BRPI0709202A2

BRPI0709202A2 - seqüências de nucleotìdeo que codificam nicotiana beta-1,2-xilosiltransferase

Info

Publication number: BRPI0709202A2
Application number: BRPI0709202-4A
Authority: BR
Inventors: Koen Weterings
Original assignee: Bayer Bioscience Nv
Priority date: 2006-03-23
Filing date: 2007-03-15
Publication date: 2011-06-28
Also published as: MX2008012153A; IL194144A0; AU2007229061A1; CN101405395A; US20100287657A1; JP2009529898A; CA2646583A1; ZA200807497B; WO2007107296A1; KR20090007354A; EP2002008A1

Abstract

SEQUêNCIAS DE NUCLEOTìDEO QUE CODIFICAM NICOTIANA BETA-1,2-XILOSILTRANSFERASE. A presente invenção refere-se a novas seqúências de nucleotídeo de 1,2-xilosiltransferase e usos das mesmas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "SEQÜÊNCIASDE NUCLEOTÍDEO QUE CODIFICAM NICOTIANA BETA-1,2-XILOSIL-TRANSFERASE".

A presente invenção refere-se à novas seqüências de nucleotídeode espécies e cultivares de Nicotiana, particularmente de Nicotiana bentha-miana e Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1, que codificam β-1,2-xilo-siltransferase (XyIT) e a seu uso para produzir plantas Nicotiana modifica-das, particularmente plantas Nicotiana Bentamiana e Nicotiana Tabacum vc.Petite Havana SR1, as quais têm um menor nível ou um padrão alterado deN-glicanos ligadas à proteína imunogênicas, particularmente um menor nívelde resíduos de beta-1,2-xiIose sobre as N-glicanos ligadas à proteína, doque a contraparte plantas Nicotiana não-modificadas. Tais plantas Nicotianapodem ser obtidas através de diminuição da expressão do(s) gene(s) de XyIT deNicotiana endógeno, por exemplo, através de modificação da atividade do(s)gene(s) de XyIT de Nicotiana endógeno através de troca o gene de XyIT deNicotiana endógeno por outro alelo do gene de XyIT1 o que proporciona ummenor nível de resíduos de beta-1,2-xilose sobre as N-glicanos ligadas àproteína ou através de qualquer combinação dos mesmos.

Descrição da Técnica Relacionada

O uso de plantas transgênicas para a produção de proteínas re-combinantes com valor adicionado, tal como anticorpos, vacinas, produtosde sangue humano, hormônios, reguladores do crescimento e similares, édescrito para oferecer muitas vantagens práticas, econômicas e de seguran-ça comparado com sistemas mais convencionais, tais como culturas de célu-las de inseto e animal, fungos filamentosos e bactérias (revisto por Stoger eoutros, 2002; Twyman e outros, 2003; Fischer e outros, 2004).

Embora a via de síntese de proteína seja grandemente a mesmaem plantas e animais, existem algumas diferenças em modificações pós-traducionais, particularmente com relação às estruturas da cadeia de glica-na. Assim, proteínas humanas recombinantes derivadas de planta tendem ater os grupos carboidrato beta(1-»2)-xilose e alfa(1-»3)-fucose, os quais es-tão ausentes em mamíferos, mas carecem dos resíduos de galactose e ácidosiálico terminais que são encontrados em muitas glicoproteínas humanasnativas (Twyman e outros, 2003).

A enzima que catalisa a transferência de xilose de UDP-xilosepara manose com núcleo beta-ligado da N-glicanos ligadas à proteína é abeta-1,2-xilosiltransferase (XylT). XyIT é uma enzima única à plantas e al-gumas espécies de animais não-vertebrados, por exemplo, em espécies S-chistosoma (Khoo e outros, 1997) e caracol (por exemplo, Mulder e outros,1995) e não ocorre em seres humanos ou em outros vertebrados.

Tezuka e outros (1992) caracterizaram uma XyIT de sycamore(Acer pseudoplatanus L.).

Zeng e outros (1997) descreveram a purificação de uma XyIT demicrossomas de soja. Apenas uma parte do cDNA de XyIT de soja foi isola-da (W099/29835 Al).

Strasser e outros (2000) e o W001/64901 descrevem o isola-mento de um gene de XyIT de Arabidopsis, a seqüência de aminoácido pre-vista da proteína de XyIT codificada e sua atividade enzimática in vitro e invivo.

As seguintes entradas em banco de dados que identificam se-qüências de gene e cDNA de XyIT putativas e experimentalmente demons-tradas, partes das mesmas ou seqüências homólogas, puderam ser identifi-cadas: AJ627182, AJ627183 (Nicotiana tabacumcv. Xanthi), AM179855 (So-Ianum tuberosum), AM179856 (Vitis vinifera), AJ891042 (Populus alba χ Po-pulus tremula), AY302251 (Medicago sativa), AJ864704 (Saccharum officina-rum), AM179857 (Zea mays), AM179853 (Hordeum vulgare), AM179854(,Sorghum b/co/or), BD434535, AJ277603, AJ272121, AF272852, AX236965(Arabidopsis thaliana), AJ621918 (Oryza sativa), AR359783, AR359782,AR123000, AR123001 (Soja), AJ618933 (Physcomitrella patens).

Strasser e outros (2004a) reportam duas abordagens para amodulação da via de N-glicosilação em plantas: primeiro, silenciamento degene pós-transcricional foi usado para realizar bloqueios (knock down) naexpressão de beta-1,2-N-acetil glicosaminil transferase I (GnTI), uma enzimaenvolvida no processamento de resíduos oligomanosídicos em um híbrido eN-glicanos complexas em eucariotas superiores, para avaliar a influência deexpressão de GnTI sobre a formação de N-glicanos complexas em Nicotianabenthamiana. Caracterização de perfil de N-glicano não revelou alteraçõessignificativas do padrão de N-glicano total indicando que, mesmo uma ativi-dade residual mínima de GnTI permite a biossíntese de N-glicanos comple-xas em Nicotiana benthamiana. Eles ainda reportam que uma abordagemsimilar para o knock down de XyIT resultou em uma redução significativa deN-glicanos beta-1,2-xilosiladas. Em segundo, de forma a obter uma elimina-ção completa de resíduos de beta-1,2-xilose e alfa-1,3-fucose de N-glicanos,plantas Arabidopsis com knockout triplo foram geradas usando linhagenscom mutação por inserção. Essas plantas exibem deficiência completa debeta-1,2-xilosil transferase e alfa-1,3-fucosil transferase de núcleo ativas,carecem de N-glicanos ligadas à proteína imunogênica e sintetizam predo-minantemente estruturas humanizadas com resíduos de beta-N-acetil glico-samina terminais (Strasser e outros, 2004b).

Safras de folhas, tal como tabaco, são consideradas como sen-do fortes candidatos para a produção comercial de proteínas recombinantes(vide, por exemplo, Twyman e outros, 2003).

O objetivo da presente invenção é proporcionar seqüências degene e cDNA de XyIT alternativas de espécies e cultivares de Nicotiana, par-ticularmente de Nicotiana benthamiana e Nicotiana tabacum cv. Petite Ha-vana SR1, as quais são melhor adequadas para modificar a expressão deXyIT, em particular espécies e cultivares de Nicotiana.

Sumário da Invenção

Em um aspecto da invenção, é proporcionado um método paraproduzir uma célula de planta ou planta Nicotiana tendo um baixo nível deresíduos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanos ligadas à proteína compreen-dendo as etapas de introdução de um gene quimérico em células de plantade uma espécie ou cultivar de Nicotiana para gerar células de planta trans-gênica, o gene quimérico compreendendo um promotor expressível em plan-ta operavelmente ligado; uma região de DNA passível de transcrição com-preendendo uma primeira região de sentido de DNA compreendendo umaseqüência de nucleotídeo de pelo menos 19 de 20 nucleotídeos consecuti-vos selecionados de uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma proteí-na de XyIT de Nicotiana ou o complemento da mesma, a seqüência de nu-cleotídeo, de preferência, obtenível de espécies ou cultivares de Nicotiana,em que pelo menos 19 de 20 nucleotídeos consecutivos codificam pelo me-nos um aminoácido de XyIT espécie ou cultivar de Nicotiana-específico ouselecionada de uma seqüência de nucleotídeo de um gene de XyIT de Nico-tiana ou cDNA de XyIT de Nicotiana ou o complemento da mesma, a se-qüência de nucleotídeo, de preferência, obtenível de uma espécie ou cultivarde Nicotiana, em que os pelo menos 19 de 20 nucleotídeos consecutivoscompreendem pelo menos um nucleotídeo de XyIT espécie de Nicotiana-específico; uma segunda região de anti-sentido de DNA compreendendouma seqüência de nucleotídeo de pelo menos 19 nucleotídeos consecutivosos quais têm pelo menos 95% de identidade de seqüência ao complementoda primeira região de DNA; em que uma molécula de RNA transcrita a partirda região de DNA passível de transcrição é capaz de formar uma região deRNA fita simples pelo menos entre uma região de RNA transcrita a partir daprimeira região de sentido de DNA e uma região de RNA transcrita a partirda segunda região de anti-sentido de DNA; e uma região de DNA compre-endendo um sinal de poliadenilação e término de transcrição funcional emplantas; opcionalmente, identificação de uma célula de planta Nicotianatransgênica a qual tem um menor nível de resíduos de beta-1,2-xilose sobreN-glicanos ligadas à proteína do que uma célula de planta Nicotiana não-transformada; opcionalmente regeneração das células de planta Nicotianatransgênicas para obter plantas Nicotiana transgênicas; e opcionalmente,identificação de uma planta Nicotiana transgênica a qual tem um menor nívelde resíduos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanos ligadas à proteína do queuma planta Nicotiana não-transformada. O aminoácido ou nucleotídeo deXyIT espécie ou cultivar de Mcof/ana-específico pode ser um aminoácido ounucleotídeo de XyIT Nicotiana benthamiana-especíUco ou Nicotiana tabacumcv. Petite Havana SR1 -específica e a espécie ou cultivar pode, de preferên-cia, ser Nicotiana benthamiana ou Nicotiana tabacum cv. Petite HavanaSR1, respectivamente. A seqüência de nucleotídeo que codifica uma proteí-na de XyIT de Nicotiana pode compreender uma seqüência de nucleotídeoque codifica a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO.: 12 ou SEQ ID NO.:14 ou a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO.: 4, SEQ ID NO.: 6, SEQ IDNO.: 8 ou SEQ ID NO.: 10 e a seqüência de nucleotídeo do gene de XyIT deNicotiana pode compreender a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO.:11, SEQ ID NO.: 13, ou SEQ ID No. 21 ou a seqüência de nucleotídeo deSEQ ID NO.: 3, SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 8, SEQ ID NO.: 10, ou SEQ IDNO.: 17.

É outro objetivo da invenção proporcionar um método para pro-duzir uma célula de planta ou planta Nicotiana tendo um baixo nível de resí-duos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanos ligadas à proteína compreendendoas etapas de fornecimento de uma ou mais moléculas de RNA de filamentoduplo às células de planta ou plantas de uma espécie ou cultivar de Nicotia-na, em que as moléculas de RNA de filamento duplo compreendem duasfitas de RNA, uma fita de RNA consistindo essencialmente em uma seqüên-cia de nucleotídeo de RNA de 19 de 20 a 21 nucleotídeos consecutivos se-lecionada de uma seqüência que codifica uma proteína de XyIT de Nieotianaou o complemento da mesma, a seqüência de nucleotídeo, de preferência,obtenível da espécie ou cultivar de Nieotiana, em que 19 de 20 a 21 nucleo-tídeos consecutivos compreendem pelo menos um aminoácido de XyIT es-pécie ou cultivar de Mcof/ana-específico ou selecionada da seqüência denucleotídeo de um gene de XyIT de Nieotiana ou um cDNA de XyIT de Nieo-tiana ou o complemento do mesmo, a seqüência de nucleotídeo, de prefe-rência, obtenível da espécie ou cultivar de Nieotiana , em que os 19 de 20 a21 nucleotídeos consecutivos compreendem pelo menos um nucleotídeo deXyIT espécie ou cultivar de Mcof/ana-específico; e identificação de uma célu-la de planta ou planta Nieotiana compreendendo a molécula ou moléculas deRNA de filamento duplo as quais têm um menor nível de resíduos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanos ligadas à proteína do que a mesma célula deplanta ou planta Nieotiana a qual não compreende a molécula ou moléculasde RNA de filamento duplo. O RNA de filamento duplo pode ser fornecido àscélulas de planta ou plantas através de integração de um gene quimérico nogenoma de células de planta da espécie ou cultivar de Nicotiana para gerarcélulas de planta transgênicas e, opcionalmente, regeneração das células deplanta para obter plantas transgênicas, o gene quimérico compreendendouma região de DNA compreendendo pelo menos 19 de 20 nucleotídeos con-secutivos selecionados de uma seqüência de nucleotídeo que codifica umaproteína de XyIT de Nicotiana ou o complemento da mesma, a seqüência denucleotídeo, de preferência, obtenível espécie ou cultivar de Nicotiana1 emque os 19 de 20 nucleotídeos consecutivos codificam pelo menos um ami-noácido de XyIT espécie ou cultivar de Nicotiana-espectíico ou selecionadada seqüência de nucleotídeo de um gene de XyIT de Nicotiana ou um cDNAde XyIT de Nieotiana ou o complemento da mesma, a seqüência de nucleo-tídeo, de preferência, obtenível da espécie ou cultivar de Nieotiana, em queos 19 de 20 nucleotídeos consecutivos compreendem pelo menos um nucle-otídeo de XyIT espécie de Nieotiana-específico, em uma orientação sentidoe/ou anti-sentido; operavelmente ligado a um promotor expressível em plan-ta e uma região de DNA compreendendo uma sinal de poliadenilação e tér-mino de transcrição funcional em plantas. O aminoácido ou nucleotídeo deXyIT espécie ou cultivar de específico Nieotiana pode, ser um aminoácido ounucleotídeo de XyIT Nieotiana benthamiana-específtco ou Nieotiana tabaeumcv. Petite Havana SR1-específico, e as espécies ou cultivar, de nieotianapodem de preferência, ser nieotiana benthamiana ou nieotiana tabaeum cv.Petite Havana SR1 respectivamente. A seqüência de nitrogênio que codificauma proteína de XyIT de Nieotiana pode compreender uma seqüência denucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO.: 12 ouSEQ ID NO.: 14 ou a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO.: 4, SEQ IDNO.: 6, SEQ ID NO.: 8 ou SEQ ID NO.: 10 e a seqüência de nucleotídeo dogene de XyIT de Nieotiana pode compreender a seqüência de nucleotídeode SEQ ID NO.: 11, SEQ ID NO.: 13 ou SEQ ID No. 21 ou a seqüência denucleotídeo de SEQ ID NO.: 3, SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 8, SEQ ID NO.:10 ou SEQ IDNO.: 17.

É ainda outro objetivo da invenção proporcionar um método paraidentificar um fragmento de DNA de XyIT de Nicotiana compreendendo asetapas de fornecimento de DNA genômico ou cDNA obtenível de uma espé-cie ou cultivar de Nicotiana, seleção de um meio do seguinte grupo: umfragmento de DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que codi-fica a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO.: 4, SEQ ID NO.: 6, SEQ IDNO.: 8, SEQ ID NO.: 10, SEQ ID NO.: 12 ou SEQ ID NO.: 14, para uso comouma sonda; um fragmento de DNA compreendendo a seqüência de nucleo-tídeo de qualquer uma de SEQ ID NO.: 3, SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 7,SEQ ID NO.: 9, SEQ ID NO.: 11, SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 17 ou SEQID NO.: 21, para uso como uma sonda; um fragmento de DNA ou oligonu-cleotídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeo consistindo ementre 20 a 1513 nucleotídeos consecutivos selecionados de uma seqüênciade nucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO.: 4 ouSEQ ID NO.: 6 para uso como uma sonda; um fragmento de DNA ou oligo-nucleotídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeo consistindo ementre 20 a 3574 nucleotídeos consecutivos selecionados de uma seqüênciade nucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO.: 8,SEQ ID NO.: 10, SEQ ID NO.: 12 ou SEQ ID NO.: 14 para uso como umasonda; um fragmento de DNA ou oligonucleotídeo compreendendo uma se-qüência de nucleotídeo consistindo em entre 20 a 3574 nucleotídeos conse-cutivos selecionada de uma seqüência de nucleotídeo de qualquer uma deSEQ ID NO.: 3, SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 7, SEQ ID NO.: 9, SEQ ID NO.:11, SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 17 ou SEQ ID NO.: 21 para uso comouma sonda; uma seqüência de oligonucleotídeo tendo uma seqüência denucleotídeo compreendendo entre 20 a 200 nucleotídeos consecutivos sele-cionada de uma seqüência de nucleotídeo que codifica a seqüência de ami-noácido de SEQ ID NO.: 4 ou SEQ ID NO.: 6, para uso como um iniciadorem uma reação de PCR; uma seqüência de oligonucleotídeo tendo uma se-qüência de nucleotídeo compreendendo entre 20 a 200 nucleotídeos conse-cutivos selecionada de uma seqüência de nucleotídeo que codifica a se-qüência de aminoácido de SEQ ID NO.: 8, SEQ ID NO.: 10, SEQ ID NO.: 12ou SEQ ID NO.: 14 , para uso como um iniciador em uma reação de PCR;uma seqüência de oligonucleotídeo tendo uma seqüência de nucleotídeocompreendendo entre 20 a 200 nucleotídeos consecutivos selecionada daseqüência de nucleotídeo de qualquer uma de SEQ ID NO.: 3, SEQ ID NO.:5, SEQ ID NO.: 7, SEQ ID NO.: 9, SEQ ID NO.: 11, SEQ ID NO.: 13, SEQ IDNO.: 17 ou SEQ ID NO.: 21, para uso como um iniciador em uma reação dePCR; ou um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo de qualqueruma de SEQ ID NO.: 1, SEQ ID NO.: 2, SEQ ID NO.: 15 ou SEQ ID NO.: 16,SEQ ID NO.: 19 ou SEQ ID NO.: 20 para uso como um iniciador em umareação de PCR; e utilização desse meio para identificar um fragmento deDNA de XyIT da espécie ou cultivar de Nicotiana realizando uma PCR usandoo DNA genômico ou o cDNA e os iniciadores ou realizando hibridização u-sando o DNA genômico ou cDNA e as sondas. O fragmento identificado po-de, subseqüentemente, ser isolado e usado para obter uma célula de plantaou planta Nicotiana tendo um baixo nível de resíduos de beta-1,2-xilose so-bre N-glicanos ligadas à proteína.

A invenção também proporciona um método para identificar umalelo de XyIT de Nicotiana correlacionado a um baixo nível de resíduos debeta-1,2-xilose sobre N-glicanos ligadas à proteína compreendendo as eta-pas de fornecimento de uma população, opcionalmente uma população commutação, de diferentes linhagens de planta de uma espécie ou cultivar deNicotiana-, identificação, em cada linhagem de planta, da população de umalelo de XyIT de Nicotiana de acordo com o método descrito acima; análisedo nível de resíduos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanos ligadas à proteínade cada linhagem de planta da população e identificação daquelas linhagensde planta tendo um menor nível de resíduos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanos ligadas à proteína do que outras linhagens de planta; e correlaçãodo baixo nível de resíduos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanos ligadas à pro-teína em uma linhagem de planta à presença de um alelo de beta-1,2-xiloseNicotiana-especíüco. O alelo de XyIT de Nicotiana pode ser introduzido emuma célula de planta ou planta Nicotiana de escolha para obter uma célulade planta ou planta Nicotiana com um baixo nível de resíduos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanos ligadas à proteína.É ainda outro objetivo da invenção proporcionar: um fragmentode DNA isolado que codifica uma proteína compreendendo a seqüência deaminoácido SEQ ID NO.: 12 ou SEQ ID NO.: 14 ou qualquer parte da mes-ma que codifica pelo menos um aminoácido de XyIT Nicotiana benthamiana-específico; um fragmento de DNA isolado compreendendo a seqüência denucleotídeo of SEQ ID NO.: 11, SEQ ID NO.: 13 ou SEQ ID NO.: 21 ou qual-quer parte da'mesma compreendendo pelo menos um nucleotídeo de XyITNicotiana benthamiana-específico; um fragmento de DNA isolado que codifi-ca uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ IDNO.: 4 ou SEQ ID NO.: 6, SEQ ID NO.: 8, SEQ ID NO.: 10 ou qualquer parteda mesma que codifica pelo menos um aminoácido de XyIT Nicotiana taba-cum cv. Petite Havana SR1-específico; um fragmento de DNA isolado com-preendendo a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO.: 3 ou SEQ ID NO.:5, SEQ ID NO.: 7, SEQ ID NO.: 9 ou SEQ ID NO.: 17 ou qualquer parte damesma compreendendo pelo menos um nucleotídeo de XyIT Nieotiana taba-cum cv. Petite Havana SR1 -específico.

A invenção ainda proporciona um gene quimérico compreen-dendo os fragmentos de DNA operavelmente ligados: um promotor expres-sível em planta; uma região de DNA passível de transcrição compreendendouma primeira região de DNA compreendendo pelo menos 19 de 20 nucleotí-deos consecutivos selecionados de uma seqüência de nucleotídeo que codi-fica uma proteína de XyIT de Nieotiana ou o complemento da mesma, emque os 19 de 20 nucleotídeos consecutivos codificam pelo menos um ami-noácido de XyIT espécie ou cultivar de Nieotiana-específico ou selecionadada seqüência de nucleotídeo de um gene de XyIT de Nieotiana ou um cDNAde XyIT de Nieotiana ou o complemento da mesma, em que os 19 de 20 nu-cleotídeos consecutivos compreendem pelo menos um nucleotídeo de XyITespécie de Nieotiana-específico, na orientação anti-sentido; uma segundaregião de DNA compreendendo pelo menos 19 de 20 nucleotídeos consecu-tivos selecionados de uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma prote-ína de XyIT de Nieotiana ou o complemento da mesma, em que os 19 de 20nucleotídeos consecutivos codificam peto menos um aminoácido de XyITespécie ou cultivar de Nicotiana-específico ou selecionada da seqüência denucleotídeo de um gene de XyIT de Nicotiana ou um cDNA de XyIT de Nico-tiana ou o complemento da mesma, em que os 19 de 20 nucleotídeos con-secutivos compreendem pelo menos um nucleotídeo de XyIT espécie de Ni-cotiana-específico, na orientação sentido, pelo que uma molécula de RNAproduzida através de transcrição da região de DNA passível de transcrição écapaz de formar uma região de DNA de filamento duplo através de empare-Ihamento de base pelo menos entre uma região de RNA correspondendo àprimeira região de DNA e uma região de RNA correspondendo à segundaregião de DNA; e uma região de DNA compreendendo a um sinal de polia-denilação e término de transcrição funcional em planta. O gene quiméricotambém pode compreender um promotor expressível em planta; uma regiãode DNA compreendendo pelo menos 19 de 20 nucleotídeos consecutivosselecionados de uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma proteínade XyIT de Nicotiana ou o complemento da mesma, em que os 19 de 20 nu-cleotídeos consecutivos codificam pelo menos um aminoácido de XyIT espé-cie ou cultivar de Mcof/ana-específico ou selecionada da seqüência de nu-cleotídeo de um gene de XyIT de Nicotiana ou um cDNA de XyIT de Nieotia-na ou o complemento da mesma, em que os 19 de 20 nucleotídeos consecu-tivos compreendem pelo menos um nucleotídeo de XyIT espécie de Nieotia-na-específico, na orientação sentido ou anti-sentido; e uma região de DNAcompreendendo um sinal de poliadenilação e término de transcrição funcio-nal em plantas.

Células de planta Nieotiana compreendendo tais genes quiméri-cos e plantas Nieotiana consistindo essencialmente em tais células de plantaNieotiana, bem como sementes da mesma são também proporcionadas pelainvenção.

A invenção também se refere ao uso de uma seqüência de nu-cleotídeo que codifica uma proteína compreendendo a seqüência de amino-ácido de SEQ ID NO.: 4, SEQ ID NO.: 6, SEQ ID NO.: 8, SEQ ID NO.: 10,SEQ ID NO.: 12 ou SEQ ID NO.: 14 ou qualquer parte da mesma compreen-dendo pelo menos 19 de 20 nucleotídeos consecutivos que codificam pelomenos um aminoácido de XyIT espécie ou cultivar de Nicotiana-específico,para diminuir o nível de resíduos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanos ligadasà proteína em uma planta Nicotiana ou ao uso de uma seqüência de nucleo-tídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO.: 3, SEQID NO.: 5, SEQ ID NO.: 7, SEQ ID NO.: 9, SEQ ID NO.: 11, SEQ ID NO.: 13,SEQ ID NO.: 17 ou SEQ ID NO.: 21 ou qualquer parte da mesma compreen-dendo pelo menos 19 de 20 nucleotídeos consecutivos compreendendo pelomenos um nucleotídeo de XyIT espécie ou cultivar de Nicotiana-e specífico,para diminuir o nível de resíduos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanos ligadasà proteína em uma planta Nicotiana, para identificar um gene de XyIT oucDNA de XyIT em uma espécie ou cultivar de Nicotiana, para identificar umalelo de um gene XyIT correlacionado a um baixo nível de resíduos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanos ligadas à proteína em uma espécie ou cultivar deNicotiana ou para introduzir um alelo de um gene XyiT correlacionado a umbaixo nível de resíduos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanos ligadas à proteí-na em uma espécie ou cultivar de Nicotiana.

Com os objetivos precedentes e outros, vantagens e caracterís-ticas da invenção que se tornarão aqui depois evidentes, a natureza da in-venção pode ser mais claramente compreendida através de referência àdescrição detalhada a seguir de diferentes modalidades da invenção, às rei-vindicações em anexo e às figuras.

Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 é um alinhamento de DNA global (baseado na matrizde escore linear padrão com os seguintes parâmetros: penalidade por com-binação errônea = 2, penalidade por abertura de gap = 4 e penalidade porextensão de gap = 1) entre uma seqüência de cDNA de Nicotiana tabacumcv. Xanthi que codifica uma proteína de XyIT putativa (número de acessoAJ627182; SEQ ID NO: 23) e duas diferentes seqüências de cDNA de XyITisoladas de Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1 (SEQ ID NO: 3 e 5).

