럼에도 불구하고, 이러한 돌연변이 식물은 특정 조건하에 정상적으로 성장할 수 있다[참고문헌: A. Schaewen et al, 1993, Plant Physiol. 102; 1109-1118].

다른 당화 단계를 간섭하지 않으면서 β1,2-크실로오스의 올리고당류으로의 전달을 특이적으로 차단하기 위하여, 이러한 특이적 당화를 직접 담당하는 효소, 즉 β1,2-크실로실트랜스퍼라제만이 불활성화 되어야 한다. 식물 및 몇몇 무척추 동물 종, 예를 들어 주혈흡충종[참고문헌: Khoo et al., 1997, Glycobiology 7, 663-677] 및 달팽이[참고문헌: Mulder et al., 1995, Eur. J. Biochem. 232, 272-283]에서만 발생하며, 인간 또는 다른 척추동물에서는 발생하지 않는 이 트랜스퍼라제는, 식물 또는 식물 세포에서 생산된 인간 단백질이 각각 지금까지의 경우와 같이 더이상 이러한 면역-반응-촉발 에피토프를 포함하지 않도록 의도적으로 불활성화되거나 억제되어야 한다.

β1,2-크실로실트랜스퍼라제는 D-크실로오스를 UDP-크실로오스로부터 식물 N-결합된 올리고당류의 베타-결합된 만노오스로 전달한다.

이러한 효소는 1997년에 대두 마이크로솜으로부터 정제되었다[참고문헌: Zeng et al. : J. Biol. Chem., 272, 31340-31347, 1997]. 이 문헌에 따르면, 크실로오스 전달에 대한 최상의 수용체는 GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂-T이지만, 3분지 상에 GLcNAc를 가진 GlcNAc₁Man₃GlcNAc₂도 좋은 수용체이다. 게다가, 많은 다른 N-결합된 올리고당류, 특히 비환원된 말단에 갈락토오스 단위를 가진 것들은 불량한 수용체이다.

레이온 등의 문헌[Plant Physiology, 1999, 119, 725-733]에서, 아라비돕시스 단백질은 고-만노오스-형 N-글리칸에 의해 그리고 크실로오스- 및 푸코오스 함유 올리고당류에 의해 N-당화된다. 테주카 등[Eur. J. Biochem. 203, 401-413 (1992)]은 상이한 효소, 예를 들어 플라타너스(sycamore)의 현탁-배양된 세포의 골지 분획내의 β1,2-크실로실트랜스퍼라제의 활성을 측정하였다. 그들은 크실로오스가 β1,2-크실로실트랜스퍼라제에 의해 내부 만노오스상으로 전달된다고 설명하였다. 게다가, 크실로오스 함유 N-결합 올리고당류이 복족류 및 녹조류로부터의 당단백질에서도 발견됨에도 불구하고, 크실로오스 함유 올리고당류은 식물계에 광범위하게 분포한다.

단백질의 특이적 억제 및 불활성화를 위해, 이것을 전사 및 번역 단계 각각에서 수행하는 것이 가장 좋다. 이를 위해, 활성 단백질을 코딩하는 누클레오티드 서열을 분리하고 서열화할 필요가 있다.

상술한 바와 같이, 대두 β1,2-크실로실트랜스퍼라제는 1997년에 분리되어 정제되었다. 크실로실트랜스퍼라제 cDNA의 일부만이 분리되었으나[참고문헌: WO99/29835 A1; SEQ ID NO 6 및 7], 활성 단백질을 코딩하는 완전한 cDNA는 이제까지 분리되지 못하고 특정될 수 없었다. 이제까지 누클레오티드 서열이 동정되지 못한 이유로는 유기체, 예를 들어 대두 내에서 크실로실트랜스퍼라제를 코딩하는 mRNA의 미소량에 기인한 절차상의 주된 문제를 들 수 있다. 이제까지, 일반적으로 대두로부터 이 유전자의 전체 누클레오티드 서열을 동정하기 위한 여러 단체의 노력이 있었으나, 대개의 경우에 유효한 것으로 알려진 종래 방법, 예를 들어 RACE-증폭(cDNA 단부의 급속 증폭)으로 크실로실트랜스퍼라제 mRNA에 상응하는 전장 cDNA를 생산하는 것은 불가능하였다. 이 방법으로, 미지의 서열이 특이적 증폭 프라이머의 도움으로 증폭되었다. 비성공적인 5'-RACE 실험에 대한 잠재적 이유는 특이적 PCR 프라이머의 부적절한 선택뿐만 아니라 cDNA 합성 동안에 역전사효소-억제 성분의 존재를 들 수 있다.

분리된 대두 β1,2-크실로실트랜스퍼라제의 하나의 문제는 그 용해도 및 활성이 세정제의 존재에 의존한다는 것이다.

β1,2-크실로실트랜스퍼라제 mRNA의 극히 낮은 농도 문제에 더하여, RNA의 5'-단부에서 2차 구조가 이 영역의 증폭을 방해하는 것으로 여겨지는 추가적 문제가 있다. 이러한 경우에, 그 자체로 민감한 방법인 RACE 증폭은 정확하고 완전한 크실로실트랜스퍼라제-cDNA 서열을 생성시키지 못한다.

물론, mRNA 및 cDNA는, 그것이 매우 낮은 농도로 존재한다는 사실 이외에, 다양한 조작 중에 매우 용이하게 재조합 및 돌연변이가 일어날 것으로 여겨진다. 이러저러한 잠재적 이유 때문에, 이 특이적 유전자의 클로닝 및 발현은 이제까지 불가능하였다.

본 발명의 목적은 β1,2-크실로실트랜스퍼라제를 코딩하는 전체 유전자를 클로닝하고 서열화하는 것이며, 이러한 유전자 또는 변경된 DNA 또는 그로부터 유도된 DNA를 포함하는 벡터를 제조하고, 이들 벡터 중 하나를 이용하여 식물뿐만 아니라 이의 세포를 트랜스펙션하고, 정상적으로 발생하는 β1,2-크실로오스를 함유하지 않은 당단백질을 생산할 뿐만 아니라 그것을 위한 상응하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 다량의 정제된 재조합 효소를 생산하여 동종 β1,2-크실로오스를 함유하는 균일한 당컨쥬게이트 또는 N-글리칸을 시험관내에서 합성하는 것을 가능하게 하는 것이다. 이것은 식물 당단백질의 면역원성 및 알레르기원성에서 β1,2-크실로오스의 역할을 추가로 해명하는데 도움이 될 것이다.

본 발명에 따른 목적은 염기쌍 227 내지 염기쌍 1831에 오픈 리딩 프레임을 가진 SEQ ID NO: 8에 따른 서열, 상기 서열에 50% 이상의 상동성을 가지거나, 엄격한 조건하에 상기 지시된 서열과 하이브리드화되거나, 유전 코드 때문에 상기 DNA 서열로 변성되거나, β1,2-크실로실트랜스퍼라제 활성을 갖거나 그것에 상보적인 식물 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 DNA 분자에 의해 달성된다. 전에 공지된 바 없었던 이러한 완전한 서열은 β1,2-크실로실트랜스퍼라제 활성과 관련된 실험, 분석 및 생산 공정에 특히 유용하다. 이 서열은 특히 β1,2-크실로실트랜스퍼라제의 불활성화 또는 억제뿐만 아니라 재조합 효소의 과발현 및 생산에 사용될 수 있다.

앞서 언급된 대두 크실로실트랜스퍼라제-유래된 펩티드를 사용하여 GenBank+EMBL+DDBJ+PDB 데이타베이스를 찾아보면, 상당한 상동성을 가진 여러 폴리펩티드 서열(아라비돕시스 및 드로소필라)이 검색된다. 그러나, 이러한 서열은 그외에는 서로 관련이 없을 뿐만 아니라 최종적으로 동정된 β1,2-크실로실트랜스퍼라제 서열과도 관련이 없다. β1,2-크실로실트랜스퍼라제의 후보 서열의 성공적인 검색은 3개의 대두 β1,2-크실로실트랜스퍼라제-유래된 펩티드 서열을 단일 서열로 적절히 조합해서만 가능하다. 현 상태의 기술에 따라 우리가 사용한 모든 검색 전략(즉, 펩티드 서열을 개별적으로 또는 서로 조합하여 사용하는 것)은 β1,2-크실로실트랜스퍼라제에 대한 정확한 서열의 성공적 검색에 이를 수 없었다.

이 유전자의 분리 및 정제는 DDBJ+GenBank+EMBL+PDB-데이타베이스내에서 대두 크실로실트랜스퍼라제의 3개의 공지된 펩티드(조합된 펩티드로 사용된)에 상응하는 서열을 검색하여 달성되었다 [참고문헌: 특허 WO99/29835 A1, SEQ ID NO: 3 및 5]. 이전까지 어떠한 단백질로도 할당된 적이 없던 아라비돕시스 탈리아나의 하나의 DNA 서열이 3개의 펩티드 중 2개에 상동성을 나타내는 것이 발견되었다. 진-파인더(gene-finder) 프로그램의 도움으로, 예상된 단백질 서열은 RT-PCR에 대해 어떤 서열 특이적 프라이머가 설계되는 지에 따라 발견되었다. 아라비돕시스 탈리아나-크실로실트랜스퍼라제 유전자의 mRNA에 상응하는 제 1가닥의 cDNA를 생산할 수 있고, 그 후 제 1가닥의 cDNA가 특이적으로 설계된 프라이머를 사용하여 PCR을 거친다. 아라비돕시스 탈리아나 크실로실트랜스퍼라제-cDNA의 성공적 생산이 가능한 이유는, 한편으로는 아라비돕시스 탈리아나의 크실로실트랜스퍼라제-mRNA가 다른 식물 종에 비해 덜 문제를 야기하기 때문이고, 다른 한편으로는 PCR이 최적 설계된 유전자-특이적 프라이머로 수행되기 때문이다.

SEQ ID NO: 8의 오픈 리딩 프레임은 534개 아미노산을 갖고 60.2 kDa의 이론적 분자량을 갖는 단백질을 코딩하고, 막횡단(transmembrane) 부분은 Ile11 및 Phe29 사이의 영역에 존재할 것이다. SEQ ID NO: 9에 따른 서열의 엔코딩된 단백질의 계산된 pI값은 7.52이다.