Os pontos representam nucleotídeos nas seqüências de cDNA de Nicotianatabacum cv. Petite Havana SR1 que são idênticas aos nucleotídeos corres-pondentes na seqüência de cDNA de Nicotiana tabacum cv. Xanthi; as Ii-nhas tracejadas representam a ausência de nucleotídeos nas seqüências decDNA de Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1 correspondendo aosnucleotídeos na seqüência de cDNA de Nicotiana tabacum cv. Xanthi.

A Figura 2 é um alinhamento de proteína global (baseado namatriz de escore blossum 62) entre a proteína de XyIT putativa codificadapela seqüência de cDNA de Nicotiana tabacum cv. Xanthi (número de aces-so AJ627182; SEQ ID NO: 24) e por duas seqüências de cDNA de XyIT dife-rentes isoladas de Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1 (SEQ ID NO: 4e 6). Os pontos representam aminoácidos nas seqüências de proteína deNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1 que são idênticas aos aminoáci-dos correspondentes na seqüência de proteína de Nicotiana tabacum cv.Xanthi; as linhas tracejadas representam a ausência de aminoácidos nasseqüências de proteína de Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1 cor-respondendo aos aminoácidos na seqüência de proteína de Nicotiana taba-cum cv. Xanthi.

A Figura 3 é um alinhamento de DNA global (baseado na matrizde escore linear padrão com os seguintes parâmetros: penalidade por com-binação errônea = 2, penalidade por abertura de gap = 4 e penalidade porextensão de gap = 1) entre a seqüência de DNA genômico de Nicotiana ta-bacum cv. Xanthi que codifica uma proteína de XyIT putativa (número deacesso AJ627183; SEQ ID NO: 25) e duas diferentes seqüências de DNAgenômico de XyIT isoladas de Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1(SEQ ID NOs: 7 e 9) e duas diferentes seqüências de DNA genômico de X-ylT na isoladas de Nicotiana benthamiana (SEQ ID NO: 11 e 13). Os pontosrepresentam nucleotídeos nas seqüências de DNA genômico de Nicotianatabacum cv. Petite Havana SR1 que são idênticas aos nucleotídeos corres-pondentes na seqüência de DNA genômico de Nicotiana tabacum cv. Xanthi;a linha tracejada representa a ausência de nucleotídeos nas seqüências deDNA genômico de Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1 corresponden-do aos nucleotídeos na seqüência de DNA genômico de Nicotiana tabacumcv. Xanthi.

A Figura 4 é um alinhamento de proteína global (baseado namatriz de escore blossum 62) entre a proteína de XyIT putativa codificadapela seqüência de DNA genômico de Nicotiana tabacum cv. Xanthi (númerode acesso AJ627183; SEQ ID NO: 26) e por duas diferentes seqüências deDNA genômico de XyIT isoladas de Nicotiana tabacum cv. Petite HavanaSR1 (SEQ ID NO: 8 e 10) e por duas diferentes seqüências de DNA genômi-co isoladas de Nicotiana benthamiana (SEQ ID NO: 12 e 14). Os pontos re-presentam aminoácidos nas seqüências de proteína de Nieotiana tabacumcv. Xanthi; a linha tracejada representa a ausência de aminoácidos nas se-qüências de proteína de Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1 corres-pondendo aos aminoácidos na seqüência de proteína de Nicotiana tabacumcv. Xanthi.

Descrição Detalhada de Diferentes Modalidades da Invenção

A presente invenção é baseada na descoberta de que genes deXyIT e cDNAs de XyIT de espécies e cultivares de Nieotiana, particularmenteNicotiana benthamiana e Nieotiana tabacum cv. Petite Havana SR1, são ex-celentes seqüências de nucleotídeo fonte para obter plantas dessas espé-cies e cultivares de Nieotiana, particularmente plantas Nieotiana benthamia-na e plantas Nieotiana tabacum cv. Petite Havana SR1, respectivamente,tendo um baixo nível de resíduos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanos ligadasà proteína, por exemplo, através de modificação da atividade de gene(s) en-dógeno(s) de XyIT de Nieotiana, através de troca de um gene de XyIT deNieotiana endógeno por outro alelo do gene de XyIT de Nieotiana o qual pro-porciona um baixo nível de resíduos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanos li-gadas à proteína ou através de qualquer combinação dos mesmos.

Em uma modalidade, a invenção é relacionada a um métodopara obtenção de uma célula de planta ou planta Nieotiana tendo um baixonível de resíduos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanos ligadas à proteína a-través de redução da expressão do(s) gene(s) de XyIT endógeno na célulade planta ou planta Nieotiana através de fornecimento de uma ou mais mo-léculas de RNA de silenciamento às células de planta ou plantas de umaespécie ou cultivar de Nieotiana, em que as moléculas de RNA de silencia-mento compreendem uma parte de uma seqüência de nucleotídeo que codi-fica uma proteína de XyIT de Nicotiana, de preferência obtida da referidaespécie ou cultivar de Nicotiana, em que a referida parte codifica pelo menosum aminoácido de XyIT espécie ou cultivar de Nicotiana-específico ou emque as moléculas de RNA de silenciamento compreendem uma parte deuma seqüência de nucleotídeo de um gene de XyIT de Nicotiana ou um cD-NA de XyIT de Nicotiana, de preferência obtida da referida espécie ou culti-var de Nicotiana, em que a referida parte compreende pelo menos um nu-cleotídeo de XyIT espécie ou cultivar de Nicotiana-especlVico.

Conforme usado aqui, "RNA de silenciamento" ou "molécula deRNA de silenciamento" se refere a qualquer molécula de RNA a qual, quan-do de introdução de uma célula de planta, reduz a expressão de um gene-alvo. Tal RNA de silenciamento pode, por exemplo, ser o assim denominado"RNA anti-sentido", pelo que a molécula de RNA compreende uma seqüên-cia de pelo menos 20 nucleotídeos consecutivos tendo 95% de identidade deseqüência ao complemento da seqüência do ácido nucléico alvo, de prefe-rência a seqüência de codificação do gene-alvo. Contudo, RNA anti-sentidotambém pode ser dirigido à seqüências regulatórias de genes alvo, incluindoas seqüências promotoras e sinais de poliadenilação e término de transcri-ção. RNA de silenciamento ainda inclui o assim denominado "RNA sentido",pelo que a molécula de RNA compreende uma seqüência de pelo menos 20nucleotídeos consecutivos tendo 95% de identidade de seqüência à seqüên-cia do ácido nucléico alvo. Outro RNA de silenciamento pode ser "RNA não-poliadenilado" compreendendo pelo menos 20 nucleotídeos consecutivostendo 95% de identidade de seqüência ao complemento da seqüência doácido nucléico alvo, tal como descrito no W001/12824 ou US6423885 (am-bos os documentos sendo aqui incorporados por referência). Ainda outro tipode RNA de silenciamento é uma molécula de RNA conforme descrito noW003/076619 (aqui incorporado por referência) compreendendo pelo menos20 nucleotídeos consecutivos tendo 95% de identidade de seqüência à se-qüência do ácido nucléico alvo ou ao complemento da mesma e ainda com-preendendo uma região grandemente fita dupla conforme descrito noW003/076619 (incluindo regiões grande de fita dupla compreendendo umsinal de localização nuclear de um viróide do tipo viróide do tubérculo de fu-so da batata ou compreendendo repetições de trinucleotídeo CUG). RNA desilenciamento também pode ser RNA de filamento duplo compreendendouma fita sentido e anti-sentido conforme definido aqui, em que a fita sentidoe anti-sentido são capazes de emparelhamento de base uma com a outrapara formar uma região de RNA de filamento duplo (de preferência, os refe-ridos pelo menos 20 nucleotídeos consecutivos do RNA sentido e anti-sentido são complementares uns aos outros). A região sentido e anti-sentidopode também estar presente dentro de uma molécula de RNA, tal como umRNA em gancho, hairpin (hpRNA) pode ser formado quando a região sendoe anti-sentido forma uma região de RNA de filamento duplo. hpRNA é bem-conhecido dentro da técnica (vide, por exemplo, W099/53050, aqui incorpo-rado por referência). O hpRNA pode ser classificado como hpRNA longo,tendo regiões sentido e anti-sentido longas as quais podem ser grandementecomplementares, mas não precisam ser totalmente complementares (tipica-mente, mais longa do que cerca de 200 bp, oscilando entre 200-1000 bp).hpRNA também pode ser menor oscilando, quanto ao tamanho, de cerca de30 a cerca de 42 bp, mas não mais longo do que 94 bp (vide W004/073390,aqui incorporado por referência). RNA de silenciamento pode também podeser molécula de micro-RNA artificiais conforme descrito, por exemplo, noW02005/052170, W02005/047505 ou US 2005/0144667 (todos os docu-mentos incorporados aqui por referência).

Em outra modalidade, as moléculas de RNA de silenciamentosão fornecidas à célula de planta ou planta da espécie ou cultivar de Nicotia-na através de produção de uma célula de planta ou planta transgênica daespécie ou cultivar de Nicotiana compreendendo um gene quimérico capazde produzir uma molécula de RNA de silenciamento, particularmente umamolécula de RNA de filamento duplo ("dsRNA"), em que a fita de RNA com-plementar de tal molécula de dsRNA compreende uma parte de uma se-qüência de nucleotídeo que codifica uma proteína de XyIT de Nicotiana, depreferência obtida da referida espécie ou cultivar de Nicotiana, em que a re-ferida parte codifica pelo menos um aminoácido de XyIT espécie ou cultivarde Nicotiana-específico ou em que a fita de RNA complementar de tal molé-cula de dsRNA compreende uma parte de uma seqüência de nucleotídeo deum gene de XyIT de Nicotiana ou um cDNA de XyIT de Nicotiana, de prefe-rência obtido da referida espécie ou cultivar de Nicotiana, em que a referidaparte compreende pelo menos uma nucleotídeo de XyIT espécie ou cultivarde Nicotiana-e specífico.

"Nicotiana", conforme usado aqui, inclui todas as espécies deNicotiana conhecidas tais como, mas não limitado a, Nicotiana acauiis, N.acuminata, N. africana, N. alata, N. ampiexicaulis, N. arentsii, N. attenuata,N. benavidesii, N. benthamiana, N. bigeiovii, N. bonariensis, N. cavicola, N.cievelandii, N. cordifoiia, N. corymbosa, N. debneyi, N. exceisior, N. forgetia-na, N. fragrans, N. glauca, N. glutinosa, N. goodspeedii, N. gossei, N. hybrid,N. inguiba, N. kawakamii, N. knightiana, N. iangsdorffii, N. iinearis, N. Iongi-flora, N. marítima, N. megalosiphon, N. miersii, N. noctiflora, N. nudicaulis, N.obtusifolia, N. occidentalis, N. otophora, N. paniculata, N. pauciflora, N. petu-nioides, N. plumbaginifolia, N. quadrivalvis, N. raimondii, N. repanda, N. ro-sulata, N. rotundifolia, N. rústica, N. setchellii, N. simulans, N. solanifolia, N.spegazzinii, N. stocktonii, N. suaveolens, N. sylvestris, N. tabacum, N. thyrsi-flora, N. tomentosa, N. tomentosiformis, N. trigonophylla, N. umbratica, N.undulata, N. velutina, N. wigandioides e Nicotiana χ sandera e todos os culti-vares conhecidos de Nicotiana tais como, mas não limitado a Nicotiana ta-bacum, tal como cv. Burley21, cv. Delgold, cv. Petit Havana, cv. Petit Hava-na SR1, cv. Samsun e cv. Xanthi.

Nicotiana tabacum, a qual é o tabaco comum, é uma espéciehíbrida tetraplóide, a qual se originou das espécies diplóides Nicotiana syl-vestris e Nicotiana tomentosiformis.

Um gene de XyIT de Nicotiana ou um cDNA de XyIT de Nicotia-na se refere a uma seqüência de nucleotídeo de um gene de XyIT que ocor-re naturalmente em uma espécie ou cultivar de Nicotiana ou a um cDNA cor-respondendo ao mRNA de um gene de XyIT que ocorre naturalmente emuma espécie ou cultivar de Nicotiana . Similarmente, uma proteína de XyITde Nicotiana se refere a uma proteína conforme ela ocorre naturalmente emuma espécie ou cultivar de Nicotiana.

Exemplos de seqüências de nucleotídeo que codificam uma pro-teína de XyIT de Nicotiana incluem aquelas obtidas de Nicotiana benthamia-na que codificam a seqüência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO.:12 ou SEQ ID NO.: 14 e aquelas obtidas de Nicotiana tabacum cv. PetiteHavana SR1 que codificam a seqüência de aminoácido apresentada emSEQ ID NO.: 4, SEQ ID NO.: 6, SEQ ID NO.: 8 ou SEQ ID NO.: 10.

Exemplos de seqüências de nucleotídeo que codificam um genede XyIT de Nicotiana incluem aquelas obtidas de Nicotiana benthamianacompreendendo a seqüência de nucleotídeo apresentada em SEQ ID NO.:11, SEQ ID NO.: 13 ou SEQ ID NO.: 21 e aquelas obtidas de Nicotiana taba-cum cv. Petite Havana SR1 compreendendo a seqüência de nucleotídeoapresentada em SEQ ID NO.: 7 ou SEQ ID NO.: 9.

Exemplos de seqüências de nucleotídeo de um cDNA de XyITde Nicotiana incluem aquelas obtidas de Nicotiana tabacum cv. Petite Hava-na SR1 compreendendo a seqüência de nucleotídeo apresentada em SEQID NO.: 3, SEQ ID NO.: 5 ou SEQ ID NO.: 17.

Contudo, será imediatamente claro para aqueles versados natécnica que as seqüências de nucleotídeo exemplificadas ou partes dasmesmas podem ser usadas para identificar outras seqüências de nucleotí-deo de genes de XyIT de Nicotiana ou cDNAs de XyIT de Nicotiana em es-pécies ou cultivares de Nicotiana e que tais seqüências de nucleotídeo oupartes das mesmas podem também ser usadas, por exemplo, para diminuiro nível de resíduos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanos ligadas à proteínaem plantas Nicotiana . As seqüências de nucleotídeo exemplificadas poderi-am ser usadas para selecionar:

i) um fragmento de DNA compreendendo uma seqüência de nu-cleotídeo que codifica a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO.: 4, SEQID NO.: 6, SEQ ID NO.: 8, SEQ ID NO.: 10, SEQ ID NO.: 12 ou SEQ ID NO.:14, para uso como uma sonda;

ii) um fragmento de DNA compreendendo a seqüência de nucle-otídeo de qualquer uma de SEQ ID NO.: 3, SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 7,SEQ ID NO.: 9, SEQ ID NO.: 11, SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 17 ou SEQID NO.: 21, para uso como uma sonda;

iii) um fragmento de DNA ou oligonucleotídeo compreendendouma seqüência de nucleotídeo consistindo em entre 20 a 1513 nucleotídeosconsecutivos selecionados de uma seqüência de nucleotídeo que codifica aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO.: 4 ou SEQ ID NO.: 6, para usocomo uma sonda;

iv) um fragmento de DNA ou oligonucleotídeo compreendendouma seqüência de nucleotídeo consistindo em entre 20 to 3574 nucleotídeosconsecutivos selecionados de uma seqüência de nucleotídeo que codifica aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO.: 8, SEQ ID NO.: 10, SEQ ID NO.:12 ou SEQ ID NO.: 14 , para uso como uma sonda;

v) um fragmento de DNA ou oligonucleotídeo compreendendouma seqüência de nucleotídeo consistindo em entre 20 a 3574 nucleotídeosconsecutivos selecionados de uma seqüência de nucleotídeo de qualqueruma de SEQ ID NO.: 3, SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 7, SEQ ID NO.: 9, SEQID NO.: 11, SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 17 ou SEQ ID NO.: 21, para usocomo uma sonda;

vi) uma seqüência de oligonucleotídeo tendo uma seqüência denucleotídeo compreendendo entre 20 a 200 nucleotídeos consecutivos sele-cionados de uma seqüência de nucleotídeo que codifica a seqüência de a-minoácido de SEQ ID NO.: 4 ou SEQ ID NO.: 6, para uso como um iniciadorem uma reação de PCR;

vii) uma seqüência de oligonucleotídeo tendo uma seqüência denucleotídeo compreendendo entre 20 a 200 nucleotídeos consecutivos sele-cionados de uma seqüência de nucleotídeo que codifica a seqüência de a -minoácido de SEQ ID NO.: 8, SEQ ID NO.: 10, SEQ ID NO.: 12 ou SEQ IDNO.: 14 , para uso como um iniciador em uma reação de PCR;

viii) uma seqüência de oligonucleotídeo tendo uma seqüência denucleotídeo compreendendo entre 20 a 200 nucleotídeos consecutivos sele-cionada da seqüência de nucleotídeo de qualquer uma de SEQ ID NO.: 3,SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 7, SEQ ID NO.: 9, SEQ ID NO.: 11, SEQ IDNO.: 13, SEQ ID NO.: 17 ou SEQ ID NO.: 21, para uso como um iniciadorem uma reação de PCR; ou

ix) um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo dequalquer uma de SEQ ID NO.: 1, SEQ ID NO.: 2, SEQ ID NO.: 15 ou SEQ IDNO.: 16, SEQ ID NO.: 19 ou SEQ ID No.20 para uso como um iniciador emuma reação de PCR.

Realizando uma PCR usando DNA genômico ou cDNA de espé-cies ou cultivares de Nicotiana e os oligonucleotídeos mencionados comoiniciadores ou realizando hibridização, de preferência sob condições estri-gentes entre o DNA genômico ou cDNA de espécies e cultivares de Nieotia-na e as sondas mencionadas, esses outros genes de XyIT de Nicotiana oucDNAs de XyIT de Nicotiana ou fragmentos dos mesmos podem ser identifi-cados e/ou isolados.

"Condições de hibridização estringentes", conforme usado aqui,significa que hibridização geralmente ocorrerá se há pelo menos 95% e, depreferência, pelo menos 97% de identidade de seqüência entre a sonda e aseqüência-alvo. exemplos de condições de hibridização estringente são in-cubação durante a noite em uma solução compreendendo formamida a 50%,5 χ SSC (NaCI a 150 mM, citrato trissódico a 15 mM), fosfato de sódio a 50mM (pH de 7,6), 5x solução de Denhardt, sulfato de dextrana a 10% e 20μg/ml de DNA veículo cisalhado, desnaturado, tal como DNA de esperma desalmão, seguido por lavagem do suporte de hibridização em 0,1 χ SSC aaproximadamente 65°C, por exemplo, durante cerca de 10 min. (duas ve-zes). Outras condições de hibridização e lavagem são bem-conhecidas eexemplificadas em Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Ma-nual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor, NY (1989), particularmente capí-tulo 11.

Um nucleotídeo de XyIT espécie de Nicotiana-específico" ou um"nucleotídeo de XyIT cultivar de Mcof/ana-específico" se refere a um nucleo-tídeo de uma seqüência de nucleotídeo de um gene de XyIT ou um cDNA deXyIT de uma espécie ou cultivar de Nieotiana que difere de ou não está pre-sente na seqüência de nucleotídeo correspondente do gene de XyIT de Ni-cotiana tabacum cv. Xanthi representada em SEQ ID NO: 25 ou do cDNA deXyIT de Nicotiana tabacum cv. Xanthi representada em SEQ ID NO: 23, res-pectivamente.

Um "aminoácido de XyIT espécie de Nicotiana-específico" ou um"aminoácido de XyIT cultivar de Nicotiana-especíüco" se refere a um amino-ácido da seqüência de aminoácido de uma proteína de XyIT codificada porum gene de XyIT ou codificada por um cDNA de XyIT de uma espécie oucultivar de Nicotiana que difere de ou não está presente na seqüência deaminoácido da proteína de XyIT codificada pelo gene de XyIT de Nicotianatabacum cv. Xanthi representada em SEQ ID NO: 26 ou codificada pelo cDNAde XyIT de Nicotiana tabacum cv. Xanthi representada em SEQ ID NO: 24,respectivamente.

Para determinar a presença de um nucleotídeo ou aminoácidode XyIT espécie ou cultivar de Nicotiana-específtco em uma seqüência denucleotídeo de um gene de XyIT ou um cDNA de XyIT de uma espécie oucultivar de Nicotiana ou na seqüência de aminoácido de uma proteína deXyIT codificada por um gene de XyIT ou codificada por um cDNA de XyIT deuma espécie ou cultivar de Nieotiana, para fins da presente invenção, as se-qüências de nucleotídeo ou aminoácido de XyIT da espécie ou cultivar deNieotiana são comparadas com as seqüências de nucleotídeo ou aminoáci-do de XyIT correspondentes de Nieotiana tabacum cv. Xanthi através de ali-nhamento das seqüências usando um procedimento de alinhamento global(para seqüências de nucleotídeo, a matriz de escore de ausência usada é"linear-padrão" com penalidade por combinação errônea = 2, penalidade porabertura de gap = 4 e penalidade por extensão de gap = 1. Para seqüênciasde proteína, a matriz de escore de ausência é "blossum 62"; Henikoff e He-nikoff, 1992). Para realizar o alinhamento, o programa Align Plus (fornecidopela Scientific & Educational Software, EUA) pode ser usado.

Um exemplo de tal alinhamento de DNA global é o alinhamentode DNA global da seqüência de cDNA de XyIT de Nieotiana tabacum cv.Xanthi representada em SEQ ID NO: 23, com as seqüências de cDNA deXyIT de Nieotiana tabacum cv. Petite Havana SR1 representadas em SEQID NO: 3 e 5, na Figura 1. exemplos de nucleotídeos de XyIT Nicotiana taba-cum cv. Petite Havana SR1-específicos baseado nesse alinhamento globalde DNA incluem:

- o nucleotídeo nas posições 1041, 1323, 1332 ou 1421 de SEQID NO: 3,

- o nucleotídeo nas posições 62, 76, 87, 104, 117, 122, 139, 140,148, 155, 169, 190, 199, 202, 212, 213, 216, 265, 287, 294, 316, 373, 385,388, 430, 554, 607, 628, 643, 838, 892, 897, 898, 941, 1005, 1021, 1039 ou1495 de SEQ ID NO: 5.

Outro exemplo de tal alinhamento de DNA global é o alinhamen-to de DNA global da seqüência do gene de XyIT de Nicotiana tabacum cv.Xanthi representada em SEQ ID NO: 25 com as seqüências do gene de XyITde Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1 representadas em SEQ ID NO:7 e 9 e com as seqüências do gene de XyIT de Nicotiana benthamiana re-presentadas em SEQ ID NO: 11 e 13, na Figura 3. exemplos de nucleotí-deos de XyIT de Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1-específicos de-terminados baseado nesse alinhamento global de DNA incluem:

- o nucleotídeo nas posições 61, 75, 86, 100-120, 124, 137, 142,159, 160, 168, 175, 189, 210, 219, 222, 232, 233, 236, 285, 307, 314, 336,393, 405, 408, 450, 574, 627, 648, 663, 692, 698, 702, 721, 754, 802, 821,842, 852, 856, 901, 903, 906, 907, 908, 917, 927, 928, 930, 931, 960, 961,965, 974, 977, 981, 983, 986, 1001, 1019, 1027, 1029, 1034, 1068, 1073,1099, 1120, 1129, 1144, 1154, 1158, 1181, 1193, 1208, 1212, 1228, 1230,1239, 1275, 1313-1316, 1348, 1353, 1357, 1384, 1386, 1496, 1531, 1571,1601, 1629, 1681, 1696, 1698, 1730, 1754, 1761, 1772, 1789, 1800, 1802,1811, 1814, 1815, 1855-1861, 1929, 2172, 2190, 2322, 2324, 2328, 2353,2354, 2391, 2404, 2419, 2428, 2429, 2433, 2434, 2459, 2464, 2478, 2479,2481, 2484, 2512, 2540-2590, 2595, 2604, 2606, 2630, 2633, 2638, 2670,2673, 2680, 2695, 2698, 2710, 2711, 2752, 2806, 2811, 2812, 2855, 2919,2953, 2966, 3217, 3226, 3229 ou 3232 de SEQ ID NO: 7,

- o nucleotídeo nas posições 553, 606, 627, 642, 671, 677, 681,700, 733, 781, 800, 821, 831, 835, 880, 882, 885, 886, 887, 896, 906, 907,909, 910, 939, 940, 944, 953, 956, 960, 962, 965, 980, 998, 1006, 1008,1013, 1047, 1052, 1078, 1099, 1108, 1123, 1133, 1137, 1160, 1172, 1187,1191, 1207, 1209, 1218, 1254, 1292, 1293, 1294, 1295, 1327, 1332, 1336,1363, 1365, 1475, 1510, 1550, 1580, 1608, 1660, 1675, 1677, 1709, 1733,1740, 1751, 1768, 1779, 1781, 1790, 1793, 1794, 1834-1840, 1908, 2151,2169, 2301, 2303, 2307, 2332, 2333, 2370, 2383, 2398, 2407, 2408, 2412,2413, 2438, 2443, 2457, 2458, 2460, 2463, 2491, 2519-2569, 2574, 2583,2585, 2609, 2612, 2617, 2649, 2652, 2659, 2674, 2677, 2689, 2690, 2731,2785, 2790, 2791, 2834, 2898, 2932, 2945, 3196 ou 3205 de SEQ ID NO: 9.

Exemplos de nucleotídeos de XyIT Nicotiana benthamiana-espe-cíficos determinados baseado nesse alinhamento global de DNA incluem:

- o nucleotídeo nas posições 71, 72, 75, 77, 86, 90, 104, 116,147, 158, 212, 222, 246, 264, 286, 317, 321, 345, 402, 472, 479, 488, 526,552, 612, 637, 668, 669, 670, 701, 726, 734, 742, 747, 773, 785, 795, 796,802, 831, 871, 872, 874, 888, 897, 898, 899, 901, 902, 927, 931, 932, 1039,1044, 1047, 1080, 1091, 1103, 1104, 1113, 1118, 1131, 1134, 1145, 1152,1164, 1179, 1183, 1199, 1201, 1206, 1227, 1286, 1287, 1288, 1289, 1296,1301, 1317, 1328, 1332, 1347, 1376, 1388, 1424, 1429, 1458, 1464, 1510,1517, 1534, 1559, 1672, 1675, 1676, 1677, 1693, 1705, 1719, 1750, 1757,1761, 1765, 1832, 1838, 1862, 1872, 1877, 1978, 2010, 2074, 2111, 2115,2227, 2251, 2259, 2271, 2283, 2296, 2297, 2341, 2348, 2361, 2370, 2371,2375, 2384, 2401, 2404, 2406, 2495, 2497, 2521, 2529, 2561, 2607, 2701,2777, 2822, 2843, 2856, 2867, 3020, 3052, 3053, 3116, 3143 ou 3227 deSEQ ID NO: 11

- o nucleotídeo nas posições 77, 107, 203, 297, 312, 399, 449,469, 489, 492, 496, 529, 538, 566, 573, 633, 661, 662, 666, 671, 683, 690,699, 723, 763, 774, 784, 785, 791, 861, 877, 886, 887, 888, 890, 891, 920,921, 943, 996, 1015, 1034, 1116, 1190, 1226, 1277-1280, 1282, 1287, 1331,1343, 1360, 1386-1651, 1672, 1689, 1738, 1770, 1791, 1813, 1820, 1822,1831, 1832, 1862, 1869, 1874, 1882, 1893, 1906, 1935, 1945, 1956, 1988,2007, 2033, 2034, 2045, 2049, 2050, 2167, 2198, 2280, 2299, 2315, 2355,2392, 2413, 2428, 2442, 2464, 2468, 2477, 2493, 2522, 2544, 2548, 2573,2574, 2639, 2648, 2649, 2653, 2655, 2659, 2679, 2684, 2740, 2773, 2775,2781, 2796, 2799, 2807, 2816, 2839, 2857, 2975, 2977, 2990, 3053, 3071,3083, 3119, 3132, 3265, 3311 ou 3392 de SEQ ID NO: 13.

Um exemplo de tal alinhamento de proteína global é o alinha-mento de proteína global da seqüência de proteína de XyIT codificada pelaseqüência de cDNA de XyIT de Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1representada em SEQ ID NO: 24 com as seqüências de proteína de XyITcodificadas pelas seqüências de cDNA de XyIT de Nicotiana tabacum cv.Petite Havana SB1 representadas em SEQ ID NO: 4 e 6, na Figura 2. exem-plos de aminoácidos de XyIT Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1-específicos determinados baseado nesse alinhamento global de proteínaincluem:

- o aminoácido nas posições 472 ou 502 de SEQ ID NO: 4,

- o aminoácido nas posições 20, 28, 38, 40, 46, 51, 70, 71, 95,97, 184, 213, 298, 313, 334 ou 497 de SEQ ID NO: 6.

Outro exemplo de tal alinhamento global de proteína é o alinha-mento global de proteína das seqüências de proteína de XyIT codificadaspela seqüência do gene de XyIT de Nicotiana tabacum cv. Xanthi represen-tada em SEQ ID NO: 26 com as seqüências de proteína de XyIT codificadaspelas seqüências do gene de XyIT de Nicotiana tabacum cv. Petite HavanaSR1 representadas em SEQ ID NO: 8 e 10 e com as seqüências de proteínade XyIT codificadas pelas seqüências do gene de XyIT de Nicotiana bentha-miana representadas em SEQ ID NO: 12 e 14, na Figura 4. exemplos deaminoácidos de XyIT Nicotiana tabacum cm. Petite Havana SR1 -específicosdeterminado baseado nesse alinhamento global de proteína incluem:

- o aminoácido nas posições 19, 27, 32-38, 44, 46, 52, 57, 76,77, 101, 103, 190, 219, 304, 319, 340 ou 356 de SEQ ID NO: 8,

- o aminoácido nas posições 183, 212, 297, 312, 333 ou 349 deSEQ ID NO: 10.

Exemplos de aminoácidos de XyIT Nicotiana benthamiana-espe-cíficos determinado baseado nesse alinhamento global de proteína incluem:

- o aminoácido nas posições 22, 24, 27, 33, 37, 51, €9, 94, 104,156, 158, 161, 174, 182, 211, 238, 297, 349 ou 414 de SEQ ID NO: 12,

- ο aminoácido nas posições 1, 26, 36, 68, 99, 133, 150, 157,166, 180, 189, 211,218, 245, 257, 296, 327, 348 ou 392 de SEQ ID NO: 14.

A parte de uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma pro-teína de XyIT de Nicotiana e a parte de uma seqüência de nucleotídeo deum gene de XyIT de Nicotiana ou um cDNA de XyIT de Nicotiana compreen-dida dentro da molécula de RNA de silenciamento, particularmente dentro deuma fita da molécula de RNA de filamento duplo, deverá ter pelo menos 19nucleotídeos de comprimento, mas pode variar de cerca de 19 nucleotídeos(nt) até um comprimento igual ao comprimento (em nucleotídeos) da se-qüência que codifica proteína de XyIT de Nicotiana ou da seqüência de cDNAou gene de XyIT de Nicotiana. O comprimento total da seqüência de nucleo-tídeo sentido ou anti-sentido pode, assim, ser de pelo menos 25 nt ou pelomenos cerca de 50 nt ou pelo menos cerca de 100 nt ou pelo menos cercade 150 nt ou pelo menos cerca de 200 nt ou pelo menos cerca de 500 nt.Espera-se que não haja limite máximo quanto ao comprimento total da se-qüência de nucleotídeo anti-sentido ou sentido. Contudo, por razões práticas(tais como, por exemplo, estabilidade dos genes quiméricos), espera-se queo comprimento da seqüência de nucleotídeo sentido ou anti-sentido não ex-ceda a 5000 nt, particularmente não exceda a 2500 nt e poderia estar limita-da a cerca de 1000 nt.

Será apreciado que quanto mais longo o comprimento total daparte da seqüência de nucleotídeo que codifica uma proteína de XyIT de Ni-cotiana ou a parte de uma seqüência de nucleotídeo de um gene de XyIT deNicotiana ou um cDNA de XyIT de Nicotiana (região sentido ou anti-sentido),menos estringentes são os requisitos para identidade de seqüência entreessas regiões e a seqüência correspondente no gene de XyIT endógeno daespécie ou cultivar de Nicotiana que ela complementa. De preferência, o á-cido nucléico de interesse terá uma identidade de seqüência de pelo menoscerca de 75% com a seqüência-alvo correspondente, particularmente pelomenos cerca de 80%, mais particularmente pelo menos cerca de 85%, muitoparticularmente cerca de 90%, especialmente cerca de 95%, mais especial-mente cerca de 100%, muito especialmente será idêntica à parte correspon-dente da seqüência-alvo ou seu complemento. Contudo, é preferido que oácido nucléico de interesse sempre inclua uma seqüência de cerca de 19nucleotídeos consecutivos, particularmente cerca de 25 nt, mais particular-mente cerca de 50 nt, especialmente cerca de 100 nt, muito especialmentecerca de 150 nt com 100% de identidade de seqüência à parte correspon-dente do ácido nucléico de XyIT alvo, em que os referidos cerca de 19 nu-cleotídeos consecutivos, particularmente cerca de 25 nt, mais particularmen-te cerca de 50 nt, especialmente cerca de 100 nt, muito especialmente cercade 150 nt codificam pelo menos um aminoácido de XyIT espécie ou cultivarde Nicotiana-específico ou compreendem pelo menos um nucleotídeo deXyIT espécie ou cultivar de Nicotiana-espec\i\co.

Para fins da presente invenção, a "identidade de seqüência" deduas seqüências de nucleotídeo ou aminoácido relacionadas, expressa co-mo um percentual, se refere a um número de posições nas duas seqüênciasotimamente alinhadas as quais têm resíduos idênticos (x100) dividido pelonúmero de posições comparadas. Uma gap, isto é, uma posição em um ali-nhamento onde um resíduo está presente em uma seqüência, mas não naoutra, é considerada como uma posição com resíduos não idênticos. De pre-ferência, para cálculo da identidade de seqüência e designing da seqüênciasentido ou anti-sentido correspondente, o número de gaps deverá ser mini-mizado, particularmente para as seqüências sentido mais curtas.

Será claro que sempre que seqüências de nucleotídeo de molé-culas de RNA são definidas através de referência a uma seqüência de nu-cleotídeo das moléculas de DNA correspondentes, a timina (T) em uma se-qüência de nucleotídeo deverá ser substituída por uracila (U). Se referênciaé à moléculas de RNA ou DNA estará claro a partir do contexto da aplicação.

Foi demonstrado que o requisito mínimo para silenciamento deum gene-alvo particular é a presença, na seqüência de nucleotídeo do genequimérico de silenciamento, de uma seqüência de nucleotídeo de cerca de20-21 nucleotídeos consecutivos de comprimento correspondendo à se-qüência do gene-alvo, na qual pelo menos 19 dos 20-21 nucleotídeos con-secutivos são idênticos à seqüência do gene-alvo correspondente. "19 de 20nucleotídeos consecutivos", conforme usado aqui, se refere a uma seqüên-cia de nucleotídeo de 20 nucleotídeos consecutivos selecionados do gene-alvo tendo um nucleotídeo erroneamente combinado.

Para silenciamento do gene de XyIT endógeno de uma espécieou cultivar de Nicotiana, é preferido que a seqüência de nucleotídeo de genequimérico de silenciamento compreenda pelo menos 19 de 20-21 nucleotí-deos consecutivos de uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma prote-ína de XyIT de Nicotiana, em que os referidos pelo menos 19 de 20-21 nu-cleotídeos consecutivos codificam pelo menos um aminoácido de XyIT espé-cie ou cultivar de /V/cof/ana-específico ou compreenda pelo menos 19 de 20-21 nucleotídeos consecutivos de uma seqüência de nucleotídeo de um genede XyIT de Nicotiana ou um cDNA de XyIT de Nicotiana, em que os referidospelo menos 19 de 20-21 nucleotídeos consecutivos compreendem pelo me-nos um nucleotídeo de XyIT espécie ou cultivar de Nicotiana-específico.

Conforme usado aqui, "uma planta Nicotiana tendo um baixonível de resíduos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanos ligadas à proteína" éuma planta (particularmente uma planta Nicotiana obtida de acordo com ométodo da invenção), na qual a atividade de XyIT é diminuída ou eliminada,resultando em um menor nível de resíduos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanos ligadas à proteína do que o nível de resíduos de beta-1,2-xiIose so-bre N-glicanos ligadas à proteína em uma planta Nicotiana de controle nãotratada de acordo com os métodos da invenção ou resultando na ausênciade resíduos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanos ligadas à proteína. Uma in-dicação de atividade de XyIT pode ser obtida através de comparação do ní-vel de resíduos de beta-1,2-xilose presentes sobre as glicanas de proteínasda planta Nicotiana obtida de acordo com os métodos da invenção com onível de resíduos de beta-1,2-xilose presentes sobre as glicanas de proteí-nas de uma planta Nicotiana de controle não tratada de acordo com os mé-todos da invenção. O nível de resíduos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanosligadas à proteína de plantas pode ser medido, por exemplo, através de aná-lise de Western blot usando anticorpos xilose-específicos conforme descrito,por exemplo, por Faye e outros (Analytical Biochemistry, 1993, 209: 104-108)ou através de espectrometria de massa sobre glicanas isoladas das glicopro-teínas de planta usando espectronomia de massa por tempo de vôo da Ioni-zação/Dessorção de Matriz assistida por laser (MALDI-TOF-MS) conformedescrito, por exemplo, por Kolarich e Altmann (2000, Anal. Biochem. 285:64-75) ou usando espectronomia de massa Aleatória por Cromatografia deLíquido (LC/MS/MS) conforme descrito, por exemplo, por Henriksson e ou-tros (2003, Biochem. J. 375: 61-73).

dsRNA que codifica genes quiméricos que reduzem a expressãode XyIT de Nicotiana de acordo com a invenção pode compreender um ín-tron, tal como um íntron heterólogo localizado, por exemplo, na seqüênciaespaçadora entre as regiões de RNA sentido e anti-sentido de acordo com adescrição do WO 99/53050 (incorporado aqui por referência).

Se tornou evidente que moléculas de RNA de filamento duplo,tais como aquelas descritas acima, são clivadas em células de planta empequenos fragmentos de RNA de cerca de 20-21 nucleotídeos, os quais ser-vem como seqüência guia na degeneração do mRNA correspondente (revis-to por Baulcombe, 2004). Assim, em outra modalidade, a invenção se referea um método para produção de uma célula de planta de Nicotiana ou plantatendo um baixo nível de resíduos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanos ligadasà proteína compreendendo as etapas de:

a) fornecimento de uma ou mais moléculas de RNA de filamentoduplo à células de uma planta de uma espécie ou cultivar de Nicotiana, emque as moléculas de RNA de filamento duplo compreendem pelo menos doisfilamento de RNA, um filamento de RNA consistindo essencialmente emuma seqüência de nucleotídeo de RNA de 20 a 21 nucleotídeos consecuti-vos selecionados de uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma proteí-na de XyIT de Nicotiana, de preferência obtida da referida espécie ou cultivarde Nicotiana, em que os referidos 20 a 21 nucleotídeos consecutivos codifi-cam pelo menos um aminoácido de XyIT espécie ou cultivar de Nicotiana-específico ou um filamento de RNA consistindo essencialmente de uma se-qüência de RNA de 20 a 21 nucleotídeos consecutivos de uma seqüência denucleotídeo de um gene de XyIT de Nicotiana ou um cDNA de Nicotiana, depreferência obtida da referida espécie ou cultivar de Nicotiana , em que osreferidos 20 a 21 nucleotídeos consecutivos compreendem pelo menos umnucleotídeo de XyIT espécie ou cultivar de Mcoí/ana-específico; e

b) identificação de uma planta Nicotiana compreendendo essamolécula ou moléculas de RNA de filamento duplo as quais têm um menornível de resíduos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanos ligadas à proteína doque a mesma planta Nicotiana a qual não compreende a molécula ou molé-culas de RNA de filamento duplo.

As seqüências de dsRNA de 20-21 nt de comprimento mencio-nadas também são geradas no curso de silenciamento RNA anti-sentidomediado ou silenciamento RNA sentido mediado convencional. Assim, emoutra modalidade da invenção, um método é proporcionado para produçãode uma célula de planta ou planta Nicotiana tendo um baixo nível de resí-duos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanos ligadas à proteína, compreendendoa etapa de fornecimento às células de uma planta da espécie ou cultivar deNicotiana, de um gene quimérico compreendendo, operavelmente ligados,os seguintes fragmentos de DNA:

a) um promotor expressível em planta;

b) uma região de DNA compreendendo pelo menos 20 nucleotí-deos consecutivos selecionados de uma seqüência de nucleotídeo que codi-fica uma proteína de XyIT de Nicotiana, de preferência obtida da mesma es-pécie ou cultivar de Nicotiana, em que os referidos pelo menos 20 nucleotí-deos consecutivos codificam pelo menos um aminoácido de XyIT espécie oucultivar de Nicotiana-específico ou compreendendo pelo menos 20 nucleotí-deos consecutivos de uma seqüência de nucleotídeo de um gene de XyIT deNicotiana ou um cDNA de XyIT de Nicotiana, de preferência obtida da referi-da espécie ou cultivar de Nicotiana, em que os referidos pelo menos 20 nu-cleotídeos consecutivos compreendem pelo menos um nucleotídeo de XyITespécie ou cultivar de Nicotiana-espec\í'\co, na orientação anti-sentido ousentido;

c) uma região de DNA compreendendo um sinal de poliadenila-ção e de término de transcrição funcional em plantas.

As regiões de nucleotídeo anti-sentido ou sentido mencionadaspodem, assim, ser de cerca de 21 nt a cerca de 5000 nt de comprimento, talcomo 21 nt, 40 nt, 50 nt, 100nt, 200 nt, 300nt, 500nt, 1000 nt ou mesmo cer-ca de 2000 nt ou mais de comprimento. Além disso, não é requerido, parafins da invenção, que a seqüência de nucleotídeo da molécula de gene deXyIT inibitória usada ou a região de codificação do gene quimérico sejacompletamente idêntica ou complementar ao gene de XyIT de Nicotiana en-dógeno, a expressão do qual é objetivada para ser reduzida na célula deplanta Nicotiana. Quanto mais longa a seqüência, menos rigoroso é o requi-sito de identidade global de seqüência. Assim, as regiões sentido ou anti-sentido podem ter uma identidade global de seqüência de cerca de 40 % ou50% ou 60 % ou 70% ou 80% ou 90 % ou 100% a uma seqüência de nu-cleotídeo do gene de Nicotiana endógeno ou o complemento da mesma.Contudo, conforme mencionado, regiões sentido ou anti-sentido compreen-derão, de preferência, uma seqüência de nucleotídeo de 19-20 nucleotídeosconsecutivos tendo cerca de 100% de identidade de seqüência a uma se-qüência de nucleotídeo do gene de XyIT, em que os referidos 19-20 nucleo-tídeos consecutivos codificam pelo menos um aminoácido de XyIT espécieou cultivar de Nicotiana-específico ou compreende pelo menos um nucleotí-deo de XyIT espécie ou cultivar de Mcoí/a/ia-específico. O trecho de cercade 100% de identidade de seqüência pode ter cerca de 50, 75 ou 100 nt.

A eficiência dos genes quiméricos acima mencionados os quais,quando transcritos, proporcionam RNA de silenciamento anti-sentido ou sen-tido, pode ser ainda intensificada através de inclusão de elementos de DNAos quais resultam na expressão de moléculas de RNA inibitórias de XyITanormais, não poliadeniladas. Um de tais elementos de DNA adequadospara essa finalidade é uma região de DNA que codifica uma ribozima de au-to-replicação, conforme descrito no WO 00/01133. A eficiência pode tambémser intensificada através de fornecimento das moléculas de RNA geradascom localização nuclear ou sinais de retenção, conforme descrito no WO03/076619.As seqüências de nucleotídeo de XyIT exemplificadas de Nicoti-ana benthamiana e de Nicotiana tabacum podem também ser usadas paraidentificar alelos de XyIT em uma população de plantas de uma espécie oucultivar de Nicotiana os quais são correlacionados com baixos níveis de re-síduos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanos ligadas à proteína. Tais popula-ções de plantas de uma espécie ou cultivar de Nicotiana podem ser popula-ções as quais sofreram mutação prévia. Os alelos de XyIT identificados po-dem, então, ser introduzidos em uma linhagem de planta de uma espécie oucultivar de Nieotiana de escolha usando técnicas de reprodução convencio-nais.

Métodos para transformar plantas Nieotiana também são bem-conhecidos na técnica. Transformação Agrobacterium-med\aóa de Nieotianafoi descrita, por exemplo, em Zambryski e outros (1983, EMBO J. 2:2143-2150), De Block e outros (1984, EMBO J. 3(8): 1681-1689) ou Horsche outros (Science (1985) 227: 1229-1231).

As plantas Nieotiana transformadas obtidas de acordo com ainvenção ou as plantas Nieotiana obtidas tendo um baixo nível de resíduosde beta-1,2-xilose sobre N-glicanos ligadas à proteína em que o gene deXyIT endógeno foi substituído por um alelo de XyIT, o qual está correlacio-nado a um menor nível de resíduos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanos liga-das à proteína do que o alelo de XyIT original, podem ser usadas em umesquema de reprodução convencional para produzir mais plantas com asmesmas características ou introduzir o gene quimérico de acordo com a in-venção em outros cultivares da mesma ou de uma espécie de planta rela-cionada ou em plantas híbridas. Sementes obtidas das plantas transforma-das contêm os genes quiméricos da invenção como um inserto genômicoestável e também são abrangidas pela invenção.

Além disso, sabe-se que a introdução de um RNA anti-sentido,sentido ou filamento duplo ou genes quiméricos de codificação podem levara uma distribuição de fenótipos, oscilando de quase nenhuma ou muito pou-ca supressão da expressão do gene-alvo a uma supressão muito forte oumesmo de 100% da expressão do gene-alvo. Contudo, aqueles versados natécnica serão capazes de selecionar aquelas células de planta, plantas, e-ventos ou linhagens de planta que levam a graus desejados de silenciamen-to e o fenótipo desejado.

Conforme usado aqui, "compreendendo" deve ser interpretadocomo especificando a presença das características, inteiros, etapas ou com-ponentes estabelecidos conforme mencionado, mas não exclui a presençaou adição de uma ou mais características, inteiros, etapas ou componentesou grupos dos mesmos. Assim, por exemplo, um ácido nucléico ou proteínacompreendendo uma seqüência de nucleotídeos ou aminoácidos pode com-preender mais nucleotídeos ou aminoácidos do que aqueles realmente cita-dos, isto é, ser incrustado em uma proteína ou ácido nucléico maior. Um ge-ne quimérico compreendendo uma região de DNA, a qual é funcional ou es-truturalmente definida, pode compreender regiões de DNA adicionais, etc.

Os exemplos não Iimitativos a seguir descrevem genes quiméri-cos para a alteração do nível de resíduos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanos ligadas à proteína em espécies Nicotiana, particularmente em Nico-tiana benthamiana, e em cultivares de Nicotiana, particularmente em Nicoti-ana tabacum cv. Petite Havana SR1 e a usos dos mesmos. A menos que deoutro modo estabelecido nos exemplos, todas as técnicas de DNA recombi-nante são realizadas de acordo com protocolos-padrão conforme descritoem Sambrook e outros (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Se-gunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY e nos Volumes 1 e2 de Ausubel e outros (1994) Current Protocols in Molecular Biology, CurrentProtocols, EUA. Materiais-padrão e métodos para trabalho molecular complantas são descritos em Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R.D.D.Croy, conjuntamente publicado pela BIOS Scientific Publications Ltda (ReinoUnido) e Blackwell Scientific Publications, Reino Unido.

Por toda a descrição e exemplos, referência é feita às seguintesseqüências representadas na Listagem de Seqüência:SEQ ID NO: 1: seqüência de nucleotídeo do oligonucleotídeo XylF4 adequa-do para amplificar uma parte de um gene ou cDNA de XyIT de Nicotiana.SEQ ID NO: 2: seqüência de nucleotídeo do oligonucleotídeo XylR4 ade-quado para amplificar uma parte de um gene ou cDNA de XyIT de Nicotiana.SEQ ID NO: 3: seqüência de cDNA parcial da variante 1 de gene de XyIT deNicotiana tabacumcv. Petite Havana SR1.

SEQ ID NO: 4: seqüência de aminoácido parcial da variante 1 de proteína deXyIT de Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1.

SEQ ID NO: 5: seqüência de cDNA parcial da variante 2 do gene de XyIT deNicotiana tabacumcv. Petite Havana SR1.

SEQ ID NO: 6: seqüência de aminoácido parcial da variante 2 de proteína deXyIT de Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1.

SEQ ID NO: 7: seqüência de nucleotídeo parcial da variante 1 do gene deXyIT de Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1.

SEQ ID NO: 8: seqüência de aminoácido parcial da variante 1 de proteína deXyIT de Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1.

SEQ ID NO: 9: seqüência de nucleotídeo parcial da variante 2 do gene deXyIT de Nicotiana tabacumcv. Petite Havana SR1.

SEQ ID NO: 10: seqüência de aminoácido parcial da variante 2 de proteínade XyIT de Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1.SEQ ID NO: 11: seqüência de nucleotídeo parcial da variante 1 de gene deXyIT de Nicotiana benthamiana.

SEQ ID NO: 12: seqüência de aminoácido parcial da variante 1 de proteínade XyIT de Nicotiana benthamiana.

SEQ ID NO: 13: seqüência de nucleotídeo parcial da variante 2 do gene deXyIT de Nicotiana benthamiana.

SEQ ID NO: 14: seqüência de aminoácido parcial da variante 2 de proteínade XyIT de Nicotiana benthamiana.

SEQ ID NO: 15: seqüência de nucleotídeo do oligonucleotídeo XylF8 ade-quado para amplificar uma parte de um gene ou cDNA de XyIT de Nicotianatabacum cv. Petite Havana SR1.

SEQ ID NO: 16: seqüência de nucleotídeo do oligonucleotídeo XylR8 ade-quado para amplificar uma parte de um gene ou cDNA de XyIT de Nicotianatabacum cv. Petite Havana SR1.

SEQ ID NO: 17: seqüência de cDNA parcial da variante 1 do gene de XyITde Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1.

SEQ ID NO: 18: seqüência de nucleotídeo da região de T-DNA do vetorpTKW20.

SEQ ID NO: 19: seqüência de nucleotídeo do oligonucleotídeo XylF9 ade-quado para amplificar uma parte de um gene ou cDNA de XyIT de Nicotianabenthamiana.

SEQ ID NO: 20: seqüência de nucleotídeo do oligonucleotídeo XylR9 ade-quado para amplificar uma parte de um gene ou cDNA de XyIT de Nicotianabenthamiana.

SEQ ID NO: 21: seqüência parcial da variante 1 do gene de XyIT de Nicotia-na benthamiana.

SEQ ID NO: 22: seqüência de nucleotídeo da região de T-DNA do vetorpTKW29.

SEQ ID NO: 23: mRNA de Nieotiana tabacum cv. Xanthi para beta-(1,2)-xilosil transferase putativa (número de acesso AJ627182).SEQ ID NO: 24: beta-(1,2)-xilosil transferase putativa codificada por SEQ IDNO: 23.

SEQ ID NO: 25: gene xylt de Nicotiana tabacum cv. Xanthi para beta-(1,2)-

xilosil transferase putativa (número de acesso AJ627183).

SEQ ID NO: 26: beta-(1,2)-xilosil transferase putativa codificada por SEQ ID

NO: 25.

Exemplos

Exemplo 1: Desiqn de iniciadores degenerados para o isolamento de cDNAde XvIT e seqüências de gene de Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1e Nicotiana benthamiana

Seqüências de oligonucleotídeo a serem usadas como iniciado-res degenerados em uma amplificação por PCR de cDNA de XyIT e DNAgenômico de Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1 e Nicotiana bentha-miana foram projetadas baseado nas seqüências de éxon de uma seqüênciade DNA genômico de Nicotiana tabacum cv. Xanthi que codifica uma proteí-na de XyIT putativa (número de acesso AJ627183). O iniciador dianteiro(SEQ ID NO: 1) foi projetado com CACC em sua extremidade 5' para fins declonagem. Dessa forma, os seguintes iniciadores degenerados foram gerados:XylF4: 5'-CACCTTGTTTCTCTCTTCGCTCTCAACTCAATCACTC-3'(SEQ ID NO: 1)

XylR4: 5'-TCGATCACAACTGGAGGATCCGCATAA -3'(SEQ ID NO: 2)

Exemplo 2: Isolamento de seqüências de cDNA de XyIT de Nicotiana tabacumcv. Petite Havana SR1

Os iniciadores degenerados descritos no Exemplo 1 foram gera-dos para isolar seqüências de cDNA de XyIT de Nicotiana tabacum cv. PetiteHavana SR1:

RNA foi extraído de folhas de Nicotiana tabacum cv. Petite Ha-vana SR1 usando o RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) de acordo com o proto-colo do fabricante e usado para síntese de cDNA usando o Sistema de sín-tese SuperScript® First-strand para RT-PCR (Invitrogen Life Technologies)de acordo com as instruções do fabricante.