식물 β1,2-크실로실트랜스퍼라제의 활성은, 크실로실트랜스퍼라제가 UDP-크실로오스 및 표지된 수용체(예를 들어, 당펩티드 또는 표지된 올리고당류)를 포함하는 샘플에 첨가되는 방법에 의해 검출되고 측정된다. 반응 시간 후에, 결합된 크실로오스의 함량이 측정되었다. 이 경우에 크실로실트랜스퍼라제의 활성은, 활성 측정치가 음성 대조군의 활성 측정치보다 10 내지 20% 이상, 특히 30 내지 50% 이상 높은 경우에 양성으로 나타났다. 추가로 올리고당류의 구조가 HPLC에 의해 확인될 수 있다. 그러한 절차는 종래 기술이다[참고문헌: Staudacher et al., 1998, Anal. Biochem. 246, 96-101; Staudacher et al., 1991, Eur. J. Biochem. 199, 745-751]. 크실로오스가 수용체 기질에 결합되는 지의 여부는 질량 분광법를 사용하여 생성물의 질량을 측정하여 추가로 결정될 수 있다.

2개의 DNA 분자를 짝짓는 것은 샘플의 온도 및 이온 강도를 선택하여 변경될 수 있다. 엄격한 조건이라 함은, 본 발명에 따르면 정확하고 엄격한 결합을 허용하는 조건으로 이해된다. 예를 들어, DNA 분자는 50℃에서 7% 나트륨 도데실 술페이트(SDS), 0.5M NaPO4, pH 7.0, 1mM EDTA 내에서 하이브리드화되고, 42℃에서 1% SDS로 세척된다.

서열이 SEQ ID NO:8과 50% 이상의 상동성을 갖는지의 여부는 예를 들어 EMBL 또는 SWISSPROT 데이타뱅크의 프로그램 FastDB에 의해 결정될 수 있다.

본 발명의 DNA 분자에 의해 엔코딩된 재조합 β1,2-크실로실트랜스퍼라제와 WO99/29835 A1에 기술된 대두로부터의 각각의 효소 사이에는 많은 관련 차이점이 존재한다.

1. 재조합 효소는 세정제(예를 들어, Triton X-100) 없이 용해될 수 있으나, 대두로부터의 효소의 용해도는 세정제의 존재에 의존한다.

2. 재조합 효소는 세정제(예를 들어, Triton X-100)가 없는 경우에 완전히 활성이다.

3. 재조합 효소는 N-당화되지만, 대두로부터의 효소는 당화되지 않는다고 기술되어 있다.

4. 아라비돕시스 탈리아나로부터의 효소는 32 N-말단 아미노산이 결핍된 절단형으로서도 완전한 효소 활성을 나타낸다.

5. 대두로부터의 효소와 비교하여, 아라비돕시스 탈리아나로부터의 효소는 넓은 pH-최적치를 가지며, pH 6-8의 범위에서 현저한 활성을 나타낸다.

6. 대두 효소를 코딩하는 cDNA 서열은 아라비돕시스 탈리아나 단백질의 아미노산 (aa) 199-469에만 상응한다(참조 도 11).

7. 아라비돕시스 탈리아나 크실로실트랜스퍼라제를 코딩하는 cDNA 서열은 대두 효소의 부분 서열과 비교하여 2개의 삽입부(예정된 단백질 서열의 aa 375-382 및 aa 425-429에 상응함)를 함유한다(참조 도 11).

8. 대두 효소로부터 분리된 5개의 펩티드(참조: WO99/29835 A1의 도 4) 중 어느 것도 아라비돕시스 탈리아나로부터의 효소의 상응 영역과 동일하지 않다:

펩티드 SEQ ID NO. 1: 아라비돕시스 탈리아나 효소의 aa 411-422에 상동임

펩티드 SEQ ID NO. 2: 아라비돕시스 탈리아나 효소의 aa 192-205에 상동임

펩티드 SEQ ID NO. 3: 아라비돕시스 탈리아나 효소의 aa 451-477에 상동임

펩티드 SEQ ID NO. 4: 아라비돕시스 탈리아나 효소의 aa 191-205에 상동임

펩티드 SEQ ID NO. 5: 아라비돕시스 탈리아나 효소의 aa 503-512에 상동임(주의: WO99/29835 A1에 나열된 cDNA 서열은 펩티드 5에 대한 코딩 서열을 함유하지 않는다).

따라서, 본 발명에 따른 DNA 분자는, 그것이 공지된 정제된 효소 보다 매우 유리한 특성 및 효과를 나타내는 유효한 활성 재조합 효소를 엔코딩하므로 특히 유리하다.

바람직하게는, 본 발명의 DNA 분자의 서열은 β1,2-크실로실트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질을 엔코딩한다. 이러한 특이적 단백질은 β1,2-크실로실트랜스퍼라제와 관련된 분석, 실험 및 생산 방법에 특히 유용하다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 DNA 분자는 SEQ ID NO: 8에 따른 서열에 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는다. 이 서열은 특히 활성인 β1,2-크실로실트랜스퍼라제를 코딩한다. 상동성은 삽입 및 결실을 인식하며 상동성 계산에서 이들을 고려하지 않는 프로그램으로 결정된다.

추가의 유리한 구체예에 따르면, DNA 분자는 1750 내지 1850, 특히 1831개의 염기쌍을 포함한다.

그렇게 하는 경우, 상기 지시된 DNA 분자 중 하나가 검출가능한 마커 물질에 공유결합 하는 것이 특히 유리하다. 마커(표지) 물질로서, 예를 들어 형광, 발광, 방사능 마커, 비오틴 등과 같은 임의의 통상적인 마커가 사용될 수 있다. 이러한 방식으로, 고체 조직 샘플(예를 들어, 식물로부터), 또는 액체 샘플내에서 하이브리드화 방법에 의해 상응하는 DNA 분자의 검출, 선별 및 정량화에 적당한 시약이 제공된다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 DNA 분자는 결실, 삽입 및/또는 치환 돌연변이를 포함하는 서열을 포함한다. 돌연변이 누클레오티드의 수가 가변적이고, 하나 내지 여러 개가 결실, 삽입 또는 치환된 누클레오티드까지 다양하다. 또한, 리딩 프레임이 돌연변이에 의해 이동될 수 있다. 그러한 "녹-아웃(knock-out) 유전자"에서, 오직 β1,2-크실로실트랜스퍼라제의 발현이 방해되고, 활성 작용성 효소의 형성이 저지되는 것이 중요하다. 그런 경우에, 효소적으로 활성인 단백질의 발현이 저지되는 한 돌연변이의 부위는 가변적이다. 바람직하게는, 돌연변이는 C-말단 영역에 위치한 효소의 촉매적 영역내에 존재한다. DNA 서열에 돌연변이를 삽입하는 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 따라서 다양한 돌연변이유발(mutagenesis) 가능성을 본원에서 상세하게 설명할 필요는 없다. 우연한 돌연변이유발 뿐만 아니라 특히, 지향성 돌연변이유발, 예를 들어 특정부위 돌연변이유발, 올리고누클레오티드-조절된 돌연변이유발 또는 제한 효소에 의한 돌연변이유발이 본원에 이용될 수 있다.

추가로, 본 발명은 2개의 서열 부분을 포함하는 리보자임을 코딩하는 DNA 분자를 제공하며, 각 서열은 적어도 10 내지 15개의 염기쌍의 길이를 가지며, 이들 부분은 전술한 바와 같이 본 발명의 DNA 분자의 서열 부분에 상보적이어서 리보자임은 복합체를 형성하고 천연 β1,2-크실로실트랜스퍼라제 DNA 분자에 의해 전사된 mRNA를 절단한다. 참고문헌[John M. Burke "Clearing the way for ribozymes", Nature Biotechnology 15:414-415; 1997]은 리보자임의 일반적 형태의 기능에 관한 것이다. 리보자임은 mRNA와의 상보적인 염기쌍형성에 의해 β1,2-크실로실트랜스퍼라제의 mRNA를 인식한다. 후속하여, 리보자임은 효소가 번역되기 전에 서열-특이적 방식으로 RNA를 절단하고 파괴한다. 절단된 기질로부터의 해리 후에, 리보자임은 반복적으로 RNA 분자와 하이브리드화되고, 특이적 엔도누클레아제로서 기능한다. 일반적으로, 단백질을 코딩하는 전체 DNA 서열이 알려지지 않았더라도, 리보자임은 특정 mRNA의 불활성화를 위해 특이적으로 생산될 수 있다. 리보자임은 mRNA를 따라 천천히 이동하는 경우에 특히 효율적이다. 그러한 경우에, 리보자임이 mRNA 상에서 리보자임-부재 부위를 찾는 것이 보다 용이하다. 이러한 이유로, 느린 리보솜 돌연변이가 리보자임용 시스템으로서 또한 적당하다[참고문헌: J. Burke, 1997, Nature Biotechnology; 15, 414-415].

또한, 다양한 형태의 리보자임, 즉 미니자임을 사용하는 것이 하나의 방법이다. 미니자임은 보다 큰 mRNA 분자를 절단하는데 특히 효율적이다. 미니자임은 스템/루프 Ⅱ 대신에 짧은 올리고누클레오티드 링커를 가진 헤머 헤드(hammer head) 리보자임이다. 이량체-미니자임이 특히 효율적이다[참고문헌: Kuwabara et al., 1998, Nature Biotechnology, 16;961-965].

추가로, 본 발명은 상기 DNA 분자 중 하나를 포함하는 생물학적 작용성 벡터에 관한 것이다. 숙주 세포로의 트랜스펙션을 위해, 증폭 가능한 독립 벡터가 필요하고, 여기에서 숙주 세포, 트랜스펙션 메카니즘, DNA 분자의 과업 및 크기에 따라, 적당한 벡터가 사용될 수 있다. 많은 수의 상이한 벡터가 공지되어 있으므로, 그것을 열거하는 것은 본원의 한계를 벗어난 것이고, 특히 벡터가 당업자에게 매우 잘 공지되어 있으므로 본원에서는 생략한다(당업자에게 공지된 본원에 사용된 벡터 뿐만 아니라 모든 기술 및 용어에 대하여는 Maniatis를 참고하라). 이상적으로, 벡터는 작은 분자량을 갖고, 세포내에서 용이하게 인식가능한 표현형이 되도록 선택가능한 유전자를 포함하여 벡터-함유 및 벡터-비함유 숙주 세포의 용이한 선별을 가능하게 한다. 높은 수율의 DNA 및 상응하는 유전자 생성물을 획득하기 위하여, 벡터는 강력한 프로모터, 뿐만 아니라 인핸서, 유전자 증폭 신호 및 조절자 서열을 포함해야 한다. 게다가, 벡터의 자율적 복제를 위해, 복제원(replicaiton origin)이 중요하다. 폴리아데닐화 부위가 mRNA의 정확한 프로세싱 및 RNA 전사체를 위한 스플라이스 신호를 담당한다. 벡터로서 파지, 바이러스 또는 바이러스 입자가 사용되는 경우, 패키징 신호는 벡터 DNA의 패키징을 제어할 것이다. 예를 들어, 식물내의 전사를 위해, Ti 플라스미드가 적당하고, 곤충세포내의 전사를 위해, 배큘로바이러스가 적당하고, 곤충내에서는, P 엘리먼트와 같은 트랜스포존이 적당하다.

상기 본 발명의 벡터가 식물내로 또는 식물 세포내로 삽입되는 경우, 내인성 β1,2-크실로실트랜스퍼라제 유전자의 유전자 발현에 대한 후-전사적 억제는 그것 또는 그것의 일부에 대해 상동인 트랜스유전자(transgene)가 센스 배향으로 전사되어 획득된다. 추가로, 이러한 센스 기술에 대하여 참고문헌[Baucombe, 1996, Plant. Mol. Biol., 9:373-382, 및 Brigneti et al., 1998, EMBO J. 17:6739-6746]을 참고하라. "유전자 사일런싱(silencing)"의 이러한 전략은 β1,2-크실로실트랜스퍼라제 유전자의 발현을 억제하는 유효한 방법이다[참고문헌: Waterhouse et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:13959-13964].

게다가, 본 발명은 프로모터에 대하여 역으로 배향된 상기 구체예 중 하나에 따른 DNA 분자를 포함하는 생물학적 작용성 벡터에 관한 것이다. 이 벡터가 숙주 세포에 트랜스펙션되는 경우, β1,2-크실로실트랜스퍼라제의 mRNA에 상보적인 "안티센스 mRNA"가 판독될 것이고, β1,2-크실로실트랜스퍼라제의 mRNA와 복합체를 형성할 것이다. 이러한 결합은 정확한 프로세싱, 전달, 안정성을 방해하거나, 리보솜 어닐링의 억제에 의해 번역을 방해하여 β1,2-크실로실트랜스퍼라제의 정상적인 유전자 발현을 방해할 것이다.

DNA 분자의 전체 서열이 벡터내로 삽입될 수 있더라도, 그것의 부분 서열이 그것의 작은 크기 때문에 특정 목적을 위해 유리할 것이다. 안티센스의 경우에, 예를 들어 DNA 분자는 트랜스퍼라제 mRNA에 결합할 충분히 큰 안티센스 mRNA를 형성하기에 충분히 큰 것이 중요하다. 적당한 안티센스 RNA 분자는, 많은 공지된 자연 발생 안티센스 RNA 분자가 약 100개의 누클레오티드를 포함하므로 예를 들어 50 내지 200개의 누클레오티드를 포함한다.

활성 β1,2-크실로실트랜스퍼라제의 발현을 특히 효과적으로 억제하기 위하여, 센스 기술 및 안티센스 기술의 조합이 바람직하다[참고문헌: Waterhouse et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 95:13959-13964].

유리하게는, 신속하게 하이브리드화하는 RNA 분자가 이용된다. 50개 누클레오티드 보다 큰 크기를 갖는 안티센스 RNA 분자의 유효성은 시험관내에서의 어닐링 속도론(kinetics)에 의존할 것이다. 따라서, 예를 들어 신속히 어닐링하는 안티센스 RNA 분자가 천천히 하이브리드화하는 RNA 분자 보다 단백질 발현을 보다 크게 억제한다[참고문헌: Wagner et al., 1994, Annu. Rev. Microbiol., 48:713-742; Rittner et al., 1993, Nucl. Acids Res., 21:1381-1387]. 그렇게 신속히 하이브리드화하는 안티센스 RNA 분자는 특히 많은 수의 외부 염기(유리 말단 및 연결 서열), 많은 수의 구조적 서브도메인(subdomain)(성분) 뿐만 아니라 낮은 농도의 루프를 포함한다[참고문헌: Patzel et al. 1998; Nature Biotechnology, 16; 64-68]. 안티센스 RNA 분자의 가설적 2차 구조는 예를 들어 컴퓨터 프로그램에 의해 결정될 수 있고, 그에 따라 적당한 안티센스 RNA DNA 서열이 선택된다.

DNA 분자의 상이한 서열 영역이 벡터내에 삽입될 수 있다. 예를 들어, 리보솜 어닐링을 담당하는 부분만을 벡터내에 삽입하는 하나의 가능성이 존재한다. mRNA의 이 영역의 차단은 전체 번역을 정지시키기에 충분하다. 안티센스 분자의 특히 높은 효율은 유전자의 5'- 및 3'-비번역된 영역을 초래한다.

또한, 본 발명은 최종 언급된 2개의 DNA 분자(돌연변이 또는 리보자임-DNA 분자) 중 하나를 포함하는 생물학적 작용성 벡터에 관한 것이다. 벡터에 대해 상기 언급된 것은 여기에도 적용된다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 DNA 분자를 포함하는 cDNA를 제조하는 방법이 제공되고, 여기에서 RNA가 식물 세포, 특히 잎 세포로부터 분리되고, 그에 의해 역전사효소 및 프라이머가 첨가된 후에 역전사가 수행된다. 이러한 방법의 개별 단계는 자체로 공지된 절차에 따라 수행된다. 역전사를 위해, 한편으로는 올리고(dT) 프라이머의 도움으로 전체 mRNA의 cDNA를 생산하는 것이 가능하고, 단지 그 다음에 β1,2-크실로실트랜스퍼라제 유전자를 포함하는 DNA 분자를 제조하기 위하여 선택된 프라이머에 의해 PCR을 수행하는 것이 가능하다. 다른 한편으로는, 선택된 프라이머는 짧은 특이적 cDNA를 획득하기 위하여 역전사에 직접 사용될 수 있다. 적당한 프라이머는 예를 들어 트랜스퍼라제의 cDNA 서열의 패턴에 따라 합성에 의해 제조될 수 있다.

게다가, 본 발명은 β1,2-크실로실트랜스퍼라제를 클로닝하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 DNA 분자는 벡터로 클로닝되고 후속하여 숙주 세포 또는 숙주로 각각 트랜스펙션되며, 여기에서 트랜스펙션된 숙주 세포의 선별 및 증폭에 의해, 활성 β1,2-크실로실트랜스퍼라제를 발현시키는 세포주가 획득된다. DNA 분자는 예를 들어 제한 엔도누클레아제의 도움으로 벡터내에 삽입된다. 벡터에 대하여, 상기 언급된 것이 적용된다. 이 방법에서 중요한 것은 효율적인 숙주-벡터 시스템이 선택되는 것이다. 활성 효소를 얻기 위하여, 진핵 숙주 세포가 특히 적당하다. 하나의 가능한 방법은 벡터를 곤충 세포에 트랜스펙션시키는 것이다. 그런 경우에, 특히 곤충 바이러스, 예를 들어 배큘로바이러스가 벡터로서 사용되어야 한다.

물론, 식물 또는 식물 세포, 인간 또는 기타 척추동물 세포가 또한 트랜스펙션될 수 있으며, 이 경우 그것에 외래인 효소를 발현시킬 것이다.

바람직하게는, 억제되거나 완전히 정지된 β1,2-크실로실트랜스퍼라제 생산을 갖는 재조합 숙주 세포, 특히 식물 세포 또는 식물체를 각각 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 본 발명에 따른 하나 이상의 벡터, 즉 본 발명의 DNA 분자, 돌연변이 DNA 분자 또는 리보자임을 코딩하는 DNA 분자 또는 프로모터에 대해 역배향의 DNA 분자를 포함하는 벡터가 숙주 세포 또는 식물에 각각 삽입된다. 트랜스펙션에 대하여 상기 언급한 것이 이 경우에도 적용될 수 있다.

숙주 세포로서, 예를 들어 식물 세포가 사용될 수 있고, 여기에서 아그로박테리움 시스템을 가진 Ti 플라스미드가 적합하다. 아그로박테리움 시스템의 경우, 식물을 직접 트랜스펙션시키는 것이 가능하다: 아그로박테리움은 식물내에 뿌리 줄기 혹(gall)을 유발한다. 아그로박테리움이 상처난 식물에 감염되면, 박테리아 자체가 식물내로 진입하지 않지만, 그것은 염색체외의 환형 종양-유도 Ti-플라스미드로부터의 재조합 DNA 부분, 소위 T-DNA를 식물 세포내로 삽입한다. T-DNA, 그리하여 내부에 삽입된 DNA 분자는 세포의 염색체 DNA에 안정한 방식으로 정착되어 T-DNA의 유전자가 식물내에 발현될 것이다.

상이한 숙주 시스템에 대한 많은 공지된 효율적인 트랜스펙션 메카니즘이 존재한다. 예를 들어, 일렉트로포레이션, 인산칼슘 방법, 현미주사, 리포좀 방법이 있다.

그 다음, 트랜스펙션된 세포는 항생물질 내성에 기초하여 선별되며, 그 때문에 벡터는 유전자 또는 기타 마커 유전자를 포함한다. 그 후, 트랜스펙션된 세포주는 예를 들어 페트리 접시내에서 소량으로 또는 예를 들어 발효기내에서 대량으로 증폭된다. 게다가, 식물은 특정 특징을 갖는데, 즉 그들은 하나의 (트랜스펙션된) 세포 또는 원형질체 각각으로부터 성장가능한 완전한 식물로 재발육될 수 있다.

사용된 벡터에 따라, 효소 발현이 억제되거나 완전히 차단되도록 숙주내에서 프로세싱이 일어날 것이다.

결실, 삽입 또는 치환 돌연변이를 가진 DNA 분자를 포함하는 벡터가 트랜스펙션되는 경우에, 상동 재조합이 발생할 것이다: 돌연변이 DNA 분자는 그 돌연변이에도 불구하고 숙주 세포의 게놈내에서 동일한 서열을 인식할 것이고, "녹-아웃 유전자"가 형성되도록 그 위치에 정확히 삽입될 것이다. 이러한 방식으로, β1,2-크실로실트랜스퍼라제의 무결점 발현을 억제할 수 있는 돌연변이가 β1,2-크실로실트랜스퍼라제에 대한 유전자내로 도입된다. 전술한 바와 같이, 이 기술로 돌연변이가 활성 단백질의 발현을 차단하기에 충분하다는 것이 중요하다. 선별 및 증폭 후에, 유전자는 상동 재조합의 성공 또는 돌연변이의 정도를 각각 결정하도록 추가적 검증으로서 서열화될 수 있다.