Usando o cDNA como padrão e um par de iniciador XylF4 / XylR4,amplificação por PCR foi realizada sob as seguintes condições: 15 seg a94°C (desnaturação) e 3 min a 68°C durante 40 ciclos (anelamento e alon-gamento).

Um fragmento de DNA de cerca de 1500 pares de base foi am-plificado, clonado em um vetor pENTR®/D-TOPO® (Invitrogen) e vários clo-nes foram seqüenciados (compreendendo as seqüências de SEQ ID NO: 3 -XylTc2Nt - e SEQ ID NO: 5 - XylTc7Nt).

Um alinhamento entre uma seqüência de mRNA de Nicotianatabacum cv. Xanthi que codifica uma proteína de XyIT putativa (número deacesso AJ627182; SEQ ID NO: 23) e as seqüências de cDNA de XyIT isola-das de Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1 (SEQ ID NO: 3 e 5) é mos-trado na Figura 1.

Um alinhamento entre a proteína de XyIT putativa codificada pe-la seqüência de mRNA de Nicotiana tabacum cv. Xanthi (número de acessoAJ627182; SEQ ID NO: 24) e pelas seqüências de cDNA isoladas de Nicotianatabacum cv. Petite Havana SR1 (SEQ ID NO: 4 e 6) é mostrado na Figura 2.Exemplo 3: Isolamento de seqüências de gene de XyIT de Nicotiana taba-cum cv. Petite Havana SR1 e de Nicotiana benthamiana

Os iniciadores degenerados descritos no Exemplo 1 foram usa-dos para isolar seqüências de gene de XyIT de Nicotiana tabacum cv. PetiteHavana SR1 e de Nieotiana benthamiana:

DNA foi extraído de folhas de Nieotiana tabacum cv. Petite Ha-vana SR1 e de Nieotiana benthamiana baseado no protocolo descrito porBernatzky e Tanksley (1986).

Usando o DNA genômico como padrão e um par de iniciadorXylF4 / XylR4, amplificação por PCR foi realizada sob as seguintes condi-ções: 15 seg a 94°C (desnaturação) e 4 min e 30 seg a 68°C durante 40 ci-clos (anelamento e alongamento).

Usando o DNA genômico de Nieotiana tabacum cv. Petite HavanaSR1 como padrão para a amplificação por PCR1 um fragmento de DNA decerca de 3400 pares de base foi amplificado, clonado em um vetor pENTR®/D-TOPO® (Invitrogen) e vários clones foram seqüenciados (compreendendoas seqüências de SEQ ID NO: 7 - XyITgI Nt - e SEQ ID NO: 9 - XylTg3Nt).

As seqüências de DNA genômico de XyIT XyITgINt e XylTg3Ntcompreendem duas seqüências de íntron putativas e três seqüências de é-xon putativas. A localização das seqüências de íntron é:

- para XyITgI Nt: do nucleotídeo na posição 679 ao nucleotídeona posição 1974 e do nucleotídeo na posição 2125 ao nucleotídeo na posi-ção 2722 de SEQ ID NO: 9 e

- para XylTg3Nt: do nucleotídeo na posição 658 ao nucleotídeona posição 1953 e do nucleotídeo na posição 2104 ao nucleotídeo na posi-ção 2701 de SEQ ID NO: 9.

Usando o DNA genômico de Nicotiana benthamiana como pa-drão para a amplificação por PCR, um fragmento de DNA de entre cerca de3300 e cerca de 3600 pares de base foi amplificado, clonado em um vetorpENTR®/D-TOPO® (Invitrogen) e vários clones foram seqüenciados (com-preendendo as seqüências de SEQ ID NO: 11 - XyITgI4Nb - e SEQ ID NO:13 - XyITgI 9Nb).As seqüências de DNA genômico de XyIT XyITgI 4Nb e XyITgI 9Nbcompreendem duas seqüências de íntron putativas e três seqüências de éxonputativas. A localização das seqüências de íntron é:

- XyITgI4Nb do nucleotídeo na posição 658 ao nucleotídeo naposição 1917 e do nucleotídeo na posição 2068 ao nucleotídeo na posição2612 de SEQ ID NO: 11 e

- XyITgI 9Nb do nucleotídeo na posição 649 ao nucleotídeo naposição 2194 e do nucleotídeo na posição 2345 ao nucleotídeo na posição2888 de SEQ ID NO: 13.

Um alinhamento entre a seqüência de DNA genômico de Nicoti-ana tabacum cv. Xanthi que codifica uma proteína de XyIT putativa (númerode acesso AJ627183; SEQ ID NO: 25) e as seqüências de DNA genômico deXyIT isoladas de Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1 (SEQ ID NO: 7 e 9)e de Nicotiana benthamiana (SEQ ID NO: 11 e 13) é mostrado na Figura 3.

Um alinhamento entre a proteína de XyIT putativa codificada pe-la seqüência de DNA genômico de Nicotiana tabacum cv. Xanthi (número deacesso AJ627183; SEQ ID NO: 26) e pelas seqüências de DNA genômicoisoladas de Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1 (SEQ ID NO: 8 e 10) ede Nicotiana benthamiana (SEQ ID NO: 12 e 14) é mostrado na Figura 4.Exemplo 4: Construção de um vetor de T-DNA contendo um gene de silenci-amento de XvIT de Nicotiana

Fragmentos de DNA amplificados de seqüências de XyIT de Ni-cotiana descritas nos exemplos 2 e 3 foram usados para construir vetores deT-DNA compreendendo um gene quimérico o qual, quando de transcrição,proporciona uma molécula de RNA compreendendo uma seqüência de DNAsentido e anti-sentido a partir do fragmento de DNA amplificado e o qual po-deria se emparelhar em bases para formar uma molécula de RNA de fila-mento duplo. Tais genes quiméricos podem ser usados para reduzir a ex-pressão de um gene de XyIT em Nicotiana, particularmente em Nicotianatabacum cv. Petite Havana SR1 e Nicotiana benthamiana.

4.1. Construção de um vetor de T-DNA compreendendo umgene de silenciamento de XyIT com um fragmento de DNA amplificado deuma seqüência de XyIT de Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1.

Seqüências de oligonucleotídeo a serem usadas como iniciado-res não degenerados em uma amplificação de PCR de um cDNA de XyIT dêNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1 foram projetadas baseado na se-qüência de cDNA de Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1 isolada noExemplo 2. O iniciador dianteiro (SEQ ID NO: 15) foi projetado com CACCem sua extremidade 5' para fins de clonagem. Dessa forma, os seguintesiniciadores não degenerados foram gerados:

XylF8: 5'-CACCTCTCGCCTTTGGGATATGAAACT -3' (SEQ ID NO: 15)XylR8: 5'-ACAGCTTTGGTGCTGCAGAAACT -3' (SEQ ID NO: 16)

Usando o vetor compreendendo um fragmento de DNA amplifi-cado de uma seqüência de cDNA de XyIT de Nicotiana tabacum cv. PetiteHavana SR1 conforme descrito no Exemplo 2 (SEQ ID NO: 3 - XylTc2Nt)como padrão e o par de iniciador XylF8 / XylR8, uma amplificação por PCRfoi realizada sob as seguintes condições: 15 seg a 94°C (desnaturação), 30seg a 56°C (anelamento) e 45 seg a 68°C (alongamento) durante 25 ciclos.

Um fragmento de DNA de cerca de 470 bp (XylTi4Nt; SEQ IDNO: 17) foi amplificado e clonado em um vetor pENTR®/D-TOPO® (Invitro-gen), proporcionando o plasmídeo pKW19. O plasmídeo pKW19 foi recom-binado com pHellsgate12 (Helliwell e Waterhouse, Methods (2003) 30: 289-295) usando o Gateway® LR Clonase® Il (Invitrogen), proporcionando oplasmídeo pTKW20.

A seqüência de T-DNA do pTKW20 (SEQ ID NO: 18), assim,compreende:

um gene de silenciamento de XyIT quimérico compreendendo:o um fragmento incluindo a região promotora do transcrito 35Sdo Vírus Mosaico da Couve-flor (Odell e outros, 1985) (SEQ ID NO: 18 donucleotídeo 969 ao nucleotídeo 2314)

o um fragmento incluindo uma parte do cDNA de XyIT de Nicoti-ana tabacum cv. Petite Havana SR1 clonada na orientação sentido (SEQ IDNO: 18 do nucleotídeo 2365 ao nucleotídeo 2834)

o um fragmento contendo o íntron do gene de catase-1 de sementede mamona (SEQ ID NO: 18 do nucleotídeo 2893 ao nucleotídeo 3088)

o um fragmento contendo o segundo íntron do gene de diquína-se de ortofosfato de piruvato de Flaveria trinervia conforme descrito por Ros-che e Westhoff (1995) na orientação reversa (SEQ ID NO: 18 do nucleotídeo3130 ao nucleotídeo 3871).

o um fragmento incluindo uma parte da seqüência de cDNA deXyIT de Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1 clonada na orientaçãoanti-sentido (SEQ ID NO: 18 do nucleotídeo 3957 ao nucleotídeo 4426).

o um fragmento incluindo a região não traduzida 3' do gene desintase de octopina de Agrobacterium tumefaciens conforme descrito por DeGreve e outros (1982) (SEQ ID NO: 18 do nucleotídeo 4479 ao nucleotídeo5244).

• um gene quimérico que codifica um marcador selecionávelcompreendendo:

o um fragmento incluindo a região promotora do gene de sintasede nopalina de T-DNA de Agrobacterium tumefaciens (SEQ ID NO: 18 donucleotídeo 5512 ao nucleotídeo 5744).

o um fragmento incluindo o gene de resistência a antibiótico nptIl(SEQ ID NO: 18 do nucleotídeo 5745 ao nucleotídeo 6690).

o um fragmento incluindo a região não traduzida 3' do gene sin-tase de nopalina de T-DNA de A. tumefaciens (SEQ ID NO: 18 do nucleotí-deo 6691 ao nucleotídeo 7396).

O vetor de T-DNA foi introduzido em Agrobacterium tumefacienscompreendendo um plasmídeo-Ti auxiliar.

4.2. Construção de um vetor de T-DNA compreendendo um ge-ne de silenciamento de XyIT com um fragmento de DNA amplificado de umaseqüência de XyIT de Nicotiana benthamiana

Seqüências de oligonucleotídeo a serem usadas como iniciado-res não degenerados em uma, amplificação por PCR de uma seqüência degene XyIT de Nicotiana benthamiana, foram projetadas baseado na seqüên-cia de gene de Nicotiana benthamiana isolada no Exemplo 3. O iniciadordianteiro (SEQ ID NO: 19) foi projetado com GGCCGGATCCTCG em suaextremidade 5' e o iniciador reservo (SEQ ID NO: 20) foi projetado comGGCCATCGATGGTACC em sua extremidade 5' para fins de clonagem.Dessa forma, os seguintes iniciadores não degenerados foram gerados:XylF9: 5'-GGCCGGATCCTCGAGACACAATTGGAGGAAACATGGAAAGC-3'(SEQ ID NO: 19)

XylR9: 5'-GGCCATCGATGGTACCGGCCCAGCTCTTTATGGAATCAAA -3'(SEQ ID NO: 20)

Usando o vetor compreendendo um fragmento de DNA amplifi-cado de uma seqüência de gene de XyIT de Nicotiana benthamiana confor-me descrito no Exemplo 3 (SEQ ID NO: 11 - XyITgI4Nb) como padrão e opar de iniciador XylF9 / XylR9, uma amplificação por PCR foi realizada sobas seguintes condições: 15 seg a 94°C (desnaturação), 30 seg a 58°C (ane-lamento) e 30 seg a 68°C (alongamento) durante 25 ciclos.

Um fragmento de DNA de cerca de 430 bp (XylTiNb; SEQ IDNO: 21) foi amplificado e digerido com Xhol e Kpnl e com BamHI e Ciai, res-pectivamente. Os fragmentos digeridos com Xhol / Kpnl e BamHI / Clal fo-ram clonados no pHANNIBAL (Helliwell e Waterhouse, 2003), digerido comXhol / Kpnl e BamHI / Ciai, proporcionando o pKW28.

O plasmídeo pKW28, assim, compreende um gene de silencia-mento de XyIT quimérico compreendendo:

o um fragmento incluindo a região promotora do transcrito 35Sdo vírus mosaico da couve-flor (Odell e outros, 1985) (SEQ ID NO: 22 donucleotídeo 3779 ao nucleotídeo 2434)

o um fragmento incluindo uma parte da seqüência do gene XyITde Nicotiana benthamiana clonado na orientação sentido (SEQ ID NO: 22 donucleotídeo 2427 ao nucleotídeo 2023).

o um fragmento contendo o segundo íntron do gene de diquínasede ortofosfato de piruvato de Flaveria trinervia conforme descrito por Rosche eWesthoff (1995) (SEQ ID NO: 22 do nucleotídeo 1991 ao nucleotídeo 1250).

o um fragmento incluindo uma parte da seqüência do gene deXyIT de Nicotiana benthamiana clonado na orientação anti-sentido (SEQ IDNO: 22 do nucleotídeo 1211 ao nucleotídeo 807).o um fragmento incluindo a região não traduzida 3' do gene desintase de octopina de Agrobacterium tumefaciens conforme descrito por DeGreve e outros (1982) (SEQ ID NO: 22 do nucleotídeo 786 ao nucleotídeo76) entre os sítios de restrição Mscl e Pstl.

O plasmídeo pkW28 é digerido com Mscl e Pstl e o gene quimé-rico é introduzido entre as bordas de T-DNA de um vetor de T-DNA cortadocom Pstl e Smal junto com um gene quimérico que codifica um marcadorselecionado compreendendo:

o um fragmento incluindo a região promotora do gene de sintasede nopalina de T-DNA de A. tumefaciens T-DNA (SEQ ID NO: 22 do nucleo-tídeo 3854 ao nucleotídeo 4140).

o um fragmento incluindo o gene de resistência à fosfinotricinabar (De Block e outros, 1987) (SEQ ID NO: 22 do nucleotídeo 4161 ao nu-cleotídeo 4712).

o um fragmento incluindo a região 3' não traduzida do gene desintase de nopalina de T-DNA de A. tumefaciens (SEQ ID NO: 22 do nucleo-tídeo 4731 ao nucleotídeo 4991) para proporcionar o pTKW29 (seqüência doT-DNA de pTKW29 é representada em SEQ ID NO: 22).

O vetor pTKW29 é derivado do pGSC1700 (Cornelissen e Van-dewiele, 1989). A cadeia principal do vetor contém os seguintes elementosgenéticos:

• o núcleo do plasmídeo compreendendo a origem de replicaçãodo plasmídeo pBR322 (Bolívar e outros, 1977) para replicação em Escheri-chia coli (ORI CoIEI) e um fragmento de restrição compreendendo a origemde replicação do plasmídeo pVS1 de Pseudomonas (ltoh e outros, 1984)para replicação em Agrobacterium tumefaciens (ORI pVS1).

• um gene marcador selecionável que confere resistência à es-treptomicina e espectinomicina (aadA) para propagação e seleção do plas-mídeo em Escherichia colie Agrobacterium tumefaciens.

• uma região de DNA consistindo em um fragmento da seqüên-cia de codificação de fosfotransferase de neomicina do gene nptI do trans-poson 7n903 (Oka e outros, 1981).O vetor de T-DNA é introduzido em Agrobacterium tumefacienscompreendendo um plasmídeo-Ti auxiliar.

Exemplo 5: Análise de plantas transqênicas Nicotiana abrigando um gene desilenciamento de XyIT.

Plantas Nicotiana foram transformadas usando as cepas de A-grobacterium tumefaciens descritas no Exemplo 4.

5.1. Análise de plantas transgênicas Nicotiana tabacum oj. Peti-te Havana SR1 abrigando um gene de silenciamento de XyIT

Plantas Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1 foram trans-formadas usando a cepa de Agrobacterium tumefaciens descrita no Exemplo4.1. de acordo com o protocolo descrito em Zambryski e outros (1983). Cin-qüenta e duas linhagens transgênicas de Nicotiana tabacum compreenden-do os genes quiméricos conforme descrito no Exemplo 4.1 foram obtidas.

Linhagens de planta transgênicas foram analisadas a nível mo-lecular usando análise de Southern blot. Similarmente, as linhagens de plan-ta foram analisadas com relação à expressão de RNA de XyIT usando análi-se de Northern blot.

Uma indicação de atividade de XyIT pode ser obtida comparan-do o nível de resíduos de beta-1,2-xilose presente sobre as glicanas de pro-teínas das linhagens transgênicas com aquele das plantas não-transforma-das. O nível de resíduos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanos ligadas à prote-ína de plantas pode ser medido, por exemplo, através de análise de Westernblot usando anticorpos xilose-específicos conforme descrito, por exemplo,por Faye e outros (1993) ou através de espectrometria de massa sobre gli-canas isoladas de glicoproteínas de planta usando Espectromoma de massapor tempo de vôo da lonização/Dessorção da matriz assistida por laser(MALDI-TOF-MS) conforme descrito, por exemplo, por Kolarich e Altmann(2000) ou usando espectronomia de massa Aleatória por Cromatografia deLíquido (LC/MS/MS) conforme descrito, por exemplo, por Henriksson e ou-tros (2003).

5.2. Análise das plantas transgênicas Nicotiana benthamianaabrigando um gene de silenciamento de XyITSimilarmente, plantas Nicotiana benthamiana foram transforma-das usando a cepa de Agrobacterium tumefaciens descrita no Exemplo 4.2.e a expressão do XyIT e o nível de resíduos de beta-1,2-xilose presentessobre as glicanas de proteína foram analisados conforme descrito acima.

Cinqüenta e quatro linhagens transgênicas de Nicotiana ben-thamiana compreendendo os genes quiméricos descritos no Exemplo 4.2.foram obtidas após transformação do disco de folha com pTKW29.

Para determinar o nível de resíduos de beta-1,2-xilose presentesobre as glicanas de proteínas endógenas dessas linhagens de planta, pro-teínas de folha solúveis de cada indivíduo foram analisadas através de Wes-tern blot usando um anticorpo beta-1,2-xilose-específico.

Seis amostras mostraram uma reação muito fraca com o anti-corpo e seis amostram não tinham reação detectável com o anticorpo. Paraas outras amostras, o nível de reação com o anticorpo oscilava de um nívelfraco ao tipo silvestre.

Para determinar o número de inserções do gene de silenciamen-to de XyIT quimérico a partir do pTKW29, DNA genômico das linhagens deplanta que mostraram reações muito fracas ou negativas ao anticorpo beta-1,2-xilose-específico foi isolado, digerido com EcoRI e analisado através deSouthern blot usando uma sonda abrangendo a região do promotor 35S euma sonda abrangendo a região de codificação do gene de resistência àfosfinotricina bar.

Nenhuma das doze linhagens de planta mostrou uma única in-serção. Uma linhagem de planta continha duas inserções e era negativa pa-ra xilose usando análise por Western blot.

Para testar se esses dois genes de silenciamento de XyIT qui-méricos inseridos independentemente e obter plantas as quais eram negati-vas para xilose quando de Western blot e as quais contêm um único gene desilenciamento de XyIT quimérico, a prole resultante de autofertilização dalinhagem de planta contendo duas inserções foi plantada e vinte e cinco li-nhagens de planta foram analisadas através de análise por Western blot.Listagem de Referência

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<120> SEQÜÊNCIAS DE NUCLEOTÍDEO QUE CODIFICAM NICOTIANABETA-1,2-XILOSILTRANSFERASE

<130> BCS 06-2005<160> 26

<170> Patentln versão 3.3

<210> 1

<211 >37

<212> DNA

<213> Artificial

<220><223> oligonucleotídeo XylF4<400> 1

caccttgttt ctctcttcgc tctcaactca atcactc 37

<210> 2<211> 27<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> oligonucleotídeo XylR4<400>2

tcgatcacaa ctggaggatc cgcataa 27

<210> 3<211>1513<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> XylTc2Nt

<220>

<221> CDS<222> (7)..(1512)<400>3

cacctt gtt tct ctc ttc gct ctc aac tca ate act ctc tat ctc tacVal Ser Leu Phe Ala Leu Asn Ser Ile Thr Leu Tyr Leu Tyr15 10

ttc tct tcc cac tct gat cac ttc cgt cac aaa tcc ccc caa aac cacPhe Ser Ser His Ser Asp His Phe Arg His Lys Ser Pro Gln Asn His15 20 25 30

ttt cct aat acc caa aac cac tat tcc ctg tcg gaa aac cac cat gatPhe Pro Asn Thr Gln Asn His Tyr Ser Leu Ser Glu Asn His His Asp

35 40 45

aat ttc cac tct tct gtc act tcc caa tat acc aag cct tgg cca attAsn Phe His Ser Ser Val Thr Ser Gln Tyr Thr Lys Pro Trp Pro Ile

50 55 60

ttg ccc tcc tac ctc ccc tgg tct cag aat cct aat gtt tct ttg agaLeu Pro Ser Tyr Leu Pro Trp Ser Gln Asn Pro Asn Val Ser Leu Arg

65 70 75

tcg tgc gag ggt tac ttc ggt aat ggg ttt act ctc aaa gtt gat cttSer Cys Glu Gly Tyr Phe Gly Asn Gly Phe Thr Leu Lys Val Asp Leu

80 85 90

ctc aaa act tcg ccg gag ctt cac cag aaa ttc ggc gaa aac acc gtaLeu Lys Thr Ser Pro Glu Leu His Gln Lys Phe Gly Glu Asn Thr Val95 100 105 110

tcc ggc gac ggc gga tgg ttt agg tgt ttt ttc agt gag act ttg cagSer Gly Asp Gly Gly Trp Phe Arg Cys Phe Phe Sex- Glu Thx Leu Gln

115 120 125

agt tcg att tgc gag gga ggt gct ata cga atg aat ccg gac gag attSer Ser Ile Cys Glu Gly Gly Ala Ile Arg Met Asn Pro Asp Glu Ile

130 135 140

ttg atg tct cgt gga ggc gag aaa ttg gag tcg gtt att ggt agg agtLeu Met Ser Arg Gly Gly Glu Lys Leu Glu Ser Val Ile Gly Arg Ser145 150 1S5gaa gat gat gag ctg cccGlu Asp Asp Glu Leu Pro160

gtt act gat aaa ctg aaaVal Thr Asp Lys Leu Lys175 180

ttg aat aaa tac tta ccgLeu Asn Lys Tyr Leu Pro195

gaa tta att gac tct attGlu Leu Ile Asp Ser Ile210

tct gag tgg att gag gagSer Glu Trp Ile Glu Glu225

gca aac ctt ttc cac acaAla Asn Leu Phe His Thr240

tcc agg gtt act ggc ttgSer Arg Val Thr Gly Leu255 260

ggc cat tgt gag aca caaGly His Cys Glu Thr Gln275

age ctc act tat gct aagSer Leu Thr Tyr Ala Lys290

gcc gtt ctc tcg cct ttgAla Val Leu Ser Pro Leu305

aca gaa act ata gat tgtThr Glu Thr Ile Asp Cys

gtg ttc aaa aat gga gctVal Phe Lys Asn Gly Ala165 170

att ggg aaa aaa tta gtgIle Gly Lys Lys Leu Val185

gaa ggt gca att tca aggGlu Gly Ala Ile Ser Arg200

cag tta gtt ggc gcc gatGln Leu Val Gly Ala Asp215

ccg tca ctt ttg att acaPro Ser Leu Leu Ile Thr230

gtt acc gat tgg tat agt

Val Thr Asp Trp Tyr Ser

245 250

ccc agt cgg cca cat ttg

Pro Ser Arg Pro His Leu265

ttg gag gaa aca tgg aaaLeu Glu Glu Thr Trp Lys280

aac ttt agt ggc cca gttAsn Phe Ser Gly Pro Val295

gga tat gaa act gcc ctgGly Tyr Glu Thr Ala Leu310

aat gga gct tct gcc catAsn Gly Ala Ser Ala His

ttt cag att aaa 528

Phe Gln Ile Lys

gat gaa aaa ate 576

Asp Glu Lys Ile190

cac act atg cgt 624

His Thr Met Arg205

gaa ttt cac tgt 672

Glu Phe His Cys220

cga ttt gag tat 720

Arg Phe Glu Tyr

235

gca tac gtg gca 768

Ala Tyr Val Ala

gtt ttt gta gat 816

Val Phe Val Asp270

gca ctc ttt tca 864

Ala Leu Phe Ser285

tgt ttc cgt cac 912

Cys Phe Arg His300

ttt aag gga ctg 960

Phe Lys Gly Leu

315

gat ttg tgg caa 1008

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aca gtc aca ggcThr Val Thr Gly370

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325

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<210> 4<211> 502<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Estrutura sintética<400>4

Val Ser Leu Phe Ala Leu Asn Ser Ile Thr Leu Tyr Leu Tyr Phe Ser1 5 10 15

Ser His Ser Asp His Phe Arg His Lys Ser Pro Gln Asn His Phe Pro

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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Glu Gly Tyr Phe Gly Asn Gly Phe Thr Leu Lys Val Asp Leu Leu Lys

85 90 95

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100 105 110

Asp Gly Gly Trp Phe Arg Cys Phe Phe Ser Glu Thr Leu Gln Ser Ser

115 120 125

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130 135 140

Ser Arg Gly Gly Glu Lys Leu Glu Ser Val Ile Gly Arg Ser Glu Asp145 150 155 160

Asp Glu Leu Pro Val Phe Lys Asn Gly Ala Phe Gln Ile Lys Val Thr165 170 175Asp Lys Leu Lys Ile Gly Lys Lys Leu Val Asp Glu Lys Ile Leu Asn

180 185 190

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195 200 205

Ile Asp Ser Ile Gln Leu Val Gly Ala Asp Glu Phe His Cys Ser Glu

210 215 220

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

Thr Tyr Ala Lys Asn Phe Ser Gly Pro Val Cys Phe Arg His Ala Val

290 295 300

Leu Ser Pro Leu Gly Tyr Glu Thr Ala Leu Phe Lys Gly Leu Thr Glu305 310 315 320

Thr Ile Asp Cys Asn Gly Ala Ser Ala His Asp Leu Trp Gln Asn Pro

325 330 335

Asp Asp Lys Arg Thr Ala Arg Leu Ser Glu Phe Gly Glu Met Ile Arg

340 345 350

Ala Ala Phe Gly Phe Pro Val Asp Arg Gln Asn Ile Pro Arg Thr Val

355 360 365

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370 375 380

Pro Arg His Gly Gly Lys Val Gln Ser Arg Leu Ser Asn Glu Glu Gln385 390 395 400

Val Phe Asp Ser Ile Lys Ser Trp Ala Leu Asn His Ser Glu Cys Lys

405 410 415

Leu Asn Val Ile Asn Gly Leu Phe Ala His Met Ser Met Lys Glu Gln420 425 430Val Arg Ala Ile Gln Asp Ala Ser Val Ile Val Gly Ala His Gly Ala

435 440 445

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450 455 460

Ile Ile Ser Ser Glu Tyr Arg His Pro His Phe Ala Leu Ile Ala Gln465 470 475 480

Trp Lys Gly Leu Glu Tyr His Pro Ile Tyr Leu Glu Gly Ser Tyr Ala

485 490 495

Asp Pro Pro Val Val Met500

<210> 5<211> 1495<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> XylTc7Nt<220><221 > CDS<222> (5)..(1495)<400>5

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20 25 30

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35 40 45

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240 245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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305 310 315

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Gly Ala Ser Ala His Asp Leu Trp Gln Asn Pro Asp Asp Lys Lys Thr

320 325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

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400 405 410 415

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420 425 430

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435 440 445

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450 455 460

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20 25 30

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50 55 60

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Gly Phe Thr Leu Lys Val Asp Leu Leu Lys Thr Ser Pro Glu Phe His

85 90 95

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100 105 110

Cys Phe Phe Ser Glu Thr Leu Gln Ser Ser Ile Cys Glu Gly Gly Ala

115 120 125

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130 135 140

Leu Glu Ser Val Ile Gly Arg Ser Glu Asp Asp Glu Leu Pro Val Phe145 150 155 160

Lys Asn Gly Ala Phe Gln Ile Lys Val Thr Asp Lys Leu Lys Ile Gly

165 170 175

Lys Lys Leu Val Asp Glu Lys Phe Leu Asn Lys Tyr Leu Pro Glu Gly

180 185 190

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195 200 205

Val Gly Ala Asp Asp Phe His Cys Ser Glu Trp Ile Glu Glu Pro Ser

210 215 220

Leu Leu Ile Thr Arg Phe Glu Tyr Ala Asn Leu Phe His Thr Val Thr225 230 235 240

Asp Trp Tyr Ser Ala Tyr Val Ala Ser Arg Val Thr Gly Leu Pro Ser

245 250 255

Arg Pro His Leu Val Phe Val Asp Gly His Cys Glu Thr Gln Leu Glu

260 265 270

Glu Thr Trp Lys Ala Leu Phe Ser Ser Leu Thr Tyr Ala Lys Asn Phe

275 280 285

Ser Gly Pro Val Cys Phe Arg His Ala Ala Leu Ser Pro Leu Gly Tyr290 295 300

Glu Thr Ala Leu Phe Lys Gly Leu Ser Glu Thr Ile Asp Cys Asn Gly305 310 315 320

Ala Ser Ala His Asp Leu Trp Gln Asn Pro Asp Asp Lys Lys Thr Ala

325 330 335

Arg Leu Ser Glu Phe Gly Glu Met Ile Arg Ala Ala Phe Gly Phe Pro

340 345 350

Val Asp Arg Gln Asn Ile Pro Arg Thr Val Thr Gly Pro Asn Val Leu

355 360 365

Phe Val Arg Arg Glu Asp Tyr Leu Ala His Pro Arg His Gly Gly Lys370 375 380

Val Gln Ser Arg Leu Ser Asn Glu Glu Gln Val Phe Asp Ser Ile Lys

385 390 395 400

Ser Trp Ala Leu Asn His Ser Glu Cys Lys Leu Asn Val Ile Asn Gly

405 410 415

Leu Phe Ala His Met Ser Met Lys Glu Gln Val Arg Ala Ile Gln Asp

420 425 430

Ala Ser Val Ile Val Gly Ala His Gly Ala Gly Leu Thr His Ile Val

435 440 445

Ser Ala Ala Pro Lys Ala Val Ile Leu Glu Ile Ile Ser Ser Glu Tyr

450 455 460

Arg Arg Pro His Phe Ala Leu Ile Ala Gln Trp Lys Gly Leu Glu Tyr465 470 475 480

His Pro Ile Tyr Leu Glu Gly Ser Tyr Ala Asp Pro Pro Val Val Ile485 490 495

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<220>

<221 > CDS

<222> (1975)..(2124)

<220>

<221 > Intron<222> (2125)..(2722)<220><221 > CDS<222> (2723)..(3406)<400>7

cacctt gtt tct ctc ttc gct ctc aac tca ate act ctc tat ctc tacVal Ser Leu Phe Ala Leu Asn Ser Ile Thr Leu Tyr Leu Tyr1 5 10

35 40 45

50 55 60

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80 85 90

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Ser Gly Asp Gly Gly Trp Phe Arg Cys Phe Phe Ser Glu Thr Leu Gln

115 120 125

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Ser Ser Ile Cys Glu Gly Gly Ala Ile Arg Met Asn Pro Asp Glu Ile

130 135 140

ttg atg tct cgt gga ggc gag aaa ttg gag tcg gtt att ggt agg agt 480

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145 150 155

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Glu Asp Asp Glu Leu Pro Val Phe Lys Asn Gly Ala Phe Gln Ile Lys

160 165 170

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ttg aat aaa tac tta ccg gaa ggt gea att tca agg cac act atg cgt 624

Leu Asn Lys Tyr Leu Pro Glu Gly Ala Ile Ser Arg His Thr Met Arg

195 200 205

gaa tta att gac tct att cag tta gtt ggc gcc gat gaa ttt cac tgt 672

Glu Leu Ile Asp Ser Ile Gln Leu Val Gly Ala Asp Glu Phe His Cys

210 215 220

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Ser Glu

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ttcagtgtat atctttaagt gtatttggaa ttttggattt ggatctagta ctgaatgggt 1028

aactgcactt gtactcccca gtcatctggg gaggagcaac agattaaatt caagggttga 1088

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agatgattac tcctataact tttgatgtct aacatggaga aagttagttg atttatgctc 1208

tttacttttc cctttattga ttttggtttt caaattctat caattccttt gtttgattgc 1268

tactcagatt gaaccttaga cggagtagca atagaaaagt gaagaaaagc cattttttct 1328

cctttcatct ctttatttct gttttacaca cagaatatgg tagcatctgt ctgaactagt 1388

taattttatt ccttaaaatt tgcataacta attcgagtaa atgccttttg aagctttagt 1448

tgtacaactg gttgttgcat tttgaggact atcgacttga tttgacagtg tctgatacat 1508

ggcttgtaag ttatgaaaac ttatatctag gaagaaatcc caaccagaga tagggagctg 1568

tcgcttggtt atgagctact ggctcaaagt tcgagtttga ccagttaatt ttagatcttc 1628

ggagtctaat caaattctga agcagtattg tgcactaata agaggaacac atcaaggatg 1688

tagcactgcc aggttatgtt accttattta ctaatgattg agaaccagct taaatgatga 1748

caaatggtct tagatttgtt ttttacattg ctcatgactt tgggatattt ctggatcaac 1808

attttccagt tctttatgta cttatcaaaa aattatccct gctagagcct agatgttagt 1868

gttcaagcaa ccatgctagc ttttaaggaa gctccttctt tgattcatgc catctttccg 1928

taatcgatgc cttacgttac tgtcattttt ctaattttca tttcag tgg att gag 1983

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230 235 240

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245 250 255

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gtatgtttga aagtattgat aacgatggca tgcattgtac tgtgttatgg atgaaagaaa 2184

tgaaatcagc aattattttc tagcaggcaa tgctcttgag atgcttgtgt caaattggtc 2244agacttaatc ctgagtttcc atttgtttca gctttctgtt tgactgacta caataattgt 2304cccaatacct agttgttccg gttggctcat tcttacttct atttacgtgt cactgtttct 2364ctgaatggtc cctttgtggt gaaaagtgct tttgctatga agaaaaacta gcaaagattt 2424catttctggg acaatttatt tttaccttac atcacgtctc ataaaattgc ttcctattgc 2484atactttaat tcttggagag atgctttaat gtgaagaaag ttctttcact ccacttttaa 2544ttcttggaga gatgctttaa tgtgaagaaa gttctttcac tccactactg taagcttgct 2604gcatgaattt tacttggcca tattgggggc gtgttttgat ttatcttcaa attcattttc 2664ttcatgtaat tcttttgagt aatttttttt tctgttttct gtttgggaaa aaattcag 2722

aca caa ttg gag gaa aca tgg aaa gca ctc ttt tca age ctc act tat 2770

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gct aag aac ttt agt ggc cca gtt tgt ttc cgt cac gcc gtt ctc tcg 2818

Ala Lys Asn Phe Ser Gly Pro Val Cys Phe Arg His Ala Val Leu Ser

295 300 305

cct ttg gga tat gaa act gcc ctg ttt aag gga ctg aca gaa act ata 2866

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310 315 320

gat tgt aat gga gct tet gcc cat gat ttg tgg caa aat cct gat gat 2914

Asp Cys Asn Gly Ala Ser Ala His Asp Leu Trp Gln Asn Pro Asp Asp

325 330 335

aag aga act gca cgg ttg tcc gag ttt ggg gag atg ate agg gca gcc 2962Lys Arg Thr Ala Arg Leu Ser Glu Phe Gly Glu Met Ile Arg Ala Ala

340 345 350

ttt gga ttt cct gtg gat aga cag aac ate cca agg aca gtc aca ggc 3010

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cct aat gtc ctc ttt gtt aga cgt gag gat tat tta gct cac cca cgt 3058Pro Asn Val Leu Phe Val Arg Arg Glu Asp Tyr Leu Ala His Pro Arg

375 380 385

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405 410 415

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420 425 430

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Ala Ile Gln Asp Ala Ser Val Ile Val Gly Ala His Gly Ala Gly Leu

435 440 445 450

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455 460 465

age age gaa tat agg cgc ccc cat ttt gct ctg att gea caa tgg aaa 3346

Ser Ser Glu Tyr Arg Arg Pro His Phe Ala Leu Ile Ala Gln Trp Lys

470 475 480

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Gly Leu Glu Tyr His Pro Ile Tyr Leu Glu Gly Ser Tyr Ala Asp Pro

485 490 495

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<210> 8<211> 502<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Estrutura sintética<400>8

Val Ser Leu Phe Ala Leu Asn Ser Ile Thr Leu Tyr Leu Tyr Phe Ser15 10 15

Ser His Ser Asp His Phe Arg His Lys Ser Pro Gln Asn His Phe Pro20 25 30

Asn Thr Gln Asn His Tyr Ser Leu Ser Glu Asn His His Asp Asn Phe

35 40 45

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50 55 60

Ser Tyr Leu Pro Trp Ser Gln Asn Pro Asn Val Ser Leu Arg Ser Cys65 70 75 80

Glu Gly Tyr Phe Gly Asn Gly Phe Thr Leu Lys Val Asp Leu Leu Lys

85 90 95

Thr Ser Pro Glu Leu His Gln Lys Phe Gly Glu Asn Thr Val Ser Gly

100 105 110

Asp Gly Gly Trp Phe Arg Cys Phe Phe Ser Glu Thr Leu Gln Ser Ser

115 120 125

Ile Cys Glu Gly Gly Ala Ile Arg Met Asn Pro Asp Glu Ile Leu Met

130 135 140

Ser Arg Gly Gly Glu Lys Leu Glu Ser Val Ile Gly Arg Ser Glu Asp145 150 155 160

Asp Glu Leu Pro Val Phe Lys Asn Gly Ala Phe Gln Ile Lys Val Thr

165 170 175

Asp Lys Leu Lys Ile Gly Lys Lys Leu Val Asp Glu Lys Ile Leu Asn

180 185 190

Lys Tyr Leu Pro Glu Gly Ala Ile Ser Arg His Thr Met Arg Glu Leu

195 200 205

Ile Asp Ser Ile Gln Leu Val Gly Ala Asp Glu Phe His Cys Ser Glu

210 215 220

Trp Ile Glu Glu Pro Ser Leu Leu Ile Thr Arg Phe Glu Tyr Ala Asn225 230 235 240

Leu Phe His Thr Val Thr Asp Trp Tyr Ser Ala Tyr Val Ala Ser Arg

245 250 255

Val Thr Gly Leu Pro Ser Arg Pro His Leu Val Phe Val Asp Gly His

260 265 270

Cys Glu Thr Gln Leu Glu Glu Thr Trp Lys Ala Leu Phe Ser Ser Leu275 280 285

Thr Tyr Ala Lys Asn Phe Ser Gly Pro Val Cys Phe Arg His Ala Val

290 295 300

Leu Ser Pro Leu Gly Tyr Glu Thr Ala Leu Phe Lys Gly Leu Thr Glu305 310 315 320

Thr Ile Asp Cys Asn Gly Ala Ser Ala His Asp Leu Trp Gln Asn Pro

325 330 335

Asp Asp Lys Arg Thr Ala Arg Leu Ser Glu Phe Gly Glu Met Ile Arg

340 345 350

Ala Ala Phe Gly Phe Pro Val Asp Arg Gln Asn Ile Pro Arg Thr Val

355 360 365

Thr Gly Pro Asn Val Leu Phe Val Arg Arg Glu Asp Tyr Leu Ala His

370 375 380

Pro Arg His Gly Gly Lys Val Gln Ser Arg Leu Ser Asn Glu Glu Gln385 390 395 400

Val Phe Asp Ser Ile Lys Ser Trp Ala Leu Asn His Ser Glu Cys Lys

405 410 415

Leu Asn Val Ile Asn Gly Leu Phe Ala His Met Ser Met Lys Glu Gln

420 425 430

Val Arg Ala Ile Gln Asp Ala Ser Val Ile Val Gly Ala His Gly Ala

435 440 445

Gly Leu Thr His Ile Val Ser Ala Ala Pro Lys Ala Val Ile Leu Glu

450 455 460

Ile Ile Ser Ser Glu Tyr Arg Arg Pro His Phe Ala Leu Ile Ala Gln465 470 475 480

Trp Lys Gly Leu Glu Tyr His Pro Ile Tyr Leu Glu Gly Ser Tyr Ala

485 490 495

Asp Pro Pro Val Val Ile500

<210> 9<211 >3385<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> XylTg3Nt

<220><221 > CDS<222> (7)..(657)<220>

<221 > Intron<222> (658)..(1953)<220><221 > CDS<222> (1954)..(2103)<220>

<221 > Intron<222> (2104)..(2701)<220><221 > CDS<222> (2702)..(3385)<400>9

ttc tct tcc cac cct gat cac ttc cgc cac aaa tcc cgc caa aac cacPhe Ser Ser His Pro Asp His Phe Arg His Lys Ser Arg Gln Asn His15 20 25 30

ttt tcc ttg tcg gaa aac cgc cat cat aat ttc cac tct tca ate actPhe Ser Leu Ser Glu Asn Arg His His Asn Phe His Ser Ser Ile Thr

35 40 45

tct caa tat tcc aag cct tgg cct att ttg ccc tcc tac ctc cct tggSer Gln Tyr Ser Lys Pro Trp Pro Ile Leu Pro Ser Tyr Leu Pro Trp50 55 60tct caa aac cct aat gtt gtt tgg aga tcg tgc gag ggt tac ttc ggt 240Ser Gln Asn Pro Asn Val Val Trp Arg Ser Cys Glu Gly Tyr Phe Gly

65 70 75

aat ggg ttt act ctc aaa gtt gac ctt ctc aaa act tcg ccg gag ttt 288

Asn Gly Phe Thr Leu Lys Val Asp Leu Leu Lys Thr Ser Pro Glu Phe

80 85 90

cac cgg aaa ttc ggc gaa aac acc gtc tcc ggc gac ggc gga tgg ttt 336

His Arg Lys Phe Gly Glu Asn Thr Val Ser Gly Asp Gly Gly Trp Phe

95 100 105 110

agg tgt ttt ttc agt gag act ttg cag agt tcg ate tgc gag gga ggc 384

Arg Cys Phe Phe Ser Glu Thr Leu Gln Ser Ser Ile Cys Glu Gly Gly

115 120 125

gea ata cga atg aat ccg gac gag att ttg atg tct cgt gga ggt gag 432

Ala Ile Arg Met Asn Pro Asp Glu Ile Leu Met Ser Arg Gly Gly Glu

130 135 140

aaa ttg gag tcg gtt att ggt agg agt gaa gat gat gag ctg ccc gtg 480

Lys Leu Glu Ser Val Ile Gly Arg Ser Glu Asp Asp Glu Leu Pro Val

145 150 155

ttc aaa aat gga gct ttt cag att aaa gtt act gat aaa ctg aaa att 528

Phe Lys Asn Gly Ala Phe Gln Ile Lys Val Thr Asp Lys Leu Lys Ile

160 165 170

ggg aaa aaa tta gtg gat gaa aaa ate ttg aat aaa tac tta ccg gaa 576

Gly Lys Lys Leu Val Asp Glu Lys Ile Leu Asn Lys Tyr Leu Pro Glu

175 180 185 190

ggt gea att tca agg cac act atg cgt gaa tta att gac tct att cag 624

Gly Ala Ile Ser Arg His Thr Met Arg Glu Leu Ile Asp Ser Ile Gln

195 200 205

tta gtt ggc gcc gat gaa ttt cac tgt tct gag gttagatttt gaaattttgc 677

Leu Val Gly Ala Asp Glu Phe His Cys Ser Glu

210 215ttgatcttta aattaaaggt ttgaactttg tgaatgttgg cagatatgga atacaataat 737ggattttgtt tgatctgttt aatgaagatt gtctagaacc tcattgttat aaatatggtt 797tgtttgcttc attaattaaa gagcattcct taaaatctcg actagatgcc agataacacc 857

agttagttga cttttggatt atggattttt tttcatttaa tcagataaga tagtcattct 917

taaatgtttc actaaagaat ttgtcatgat ttcagtgtat atctttaagt gtatttggaa 977

ttttggattt ggatctagta ctgaatgggt aactgcactt gtactcccca gtcatctggg 1037

gaggagcaac agattaaatt caagggttga aaagtaatac agagtcagaa attaaccaca 1097

agttggaaaa tggtaaatgt atgtggtcta agatgattac tcctataact tttgatgtct 1157

aacatggaga aagttagttg atttatgctc tttacttttc cctttattga ttttggtttt 1217

caaattctat caattccttt gtttgattgc tactcagatt gaaccttaga cggagtagca 1277

atagaaaagt gaagaaaagc cattttttct cctttcatct ctttatttct gttttacaca 1337

cagaatatgg tagcatctgt ctgaactagt taattttatt ccttaaaatt tgcataacta 1397

attcgagtaa atgccttttg aagctttagt tgtacaactg gttgttgcat tttgaggact 1457

atcgacttga tttgacagtg tctgatacat ggcttgtaag ttatgaaaac ttatatctag 1517

gaagaaatcc caaccagaga tagggagctg tcgcttggtt atgagctact ggctcaaagt 1577

tcgagtttga ccagttaatt ttagatcttc ggagtctaat caaattctga agcagtattg 1637

tgcactaata agaggaacac atcaaggatg tagcactgcc aggttatgtt accttattta 1697

ctaatgattg agaaccagct taaatgatga caaatggtct tagatttgtt ttttacattg 1757

ctcatgactt tgggatattt ctggatcaac attttccagt tctttatgta cttatcaaaa 1817

aattatccct gctagagcct agatgttagt gttcaagcaa ccatgctagc ttttaaggaa 1877

gctccttctt tgattcatgc catctttccg taatcgatgc cttacgttac tgtcattttt 1937

ctaattttca tttcag tgg att gag gag ccg tca ctt ttg att aca cga ttt 1989Trp Ile Glu Glu Pro Ser Leu Leu Ile Thr Arg Phe220 225

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gtg gca tcc agg gtt act ggc ttg ccc agt cgg cca cat ttg gtt ttt 2085Val Ala Ser Arg Val Thr Gly Leu Pro Ser Arg Pro His Leu Val Phe

250 255 260

gta gat ggc cat tgt gag gtatgtttga aagtattgat aacgatggca 2133Val Asp Gly His Cys Glu265

tgcattgtac tgtgttatgg atgaaagaaa tgaaatcagc aattattttc tagcaggcaa 2193tgctcttgag atgcttgtgt caaattggtc agacttaatc ctgagtttcc atttgtttca 2253gctttctgtt tgactgacta caataattgt cccaatacct agttgttccg gttggctcat 2313tcttacttct atttacgtgt cactgtttct ctgaatggtc cctttgtggt gaaaagtgct 2373tttgctatga agaaaaacta gcaaagattt catttctggg acaatttatt tttaccttac 2433atcacgtctc ataaaattgc ttcctattgc atactttaat tcttggagag atgctttaat 2493gtgaagaaag ttctttcact ccacttttaa ttcttggaga gatgctttaa tgtgaagaaa 2553gttctttcac tccactactg taagcttgct gcatgaattt tacttggcca tattgggggc 2613gtgttttgat ttatcttcaa attcattttc ttcatgtaat tcttttgagt aatttttttt 2673tctgttttct gtttgggaaa aaattcag aca caa ttg gag gaa aca tgg aaa 2725

Thr Gln Leu Glu Glu Thr Trp Lys270 275

gca ctc ttt tca age ctc act tat gct aag aac ttt agt ggc cca gtt 2773

Ala Leu Phe Ser Ser Leu Thr Tyr Ala Lys Asn Phe Ser Gly Pro Val

280 285 290

tgt ttc cgt cac gcc gtt ctc tcg cct ttg gga tat gaa act gcc ctg 2821

Cys Phe Arg His Ala Val Leu Ser Pro Leu Gly Tyr Glu Thr Ala Leu

295 300 305

ttt aag gga ctg aca gaa act ata gat tgt aat gga gct tet gcc cat 2869

Phe Lys Gly Leu Thr Glu Thr Ile Asp Cys Asn Gly Ala Ser Ala His

310 315 320

gat ttg tgg caa aat cct gat gat aag aga act gca cgg ttg tcc gag 2917

Asp Leu Trp Gln Asn Pro Asp Asp Lys Arg Thr Ala Arg Leu Ser Glu

325 330 335

ttt ggg gag atg ate agg gca gcc ttt gga ttt cct gtg gat aga cag 2965Phe Gly Glu Met Ile Arg Ala Ala Phe Gly Phe Pro Val Asp Arg Gln340 345 350 355

aac ate cca agg aca gtc aca ggc cct aat gtc ctc ttt gtt aga cgt 3013Asn Ile Pro Arg Thr Val Thr Gly Pro Asn Val Leu Phe Val Arg Arg

360 365 370

gag gat tat tta gct cac cca cgt cat ggt gga aag gta cag tet agg 3061Glu Asp Tyr Leu Ala His Pro Arg His Gly Gly Lys Val Gln Ser Arg375 380 385ctt age aat gaa gag caa gta ttt gat tcc ata aag age tgg gcc ttg 3109

Leu Ser Asn Glu Glu Gln Val Phe Asp Ser Ile Lys Ser Trp Ala Leu

390 395 400

aac cac tcg gag tgc aaa tta aat gta att aac gga ttg ttt gcc cac 3157

Asn His Ser Glu Cys Lys Leu Asn Val Ile Asn Gly Leu Phe Ala His

405 410 415

atg tcc atg aaa gag caa gtt cga gea ate caa gat gea tet gtc att 3205

Met Ser Met Lys Glu Gln Val Arg Ala Ile Gln Asp Ala Ser Val Ile420 425 430 435

gtt ggt gct cat gga gea ggt cta act cac ata gtt tet gea gea cca 3253

Val Gly Ala His Gly Ala Gly Leu Thr His Ile Val Ser Ala Ala Pro

440 445 450

aaa gct gta ata cta gaa att ata age age gaa tat agg cgc ccc cat 3301

Lys Ala Val Ile Leu Glu Ile Ile Ser Ser Glu Tyr Arg Arg Pro His

455 460 465

ttt gct ctg att gea caa tgg aaa gga ttg gag tac cat ccc ata tat 3349

Phe Ala Leu Ile Ala Gln Trp Lys Gly Leu Glu Tyr His Pro Ile Tyr

470 475 480

ttg gag ggg tet tat gcg gat cct cca gtt gtg ate 3385

Leu Glu Gly Ser Tyr Ala Asp Pro Pro Val Val Ile485 490 495

<210> 10<211> 495<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Estrutura sintética<400> 10

Val Ser Leu Phe Ala Leu Asn Ser Ile Thr Leu Tyr Leu Tyr Phe Ser1 5 10 15

Ser His Pro Asp His Phe Arg His Lys Ser Arg Gln Asn His Phe Ser

<520 25 30

Leu Ser Glu Asn Arg His His Asn Phe His Ser Ser Ile Thr Ser Gln

35 40 45

Tyr Ser Lys Pro Trp Pro Ile Leu Pro Ser Tyr Leu Pro Trp Ser Gln

50 55 60

Asn Pro Asn Val Val Trp Arg Ser Cys Glu Gly Tyr Phe Gly Asn Gly65 70 75 80

Phe Thr Leu Lys Val Asp Leu Leu Lys Thr Ser Pro Glu Phe His Arg

85 90 95

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100 105 110

Phe Phe Ser Glu Thr Leu Gln Ser Ser Ile Cys Glu Gly Gly Ala Ile

115 120 125

Arg Met Asn Pro Asp Glu Ile Leu Met Ser Arg Gly Gly Glu Lys Leu

130 135 140

Glu Ser Val Ile Gly Arg Ser Glu Asp Asp Glu Leu Pro Val Phe Lys145 150 155 160

Asn Gly Ala Phe Gln Ile Lys Val Thr Asp Lys Leu Lys Ile Gly Lys

165 170 175

Lys Leu Val Asp Glu Lys Ile Leu Asn Lys Tyr Leu Pro Glu Gly Ala

180 185 190

Ile Ser Arg His Thr Met Arg Glu Leu Ile Asp Ser Ile Gln Leu Val

195 200 205

Gly Ala Asp Glu Phe His Cys Ser Glu Trp Ile Glu Glu Pro Ser Leu

210 215 220

Leu Ile Thr Arg Phe Glu Tyr Ala Asn Leu Phe His Thr Val Thr Asp225 230 235 240

Trp Tyr Ser Ala Tyr Val Ala Ser Arg Val Thr Gly Leu Pro Ser Arg

245 250 255

Pro His Leu Val Phe Val Asp Gly His Cys Glu Thr Gln Leu Glu Glu

260 265 270

Thr Trp Lys Ala Leu Phe Ser Ser Leu Thr Tyr Ala Lys Asn Phe Ser275 280 285

Gly Pro Val Cys Phe Arg His Ala Val Leu Ser Pro Leu Gly Tyr Glu

290 295 300

Thr Ala Leu Phe Lys Gly Leu Thr Glu Thr Ile Asp Cys Asn Gly Ala305 310 315 320

Ser Ala His Asp Leu Trp Gln Asn Pro Asp Asp Lys Arg Thr Ala Arg

325 330 335

Leu Ser Glu Phe Gly Glu Met Ile Arg Ala Ala Phe Gly Phe Pro Val

340 345 350

Asp Arg Gln Asn Ile Pro Arg Thr Val Thr Gly Pro Asn Val Leu Phe

355 360 365

Val Arg Arg Glu Asp Tyr Leu Ala His Pro Arg His Gly Gly Lys Val

370 375 380

Gln Ser Arg Leu Ser Asn Glu Glu Gln Val Phe Asp Ser Ile Lys Ser385 390 395 400

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405 410 415

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420 425 430

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435 440 445

Ala Ala Pro Lys Ala Val Ile Leu Glu Ile Ile Ser Ser Glu Tyr Arg

450 455 460

Arg Pro His Phe Ala Leu Ile Ala Gln Trp Lys Gly Leu Glu Tyr His465 470 475 480

Pro Ile Tyr Leu Glu Gly Ser Tyr Ala Asp Pro Pro Val Val Ile485 490 495

<210> 11<211 >3298<212> DNA<213> Artificial<220><223> XyITg 14Nb<220><221 > CDS<222> (7)..(657)<220><221 > Intron<222> (658)..(1917)<220><221 > CDS<222> (1918)..(2067)<220>