리보자임을 코딩하는 DNA 분자를 포함하는 벡터가 트랜스펙션된 경우, 활성리보자임은 숙주 세포내에서 발현될 것이다. 리보자임은 적어도 특정 부위에서 β1,2-크실로실트랜스퍼라제의 상보적 mRNA 서열과 복합체를 형성하고, 이 부위를 절단하며, 이러한 방식으로 효소의 번역을 억제할 수 있다. 이 숙주 세포 뿐만 아니라 그로부터 각각 유도된 세포주 또는 선택적으로 식물내에서 β1,2-크실로실트랜스퍼라제는 발현되지 않을 것이다.

벡터가 본 발명의 DNA 분자를 프로모터에 대해 센스 방향 또는 역방향으로 포함하는 경우에, 센스 또는 안티센스-mRNA가 트랜스펙션된 세포(또는 식물 각각)내에서 발현될 것이다. 안티센스 mRNA는 β1,2-크실로실트랜스퍼라제의 mRNA 서열의 적어도 일부와 상보적이고, 마찬가지로 효소의 번역을 억제할 수 있다. 안티센스 기술로 유전자의 발현을 억제하는 방법의 예로서, 참고문헌[Smith et al., 1990, Mol. Gen. Genet. 224:477-481]을 참고할 수 있고, 여기에서 토마토의 숙성 과정과 관련된 유전자의 발현이 억제된다. 이중가닥 RNA(dsRNA)는 폭 넓은 유기체, 예를 들어 선충, 식물, 트리파노소마, 과실파리 및 플라나리아내에서 서열-특이적 유전자 사일런싱을 촉발시키는 것으로 입증되었다; 아직까지 특성화되지 않은 RNA 촉발이 여러 상이한 식물 시스템에서 유전자 기능에 선택적인 간섭을 초래하는 DNA 메틸화를 유도하는 것으로 입증되었다[참고문헌: Fire A., 1999, Trends Genet 15 (9): 356-363].

모든 시스템에서, β1,2-크실로실트랜스퍼라제의 발현은 적어도 억제되거나 바람직하게는 완전히 차단된다. 유전자 발현의 방해 정도는 복합체형성 상동 재조합 정도, 가능한 후속 우연성 돌연변이 및 게놈 영역내의 기타 가공에 의존할 것이다. 트랜스펙션된 세포는 β1,2-크실로실트랜스퍼라제 활성에 대해 검사되고 선별된다.

더욱이, 상기 벡터의 도입에 더하여 포유류 단백질, 예를 들어 β1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 숙주에 도입시켜 β1,2-크실로실트랜스퍼라제의 발현의 상기 억제를 추가로 증가시키는 것이 가능하다. 크실로실화는 기타 포유류 효소의 작용으로 감소될 수 있고, 본 발명의 벡터에 의해 그리고 포유류 효소 벡터에 의해 활성 β1,2-크실로실트랜스퍼라제의 발현을 억제하는 것을 병용하는 것이 특히 효율적이다.

임의의 형태의 식물, 예를 들어 녹두(mung bean), 담배 식물, 토마토 및/또는 감자 식물이 트랜스펙션을 위해 사용될 수 있다.

재조합 숙주 세포, 특히 식물 세포 또는 식물을 각각 생산하는 또 다른 유리한 방법은, 돌연변이를 포함하는 DNA 분자를 숙주 세포 또는 식물 각각의 게놈내로 비돌연변이 상동 서열의 위치에 도입시키는 것으로 구성된다[참고문헌: Schaefer et al., 1997, Plant J.; 11(6):1195-1206]. 따라서, 이러한 방법은 벡터가 아니라 순수한 DNA 분자를 사용한다. DNA 분자는 단지 3개의 예를 언급하자면 유전자 폭격(bombardment), 현미주사 또는 일렉트로포레이션에 의해 숙주내로 삽입된다. 이미 설명된 바와 같이, DNA 분자는 숙주의 게놈내의 상동 서열에 결합하여 상동 재조합 및 그에 따른 결실, 삽입 또는 치환 돌연변이 각각의 수용이 게놈내에 일어난다: β1,2-크실로실트랜스퍼라제의 발현은 각각 억제되거나 완전히 차단될 수 있다.

바람직하게는, 전술된 방법 중 하나에 의해 제조된 재조합 식물 또는 식물 세포 각각이 제공되고, 이들의 β1,2-크실로실트랜스퍼라제 생산은 억제되거나 완전히 차단된다. 바람직하게는, 그들의 β1,2-크실로실트랜스퍼라제 활성은 천연 식물 또는 식물 세포 각각에서 발생하는 β1,2-크실로실트랜스퍼라제 활성의 50% 미만, 특히 20% 미만, 특히 바람직하게는 0%이다. 이러한 식물 또는 식물 세포 각각의 이점은 그들에 의해 생산된 당단백질이 임의의 β1,2-결합된 크실로오스도 포함하지 않거나 거의 포함하지 않는다는 것이다. 이들 식물의 생성물이 인간 또는 척추동물체에 의해 섭취되는 경우, β1,2-크실로오스 에피토프에 기인하는 어떠한 면역 반응도 없을 것이다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 DNA 분자의 서열에 상보적인 염기서열을 포함하는 PNA 분자에 관한 것이다. PNA(펩티드 헥산: peptide nucleic acid)은 DNA 유사 서열이고, 핵염기(nucleobase)는 의사(pseudo)-펩티드 주쇄에 결합한다. 일반적으로 PNA는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍형성과 나선형성에 의해 상보적 DNA-, RNA- 또는 PNA-올리고머와 하이브리드화된다. 펩티드 주쇄는 효소적 분해에 대해 보다 큰 내성을 보장한다. 따라서, PNA 분자는 개선된 안티센스 작용제이다.

누클레아제나 프로테아제를 PNA 분자를 공격할 수 없다. PNA 분자의 안정성은, 상보적 서열에 결합하는 경우, DNA 및 RNA 중합효소, 역전사효소, 텔로머라제 및 리보솜의 충분한 입체 차단을 포함한다. 참고문헌[Pooga et al., "Cell penetrating PNA constructs regulate galatin receptor levels and modify pain transmission in vivo"; Nature Biotechnology 16:857-861; 1998]은 일반적으로 PNA 분자에 관한 것으로서 특히 인간 갈라닌 수용체 1형 mRNA에 상보적인 PNA 분자에 관한 것이다.

PNA 분자가 상기 서열을 포함하는 경우, 그것은 β1,2-크실로실트랜스퍼라제를 코딩하는 DNA 또는 DNA의 부위에 결합할 것이고, 이러한 방식으로 이 효소의 전사를 억제할 수 있다. 그것이 전사되거나 번역되지 않기 때문에, PNA 분자는 예를 들어 t-Boc 기술에 의해 합성적으로 제조될 것이다.

유리하게는, 본 발명의 DNA 분자의 서열에 상응하는 염기 서열을 포함하는 PNA 분자가 제공된다. 이 PNA 분자는 β1,2-크실로실트랜스퍼라제의 mRNA 또는 mRNA의 부위와 복합체를 형성하여 효소의 번역을 억제할 것이다. 안티센스 RNA에 대하여 개시된 유사한 논의가 이 경우에 적용된다. 따라서, 예를 들어 특히 유효한 복합체 형성 영역은 mRNA의 번역 개시 영역 또는 5'-비번역 영역이다.

추가로, 본 발명은 각각 전사 또는 번역 수준에서 β1,2-크실로실트랜스퍼라제의 차단된 발현을 포함하는 식물 또는 식물 세포, 특히 식물 세포를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 PNA 분자가 세포내에 삽입됨을 특징으로 한다. PNA 분자(들)을 세포내로 삽입하기 위하여, 다시 종래 기술 예를 들어 일렉트로포레이션 또는 현미주사가 사용된다. PNA 올리고머가 세포 투과 펩티드, 예를 들어 수송단백질(transportan), 또는 pAntp에 결합되는 경우, 삽입이 특히 효율적이다[참고문헌: Pooga et al., 1998, Nature Biotechnology, 16;857-861].

본 발명은 재조합 당단백질을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 β1,2-크실로실트랜스퍼라제 생산이 억제되거나 완전히 차단된 본 발명의 재조합 식물 또는 식물 세포, 또는 본 발명의 방법에 따라 PNA 분자가 삽입된 식물 또는 세포가 당단백질을 발현시키는 유전자로 트랜스펙션되어 재조합 당단백질이 발현됨을 특징으로 한다. 그런 경우에, 이미 설명한 바와 같이, 원하는 단백질에 대한 유전자를 포함한 벡터가 이미 설명된 바와 같은 숙주 또는 숙주 세포내로 트랜스펙션된다. 트랜스펙션된 식물 세포는 원하는 단백질을 발현할 것이고, 그들은 거의 또는 전혀 β1,2-결합된 크실로오스를 갖지 않는다. 따라서, 그들은 인간 또는 척추동물체 내에서 이미 언급한 면역 반응을 촉발하지 않는다. 임의의 단백질이 이러한 시스템으로 생산될 수 있다.

유리하게는, 재조합 인간 당단백질을 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 β1,2-크실로실트랜스퍼라제 생산이 억제되거나 완전히 차단된 재조합 식물 또는 식물 세포, 또는 본 발명의 방법에 따라 PNA 분자가 삽입된 식물 또는 세포가 당단백질을 발현시키는 유전자로 트랜스펙션되어 재조합 당단백질이 발현됨을 특징으로 한다. 이러한 방법으로, 인체에 의해 섭취되는 경우 β1,2-결합된 크실로오스 잔기에 대해 유도된 임의의 면역 반응을 촉발하지 않는 인간 단백질을 식물(식물 세포)내에서 생산하는 것이 가능해 진다. 거기에서, 식품으로서 기능하는 재조합 당단백질을 생산하기 위하여 식물 유형, 예를 들어 바나나, 감자 및/또는 토마토를 이용하는 것이 가능하다. 이 식물의 조직은 재조합 당단백질을 포함하므로, 예를 들어 조직으로부터 재조합 당단백질을 추출하여 투여하거나, 직접 식물 조직을 먹는 방법으로, 재조합 당단백질이 인체내로 섭취된다.