<221 > Intron

<222> (2068)..(2612)

<220>

<221 > CDS

<222> (2613)..(3290)

<400> 11

ttc tct tcc cac cct gat cac tct cgtPhe Ser Ser His Pro Asp His Ser Arg15 20

ttt tcc tcg tcg gaa aac cac cat catPhe Ser Ser Ser Glu Asn His His His35

tcc caa tat tcc agg cct tgg cct attSer Gln Tyir Ser Arg Pro Trp Pro Ile

50 55

tct caa aac cct aat gtt gct tgg agaSer Gln Asn Pro Asn Val Ala Trp Arg65 70

cgc aaa tcc ccc cag aac cacArg Lys Ser Pro Gln Asn His

25 30

aat ttc cac tct tca ate actAsn Phe His Ser Ser Ile Thr40 45

ttg ccc tcc tac ctc cct tggLeu Pro Ser Tyr Leu Pro Trp60

tca tgc gag ggt tac ttc ggtSer Cys Glu Gly Tyr Phe Gly75aat ggt ttt act ctc aaa gtt gat ctt ctc aaa act tcg ccg gag ctt 288

Asn Gly Phe Thr Leu Lys Val Asp Leu Leu Lys Thr Ser Pro Glu Leu

80 85 90

cac cgg aaa ttc ggc gaa aac acc gtc ttc gga gac ggc gga tgg ttt 336

His Arg Lys Phe Gly Glu Asn Thr Val Phe Gly Asp Gly Gly Trp Phe95 100 105 110

agg tgt ttc ttc agt gag act ttg cag agt tcg ate tgc gag gga ggc 384

Arg Cys Phe Phe Ser Glu Thr Leu Gln Ser Ser Ile Cys Glu Gly Gly

115 120 125

gea ata cga atg aat cca gac gag att ttg atg tet cgt gga ggt gag 432

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130 135 140

aaa ttg gag tcg gtt att ggt agg agt gaa gat gat gag gtg ccc gcg 480

Lys Leu Glu Ser Val Ile Gly Arg Ser Glu Asp Asp Glu Val Pro Ala

145 150 155

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Phe Lys Thr Gly Ala Phe Gln Ile Lys Val Thr Asp Lys Leu Lys Phe

160 165 170

ggg aaa aaa tta gtg gat gaa aac ttc ttg aat aaa tac tta ccg gaa 576

Gly Lys Lys Leu Val Asp Glu Asn Phe Leu Asn Lys Tyr Leu Pro Glu175 180 185 190

ggt gea att tca agg cac act atg cgt gag tta ate gac tet att cag 624

Gly Ala Ile Ser Arg His Thr Met Arg Glu Leu Ile Asp Ser Ile Gln

195 200 205

ttg gtt ggc gcc aat gat ttt cac tgt tet gag gttagatttt tgaaattttg 677Leu Val Gly Ala Asn Asp Phe His Cys Ser Glu

210 215

tttgctcttt aaattaaagg tttgaacttt gtgaatgttg geagatatag aatacaataa 737tggaatttgc ttgatctgtt taatgaagat tgtctggaac ctcaatgcta taaatatttg 797tttgtttgct tcattaatta aagagaatat cccaactaga tgccagataa caccagttag 857ttgacttttg gatcggattg catttcattt aatcagatat ggtactcatt cttaaatgtt 917tcactaaagt atttgtcaag atttcagagt ttatatgtag gtgtatttgg aattctggat 977ttggatctag tattgaatgg attactgaac ttgtactccc cagtcatctg gggaggagca 1037

acagattaac ttcaagggtt gaaaagtaat actgagtcag aagttaacca cttcaacttg 1097

gaaaattgta aatgtgtgtg gtctaagatg attactctaa cttttgaggt ctaacatgga 1157

gaaagttagt tgatttatgc tctttacttt tccctttatt gattttggct tttaaattct 1217

atcaattcca ttgtttgatt gctactcaaa ttgaacctta gacggagtag caatagcaaa 1277

aagtgaagaa aggccatttt ttttctcctt tcatctctta atttccgttt tacacacaga 1337

atatggtaga atctgtttga agctttagtt gaatagttat acaactggtt attgcatttt 1397

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gaacttctat ctaggaagaa atcccaacca gagataggga gctgtcactt ggctatgagt 1517

tactggctca aagttcgagt ttgaccagtt aattttagat cctcaccagg ataacattta 1577

gagtctaatc aaattctgaa gcagtattgt gcactaataa gaggaacaca tgaaggatgt 1637

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gacaaatggt cttatatttg ccttttacat tgctcatgac ttgggatatt tctgaatcag 1757

catttttcag ttctttatgt acttatcaaa aaattatccc tgctagatgt tagtgttcaa 1817

gcaaccatgc tagcatttaa cgaagctcct tctttgattc atgcgatctt tccgtaatct 1877

atgccttacg ttactgtcat ttttctaatt ttcatttcag tgg att gag gag ccg 1932

Trp Ile Glu Glu Pro220

tca ctt ttg att aca cga ttt gag tat gca aac ctt ttc cac aca att 1980Ser Leu Leu Ile Thr Arg Phe Glu Tyr Ala Asn Leu Phe His Thr Ile

225 230 235

acc gat tgg tat agt gca tac gtg gca tcg agg gtt act ggc ttg ccc 2028Thr Asp Trp Tyr Ser Ala Tyr Val Ala Ser Arg Val Thr Gly Leu Pro

240 245 250

agt cgg cca cat ttg gtt ttt gta gat ggc cat tgt gag gtatgtctga 2077Ser Arg Pro His Leu Val Phe Val Asp Gly His Cys Glu255 260 265

aagtattgat aacgatggca tgcattgtac tgtcttatgg atgaaagaaa tgaaaccagc 2137

aattattttc tagcaggcaa tgctcttgag atgcttgtgt caaattggtc agacttaatc 2197

ctgagtttcc atttgtttca gctttctgtg tgactgacta caataattgt cccgatacct 2257

aattgttgca gttggctcat tcttatttct atttacgtgt cactgtttct ctgaatggcc 2317

ctttgtggtg aaaagagctt ttgatatgta aaaaaactag caaagatttc atttctggaa 2377caatttcttt ttaccttaca tcacgtgtca taaaattgct tctaactgta tactttaatt 2437cttggagaga tgctttcatg tgaagaaagt tctttcactc cactactgga agcttgctgc 2497atgaatttta cttggccata ttggggccgt gttttgattt atcttcaaat tcattttctt 2557catgtagttc tttcgagtaa ttttttttcc tcttttctgt ttgaaaaaat ttcag aca 2615

Thr

caa ttg gag gaa aca tgg aaa gca ctt ttt tca age ctc act tat gct 2663

Gln Leu Glu Glu Thr Trp Lys Ala Leu Phe Ser Ser Leu Thr Tyr Ala

270 275 280

aag aac ttt agt ggc cca gtt tgt ttc cgt cat gcc gtc ctc tcg cct 2711

Lys Asn Phe Ser Gly Pro Val Cys Phe Arg His Ala Val Leu Ser Pro285 290 295 300

ttg gga tat gaa act gcc ctg ttt aag gga ctg tca gaa act ata gat 2759

Leu Gly Tyr Glu Thr Ala Leu Phe Lys Gly Leu Ser Glu Thr Ile Asp

305 310 315

tgt aat gga gct tet gct cat gat ttg tgg caa aat cct gat gat aag 2807Cys Asn Gly Ala Ser Ala His Asp Leu Trp Gln Asn Pro Asp Asp Lys

320 325 330

aaa act gca cgg tta tcc gag ttt ggg gag atg ate agg gca gcc ttt 2855Lys Thr Ala Arg Leu Ser Glu Phe Gly Glu Met Ile Arg Ala Ala Phe

335 340 345

gga ttt cct gtt gat aga cag aac ate cca agg aca gtc aca ggc cct 2903

Gly Phe Pro Val Asp Arg Gln Asn Ile Pro Arg Thr Val Thr Gly Pro

350 355 360

aat gtc ctc ttt gtt aga cgt gag gat tat tta gct cac cca cgt cat 2951Asn Val Leu Phe Val Arg Arg Glu Asp Tyr Leu Ala His Pro Arg His365 370 375 380

ggt gga aag gta cag tet agg ctt age aat gaa gag caa gta ttt gat 2999Gly Gly Lys Val Gln Ser Arg Leu Ser Asn Glu Glu Gln Val Phe Asp

385 390 395

tcc ata aag age tgg gcc tta aac cac tcg gag tgc aaa tta aat gta 3047Ser Ile Lys Ser Trp Ala Leu Asn His Ser Glu Cys Lys Leu Asn Val400

att agt gga ttg ttt gccIle Ser Gly Leu Phe Ala415

ate caa gat gct tet gtcIle Gln Asp Ala Ser Val430

cac ata gtt tet gea geaHis Ile Val Ser Ala Ala445 450

age gaa tat agg cgc cccSer Glu Tyr Arg Arg Pro465

ttg gag tac cat ccc ataLeu Glu Tyr His Pro Ile480

gtt gtgatcgaVal

405

cac atg tcc atg aaa gagHis Met Ser Met Lys Glu420

att gtt ggt gct cat ggaIle Val Gly Ala His Gly435 440

cca aaa gct gta ata ctaPro Lys Ala Val Ile Leu455

cat ttt gct ctg att gctHis Phe Ala Leu Ile Ala470

tat ttg gag ggg tet tatTyr Leu Glu Gly Ser Tyr485

410

caa gtt cga gea 3095

Gln Val Arg Ala

425

gea ggt cta acc 3143Ala Gly Leu Thr

gaa att ata age 3191Glu Ile Ile Ser460

caa tgg aaa gga 323 9Gln Trp Lys Gly475

gcg gat cct cca 3287

Ala Asp Pro Pro490

3298

<210> 12<211 >493<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Estrutura sintética<400> 12

Val Ser Leu Phe Ala Leu Asn Ser1 5

Ser His Pro Asp His Ser Arg Arg20

Ser Ser Glu Asn His His His Asn35 40

Ile Thr Leu Tyr Leu Tyr Phe Ser

10 15

Lys Ser Pro Gln Asn His Phe Ser25 30

Phe His Ser Ser Ile Thr Ser Gln .45Tyr Ser Arg Pro Trp Pro Ile Leu Pro Ser Tyr Leu Pro Trp Ser Gln

50 55 60

Asn Pro Asn Val Ala Trp Arg Ser Cys Glu Gly Tyr Phe Gly Asn Gly65 70 75 80

Phe Thr Leu Lys Val Asp Leu Leu Lys Thr Ser Pro Glu Leu His Arg

85 90 95

Lys Phe Gly Glu Asn Thr Val Phe Gly Asp Gly Gly Trp Phe Arg Cys

100 105 110

Phe Phe Ser Glu Thr Leu Gln Ser Ser Ile Cys Glu Gly Gly Ala Ile

115 120 125

Arg Met Asn Pro Asp Glu Ile Leu Met Ser Arg Gly Gly Glu Lys Leu

130 135 140

Glu Ser Val Ile Gly Arg Ser Glu Asp Asp Glu Val Pro Ala Phe Lys145 150 155 160

Thr Gly Ala Phe Gln Ile Lys Val Thr Asp Lys Leu Lys Phe Gly Lys

165 170 175

Lys Leu Val Asp Glu Asn Phe Leu Asn Lys Tyr Leu Pro Glu Gly Ala

180 185 190

Ile Ser Arg His Thr Met Arg Glu Leu Ile Asp Ser Ile Gln Leu Val

195 200 205

Gly Ala Asn Asp Phe His Cys Ser Glu Trp Ile Glu Glu Pro Ser Leu

210 215 220

Leu Ile Thr Arg Phe Glu Tyr Ala Asn Leu Phe His Thr Ile Thr Asp225 230 235 240

Trp Tyr Ser Ala Tyr Val Ala Ser Arg Val Thr Gly Leu Pro Ser Arg

245 250 255

Pro His Leu Val Phe Val Asp Gly His Cys Glu Thr Gln Leu Glu Glu

260 265 270

Thr Trp Lys Ala Leu Phe Ser Ser Leu Thr Tyr Ala Lys Asn Phe Ser

275 280 285

Gly Pro Val Cys Phe Arg His Ala Val Leu Ser Pro Leu Gly Tyr Glu290 295 300Thr Ala Leu Phe Lys Gly Leu Ser Glu Thr Ile Asp Cys Asn Gly Ala305 310 315 320

Ser Ala His Asp Leu Trp Gln Asn Pro Asp Asp Lys Lys Thr Ala Arg

325 330 335

Leu Ser Glu Phe Gly Glu Met Ile Arg Ala Ala Phe Gly Phe Pro Val

340 345 350

Asp Arg Gln Asn Ile Pro Arg Thr Val Thr Gly Pro Asn Val Leu Phe

355 360 365

Val Arg Arg Glu Asp Tyr Leu Ala His Pro Arg His Gly Gly Lys Val

370 375 380

Gln Ser Arg Leu Ser Asn Glu Glu Gln Val Phe Asp Ser Ile Lys Ser385 390 395 400

Trp Ala Leu Asn His Ser Glu Cys Lys Leu Asn Val Ile Ser Gly Leu

405 410 415

Phe Ala His Met Ser Met Lys Glu Gln Val Arg Ala Ile Gln Asp Ala

420 425 430

Ser Val Ile Val Gly Ala His Gly Ala Gly Leu Thr His Ile Val Ser

435 440 445

Ala Ala Pro Lys Ala Val Ile Leu Glu Ile Ile Ser Ser Glu Tyr Arg

450 455 460

Arg Pro His Phe Ala Leu Ile Ala Gln Trp Lys Gly Leu Glu Tyr His465 470 475 480

Pro Ile Tyr Leu Glu Gly Ser Tyr Ala Asp Pro Pro Val485 490

<210> 13<211 >3574<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> XyITgI 9Nb<220><221 > CDS<222> (7)..(648)<220>

<221 > Intron

<222> (649) ..(2194)

<220>

<221 > CDS

<222> (2195)..(2344)

<220>

<221 > Intron<222> (2345)..(2888)<220><221 > CDS<222> (2889)..(3566)<400> 13

ttc tct tcc cac cct gat cac aaa tcc ccc caa aac cac ttt tcc ttgPhe Ser Ser His Pro Asp His Lys Ser Pro Gln Asn His Phe Ser Leu15 20 25 30

tcg gaa aac cac cat cat aat ttc cac tct tca ate act tct caa tatSer Glu Asn His His His Asn Phe His Ser Ser Ile Thr Ser Gln Tyr

35 40 45

tcc aag cct tgg cct att ttg ccc tcc tac ctc cct tgg tct caa aacSer Lys Pro Trp Pro Ile Leu Pro Ser Tyr Leu Pro Trp Ser Gln Asn

50 55 60

cct aat gtt gct tgg aga tcg tgc gag ggt tac ttc ggt aat ggg tttPro Asn Val Ala Trp Arg Ser Cys Glu Gly Tyr Phe Gly Asn Gly Phe

65 70 75

act ctc aaa gtt gac ctt ctc aaa act tcg ccg gag ttt cac cgg aaaThr Leu Lys Val Asp Leu Leu Lys Thr Ser Pro Glu Phe His Arg Lys80 85 90

ttc ggc gat aac acc gtc tcc ggt gac ggc gga tgg ttt agg tgt ttt 336

Phe Gly Asp Asn Thr Val Ser Gly Asp Gly Gly Trp Phe Arg Cys Phe95 100 105 110

ttc agt gag act ttg cag agt tcg ate tgc gag gga ggc gea ata cga 384

Phe Ser Glu Thr Leu Gln Ser Ser Ile Cys Glu Gly Gly Ala Ile Arg

115 120 125

atg aat ccg gac gat att ttg atg tet cgt gga ggt gag aaa ttg gag 432

Met Asn Pro Asp Asp Ile Leu Met Ser Arg Gly Gly Glu Lys Leu Glu

130 135 140

tcg gtt att ggt agg aat gaa gat gat gag ctg ccc atg ttc aaa aat 480

Ser Val Ile Gly Arg Asn Glu Asp Asp Glu Leu Pro Met Phe Lys Asn

145 150 155

gga gct ttc caa att gaa gtt act gat aaa ctg aaa att ggg aaa aaa 528

Gly Ala Phe Gln Ile Glu Val Thr Asp Lys Leu Lys Ile Gly Lys Lys

160 165 170

cta gtg gat aaa aaa ttc ttg aat aaa tac tta ccg gga ggt gcg att 576

Leu Val Asp Lys Lys Phe Leu Asn Lys Tyr Leu Pro Gly Gly Ala Ile175 180 185 190

tca agg cac act atg cgt gag tta att gac tet att cag ttg gtt ggc 624

Ser Arg His Thr Met Arg Glu Leu Ile Asp Ser Ile Gln Leu Val Gly

195 200 205

gcc gat gaa ttt cac tgt tet gag gttagatttt gatatttatt tgatctttaa 678Ala Asp Glu Phe His Cys Ser Glu210

attagaggtt tgaactttgt taatgttggc agatatggaa tacaataatg gattttgttt 738gatctgttta atgaagattg tctaaaacct caatgctata aatatttgtt tgtttgcttc 798attaattaaa gagaatatcc cgactagatg ccagataaca ccagttagtt gacttttgga 858ttgggttgca tttcatttaa tcagatatgg tactcattct taaatgtttc actaaagaat 918ttgtcaagat ttcagagttt atatataggt gtatttggaa ttctggattt ggatctagta 978ttgaatggat tactgaattt gtactcccca gtcatcaggg gaggagcaat agategaatt 1038caagggttga aaagtaatac tgagtcagaa at-taaccact ttaacttgga aacggtaaat 1098gtatgtgttc taagatgatt attcctataa cttttgatgt ctaatatgga gaaagtgagt 1158

tgatttatgc tttttccttt tccctttatt gatgttggtt tttaaattct atcaattcct 1218

ttgtttggtt gctactcaaa ttgaacctta gacggagtag caatagcaaa aagtgaagaa 1278

aggacatttt tttctccttt catctcttta tttccgtttg acatacagaa tacggtagca 1338

tctgcctgaa gtggttaatt tcattcctta aaatttgcat aactaatatt tccgtttttg 1398

tttttgttta tcttttccat tggcatgcca tgttattttt ggtttaggtt tacataatta 1458

tttatgtgat ttctgatgga gttactaatg attttttgtt tttgtttttg tttttttctt 1518

ttccttttcc tgagtcgagg gtcgattgga aatagcctct ctgccctttt ggataggggt 1578

aaggcctggg tacgtgtacc atccccagac cccactctgt gggactatac cgggtagttg 1638

ttgttgttgt aattcgagta aatgcctttt gaacctttag ttgaatagtt gtacaactgg 1698

ttgttgcatt ttgaggacta tcgacttgat ttgacacttt acatgaaaac ttttatctag 1758

gaagaaatcc ctaccagaga tagggagctg tcgcttggtt atgagctact ggcttaaagt 1818

ttgagtttga cctattaatt ttagatcttc accaggataa catctagagt ttaattaaat 1878

tctcaagcag tattttgcac taataagggg aacacatgaa ggatgtagca ctactacgtt 1938

atgttcttta tttactattg attgacaacc agcttaaatg atgacaaatg gtcttatatt 1998

tgctttttta cattgctcat gacttgggat atttttgaat caacattttt cggttcttta 2058

tgtacttatc aaaaaattat ccctgctaga tgttagtgtt caagcaacat gctagctttt 2118

aaggaagctc cttctttgat tcatgccatc tttccgaagc cttacgtttc tgtcattttt 2178

ctaattttca tttcag tgg gtt gag gag ccg tca ctt ttg att aca cga ttt 2230Trp Val Glu Glu Pro Ser Leu Leu Ile Thr Arg Phe215 220 225

gag tat gca aac ctt ttc cac aca gtt acc gat tgg tat agt gca tac 2278Glu Tyr Ala Asn Leu Phe His Thr Val Thr Asp Trp Tyr Ser Ala Tyr

230 235 240

gcg gca tcc agg gtt act ggt ttg ccc agt cgg cca aat ttg gtt ttt 2326Ala Ala Ser Arg Val Thr Gly Leu Pro Ser Arg Pro Asn Leu Val Phe

245 250 255

gta gat ggc cat tgt gag gtatgtttga cagtattgat aacgatggca 2374Val Asp Gly His Cys Glu260

tgcattgtac tgtgttatgg atgaaagaaa tgaaaccatc aattattttc tagtaggcaa 2434

tgctcttaag atgcttgtgt caaattggtt agagttaatc ctaagtttcc atttgtttga 2494gctttctgtt tgactgacta caatacttgt cccaatacct agttgttgcg gttggctcat 2554tcttacttct atttacgtgt cactgtttct ctgaatggtc cctttgtggt gaaaagagct 2614tttgctatgt agaaaaacta gcaaagattt catttctgga gcaacttatt tttaccttac 2674atcacgtctc ataaaattgc ttctaactgt atactttaat tcttggagag atgctttcat 2734gtgaataaag ttctttcact ccactactgg aagcttgctg catgaaattt acttggccat 2794actggggccg tgttttgatt tgtcttcaaa ttcattttct tcatgtagtt ctttcgagta 2854atattttttc ctcttctgtt tgaaaaaaat tcag aca caa ttg gag gaa aca tgg 2909

Thr Gln Leu Glu Glu Thr Trp265 270

aaa gca ctt ttt tca age ctc act tat gct aag aac ttt agt ggc cca 2957Lys Ala Leu Phe Ser Ser Leu Thr Tyr Ala Lys Asn Phe Ser Gly Pro

275 280 285

gtt tgt ttc cgt cat gct gtc ctc tcg cct tta gga tat gaa act gcc 3005

Val Cys Phe Arg His Ala Val Leu Ser Pro Leu Gly Tyr Glu Thr Ala

290 295 300

ctg ttt aag gga ctg tca gaa act ata gat tgt aat gga gct tet gct 3053

Leu Phe Lys Gly Leu Ser Glu Thr Ile Asp Cys Asn Gly Ala Ser Ala

305 310 315

cat gat ttg tgg caa aag cct gat gat aaa aaa act gca cgg ttg tcc 3101

His Asp Leu Trp Gln Lys Pro Asp Asp Lys Lys Thr Ala Arg Leu Ser320 325 330 335

gag ttt ggg gag atg ate agg gca gcc ttt gga ttt cct gtg gat aga 3149Glu Phe Gly Glu Met Ile Arg Ala Ala Phe Gly Phe Pro Val Asp Arg

340 345 350

cag aac ate cca agg aca gtc aca ggc cct aat gtc ctc ttt gtt aga 3197Gln Asn Ile Pro Arg Thr Val Thr Gly Pro Asn Val Leu Phe Val Arg

355 360 365

cgt gag gat tat tta gct cac cca cgt cat ggt gga aag gta cag tet 3245Arg Glu Asp Tyr Leu Ala His Pro Arg His Gly Gly Lys Val Gln Ser

370 375 380

agg ctt age aat gaa gag cta gta ttt gat tcc ata aag age tgg gcc 3293Arg Leu Ser Asn Glu Glu Leu Val Phe Asp Ser Ile Lys Ser Trp Ala385 390 395

ttg aac cac tcg gag tgt aaa tta aat gta att aac gga ttg ttt gccLeu Asn His Ser Glü Cys Lys Leu Asn Val Ile Asn Gly Leu Phe Ala400 405 410 415

cac atg tcc atg aaa gag caa gtt cga gca ate caa gat gct tet gtcHis Met Ser Met Lys Glu Gln Val Arg Ala Ile Gln Asp Ala Ser Val

420 425 430

att gtt ggt gct cat gga gca ggt cta act cac ata gtt tet gca gcaIle Val Gly Ala His Gly Ala Gly Leu Thr His Ile Val Ser Ala Ala

435 440 445

cca aaa gct gta ata cta gaa att ata age age gaa tat agg cgc cccPro Lys Ala Val Ile Leu Glu Ile Ile Ser Ser Glu Tyr Arg Arg Pro

450 455 460

cat ttt gct ctg att gca caa tgg aaa gga ttg gag tac cat ccc ataHis Phe Ala Leu Ile Ala Gln Trp Lys Gly Leu Glu Tyr His Pro Ile

465 ' 470 475

tat ttg gag ggg tet tat gcg gat cct cca gtt gtgatcgaTyr Leu Glu Gly Ser Tyr Ala Asp Pro Pro Val480 485 490

<210> 14<211 >490<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Estrutura sintética<400> 14

Val Ser Leu Phe Ala Leu Asn Ser Ile Thr Leu Tyr Leu Tyr Phe Ser15 10 15

Ser His Pro Asp His Lys Ser Pro Gln Asn His Phe Ser Leu Ser Glu

20 25 30

Asn His His His Asn Phe His Ser Ser Ile Thr Ser Gln Tyr Ser Lys35 40 45Pro Trp Pro Ile Leu Pro Ser Tyr Leu Pro Trp Ser Gln Asn Pro Asn

50 55 60

Val Ala Trp Arg Ser Cys Glu Gly Tyr Phe Gly Asn Gly Phe Thr Leu65 70 75 80

Lys Val Asp Leu Leu Lys Thr Ser Pro Glu Phe His Arg Lys Phe Gly

85 90 95

Asp Asn Thr Val Ser Gly Asp Gly Gly Trp Phe Arg Cys Phe Phe Ser

100 105 110

Glu Thr Leu Gln Ser Ser Ile Cys Glu Gly Gly Ala Ile Arg Met Asn

115 120 125

Pro Asp Asp Ile Leu Met Ser Arg Gly Gly Glu Lys Leu Glu Ser Val

130 135 140

Ile Gly Arg Asn Glu Asp Asp Glu Leu Pro Met Phe Lys Asn Gly Ala145 150 155 160

Phe Gln Ile Glu Val Thr Asp Lys Leu Lys Ile Gly Lys Lys Leu Val

165 170 175

Asp Lys Lys Phe Leu Asn Lys Tyr Leu Pro Gly Gly Ala Ile Ser Arg

180 185 190

His Thr Met Arg Glu Leu Ile Asp Ser Ile Gln Leu Val Gly Ala Asp

195 200 205

Glu Phe His Cys Ser Glu Trp Val Glu Glu Pro Ser Leu Leu Ile Thr

210 215 220

Arg Phe Glu Tyr Ala Asn Leu Phe His Thr Val Thr Asp Trp Tyr Ser225 230 235 240

Ala Tyr Ala Ala Ser Arg Val Thr Gly Leu Pro Ser Arg Pro Asn Leu

245 250 255

Val Phe Val Asp Gly His Cys Glu Thr Gln Leu Glu Glu Thr Trp Lys

260 265 270

Ala Leu Phe Ser Ser Leu Thr Tyr Ala Lys Asn Phe Ser Gly Pro Val

275 280 285

Cys Phe Arg His Ala Val Leu.Ser Pro Leu Gly Tyr Glu Thr Ala Leu290 295 300Phe Lys Gly Leu Ser Glu Thr Ile Asp Cys Asn Gly Ala Ser Ala His305 310 315 320

Asp Leu Trp Gln Lys Pro Asp Asp Lys Lys Thr Ala Arg Leu Ser Glu

325 330 335

Phe Gly Glu Met Ile Arg Ala Ala Phe Gly Phe Pro Val Asp Arg Gln

340 345 350

Asn Ile Pro Arg Thr Val Thr Gly Pro Asn Val Leu Phe Val Arg Arg

355 360 365

Glu Asp Tyr Leu Ala His Pro Arg His Gly Gly Lys Val Gln Ser Arg

370 375 380

Leu Ser Asn Glu Glu Leu Val Phe Asp Ser Ile Lys Ser Trp Ala Leu385 390 395 400

Asn His Ser Glu Cys Lys Leu Asn Val Ile Asn Gly Leu Phe Ala His

405 410 415

Met Ser Met Lys Glu Gln Val Arg Ala Ile Gln Asp Ala Ser Val Ile

420 425 430

Val Gly Ala His Gly Ala Gly Leu Thr His Ile Val Ser Ala Ala Pro

435 440 445

Lys Ala Val Ile Leu Glu 13.6 Ile Sex* Seir Glu Tyr Ajrg Zkjcçj Piro His

450 455 460

Phe Ala Leu Ile Ala Gln Trp Lys Gly Leu Glu Tyr His Pro Ile Tyr465 470 475 480

Leu Glu Gly Ser Tyr Ala Asp Pro Pro Val485 490

<210> 15<211> 27<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> oligonucleotídeo XylF8<400> 15

cacctctcgc ctttgggata tgaaact<210> 16<211 >24<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> oligonucleotídeo XylR8<400> 16

acagcttttg gtgctgcaga aact 24

<210> 17<211 >473<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> XylTi4Nt<400> 17

cacctctcgc ctttgggata tgaaactgcc ctgtttaagg gactgacaga aactatagat 60tgtaatggag cttctgccca tgatttgtgg caaaatcctg atgataagag aactgcacgg 120ttgtccgagt ttggggagat gatcagggca gcctttggat ttcctgtgga tagacagaac 180atcccaagga cagtcacagg ccctaatgtc ctctttgtta gacgtgagga ttatttagct 240cacccacgtc atggtggaaa ggtacagtct aggcttagca atgaagagca agtatttgat 300tccataaaga gctgggcctt gaaccactcg gagtgcaaat taaatgtaat taacggattg 360tttgcccaca tgtccatgaa agagcaagtt cgagcaatcc aagatgcatc tgtcattgtt 420ggtgctcatg gagcaggtct aactcacata gtttctgcag caccaaaagc tgt 473

<210> 18<211 >7954<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> T-DNA de pTKW20<220>

<221 > misc feature<222> (1)..(619)<223> borda direita<220>

<221 > misc_feature<222> (969)..(2314)

<223> seqüência incluindo a região promotora do transcrito 35S do vírusmosaico de Couve-Flor (Odell e outros, 1985)<220>

<221 > misc_feature<222> (2365)..(2834)

<223> seqüência incluindo uma parte da seqüência de cDNA de XyIT deNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1 clonada na orientação sentido<220>

<221 > misc_feature<222> (2893)..(3088)

<223> seqüência incluindo o íntron do gene de catase-1 de semente demamona<220>

<221 > misc_feature<222> (3130)..(3871)

<223> seqüência contendo o segundo íntron do gene de diquínase de orto-fosfato de Flaveria trinervia conforme descrito por Rosche e Westhoff (1995)na orientação reversa<220>

<221 > misc_feature<222> (3957)..(4426)

<223> seqüência incluindo uma parte da seqüência de cDNA de XyIT deNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1 clonada na orientação anti-sentido<220>

<221 > m isc_featu re<222> (4479)..(5244)

<223> seqüência incluindo a região não traduzida 3'do gene de sintase deoctopina de Agrobacterium tumefaciens conforme descrito por De Greve eoutros (1982)<220>

<221 > misc_feature<222> (5512)..(5744)

<223> seqüência incluindo a região promotora do gene de sintase de nopali-na de T-DNA de Agrobacterium tumefaciens<220>

<221 > misc_feature<222> (5745)..(6690)

<223> seqüência incluindo o gene de resistência a antibiótico nptll<220>

<221 > misc_feature<222> (6691)..(7396)

<223> seqüência incluindo a região não traduzida 3' do gene de sintase denopalina de T-DNA de A. tumefaciens<220>

<221 > misc_feature<222> (7397)..(7954)<223> borda esquerda<400> 18

tcgacatctt gctgcgttcg gatattttcg tggagttccc gccacagacc cggattgaag 60gcgagatcca gcaactcgcg ccagatcatc ctgtgacgga actttggcgc gtgatgactg 120gccaggacgt cggccgaaag agcgacaagc agatcacgat tttcgacagc gtcggatttg 180cgatcgagga tttttcggcg ctgcgctacg tccgcgaccg cgttgaggga tcaagccaca 240gcagcccact cgaccttcta gccgacccag acgagccaag ggatcttttt ggaatgctgc 300tccgtcgtca ggctttccga cgtttgggtg gttgaacaga agtcattatc gtacggaatg 360ccagcactcc cgaggggaac cctgtggttg gcatgcacat acaaatggac gaacggataa 420accttttcac gcccttttaa atatccgtta ttctaataaa cgctcttttc tcttaggttt 480acccgccaat atatcctgtc aaacactgat agtttaaact gaaggcggga aacgacaatc 540tgatcatgag cggagaatta agggagtcac gttatgaccc ccgccgatga cgcgggacaa 600gccgttttac gtttggaact gacagaaccg caacgattga aggagccact cagccccaat 660acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt 720tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc tcactcatta 780ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa ttgtgagcgg 840ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagctat ttaggtgaca 900

ctatagaata ctcaagctat gcatccaacg cgttgggagc tctcccatat cgacctgcag 960

gcggccgctc gacgaattaa ttccaatccc acaaaaatct gagcttaaca gcacagttgc 1020

tcctctcaga gcagaatcgg gtattcaaca ccctcatatc aactactacg ttgtgtataa 1080

cggtccacat gccggtatat acgatgactg gggttgtaca aaggcggcaa caaacggcgt 1140

tcccggagtt gcacacaaga aatttgccac tattacagag gcaagagcag cagctgacgc 1200

gtacacaaca agtcagcaaa cagacaggtt gaacttcatc cccaaaggag aagctcaact 1260

caagcccaag agctttgcta aggccctaac aagcccacca aagcaaaaag cccactggct 1320

cacgctagga accaaaaggc ccagcagtga tccagcccca aaagagatct cctttgcccc 1380

ggagattaca atggacgatt tcctctatct ttacgatcta ggaaggaagt tcgaaggtga 1440

aggtgacgac actatgttca ccactgataa tgagaaggtt agcctcttca atttcagaaa 1500

gaatgctgac ccacagatgg ttagagaggc ctacgcagca ggtctcatca agacgatcta 1560

cccgagtaac aatctccagg agatcaaata ccttcccaag aaggttaaag atgcagtcaa 1620

aagattcagg actaattgca tcaagaacac agagaaagac atatttctca agatcagaag 1680

tactattcca gtatggacga ttcaaggctt gcttcataaa ccaaggcaag taatagagat 1740

tggagtctct aaaaaggtag ttcctactga atctaaggcc atgcatggag tctaagattc 1800

aaatcgagga tctaacagaa ctcgccgtga agactggcga acagttcata cagagtcttt 1860

tacgactcaa tgacaagaag aaaatcttcg tcaacatggt ggagcacgac actctggtct 1920

actccaaaaa tgtcaaagat acagtctcag aagaccaaag ggctattgag acttttcaac 1980

aaaggataat ttcgggaaac ctcctcggat tccattgccc agctatctgt cacttcatcg 2040

aaaggacagt agaaaaggaa ggtggctcct acaaatgcca tcattgcgat aaaggaaagg 2100

ctatcattca agatctctct gccgacagtg gtcccaaaga tggaccccca cccacgagga 2160

gcatcgtgga aaaagaagac gttccaacca cgtcttcaaa gcaagtggat tgatgtgaca 2220

tctccactga cgtaagggat gacgcacaat cccactatcc ttcgcaagac ccttcctcta 2280

tataaggaag ttcatttcat ttggagagga cacgctcgag acaagtttgt acaaaaaagc 2340

aggctccgcg gccgccccct tcacctctcg cctttgggat atgaaactgc cctgtttaag 2400

ggactgacag aaactataga"ttgtaatgga gcttctgccc atgatttgtg gcaaaatcct 2460

gatgataaga gaactgcacg gttgtccgag tttggggaga tgatcagggc agcctttgga 2520

tttcctgtgg atagacagaa catcccaagg acagtcacag gccctaatgt cctctttgtt 2580agacgtgagg attatttagc tcacccacgt catggtggaa aggtacagtc taggcttagc 2640

aatgaagagc aagtatttga ttccataaag agctgggcct tgaaccactc ggagtgcaaa 2700

ttaaatgtaa ttaacggatt gtttgcccac atgtccatga aagagcaagt tcgagcaatc 2760

caagatgcat ctgtcattgt tggtgctcat ggagcaggtc taactcacat agtttctgca 2820

gcaccaaaag ctgtaagggt gggcgcgccg acccagcttt cttgtacaaa gtggtctaga 2880

ggatccaagc ttgtgcaggt aaatttctag tttttctcct tcattttctt ggttaggacc 2940

cttttctctt tttatttttt tgagctttga tctttcttta aactgatcta ttttttaatt 3000

gattggttat ggcgcaaata ttacatagct ttaactgata atctgattac tttatttcgt 3060

gtgtctatga tgatgatgat aactgcagcg caagcttatc gatttcgaac ccagcttccc 3120

aactgtaatc aatccaaatg taagatcaat gataacacaa tgacatgatc tatcatgtta 3180

ccttgtttat tcatgttcga ctaattcatt taattaatag tcaatccatt tagaagttaa 3240

taaaactaca agtattattt agaaattaat aagaatgttg attgaaaata atactatata 3300

aaatgataga tcttgcgctt tgttatatta gcattagatt atgttttgtt acattagatt 3360

actgtttcta ttagtttgat attatttgtt actttagctt gttatttaat attttgttta 3420

ttgataaatt acaagcagat tggaatttct aacaaaatat ttattaactt ttaaactaaa 34 80

atatttagta atggtataga tatttaatta tataataaac tattaatcat aaaaaaatat 3540

tattttaatt tatttattct tatttttact atagtatttt atcattgata tttaattcat 3 600

caaaccagct agaattacta ttatgattaa aacaaatatt aatgctagta tatcatctta 3660

catgttcgat caaattcatt aaaaataata tacttactct caacttttat cttcttcgtc 3720

ttacacatca cttgtcatat ttttttacat tactatgttg tttatgtaaa caatatattt 3780

ataaattatt ttttcacaat tataacaact atattattat aatcatacta attaacatca 3840

cttaactatt ttatactaaa aggaaaaaag aaaataatta tttccttacc aagctggggt 3900

accgaattcc tcgagaccac tttgtacaag aaagctgggt cggcgcgccc acccttacag 3960

cttttggtgc tgcagaaact atgtgagtta gacctgctcc atgagcacca acaatgacag 4020

atgcatcttg gattgctcga acttgctctt tcatggacat gtgggcaaac aatccgttaa 4080

ttacatttaa tttgcactcc gagtggttca aggcccagct ctttatggaa tcaaatactt 4140

gctcttcatt gctaagccta gactgtacct ttccaccatg acgtgggtga gctaaataat 4200

cctcacgtct aacaaagagg acattagggc ctgtgactgt ccttgggatg ttctgtctat 4260

ccacaggaaa tccaaaggct gccctgatca tctccccaaa ctcggacaac cgtgcagttc 4320

tcttatcatc aggattttgç cacaaatcat gggcagaagc tccattacaa tctatagttt 4380

ctgtcagtcc cttaaacagg gcagtttcat atcccaaagg cgagaggtga agggggcggc 4440

cgcggagcct gcttttttgt acaaacttgt ctagagtcct gctttaatga gatatgcgag 4500acgcctatga tcgcatgata tttgctttcagcatgtgtag ctcagatcct taccgccggtttactatcgt atttttatga ataatattctttatatgtac aatattaaaa tgaaaacaatctatgataga gcgccacaat aacaaacaataaaaagcggc agaaccggtc aaacctaaaaaaaaggcccc aggggctagt atctacgacaaagggaactc cggttccccg ccggcgcgcaccgtccgctc taccgaaagt tacgggcaccaaccgacttg ctgccccgag aattatgcagaagtgcaggt caaaccttga cagtgacgacgcgacaacat gtcgaggctc agcaggacctcatattctat agtgtcacct aaatctgcgggccgggagca tgcgacgtcg ggcccaattcggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactgggatgcagcacat ccccctttcg ccagctggcgttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcgagagtttaatg agctaagcac atacgtcagaaggtcactat cagctagcaa atatttcttgtcccctcggt atccaattag agtctcatataattacctta tccgcaactt ctttacctatcgcttgggtg gagaggctat tcggctatgatgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggggtccggtgcc ctgaatgaac tgcaggacgagggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgtattgggcgaa gtgccggggc aggatctcctatccatcatg gctgatgcaa tgcggcggctcgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcgcgatcaggat gatctggacg aagagcatcagctcaaggcg cgcatgcccg acggcgaggagccgaatatc atggtggaaa atggccgctttgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt

attctgttgt gcacgttgta aaaaacctga 45€0

ttcggttcat tctaatgaat atatcacccg 4620

ccgttcaatt tactgattgt accctactac 4680

atattgtgct gaataggttt atagcgacat 4740

tgcgttttat tattacaaat ccaattttaa 4800

gactgattac ataaatctta ttcaaatttc 4860

caccgagcgg cgaactaata acgttcactg 4920

tgggtgagat tccttgaagt tgagtattgg 4980

attcaacccg gtccagcacg gcggccgggt 5040

catttttttg gtgtatgtgg gccccaaatg 5100

aaatcgttgg gcgggtccag ggcgaatttt 5160

gcaggcatgc aagctagctt actagtgatg 5220

ccgcactagt gatatcccgc ggccatggcg 5280

gccctatagt gagtcgtatt acaattcact 5340

aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct 5400

taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc 5460

atggaaattg taaacgttaa tgggtttctg 5520

aaccattatt gcgcgttcaa aagtcgccta 5580

tcaaaaatgc tccactgacg ttccataaat 5640

tcactctcaa tccaaataat ctgcaatggc 5700

ttccgcccgg atccgggcag gttctccggc 5760

ctgggcacaa cagacaatcg gctgctctga 5820

gcgcccggtt ctttttgtca agaccgacct 5880

ggcagcgcgg ctatcgtggc tggccacgac 5940

tgtcactgaa gcgggaaggg actggctgct 6000

gtcatctcac cttgctcctg ccgagaaagt 6060

gcatacgctt gatccggcta cctgcccatt 6120

agcacgtact cggatggaag ccggtcttgt 6180

ggggctcgcg ccagccgaac tgttcgccag 6240

tctcgtcgtg acccatggcg atgcctgctt 6300

ttctggattc atcgactgtg gccggctggg 6360

ggctacccgt gatattgctg aagagcttgg 6420cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgctcatcgccttc tatcgccttc ttgacgagttaccgaccaag cgacgcccaa cctgccatcagaaaggttgg gcttcggaat cgttttccgggatctcatgc tggagttctt cgcccaccccagcaaataga ccacgaacgc cggaaggttgtcttgcagga atgcaatgat gaatatgatatagcaccgtc acctcataac gtgcatcatgtttctgaaga attatgctcg ttggaggatgaactacccct cacgcatgca ttcatcaatacaactggcaa atcatccagc gtgattggtagtgctaccca cgttttcaat aaggacgagaagatcgttca aacatttggc aataaagtttgatgattatc atataatttc tgttgaattacatgacgtta tttatgagat gggtttttatcgcgatagaa aacaaaatat agcgcgcaaatatgttacta gatcgaatta attccaggcgctggtgaaaa gaaaaaccac cccagtacattctaagcgtc aatttgttta caccacaatacgaccggcag ctcggcacaa aatcaccactcgtcagcggg agagccgttg taaggcggcaaagaacggca actaagctgc cgggtttgaatgattgtaac gatgacagag cgttgctgcctccgaattat cagccttctt attcatttctgaactatgcc gacataatag gaaatcgctgtatttcttta gaagtgaacg ttgacgatgt

ttacggtatc gccgctcccg attcgcagcg 6480

cttctgagcg ggactctggg gttcgaaatg 6540

cgagatttcg attccaccgc cgccttctat 6600

gacgccggct ggatgatcct ccagcgcggg 6660

gatccaacac ttacgtttgc aacgtccaag 6720

ccgcagcgtg tggattgcgt ctcaattctc 6780

ctgactatga aactttgagg gaatactgcc 6840

catgccctga caacatggaa catcgctatt 6900

tcgcggcaat tgcagctatt gccaacatcg 6960

ttattcatgc ggggaaaggc aagattaatc 7020

acttcagttc cagcgacttg attcgttttg 7080

tggtggagta aagaaggagt gcgtcgaagc 7140

cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc 7200

cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg 7260

gattagagtc ccgcaattat acatttaata 7320

ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc 7380

gtgaagggca atcagctgtt gcccgtctca 7440

taaaaacgtc cgcaatgtgt tattaagttg 7500

tatcctgcca ccagccagcc aacagctccc 7560

cgatacaggc agcccatcag tccgggacgg 7620

gactttgctc atgttaccga tgctattcgg 7680

acacggatga tctcgcggag ggtagcatgt 7740

tgtgatcaaa tatcatctcc ctcgcagaga 7800

cgcttaaccg tgacaggctg tcgatcttga 7860

gataaagccg ctgaggaagc tgagtggcgc 7920

cgac 7954

<210> 19<211 >41<212> DNA<213> Artificial<220><223> oligonucleotídeo XylF9<400> 19

ggccggatcc tcgagacaca attggaggaa acatggaaag c

<210> 20<211> 40<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> oligonucleotídeo XylR9<400> 20

ggccatcgat ggtaccggcc cagctcttta tggaatcaaa<210> 21<211 >436<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> XyITiNb<400> 21

ggccggatcc tcgagacaca attggaggaa acatggaaag cacttttttc aagcctcacttatgctaaga actttagtgg cccagtttgt ttccgtcatg ccgtcctctc gcctttgggatatgaaactg ccctgtttaa gggactgtca gaaactatag attgtaatgg agcttctgctcatgatttgt ggcaaaatcc tgatgataag aaaactgcac ggttatccga gtttggggagatgatcaggg cagcctttgg atttcctgtt gatagacaga acatcccaag gacagtcacaggccctaatg tcctctttgt tagacgtgag gattatttag ctcacccacg tcatggtggaaaggtacagt ctaggcttag caatgaagag caagtatttg attccataaa gagctgggccggtaccatcg atggcc

<210> 22<211 >5093<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> T-DNA de pTKW29<220>

<221 > misc_feature<222> (1)..(25)

<223> repetição de borda direita do T-DNA de Agrobacterium tumefaciens(Zambryski, 1988)<220>

<221 > misc_feature<222> (76)..(786)

<223> seqüência incluindo a região não traduzida 3' do gene de sintase deoctopina de Agrobacterium tumefaciens conforme descrito por De Greve eoutros(1982) (complemento)<220>

<221 > misc_feature<222> (807)..(1211)

<223> seqüência incluindo uma parte do gene de XyITde Nicotiana bentha-miana clonado na orientação anti-sentido (complemento)<220>

<221 > misc_feature<222> (1250)..(1991)

<223> seqüência contendo o segundo íntron do gene de diquínase de orto-fosfato de piruvato de Flaveria trinervia conforme descrito por Rosche eWesthoff (1995) (complemento)<220>

<221 > misc_feature<222> (2023) (2427)

<223> seqüência incluindo uma parte do gene XyIT de Nicotiana benthamia-na clonado na oriientação sentido (complemento)<220>

<221 > misc_feature<222> (2434)..(3779)<223> seqüência incluindo a região promotora do transcrito 35S do vírusmosaico da couve-flor (Odell e outros, 1985) (complemento)<220>

<221 > misc_feature<222> (3854)..(4140)

<223> seqüência incluindo a região promotora do gene de sintase de nopali-na de T-DNA de A. tumefaciens<220>

<221 > misc_feature<222> (4161)..(4712)

<223> seqüência incluindo o gene de resistência à fosfinotricina bar [DeBlock e outros (1987) EMBO J 6:2513]<220>

<221 > misc_feature<222> (4731)..(4991)

<221 > m isc_featu re<222> (5069)..(5093)