바람직하게는, 의약 용도의 재조합 인간 당단백질을 제조하는 방법이 제공되며, 여기에서, β1,2-크실로실트랜스퍼라제 생산이 억제되거나 완전히 차단된 재조합 식물 또는 식물 세포, 또는 본 발명의 방법에 따라 PNA 분자가 삽입된 식물 또는 세포가 당단백질을 발현시키는 유전자로 트랜스펙션되어 재조합 당단백질이 발현됨을 특징으로 한다. 그런 경우에, 의료용 관심이 있는 임의의 단백질이 사용될 수 있다.

더욱이, 본 발명은 상기 방법에 따른 재조합 당단백질에 관한 것으로서, 여기에서 그것은 식물 시스템내에서 제조되고, 그들의 펩티드 서열은 50% 미만, 특히 20% 미만, 특히 바람직하게는 0%의 크실로실트랜스퍼라제 감소되지 않은 식물 시스템내에서 발현된 단백질에서 발생하는 β1,2-결합된 크실로오스 잔기를 포함한다. 자연적으로, β1,2-결합된 크실로오스 잔기를 포함하지 않는 당단백질이 바람직하다. β1,2-결합된 크실로오스의 양은 β1,2-크실로실트랜스퍼라제의 상기 억제 정도에 의존할 것이다.

바람직하게는, 본 발명은 상기 방법에 따라 식물 시스템내에서 생산된 재조합 인간 당단백질에 관한 것으로서, 그 펩티드 서열은 50% 미만, 특히 20% 미만, 특히 바람직하게는 0%의 크실로실트랜스퍼라제 감소되지 않은 식물 시스템내에서 발현된 단백질에서 발생하는 β1,2-결합된 크실로오스 잔기를 포함한다.

특히 바람직한 구체예는 상기 방법에 따라 식물 시스템에서 제조된 의약 용도의 재조합 인간 당단백질에 관한 것으로서, 그 펩티드 서열은 50% 미만, 특히 20% 미만, 특히 바람직하게는 0%의 크실로실트랜스퍼라제 감소되지 않은 식물 시스템내에서 발현된 단백질에서 발생하는 β1,2-결합된 크실로오스 잔기를 포함한다.

본 발명에 따른 당단백질은 식물에 특이적인 기타 결합된 올리고당류 단위를 포함할 수 있으며, 그리하여 - 인간 당단백질의 경우 - 그들은 이들 천연 당단백질과 상이하다. 그럼에도 불구하고, 본원의 도입부에 설명한 바와 같이 β1,2-결합된 크실로오스 잔기는 α1,3-푸코오스 잔기와 함께 식물 당단백질에 대한 면역 반응 또는 교차 면역 반응 각각의 주된 원인이므로, 본 발명에 따른 당단백질에 의해, 인체내에서 약간의 면역 반응 또는 어떠한 면역 반응도 촉발되지 않는다.

추가로, 본 발명은 본 발명에 따른 당단백질을 포함하는 약제 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 당단백질에 부가하여, 약제 조성물은 그러한 조성물에 공통적인 첨가물을 추가로 포함한다. 이들은 예를 들어 다양한 완충제 함유물(예를 들어, Tris-HCl, 아세트산염, 인산염, pH 및 이온 강도)의 적당한 희석제, 텐시드(tenside) 및 용해제(예를 들어, Tween 80, Polysorbate 80)와 같은 첨가제, 보존제(예를 들어, Thimerosal, 벤질 알코올), 애쥬번트, 항산화제(예를 들어, 아스코르브산, 나트륨 메타비술파이트), 유화제, 충전제(예를 들어, 락토오스, 만니톨), 폴리에틸렌 글리콜과 같은 중합체의 단백질로의 공유 결합, 폴리락트산, 폴리글리콜산 등과 같은 중합체 화합물의 입자 조성물 또는 리포좀으로의 재료의 혼입, 각 처리에 적당한 보조제(auxiliary agent) 및/또는 담체 물질일 수 있다. 그러한 조성물은 본 발명의 당단백질의 물리적 상태, 안정성, 생체내 유리 속도 및 생체내 배출 속도에 영향을 미칠 것이다.

또한, 본 발명은 β1,2-크실로실트랜스퍼라제를 코딩하는 DNA 분자를 샘플내에서 선별하는 방법을 제공하며, 여기에서 본 발명의 표지된 DNA 분자 또는 그것의 부분 서열이 샘플에 첨가되고, 이것은 β1,2-크실로실트랜스퍼라제를 코딩하는 DNA 분자에 결합한다. 하이브리드화된 DNA 분자가 검출되고, 정량화되며 선별될 수 있다. 표지된 DNA 분자가 하이브리드화될 수 있는 단일 가닥 DNA를 함유하는 샘플에 대하여, 샘플이 예를 들어 가열에 의해 변성된다.

하나의 가능한 방법은 엔도누클레아제의 첨가 후에, 아가로스겔 상에서의 겔 전기영동에 의해 검정될 DNA를 분리하는 것이다. 니트로셀룰로오스 막으로 전달된 후, 본 발명에 따른 표지된 DNA 분자가 혼합되어 상응하는 상동 DNA 분자에 하이브리드화된다("Southern blotting").

또 다른 가능한 방법은 본 발명에 따른 DNA 분자의 서열로부터 유도된, 특이적 및/또는 퇴행된 프라이머를 사용하는 PCR-의존 방법에 의해 다른 종으로부터 상동 유전자를 발견하는 것이다.

유리하게는, 본 발명의 표지된 DNA 분자 또는 그것의 부분 서열은 담체 매트릭스 상에 고정된다. DNA 마이크로어레이("유전자 칩")의 사용은 상동 유전자를 발견하거나 상동 유전자의 발현 수준을 연구하기 위한 추가의 가능한 방법이다. 이를 위해, 전체 게놈 유전자 서열, 전장 cDNA 서열, 이들 서열의 일부 또는 부분 서열의 임의의 조합을 표현하는 DNA가 담체 매트릭스 상으로 고정되어, 샘플을 캐리어 담체에 첨가한 후에, 상동 유전자가 표지된 DNA 분자와 하이브리드화된다[참고문헌: Ferea T.L. & Brown, P.O., 199, Current Opinion in Genetics & Development 9:715-722].

바람직하게는, 상기 확인된 본 발명의 방법에 대한 샘플은 식물 유기체의 게놈 DNA를 포함한다. 이 방법에 의해, 많은 수의 식물 또는 다른 종이 β1,2-크실로실트랜스퍼라제 유전자의 존재에 대해 매우 신속하고 효율적인 방식으로 검정된다. 이런 방식으로, 상기 본 발명의 방법에 의해 이 유전자를 포함하지 않는 식물 또는 다른 종의 개체를 선별할 수 있거나, 이 유전자를 포함하는 식물 또는 다른 유기체내에서 β1,2-크실로실트랜스퍼라제의 발현을 억제하거나 완전히 차단할 수 있으므로 후속하여 그들이 (인간) 당단백질의 트랜스펙션 및 생산을 위해 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 최후의 3가지 방법에 따라 선별되고 후속하여 샘플로부터 분리된 β1,2-크실로실트랜스퍼라제를 코딩하는 DNA 분자에 관한 것이다. 이들 분자는 추가 검정을 위해 사용될 수 있다. 그들은 서열화된 다음 β1,2-크실로실트랜스퍼라제를 발견하기 위한 DNA 프로브로서 사용될 수 있다. 이들 - 표지된 - DNA 분자는 이들이 분리된 유기체와 관련된 유기체에 대하여 본 발명의 DNA 분자보다 효율적으로 프로브로서 작용할 것이다.

추가로, 본 발명은 pI 값이 6.0 내지 9.0, 특히 7.50 내지 8.00인 이소형(isoform)을 포함하는 본 발명에 따라 클로닝된 β1,2-크실로실트랜스퍼라제의 제조물에 관한 것이다. 단백질의 pI 값은 그 알짜 전하가 0이고 아미노산 서열, 당화 형태 뿐만 아니라 단백질의 공간 구조에 의존하는 pH 값이다. β1,2-크실로실트랜스퍼라제는 이러한 범위의 pI 값을 갖는 여러 이소형을 포함할 수 있다. 트랜스퍼라제의 다양한 이소형이 존재하는 이유는 예를 들어 당화 뿐만 아니라 제한된 단백질 분해 때문이다. 단백질의 pI 값은 등전 포커싱(isoelectric focussing)에 의해 결정될 수 있으며, 이것은 당업자에게 공지되어 있다.

효소의 주된 이소형은 60.2 kDa의 겉보기 분자량을 갖는다.

특히, 본 발명의 제조물은 pI 값이 7.52인 이소형을 포함한다.

또한, 본 발명은 인간 또는 다른 척추동물 당단백질 또는 다른 당컨쥬게이트의 "식물화된(plantified)" 탄수화물 단위를 제조하는 방법에 관한 것이고, 여기에서 상기 DNA 분자에 의해 엔코딩된 β1,2-크실로실트랜스퍼라제 뿐만 아니라 UDP-크실로오스가 탄수화물 단위 또는 당단백질을 각각 포함하는 샘플에 첨가됨으로써 β1,2-위치의 크실로오스가 β1,2-크실로실트랜스퍼라제에 의해 탄수화물 단위 또는 당단백질 각각에 결합된다. β1,2-크실로실트랜스퍼라제를 클로닝하기 위한 본 발명의 방법에 의해, 다량의 정제된 효소를 생산하는 것이 가능하다. 완전한 활성의 트랜스퍼라제를 획득하기 위하여, 적당한 반응 조건이 제공된다.

본 발명은 하기 실시예 및 도면에 의해 보다 상세히 설명될 것이며, 이것은 본 발명을 제한하는 것이 아니다.

도 1은 대두 펩티드 2 및 3의 아미노산 서열(특허 WO99/29835; SEQ ID NO:3 및 5), 이들 펩티드와 아라비돕시스 탈리아나 서열 사이의 상동성 뿐만 아니라 4개의 프라이머 1-4의 DNA 서열을 나타낸다.

도 2는 5'-비번역된 영역의 226 nt를 포함하는 β1,2-크실로실트랜스퍼라제의 cDNA 서열을 나타낸다.

도 3은 그로부터 유래한 β1,2-크실로실트랜스퍼라제의 아미노산 서열을 나타낸다.

도 4a, 4b 및 4c는 아라비돕시스 탈리아나 β1,2-크실로실트랜스퍼라제 cDNA, 하나의 게놈 DNA 및 하나의 EST 서열의 정렬을 나타낸다.

도 5는 cDNA, 게놈 DNA 및 EST 서열로부터 유도된 β1,2-크실로실트랜스퍼라제의 아미노산 서열의 정렬을 나타낸다.

도 6은 β1,2-크실로실트랜스퍼라제 뿐만 아니라 PCR-생성물 및 아미노산 잔기의 소수성을 개략적으로 표현한 것이다.

도 7은 β1,2-크실로실트랜스퍼라제 유전자로 트랜스펙션된 곤충 세포의 β1,2-크실로실트랜스퍼라제 활성을 음성 대조군의 것과 비교한 것이다.

도 8a 및 8b는 β1,2-크실로실트랜스퍼라제의 수용체 기질 및 생성물의 구조를 나타낸다.

도 9는 질량 스펙트럼을 나타낸다.

도 10은 역상 HPLC에 의한 β1,2-크실로실트랜스퍼라제 생성물의 분석을 나타낸다.

도 11은 대두로부터 정제된 β1,2-크실로실트랜스퍼라제의 아미노산 서열을 가진 본원의 cDNA로부터 유도된 예정된 아미노산 서열의 정렬을 나타낸다.

실시예 1

RT-PCR 및 cDNA 클로닝

추정 β1,2-크실로실트랜스퍼라제 cDNA의 RT-PCR에 의한 증폭을 위한 프라이머를 다음과 같이 설계하였다: 2개의 대두 펩티드(SEQ ID NO: 1 및 2; 특허 WO99/29835 A1의 도 4의 SEQ ID NO: 3 및 5에 상응하지만; SEQ ID NO: 5로부터 C-말단 아미노산 LG가 생략됨)(도 1)를 사용하는 DDBJ 데이타베이스의 BLASTP 검색은 아라비돕시스 탈리아나 게놈 DNA 서열(Acc. Nr. AB015479)로부터 유래한 하나의 단백질 서열이 80% 초과의 상동성을 가짐을 나타낸다(SEQ ID NO:3). 프라이머 3 (SEQ ID NO:4) 및 4 (SEQ ID NO:5)는 대두 펩티드 2 및 3에 상동성인 아라비돕시스 탈리아나 서열에 기초한다. BCM Search Launcher에서 진-파인더를 사용한 상동성 게놈 DNA 서열의 분석은 하나의 예상된 단백질로 귀결된다. 프라이머 1 (SEQ ID NO:6)는 예정된 단백질의 개시 코돈을 포함하도록 설계되었으나, 프라이머 2 (SEQ ID NO:7)는 예정된 단백질의 정지 코돈을 포함한다.

전체 RNA는 TRIzol 시약(Life Technologies사)을 사용하여 아라비돕시스 탈리아나 바르(var) 콜롬비아의 어린 잎으로부터 분리하였다. RNA를 DNAse(Promega, RQ1 RNase Free DNase)로 처리하여 미량의 게놈 DNA를 분리하였다. 제 1가닥의 cDNA를 올리고(dt) 프라이머(Sigma) 및 AMV 역전사효소(Promega)를 사용하여 42℃에서 총 RNA 1㎍으로부터 합성하였다.

제 1가닥 cDNA를 PCR하였고, 여기에서 상이한 조합의 센스 및 안티센스 프라이머를 사용하였다 (도 6 참조). 프라이머 3 및 프라이머 4의 생성물은 174 bp의 길이를 갖는 DNA 단편이고 (P1), 프라이머 1 및 프라이머 2의 생성물은 1605 bp의 DNA 단편이며 (P2), 프라이머 1 및 프라이머 4의 생성물은 1525 bp의 길이를 갖는 DNA 단편이고 (P3), 프라이머 3 및 프라이머 4의 생성물은 254 bp의 DNA 단편이었다 (P4). 추정된 개방 판독 프레임의 증폭을 위해 프라이머 1 및 프라이머 2를 사용하였다. PCR 반응물은 총 부피 50㎕로 0.2 μmol의 각 프라이머, 0.05 mM dNTP, 2 mM MgSO₄, 20 mM Tris-HCl (25℃에서 pH 8.2), 10 mM KCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 0.1% 트리톤 X-100, 5 ㎍ 누클레아제-비함유 BSA 및 2.5 단위 Pfu DNA 폴리머라제(Promega)를 함유하였다. 94℃에서 2분 동안의 제 1변성 단계 후에, 92℃에서 1분, 53℃에서 40초 및 72℃에서 3분 30초의 30 사이클을 수행하였다. 최종 신장 단계는 72℃에서 8분 동안 수행하였다. PCR 생성물을 SmaI 선형화되고 탈인산화된 puc19 벡터로 서브클로닝하고, 서열화하였다: 서브클로닝된 단편의 서열은 디데스옥시누클레오티드 방법(ABI PRISM Dye Termination Cycle Sequencing Ready reation Kit and ABI PRISM 310 Genetic analyzer from Perkin Elmer)에 의해 수득하였다. RT-PCR의 결과로서, 3개의 약간 상이한 cDNA 서열이 수득되었다. cDNA 6의 서열은 1605 bp (xt-Ath6; SEQ ID NO: 8)의 크기를 갖고, 분자량이 60.2 kDa인 534개 아미노산의 단백질을 코딩하며, 7.52의 이론적 pI 값(도 3 참조)은 2개의 인트론 (xt-Athgen.seq)을 제거한 후 게놈 클론으로부터 유도된 누클레오티드 서열과 동일하다. cDNA 9는 cDNA 6와 비교하여 4개의 염기쌍 변화를 나타내지만, cDNA 16은 cDNA 6와 비교하여 6개의 염기쌍 변화를 나타낸다(도 4a, 4b 및 4c에 도시됨). 따라서, cDNA 9로부터 유도된 아미노산 서열은 cDNA 6 (SEQ ID NO: 8)으로부터 유도된 아미노산 서열과 비교하여 2개의 변화를 포함하며, cDNA 16의 아미노산 서열은 4개의 변화된 잔기를 나타낸다(도 5에 도시됨).

도 3은 β1,2-크실로실트랜스퍼라제 (xt-Ath 6; SEQ ID NO: 8)의 cDNA-유도된 아미노산 서열(SEQ ID NO: 9)을 나타낸다. 아스파라긴 결합된 당화를 위한 잠재적 위치는 Asn51, Asn301 및 Asn479이다.

도 4a, 4b 및 4c는 아라비돕시스 탈리아나 cDNA 6(xt-Ath6; SEQ ID NO: 8), 아라비돕시스 탈리아나 cDNA 9 (xt-Ath9), 아라비돕시스 탈리아나 cDNA 16 (xt-Ath16), 2개의 인트론을 제거한 후의 아라비돕시스 탈리아나 게놈 DNA 서열 (xt-Athgen) 및 아라비돕시스 탈리아나 EST 서열(xtAthEST)로부터의 β1,2-크실로실트랜스퍼라제 누클레오티드 서열의 정렬을 나타낸다. 점선은 컨센서스 서열을 나타내고; 파선은 갭을 나타낸다.

게놈 서열(xt-Athgen; Acc. No. AB015479, 게놈 DNA의 58185-58187 위치에 개시 코돈, 60214-60216 위치에 정지 코돈)은 스플라이싱 부위 예상 서버인 NetPlantGene를 사용하여 2개의 추정 인트론(인트론 1: 게놈 DNA의 58881 내지 59116 위치; 인트론 2: 게놈 DNA의 59268 내지 59458 위치)을 제거함으로써 생성된다. 아라비돕시스 탈리아나 EST 서열(xt-AthEST; Acc. No. AI994524)은 BLASTN을 사용한 데이타베이스 검색의 결과이다.

도 5는 아라비돕시스 탈리아나 cDNA 6(xt-Ath6; SEQ ID NO: 9), 아라비돕시스 탈리아나 cDNA 9 (xt-Ath9), 아라비돕시스 탈리아나 cDNA 16 (xt-Ath16), 아라비돕시스 탈리아나 게놈 DNA 서열(xt-Athgen) 및 아라비돕시스 탈리아나 EST 서열(xtAthEST)로부터 유도된 β1,2-크실로실트랜스퍼라제로부터의 아미노산 서열의 정렬을 나타낸다. 점선은 컨센서스 서열을 나타내고; 파선은 간극을 나타낸다.

도 6에서, 개략적으로 예상된 β1,2-크실로실트랜스퍼라제 단백질(상부) 및 엔코딩된 단백질의 ProtScale을 사용하여 유도된 소수성 지수(바닥)가 도시되었고, 양의 소수성 지수는 소수성 증가를 의미한다. 그 사이에 4개의 상기 PCR 생성물(P1-P4)의 크기가 cDNA와 관련하여 도시되었다. "C"는 가정된 세포질 영역을 코딩하고, "T"는 가정된 막횡단 영역을 코딩하며, "G"는 트랜스퍼라제의 가정된 골지 내강 촉매 영역을 코딩한다. "TMpred(EMBnet으로부터)"에 의한 단백질 서열의 분석은 Ile11 내지 Phe29의 가정된 막횡단 영역을 제공한다. 효소의 C-말단 영역은 촉매 영역을 포함하고, 결과적으로 골지체의 내강쪽을 향한다. 이에 따라, 이 트랜스퍼라제는 당단백질의 생합성과 관련된 모든 지금까지 분석된 글리코실트랜스퍼라제와 같은 Ⅱ형 막횡단 단백질인 것으로 여겨진다[참고문헌: Joziasse, 1992, Glycobiology 2, 271-277). 회색 영역은 2개의 펩티드의 위치를 나타내고, 6각형은 잠재적 N-당화 부위를 나타낸다. NCBI를 통해 접근가능한 데이타 뱅크에서의 BLAST 검색은 하나의 다른 식물 서열에 대한 높은 상동성만을 나타낸다[참고문헌: hybrid aspen, Acc. No. AI62640].

실시예 2

곤충 세포내에서의 재조합 β1,2-크실로실트랜스퍼라제의 발현

세포질 및 막횡단 영역을 포함하는 가정된 β1,2-크실로실트랜스퍼라제의 전체 코딩 영역을 BamHI 및 EcoRI 분해에 의해 puc19 벡터로부터 분리하였고, BamHI/EcoRI 분해되고 탈인산화된 배큘로바이러스 전달 벡터 pVL 1393(PharMingen, San Diego, CA)내로 서브클로닝하였다. 정확한 클로닝은 pVL1393 정방향 프라이머 5'-AACCATCTCGCAAATAAATAAGTA-3' (SEQ ID NO: 10) 및 pVL1393 역방향 프라이머 5'-GTCGGGTTTAACATTACGGATTTC-3' (SEQ ID NO: 11)를 사용하여 서열화하여 확인하였다. 상동 재조합을 보장하기 위하여, 200 ng의 선형 배큘로-골드(Baculo-Gold) 바이러스 DNA (PharMingen, San Diego, CA)를 지닌 1㎍의 전달 벡터를 제조자의 프로토콜에 따라 리포펙틴(Lipofectin)(Life Technologies)을 사용하여 IPL-41 매질 중의 1×10⁶ 세포내로 공동 트랜스펙션시켰다. 27℃에서 5일간 인큐베이션한 후, 재조합 바이러스를 가진 다양한 부피의 상청액을 Sf-21 곤충 세포의 감염을 위해 사용하였다. 세포를 5% 열-불활성화된 우태아혈청으로 보충된 IPL-41 매질내에서 4일간 27℃에서 배양하고 나서, 수거하고, 인산염-완충된 식염 용액으로 2회 세척하였다. 세포를 재현탁시키고, 하기 완충액(10⁷ 세포 당 1 ml)내에서 균질화시켰다: 1% 트리톤 X-100, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 5㎍/ml 류펩틴(Sigma), 5 ㎍/ml E-64 (Serva)를 갖고 30분 동안 얼음 위에서 배양된 pH 7.0인 100 mM MES 완충액.

실시예 3

β1,2-크실로실트랜스퍼라제 활성 검정

β1,2-크실로실트랜스퍼라제 활성에 대하여 세포 균질물을 검정하였다. 동일한 수의 비감염된 세포로 음성 대조군을 수행하였다. 검정 혼합물은 총 부피 20㎕내에 13㎕의 균질화된 세포, 수용체 기질로서 2 nmol의 댑실레이트된(dabsylated) GnGn 헥사펩티드 또는 GnGn-피리딜아민(도 8a), 공여자 기질로서 1 mM UDP-크실로오스, 10 mM ATP, 20 mM MnCl₂을 포함하며, 1 mM의 2-아세트아미도-1,2-디데옥시-노지리마이신이 N-아세틸헥소사미니다제에 의한 생성물의 분해를 막기 위해 포함되었다. 샘플을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고 MALDI-TOF 질량 분광법으로 분석하였다.

도 7은 재조합 β1,2-크실로실트랜스퍼라제 뿐만 아니라 음성 대조군의 측정된 효소 활성을 나타낸다. 회색 기둥은 GnGn 헥사펩티드가 기질로서 사용된 경우의 활성을 나타내며, 검정 기둥은 기질로서 GnGn-피리딜아민을 사용한 경우를 나타낸다. 공동 트랜스펙션된 세포의 효소 활성은 음성 대조군 보다 30배 높았다.

β1,2-크실로실트랜스퍼라제의 수용체 기질의 구조는 도 8a에 도시되었고, 가정된 생성물은 도 8b에 도시되었고, 여기서 R은 피리딜아민이거나 댑실레이트된 헥사펩티드 잔기를 나타낸다.

실시예 4

크실로실트랜스퍼라제 생성물의 질량 분석법

동적 추출(말기 추출에 대한 동의어)이 가능한 DYNAMO (BioAnalysis, Santa Fe, NM), MALDITOF MS 상에서 질량 분석법을 수행한다. 2가지 유형의 샘플 매트릭스 제조물을 사용하였다: 댑실레이트된 글리코펩티드를 5% 포름산에 용해시키고, 분량을 표적에 적용하고, 공기 건조시키고, 1% 알파-시아노-4-히드록시 신남산으로 덮었다. 피리딜아민화된 글리칸을 물로 희석하고, 표적에 적용하고, 공기 건조시켰다. 2% 2.5-디히드록시 벤조산을 첨가한 후, 샘플을 즉시 진공을 가하여 건조시켰다.

도 9는 이들 샘플의 질량 스펙트럼을 나타내고, (A)는 음성 대조군이다: 주된 피크(S)는 댑실(dabsyl)-Val-Gly-Glu-(GlcNAc₄Man₃)Asn-Arg-Thr 기질을 나타내고, 계산된 [M+H]⁺ 값은 2262.3이다. 또한, 이 기질은 나트륨 첨가 생성물 및 (S^*)에서 댑실(dabsyl)기의 아조 작용기의 분획화에 의해 형성된 보다 작은 이온으로 나타난다. m/z=2424.4에서의 피크는 기질의 불완전한 탈-갈락토실화를 나타낸다. 질량 스펙트럼 (B)은 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후에 재조합 β1,2-크실로실트랜스퍼라제를 갖는 샘플을 나타낸다. [M+H]⁺ 값이 2393.4인 주된 피크(P)는 크실로실화된 생성물을 나타낸다.

실시예 5

크실로실트랜스퍼라제 생성물의 HPLC-분석

수용체 기질로서 10 nmol의 GnGn-피리딜아민을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 3에 설명된 바와 같이 크실로실트랜스퍼라제 검정을 수행하였다. 4시간의 인큐베이션 후에, 샘플을 MALDI-TOF 질량 분석법 및 역상 HPLC로 분석하여 생성물의 구조를 확인하였다. 기질 GnGn-PA의 약간 앞에서 용리하는 가정된 생성물 피크를 수집하였다. MALDI-TOF MS에 의해 생성물의 질량이 GnGnX-PA와 양호하게 일치되는 1550.9인 것으로 결정되었다. 소의 신장으로부터의 β-N-아세틸글루코사미니다제로 소화된 경우(25 mU의 효소를 사용하여 37℃에서 20시간 동안 pH 5.0의 50 mM 시트르산나트륨 완충액 중에서), 글리칸이 MM을 거의 보존하며 용리되었다. 이것은 MM-PA 및 MMX-PA의 보존에 대한 공개된 데이타와 일치된다[참고문헌: Wilson & Altmann, 1998, Glycoconj. J. 15, 1055-1070). 선택된 조건(50 mU의 효소를 사용하여 37℃에서 20시간)하에 잭(jack) 콩으로부터 알파-만노시다제로 추가로 소화시키면 2개의 새로운 피크가 출현하게 된다. 알파-1,3-결합된 만노오스가 알파-1,6-결합된 만노오스보다 만노시다제에 보다 민감하기 때문에, 피크가 00X 및 M0X에 할당된다(용리 순서로). 사실, 산을 사용한 디푸코실화에 의해 브로멜라인으로부터 제조된 M0X-피리딜아민은 크실로실트랜스퍼라제 생성물로부터 유도된 가정된 M0X와 함께 용리되었다. 알파-1,3-결합된 만노오스 잔기를 제거함으로써 매우 크게 변화된 용리 시간은 β-만노오스가 크실로오스로 치환되었음을 강하게 나타내는 것이다[참고문헌: Wilson & Altmann, 1998, Glycoconj. J. 15, 1055-1070; Altmann, 1998, Glycoconj. J. 15, 79-82].

도 10은 역상 HPLC에 의한 크실로실트랜스퍼라제 생성물의 분석을 나타낸다. (A) 트랜스퍼라제 인큐베이션 혼합물; (B) 분리된 크실로실트랜스퍼라제 생성물; (C) β-N-아세틸글루코사미니다제로 소화된 후의 분리된 크실로실트랜스퍼라제 생성물; (D) 알파-만노시다제로 추가로 소화된 후의 분리된 크실로실트랜스퍼라제 생성물. 피크의 할당은 다음과 같다: 1, GnGn-PA; 2, GnGnX-PA; 3, MMX-PA; 4, M0X-PA; 5, 00X-PAA; 6, M0-PA (분리된 생성물내의 미량의 기질로부터). N-글리칸 구조의 약어를 위해 참고문헌[Wilson I.B.H. and Altmann, F., 1998, Glycoconj. J. 15, 1055-1077]를 참조하라.

도 11은 WO99/29835 A1에 따른 예상된 아미노산 서열의 정렬을 나타낸다. 이 정렬은, 정제된 대두 효소의 아미노산 서열이 본 발명에 따른 cDNA로부터 유도된 서열의 아미노산 199-469에만 상응함을 나타낸다. 게다가, 본원의 cDNA로부터 유도된 예상된 아미노산 서열은 정제된 대두 효소의 서열에 비해 2개의 삽입부(예상된 서열의 aa 375-382 및 aa 425-429에 대응됨)를 함유한다.

SEQUENCE LISTING <110> Glossl Prof., Josef <120> xylosyltransferase-gene <130> xylosyltransferase-gene <140> <141> <160> 11 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 27 <212> PRT <213> soyabean <400> 1 Ser Gln Val Gln Ala Ile His Asp Ala Ser Val Ile Ile Gly Ala His 1 5 10 15 Gly Ala Gly Leu Thr His Ile Val Ser Ala Leu 20 25 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> soyabean <400> 2 Gly Leu Glu Tyr His Ala Ile Asn 1 5 <210> 3 <211> 60 <212> PRT <213> arabidopsis thaliana <400> 3 Asp Gln Val Arg Ala Ile Gln Asp Ala Ser Val Ile Ile Gly Ala His 1 5 10 15 Gly Ala Gly Leu Thr His Ile Val Ser Ala Thr Pro Asn Thr Thr Ile 20 25 30 Phe Glu Ile Ile Ser Val Glu Phe Gln Arg Pro His Phe Glu Leu Ile 35 40 45 Ala Lys Trp Lys Gly Leu Glu Tyr His Ala Met His 50 55 60 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 4 gatcaagtcc gagccattca a 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 5 cgcgtgatac tccaatcctt t 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 6 atgagtaaac ggaatccgaa g 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 7 ttagcagcca aggctcttca t 21 <210> 8 <211> 1831 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 8 aaatctgcag actctcaaaa ttccgattca tcttattgaa gaacaatttt ccggcgaaac 60 agccgatgaa gtctcgcctg aatcttctgt acctttcacc ggcgattgac ttcacttcag 120 aatcgagaga gaagaaatcg atggaaaact aaaaatagaa agagtttcaa attctcgctc 180 tctcttcaaa accgcaaatc aagggaacga gagacgagag agagagatga gtaaacggaa 240 tccgaagatt ctgaagattt ttctgtatat gttacttctc aactctctct ttctcatcat 300 ctacttcgtt tttcactcat cgtcgttttc accggagcag tcacagcctc ctcatatata 360 ccacgtttca gtgaataacc aatcggcgat tcagaaaccg tggccgatct taccttctta 420 cctcccatgg acgccgccgc agaggaatct accaactggc tcctgcgaag gttacttcgg 480 gaatggattt acaaagagag ttgacttcct taagccgagg attggaggag gaggagaagg 540 aagctggttc cgatgttttt acagtgagac attacagagt tcgatttgtg aaggaaggaa 600 tctgagaatg gttccggatc ggattgttat gtcgagagga ggtgagaagt tagaggaagt 660 tatggggagg aaagaggagg aggagcttcc tgcgtttcga caaggtgcgt ttgaggtagc 720 ggaagaggtt tcttcacggt taggttttaa gagacaccgt cgttttggtg gaggagaagg 780 aggtagtgcg gtttctcggc ggctggtgaa tgatgagatg ttgaatgaat atatgcaaga 840 aggtggaatt gatagacata caatgagaga tttggttgct tcgattcgtg ctgttgatac 900 caatgatttc gtttgtgaag agtgggtgga ggaaccgacc ttgcttgtca ctagattcga 960 gtacgcaaat ctcttccata ctgtgacaga ttggtatagt gcctatgttt cgtctagagt 1020 caccggtttg cctaatcgac ctcacgttgt tttcgttgac ggacactgca cgacgcagct 1080 agaagaaaca tggacagctt tgttttccgg aatcagatac gcaaagaact tcaccaaacc 1140 ggtttgtttc cgccacgcga ttctttcacc attgggatac gaaaccgctc tttttaaagg 1200 cttgtccgga gaaatagact gcaagggaga ttcagctcac aatctgtggc aaaacccgga 1260 cgataaaagg actgcgagga tatcagagtt tggtgaaatg atcagagcag ctttcgggtt 1320 gcctgtcaat agacaccgct cattagaaaa gccgctatca tcatcatcat catcagcctc 1380 agtttataat gttctttttg tccgccgtga agattactta gcccatcctc gtcatggcgg 1440 taaagtccag tctcggctca tcaatgagga agaagtgttc gactcgttgc atcattgggt 1500 tgcaactggg tccaccggtc tgaccaaatg cgggattaac cttgtgaatg gcttgcttgc 1560 acacatgtca atgaaagatc aagtccgagc cattcaagat gcttcagtga tcataggagc 1620 tcatggagca ggactgactc acattgtctc tgcaacacca aacacaacga tatttgagat 1680 aataagcgtc gagtttcaga gacctcattt cgagcttata gctaagtgga aaggattgga 1740 gtatcacgcg atgcatctgg cgaactcacg agcggaacca acggctgtga ttgagaagtt 1800 aacggagatc atgaagagcc ttggctgcta a 1831 <210> 9 <211> 533 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 9 Met Ser Lys Arg Asn Pro Lys Ile Leu Lys Ile Phe Leu Tyr Met Leu 1 5 10 15 Leu Leu Asn Ser Leu Phe Leu Ile Ile Tyr Phe Val Phe His Ser Ser 20 25 30 Ser Phe Ser Pro Glu Gln Ser Gln Pro Pro His Ile Tyr His Val Ser 35 40 45 Val Asn Asn Gln Ser Ala Ile Gln Lys Pro Trp Pro Ile Leu Pro Ser 50 55 60 Tyr Leu Pro Trp Thr Pro Pro Gln Arg Asn Leu Pro Thr Gly Ser Cys 65 70 75 80 Glu Gly Tyr Phe Gly Asn Gly Phe Thr Lys Arg Val Asp Phe Leu Lys 85 90 95 Pro Arg Ile Gly Gly Gly Gly Glu Gly Ser Trp Phe Arg Cys Phe Tyr 100 105 110 Ser Glu Thr Leu Gln Ser Ser Ile Cys Glu Gly Arg Asn Leu Arg Met 115 120 125 Val Pro Asp Arg Ile Val Met Ser Arg Gly Gly Glu Lys Leu Glu Glu 130 135 140 Val Met Gly Arg Lys Glu Glu Glu Glu Leu Pro Ala Phe Arg Gln Gly 145 150 155 160 Ala Phe Glu Val Ala Glu Glu Val Ser Ser Arg Leu Gly Phe Lys Arg 165 170 175 His Arg Arg Phe Gly Gly Gly Glu Gly Gly Ser Ala Val Ser Arg Arg 180 185 190 Leu Val Asn Asp Glu Met Leu Asn Glu Tyr Met Gln Glu Gly Gly Ile 195 200 205 Asp Arg His Thr Met Arg Asp Leu Val Ala Ser Ile Arg Ala Val Asp 210 215 220 Thr Asn Asp Phe Val Cys Glu Glu Trp Val Glu Glu Pro Thr Leu Leu 225 230 235 240 Val Thr Arg Phe Glu Tyr Ala Asn Leu Phe His Thr Val Thr Asp Trp 245 250 255 Tyr Ser Ala Tyr Val Ser Ser Arg Val Thr Gly Leu Pro Asn Arg Pro 260 265 270 His Val Val Phe Val Asp Gly His Cys Thr Thr Gln Leu Glu Glu Thr 275 280 285 Trp Thr Ala Leu Phe Ser Gly Ile Arg Tyr Ala Lys Asn Phe Thr Lys 290 295 300 Pro Val Cys Phe Arg His Ala Ile Leu Ser Pro Leu Gly Tyr Glu Thr 305 310 315 320 Ala Leu Phe Lys Gly Leu Ser Gly Glu Ile Asp Cys Lys Gly Asp Ser 325 330 335 Ala His Asn Leu Trp Gln Asn Pro Asp Asp Lys Arg Thr Ala Arg Ile 340 345 350 Ser Glu Phe Gly Glu Met Ile Arg Ala Ala Phe Gly Leu Pro Val Asn 355 360 365 Arg His Arg Ser Leu Glu Lys Pro Leu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala 370 375 380 Ser Val Tyr Asn Val Leu Phe Val Arg Arg Glu Asp Tyr Leu Ala His 385 390 395 400 Pro Arg His Gly Gly Lys Val Gln Ser Arg Leu Ile Asn Glu Glu Glu 405 410 415 Val Phe Asp Ser Leu His His Trp Val Ala Thr Gly Ser Thr Gly Leu 420 425 430 Thr Lys Cys Gly Ile Asn Leu Val Asn Gly Leu Leu Ala His Met Ser 435 440 445 Met Lys Asp Gln Val Arg Ala Ile Gln Asp Ala Ser Val Ile Ile Gly 450 455 460 Ala His Gly Ala Gly Leu Thr His Ile Val Ser Ala Thr Pro Asn Thr 465 470 475 480 Thr Ile Phe Glu Ile Ile Ser Val Glu Phe Gln Arg Pro His Phe Glu 485 490 495 Leu Ile Ala Lys Trp Lys Gly Leu Glu Tyr His Ala Met His Leu Ala 500 505 510 Asn Ser Arg Ala Glu Pro Thr Ala Val Ile Glu Lys Leu Thr Glu Ile 515 520 525 Met Lys Ser Leu Gly Cys 530 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 10 aaccatctcg caaataaata agta 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 11 gtcgggttta acattacgga tttc 24

Claims

β1,2-크실로실트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질을 코딩하며, 염기쌍 227 내지 염기쌍 1831의 오픈 리딩 프레임을 가진 SEQ ID NO: 8에 따른 서열 (서열 A), 유전 코드의 축퇴로 인해 상기 서열 A와 동일한 아미노산 서열을 엔코딩하는 서열, 또는 상기 서열 중 어느 하나에 상보적인 서열로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함함을 특징으로 하는 DNA 분자.
삭제
삭제
삭제
제 1항에 있어서, 검출 가능한 마커 물질과 공유적으로 결합됨을 특징으로 하는 DNA 분자.
삭제
삭제
제 1항 또는 제 5항에 따른 DNA 분자를 포함함을 특징으로 하는 생물학적 작용성 벡터.
제 1항 또는 제 5항에 따른 DNA 분자를 포함하며, 이러한 DNA 분자가 프로모터에 대하여 역으로 배향됨을 특징으로 하는 생물학적 작용성 벡터.
삭제
RNA를 식물 세포로부터 분리하고, 역전사효소 및 프라이머를 첨가한 후에 상기 RNA를 사용하여 역전사를 수행함을 특징으로 하는, 제 1항 또는 제 5항에 따른 DNA 분자를 포함하는 cDNA를 제조하는 방법.
제 1항 또는 제 5항에 따른 DNA 분자를 벡터내로 클로닝시킨 후, 이러한 벡터를 숙주 세포 또는 숙주내로 트랜스펙션시키고, 트랜스펙션된 숙주 세포를 선별하고 증폭시킴으로써 활성 β1,2-크실로실트랜스퍼라제를 발현시키는 세포주를 수득함을 특징으로 하는, 활성 β1,2-크실로실트랜스퍼라제를 생성시키는 방법.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
제 5항에 따른 DNA 분자를 샘플에 첨가하고, 그 분자를 50℃에서의 7% 소듐 도데실 설페이트 (SDS), 0.5M NaPO₄, pH 7.0, 1mM EDTA의 엄격한 조건하에서 β1,2-크실로실트랜스퍼라제를 코딩하는 DNA 분자와 하이브리드화시키고 42℃에서 1% SDS로 세척함을 특징으로 하는, 샘플내에서 β1,2-크실로실트랜스퍼라제를 코딩하는 DNA 분자를 선별하는 방법.
제 22항에 있어서, 샘플이 식물 또는 비척추 동물 유기체의 게놈 DNA를 포함함을 특징으로 하는 방법.
삭제
삭제
삭제
인간 또는 기타 척추동물의 탄수화물 단위 또는 당단백질을 포함하는 샘플에 UDP-크실로오스 및 제 1항 또는 제 5항에 따른 DNA 분자에 의해 코딩된 β1,2-크실로실트랜스퍼라제를 첨가하여 크실로오스가 β1,2-크실로실트랜스퍼라제에 의해 β1,2-위치에서 탄수화물 단위 또는 당단백질에 결합됨을 특징으로 하는, 인간 및 기타 척추동물의 식물화된(plantified) 탄수화물 단위 또는 당단백질을 제조하는 방법.
삭제
삭제
제 1항에 있어서, 1831개의 염기쌍을 포함함을 특징으로 하는 DNA 분자.
제 11항에 있어서, 상기 식물 세포가 잎 세포임을 특징으로 하는 방법.
삭제
삭제
삭제
제8항에 따른 벡터를 숙주 세포 또는 숙주내로 트랜스펙션시키고, 트랜스펙션된 숙주 세포를 선별하고 증폭시킴으로써 활성 β1,2-크실로실트랜스퍼라제를 발현시키는 세포주를 수득함을 특징으로 하는, 활성 β1,2-크실로실트랜스퍼라제를 생성시키는 방법.