<223> repetição de borda esquerda do T-DNA de Agrobacterium tumefaci-ens (Zambryski, 1988)<400> 22

aattacaacg gtatatatcc tgccagtact cggccgtcga ccgcggtacc ccggaattaa 60

gcttgcatgc ctgcaggtcc tgctgagcct cgacatgttg tcgcaaaatt cgccctggac 120ccgcccaacg atttgtcgtc actgtcaagg tttgacctgc acttcatttg gggcccacat 180acaccaaaaa aatgctgcat aattctcggg gcagcaagtc ggttacccgg ccgccgtgct 240ggaccgggtt gaatggtgcc cgtaactttc ggtagagcgg acggccaata ctcaacttca 300aggaatctca cccatgcgcg ccggcgggga accggagttc ccttcagtga acgttattag 360ttcgccgctc ggtgtgtcgt agatactagc ccctggggcc ttttgaaatt tgaataagat 420ttatgtaatc agtcttttag gtttgaccgg ttctgccgct ttttttaaaa ttggatttgt 480aataataaaa cgcaattgtt tgttattgtg gcgctctatc atagatgtcg ctataaacct 540attcagcaca atatattgtt ttcattttaa tattgtacat ataagtagta gggtacaatc 600

agtaaattga acggagaata ttattcataa aaatacgata gtaacgggtg atatattcat 660

tagaatgaac cgaaaccggc ggtaaggatc tgagctacac atgctcaggt tttttacaac 720

gtgcacaaca gaattgaaag caaatatcat gcgatcatag gcgtctcgca tatctcatta 780

aagcaggact ctagaggatc ctcgagacac aattggagga aacatggaaa gcactttttt 840

caagcctcac ttatgctaag aactttagtg gcccagtttg tttccgtcat gccgtcctct 900

cgcctttggg atatgaaact gccctgttta agggactgtc agaaactata gattgtaatg 960

gagcttctgc tcatgatttg tggcaaaatc ctgatgataa gaaaactgca cggttatccg 1020

agtttgggga gatgatcagg gcagcctttg gatttcctgt tgatagacag aacatcccaa 1080

ggacagtcac aggccctaat gtcctctttg ttagacgtga ggattattta gctcacccac 1140

gtcatggtgg aaaggtacag tctaggctta gcaatgaaga gcaagtattt gattccataa 1200

agagctgggc cggtaccatc gatttcgaac ccaatttccc aactgtaatc aatccaaatg 1260

taagatcaat gataacacaa tgacatgatc tatcatgtta ccttgtttat tcatgttcga 1320

ctaattcatt taattaatag tcaatccatt tagaagttaa taaaactaca agtattattt 1380

agaaattaat aagaatgttg attgaaaata atactatata aaatgataga tcttgcgctt 1440

tgttacatta gcattagatt atgttttgtt acattagatt actgtttcta ttagtttgat 1500

attatttgtt actttagctt gttatttaat attttgttta ttgataaatt acaagcagat 1560

tggaatttct aacaaaatat ttattaactt ttaaactaaa atatttagta atggtataga 1620

tatttaatta tataataaac tattaatcat aaaaaaatat tattttaatt tatttattct 1680

tatttttact atagtatttt atcattgata tttaattcat caaaccagct agaattacta 1740

ttatgattaa aacaaatatt aatgctagta tatcatctta catgttcgat caaattcatt 1800

aaaaataata tacttactct caacttttat cttcttcgtc ttacacatca cttgtcatat 1860

ttttttacat tactatgttg tttatgtaaa caatatattt ataaattatt ttttcacaat 1920

tataacaact atattattat aatcatacta attaacatca cttaactatt ttatactaaa 1980

aggaaaaaag aaaataatta tttccttacc aattggggta ccggcccagc tctttatgga 2040

atcaaatact tgctcttcat tgctaagcct agactgtacc tttccaccat gacgtgggtg 2100

agctaaataa tcctcacgtc taacaaagag gacattaggg cctgtgactg tccttgggat 2160

gttctgtcta tcaacaggaa atccaaaggc tgccctgatc atctccccaa actcggataa 2220

ccgtgcagtt ttcttatcat caggattttg ccacaaatca tgagcagaag ctccattaca 2280

atctatagtt tctgacagtc ccttaaacag ggcagtttca tatcccaaag gcgagaggac 2340

ggcatgacgg aaacaaactg ggccactaáa gttcttagca taagtgaggc ttgaaaaaag 2400

tgctttccat gtttcctcca attgtgtctc gagcgtgtcc tctccaaatg aaatgaactt 2460ccttatatag aggaagggtc ttgcgaagga tagtgggatt gtgcgtcatc ccttacgtca 2520

gtggagatgt cacatcaatc cacttgcttt gaagacgtgg ttggaacgtc ttctttttcc 2580

acgatgctcc tcgtgggtgg gggtccatct ttgggaccac tgtcggcaga gagatcttga 2640

atgatagcct ttcctttatc gcaatgatgg catttgtagg agccaccttc cttttctact 2700

gtcctttcga tgaagtgaca gatagctggg caatggaatc cgaggaggtt tcccgaaatt 2760

atcctttgtt gaaaagtctc aatagccctt tggtcttctg agactgtatc tttgacattt 2820

ttggagtaga ccagagtgtc gtgctccacc atgttgacga agattttctt cttgtcattg 2880

agtcgtaaaa gactctgtat gaactgttcg ccagtcttca cggcgagttc tgttagatcc 2940

tcgatttgaa tcttagactc catgcatggc cttagattca gtaggaacta cctttttaga 3000

gactccaatc tctattactt gccttggttt atgaagcaag ccttgaatcg tccatactgg 3060

aatagtactt ctgatcttga gaaatatgtc tttctctgtg ttcttgatgc aattagtcct 3120

gaatcttttg actgcatctt taaccttctt gggaaggtat ttgatctcct ggagattgtt 3180

actcgggtag atcgtcttga tgagacctgc tgcgtaggcc tctctaacca tctgtgggtc 3240

agcattcttt ctgaaattga agaggctaac cttctcatta tcagtggtga acatagtgtc 3300

gtcaccttca ccttcgaact tccttcctag atcgtaaaga tagaggaaat cgtccattgt 3360

aatctccggg gcaaaggaga tctcttttgg ggctggatca ctgctgggcc ttttggttcc 3420

tagcgtgagc cagtgggctt tttgctttgg tgggcttgtt agggccttag caaagctctt 3480

gggcttgagt tgagcttctc ctttggggat gaagttcaac ctgtctgttt gctgacttgt 3540

tgtgtacgcg tcagctgctg ctcttgcctc tgtaatagtg gcaaatttct tgtgtgcaac 3600

tccgggaacg ccgtttgttg ccgcctttgt acaaccccag tcatcgtata taccggcatg 3660

tggaccgtta tacacaacgt agtagttgat atgagggtgt tgaatacccg attctgctct 3720

gagaggagca actgtgctgt taagctcaga tttttgtggg attggaatta attcgtcgag 3780

cggccgctcg acgagctccc tatagtgagt cgtattagag gccgacttgg gggccggcca 3840

tttaaatgaa ttcgatcatg agcggagaat taagggagtc acgttatgac ccccgccgat 3900

gacgcgggac aagccgtttt acgtttggaa ctgacagaac cgcaacgatt gaaggagcca 3960

ctcagccgcg ggtttctgga gtttaatgag ctaagcacat acgtcagaaa ccattattgc 4020

gcgttcaaaa gtcgcctaag gtcactatca gctagcaaat atttcttgtc aaaaatgctc 4080

cactgacgtt ccataaattc ccctcggtat ccaattagag tctcatattc actctcaatc 4140

aaagatccgg cccatgatcc atggacccag aacgacgccc ggccgacatc cgccgtgcca 4200

ccgaggcgga catgccggcg gtctgcacca tcgtcaacca ctacatcgag acaagcacgg 4260

tcaacttccg taccgagccg caggaaccgc aggagtggac ggacgacctc gtccgtctgc 432.0

gggagcgcta tccctggctc gtcgccgagg tggacggcga ggtcgccggc atcgcctacg 4380cgggcccctg gaaggcacgc aacgcctacg actggacggc cgagtcgacc gtgtacgtct 4440ccccccgcca ccagcggacg ggactgggct ccacgctcta cacccacctg ctgaagtccc 4500tggaggcaca gggcttcaag agcgtggtcg ctgtcatcgg gctgcccaac gacccgagcg 4560tgcgcatgca cgaggcgctc ggatatgccc cccgcggcat gctgcgggcg gccggcttca 4620agcacgggaa ctggcatgac gtgggtttct ggcagctgga cttcagcctg ccggtaccgc 4680cccgtccggt cctgcccgtc accgagatct gatctcacgc gtctaggatc cgaagcagat 4740cgttcaaaca tttggcaata aagtttctta agattgaatc ctgttgccgg tcttgcgatg 4800attatcatat aatttctgtt gaattacgtt aagcatgtaa taattaacat gtaatgcatg 4860acgttattta tgagatgggt ttttatgatt agagtcccgc aattatacat ttaatacgcg 4920atagaaaaca aaatatagcg cgcaaactag gataaattat cgcgcgcggt. gtcatctatg 4980ttactagatc gggaagatcc attaattcgg tactcgaggc attacggcat tacggcactc 5040gcgagggtcc caattcgagc atggagccat ttacaattga atatatcctg ccg 5093

<210> 23<211 >2318<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum cv. Xanthi<220>

<221 > 5'UTR<222> (1)..(18)<220><221 > CDS<222> (19)..(1590)<220>

<221> 3'UTR<222> (1592)..(2291)<220>

<221 > sinal_poliA<222> (2292)..(2318)<400> 23

agtcagagag agaagaag atg aac aag aaa aag ctg

Met Asn Lys Lys Lys Leu1 5

aaa ttt ctt gtt tctLys Phe Leu Val Ser10

51ctc ttc gct ctcLeu Phe Ala Leu15

tct gat cac ttcSer Asp His Phe30

caa aac cac tatGln Asn His Tyr45

tct gtc act tccSer Val Thr Ser60

ctc ccc tgg tctLeu Pro Trp Ser

tac ttc ggt aatTyr Phe Gly Asn95

ccg gag ctt cacPro Glu Leu His110

gga tgg ttt aggGly Trp Phe Arg125

gag gga ggt gctGlu Gly Gly Ala140

gga ggc gag aaaGly Gly Glu Lys

ctg ccc gtg ttcLeu Pro Val Phe

aac tca ate actAsn Ser Ile Thr

cgt cac aaa tccArg His Lys Ser35

tcc ctg tcg gaaSer Leu Ser Glu50

caa tat acc aagGln Tyr Thr Lys65

cag aat cct aatGln Asn Pro Asn80

ggg ttt act ctcGly Phe Thr Leu

cag aaa ttc ggcGln Lys Phe Gly115

tgt ttt ttc agtCys Phe Phe Ser130

ata cga atg aatIle Arg Met Asn145

ttg gag tcg gttLeu Glu Ser Val160

aaa aat gga gctLys Asn Gly Ala

ctc tat ctc tacLeu Tyr Leu Tyr20

ccc caa aac cacPro Gln Asn His

aac cac cat gatAsn His His Asp55

cct tgg cca attPro Trp Pro Ile70

gtt tct ttg agaVal Ser Leu Arg85

aaa gtt gat cttLys Val Asp Leu100

gaa aac acc gtaGlu Asn Thr Val

gag act ttg cagGlu Thr Leu Gln135

ccg gac gag attPro Asp Glu Ile150

att ggt agg agtIle Gly Arg Ser165

ttt cag att aaaPhe Gln Ile Lys

ttc tct tcc cacPhe Ser Ser His25

ttt cct aat accPhe Pro Asn Thr40

aat ttc cac tctAsn Phe His Ser

ttg ccc tcc tacLeu Pro Ser Tyr75

tcg tgc gag ggtSer Cys Glu Gly90

ctc aaa act tcgLeu Lys Thr Ser105

tcc ggc gac ggcSer Gly Asp Gly120

agt tcg att tgcSer Ser Ile Cys

ttg atg tct cgtLeu Met Ser Arg155

gaa gat gat gagGlu Asp Asp Glu170

gtt act gat aaaVal Thr Asp Lys175

ctg aaa att ggg aaa aaaLeu Lys Ile Gly Lys Lys190

tta ccg gaa ggt gca attLeu Pro Glu Gly Ala Ile205

tct att cag tta gtt ggcSer Ile Gln Leu Val Gly220 225

gag gag ccg tca ctt ttgGlu Glu Pro Ser Leu Leu240

cac aca gtt acc gat tggHis Thr Val Thr Asp Trp255

ggc ttg ccc agt cgg ccaGly Leu Pro Ser Arg Pro270

aca caa ttg gag gaa acaThr Gln Leu Glu Glu Thr285

gct aag aac ttt agt ggcAla Lys Asn Phe Ser Gly300 305

cct ttg gga tat gaa actPro Leu Gly Tyr Glu Thr320

gát tgt aat gga gct tctAsp Cys Asn Gly Ala Ser335

aag aga act gca cgg ttg

180

tta gtg gat gaa aaa ateLeu Val Asp Glu Lys Ile195

tca agg cac act atg cgtSer Arg His Thr Met Arg210 215

gcc gat gaa ttt cac tgtAla Asp Glu Phe His Cys230

att aca cga ttt gag tatIle Thr Arg Phe Glu Tyr245

tat agt gca tac gtg gcaTyr Ser Ala Tyr Val Ala260

cat ttg gtt ttt gta gatHis Leu Val Phe Val Asp275

tgg aaa gca ctc ttt tcaTrp Lys Ala Leu Phe Ser290 295

cca gtt tgt ttc cgt cacPro Val Cys Phe Arg His310

gcc ctg ttt aag gga ctgAla Leu Phe Lys Gly Leu325

gcc cat gat ttg tgg caaAla His Asp Leu Trp Gln340

tct gag ttt ggg gag atg

185

ttg aat aaa tac 627

Leu Asn Lys Tyr

200

gaa tta att gac 675

Glu Leu Ile Asp

tct gag tgg att 723

Ser Glu Trp Ile235

gca aac ctt ttc 771

Ala Asn Leu Phe250

tcc agg gtt act 819

Ser Arg Val Thr265

ggc cat tgt gag 867

Gly His Cys Glu280

age ctc act tat 915

Ser Leu Thr Tyr

gcc gtt ctc tcg 963

Ala Val Leu Ser315

aca gaa act ata 1011Thr Glu Thr Ile330

aat cct gat gat 1059Asn Pro Asp Asp345 .

ate agg gca gcc 1107Lys Arg Thr Ala350

ttt gga ttt cctPhe Gly Phe Pro365

cct aat gtc ctcPro Asn Val Leu380

cat ggt gga aagHis Gly Gly Lys

gat tcc ata aagAsp Ser Ile Lys415

gta att aac ggaVal Ile Asn Gly430

gca ate caa gatAla Ile Gln Asp445

act cac ata gttThr His Ile Val460

age age gaa tatSer Ser Glu Tyr

gga ttg gag tacGly Leu Glu Tyr495

cca gtt gtg atePro Val Val Ile510

Arg Leu Ser Glu355

gtg gat aga cagVal Asp Arg Gln370

ttt gtt aga cgtPhe Val Arg Arg385

gta cag tet aggVal Gln Ser Arg400

age tgg gcc ttgSer Trp Ala Leu

ttg ttt gcc cac

Leu Phe Ala His435

gct tet gtc ata

Ala Ser Val Ile450

tet gca gca cca

Ser Ala Ala Pro465

agg cgc ccc cat

Arg Arg Pro His480

cat ccc ata tatHis Pro Ile Tyr

gac agg ctc ageAsp Arg Leu Ser515

Phe Gly Glu Met

aac ate cca aggAsn Ile Pro Arg375

gag gat tat ttaGlu Asp Tyr Leu390

ctt age aat gaaLeu Ser Asn Glu405

aac cac tcg gagAsn His Ser Glu420

atg tcc atg aaaMet Ser Met Lys

gtt ggt gct catVal Gly Ala His455

aaa gct gta ataLys Ala Val Ile470

ttt gct ctg attPhe Ala Leu Ile485

ttg gag ggg tetLeu Glu Gly Ser500

age att ttg aggSer Ile Leu Arg

Ile Arg Ala Ala360

aca gtc aca ggcThr Val Thr Gly

gct cac cca cgtAla His Pro Arg395

gag caa gta tttGlu Gln Val Phe410

tgc aaa tta aatCys Lys Leu Asn425

gag caa gtt cgaGlu Gln Val Arg440

gga gca ggt ctaGly Ala Gly Leu

cta gaa att ataLeu Glu Ile Ile475

gca caa tgg aaaAla Gln Trp Lys490

tat gcg gat cctTyr Ala Asp Pro505

agt ctt ggg tgcSer Leu Gly Cys520taa gtccgctcga cagtttgaat agttcggctt ttctctaaaa gacggggaag 1640

gatagaggaa ttcggggttc tggaacttgg agcctgggaa ttttgataaa tatgtttcac 1700

acgcagttct gtagtcaatg gttgcaatct aggtcctcaa tctggtgttg ataagcttgg 1760

caatttccag cagctactaa tttattagcc cgctctgact cggttatgga ctaccagagc 1820

aatcatatca aatggaagca tggaatcctg attgtggaat ggtgagctca ttgaagagca 1880

tattctttat ggtgttgaag attacaattc acaattaaca cgtgtatgtg aaagattagg 1940

ttggtacact tacttacaat tcattgtcaa ttgtttttca ttattctcat taatgatcat 2000

aggataagaa catgagaaaa ccatccatgt tctgtgttgt tttcccatca atccggccac 2060

cctcttccct ccttatgtag agatgatttc aacagagttt gttttgtagt tgtaacactt 2120

gcactcccag ttacagtttt gcattcgaca cattcatccc atcagatgtc aagtttaaag 2180

gcataagaca tttgacatat tgaagaagca gattaacacg aacgtcagta tgatgcttca 2240

gtgaagatat ggttgtaact tgtaaccaaa caaaagaaat gagactttga caaaaaaaaa 2300

aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2318

<210> 24<211 >523<212> PRT

<213> Nicotiana tabacum cv. Xanthi<400> 24

Met Asn Lys Lys Lys Leu Lys Phe Leu Val Ser Leu Phe Ala Leu Asn1 5 10 15

Ser Ile Thr Leu Tyr Leu Tyr Phe Ser Ser His Ser Asp His Phe Arg

20 25 30

His Lys Ser Pro Gln Asn His Phe Pro Asn Thr Gln Asn His Tyr Ser

35 40 45

Leu Ser Glu Asn His His Asp Asn Phe His Ser Ser Val Thr Ser Gln

50 55 60

Tyr Thr Lys Pro Trp Pro Ile Leu Pro Ser Tyr Leu Pro Trp Ser Gln65 70 75 80

Asn Pro Asn Val Ser Leu Arg Ser Cys Glu Gly Tyr Phe Gly Asn Gly

85 90 95

Phe Thr Leu Lys Val Asp Leu Leu Lys Thr Ser Pro Glu Leu His Gln100 105 110

Lys Phe Gly Glu Asn Thr Val Ser Gly Asp Gly Gly Trp Phe Arg Cys

115 120 125

Phe Phe Ser Glu Thr Leu Gln Ser Ser Ile Cys Glu Gly Gly Ala Ile

130 135 140

Arg Met Asn Pro Asp Glu Ile Leu Met Ser Arg Gly Gly Glu Lys Leu145 150 155 160

Glu Ser Val Ile Gly Arg Ser Glu Asp Asp Glu Leu Pro Val Phe Lys

165 170 175

Asn Gly Ala Phe Gln Ile Lys Val Thr Asp Lys Leu Lys Ile Gly Lys

180 185 190

Lys Leu Val Asp Glu Lys Ile Leu Asn Lys Tyr Leu Pro Glu Gly Ala

195 200 205

Ile Ser Arg His Thr Met Arg Glu Leu Ile Asp Ser Ile Gln Leu Val

210 215 220

Gly Ala Asp Glu Phe His Cys Ser Glu Trp Ile Glu Glu Pro Ser Leu225 230 235 240

Leu Ile Thr Arg Phe Glu Tyr Ala Asn Leu Phe His Thr Val Thr Asp

245 250 255

Trp Tyr Ser Ala Tyr Val Ala Ser Arg Val Thr Gly Leu Pro Ser Arg

260 265 270

Pro His Leu Val Phe Val Asp Gly His Cys Glu Thr Gln Leu Glu Glu

275 280 285

Thr Trp Lys Ala Leu Phe Ser Ser Leu Thr Tyr Ala Lys Asn Phe Ser

290 295 300

Gly Pro Val Cys Phe Arg His Ala Val Leu Ser Pro Leu Gly Tyr Glu305 310 315 320

Thr Ala Leu Phe Lys Gly Leu Thr Glu Thr Ile Asp Cys Asn Gly Ala

325 330 335

Ser Ala His Asp Leu Trp Gln Asn Pro Asp Asp Lys Arg Thr Ala Arg

340 345 350

Leu Ser Glu Phe Gly Glu Met Ile Arg Ala Ala Phe Gly Phe Pro Val355 360 365

Asp Arg Gln Asn Ile Pro Arg Thr Val Thr Gly Pro Asn Val Leu Phe

370 375 380

Val Arg Arg Glu Asp Tyr Leu Ala His Pro Arg His Gly Gly Lys Val385 390 395 400

Gln Ser Arg Leu Ser Asn Glu Glu Gln Val Phe Asp Ser Ile Lys Ser

405 410 415

Trp Ala Leu Asn His Ser Glu Cys Lys Leu Asn Val Ile Asn Gly Leu

420 425 430

Phe Ala His Met Ser Met Lys Glu Gln Val Arg Ala Ile Gln Asp Ala

435 440 445

Ser Val Ile Val Gly Ala His Gly Ala Gly Leu Thr His Ile Val Ser

450 455 460

Ala Ala Pro Lys Ala Val Ile Leu Glu Ile Ile Ser Ser Glu Tyr Arg465 470 475 480

Arg Pro His Phe Ala Leu Ile Ala Gln Trp Lys Gly Leu Glu Tyr His

485 490 495

Pro Ile Tyr Leu Glu Gly Ser Tyr Ala Asp Pro Pro Val Val Ile Asp

500 505 510

Arg Leu Ser Ser Ile Leu Arg Ser Leu Gly Cys515 520

<210> 25<211 >4973<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum cv. Xanthi<220>

<221 > 5'UTR<222> (1)..(18)<220><221 > CDS<222> (19)..(696)<220><221 > Intron<222> (697)..(2028)<220><221 > CDS<222> (2029)..(2178)<220><221 > Intron<222> (2179)..(3606)<220><221 > CDS<222> (3607)..(4326)<220>

<221 > 3'UTR<222> (4330)..(4973)<400> 25

agtcagagag agaagaag atg aac aag aaa aag ctg aaa att ctt gtt tct 51

Met Asn Lys Lys Lys Leu Lys Ile Leu Val Ser1 5 10

ctc ttc gct ctc aac tca ate act ctc tat ctc tac ttc tct tcc cac 99

Leu Phe Ala Leu Asn Ser Ile Thr Leu Tyr Leu Tyr Phe Ser Ser His

15 20 25

cct gat cac ttc cgc cac aaa tcc cgc caa aac cac ttt tcc ttg tcg 147

Pro Asp His Phe Arg His Lys Ser Arg Gln Asn His Phe Ser Leu Ser

30 35 40

gaa aac cgc cat cat aat ttc cac tct tca ate act tct caa tat tcc 195

Glu Asn Arg His His Asn Phe His Ser Ser Ile Thr Ser Gln Tyr Ser

45 50 55

aag cct tgg cct att ttg ccc tcc tac ctc cct tgg tct caa aac cct 243

Lys Pro Trp Pro Ile Leu Pro Ser Tyr Leu Pro Trp Ser Gln Asn Pro60 65 70 75

aat gtt gtt tgg aga tcg tgc gag ggt tac ttc ggt aat ggg ttt act 291Asn Val Val Trp Arg Ser Cys Glu Gly Tyr Phe Gly Asn Gly Phe Thr

80 85 90

ctc aaa gtt gac ctt ctc aaa act tcg ccg gag ttt cac cgg aaa ttc 339Leu Lys Val Asp Leu Leu Lys Thr Ser Pro Glu Phe His Arg Lys Phe

95 100 105

ggc gaa aac acc gtc tcc ggc gac ggc gga tgg ttt agg tgt ttt ttc 387

Gly Glu Asn Thr Val Ser Gly Asp Gly Gly Trp Phe Arg Cys Phe Phe

110 115 120

agt gag act ttg cag agt tcg ate tgc gag gga ggc gea ata cga atg 435

Ser Glu Thr Leu Gln Ser Ser Ile Cys Glu Gly Gly Ala Ile Arg Met

125 130 135

aat ccg gac gag att ttg atg tet cgt gga ggt gag aaa ttg gag tcg 483

Asn Pro Asp Glu Ile Leu Met Ser Arg Gly Gly Glu Lys Leu Glu Ser

140 145 150 155

gtt att ggt agg agt gaa gat gat gag ctg ccc gtg ttc aaa aat gga 531

Val Ile Gly Arg Ser Glu Asp Asp Glu Leu Pro Val Phe Lys Asn Gly

160 165 170

gct ttt cag att aaa gtt act gat aaa ctg aaa att ggg aaa aaa tta 579

Ala Phe Gln Ile Lys Val Thr Asp Lys Leu Lys Ile Gly Lys Lys Leu

175 180 185

gtg gat gaa aaa ttc ttg aat aaa tac tta ccg gaa ggt gea att tca 627

Val Asp Glu Lys Phe Leu Asn Lys Tyr Leu Pro Glu Gly Ala Ile Ser

190 195 200

agg cac act atg cgt gag tta att gac tet att cag ttg gtt ggc gcc 675Arg His Thr Met Arg Glu Leu Ile Asp Ser Ile Gln Leu Val Gly Ala

205 210 215

gat gat ttt cac tgt tet gag gttagatttt gaattttgtt tgctctttaa 726Asp Asp Phe His Cys Ser Glu220 225

attaaaggtt tãaactttgt gaatgttggc agatatggaa tacactaatg gatt-ttgttt 786gatctgttta atgaagattg tctagaacct caatgttata aatatggttt ggttgcttca 846ttaattaaag agaattcctt aatatcccga ctagatgoca gataacacca gttagttgac 906ttttggatta ttggttgcat ttcatttgat cagataaatt gttcattctt aaatgtttca 966

ctaaagaatt actcaagatt tcagagttta tatgtaggtg tatgtatttg gaattctgga 1026

tttggatcta gtattgaatg gattactgaa cttgtactcc ccagtcatct ggggaggagc 1086

aatagatcaa attcaagggt tgaaaagtaa tactgagtca gaaattaacc actttaactt 1146

ggaaaacggt aaatgtatgt gttctaagat ggttattcct ataacttttg atgtctaata 1206

tggagaaagt gagttgattt atgctttttc cttttccctt tattggtgtt ggtttttaaa 1266

ttctatcaat tcctttgttt gattgctact caaattgaac cttagacgga gtagcaatag 1326

caaaaagtga aggccattct tttctccttt catctcttta tttccgtttg acatacagaa 1386

tatggtagca tctgtctgaa gtggttaatt ttattcctta aaatttgcat aactaattcg 1446

agtaaatgcc ttttgaagct ttagttgaat agttctacaa ctggttgttg cattttgagg 1506

actatcgact tgatttgaca cttgacattg tctgatacat ggcttgtaag ttatgaaaac 1566

ttttatctag gaagaaatcc caaccagaga tagggagctg tcacttggtt atgagctact 1626

ggctcaaagt tcaagtttga ccagttaatt ttagatcttc accaggataa catttagagt 1686

ctaatcaaat tctgaagcag tattgtgcac taataagagg aacacatgaa ggatgtagca 1746

ctactaggtt atgttacctt atttactaat gattgacaac cagcttaaat gatgacaaat 1806

agtcttatat ttgctttttc acattgctca tgacttggga tatttccgaa tcaacatatt 1866

ttagttcttt atgtacttaa ctacttatca aaaaattatc cctgctagat gttagtgttc 1926

aagcaaccat gctagctttt aaggaagctc cttctttgat tcatgccatc tttccgaaat 1986

cgatgcctta cgttactgtc atttttctaa ttttcatttc ag tgg att gag gag 2040

Trp Ile Glu Glu230

ccg tca ctt ttg att aca cga ttt gag tat gca aac ctt ttc cac aca 2088Pro Ser Leu Leu Ile Thr Arg Phe Glu Tyr Ala Asn Leu Phe His Thr

235 240 245

gtt acc gat tgg tat agt gca tac gtg gca tcc agg gtt act ggc ttg 2136Val Thr Asp Trp Tyr Ser Ala Tyr Val Ala Ser Arg Val Thr Gly Leu

250 255 260

ccc agt cgg cca cat ttg gtt ttt gta gat ggc cat tgt gag 2178Pro Ser Arg Pro His Leu Val Phe Val Asp Gly His Cys Glu

265 270 275

gtatgtttga aagtattgat aacgatggca tgcattgtac tgtgttacgg atgaaagaaa 2238

tgaaaccagc aattattttc tagcaggcaa tgctcttgag atgcttgtgt caaattggtc 2298agacttaatc ctgagtttcc atttgtttca gctttctgtt tgactgacta caataattgt 2358

cccaattagg ggtgtcaatg gatattcgaa agccgactaa accgaccgaa ccgtaccgta 2418

ccgattttta ggtttctttt taagaaaccg taggttttta tataaatcta taaccgcacc 2478

gataattagg gtaggttttt tattttataa aaataagccg aaaaaatacc gaaccgtacc 2538

gaataaattt tacatgtgga aaatatattt atttagtaag tttaaaaata ataatgcatt 2598

aaattttctt tgggccatgg aattatgaaa actattacaa gccaacaagt aattagactc 2658

aaaatactaa ttcctaaaac ctattatgtt acttctactt aaactaagtt atttcaagtã 2718

tctttattag caagacacaa agtattctag cgattatgag caaactacaa tgtattgaat 2778

atgtttcctt tcatatattt tagatttatc tttttgaata tttaatcttc tatagactct 2838

attcttgagt cccagcttgg tatatctttc aactcgtgtg atttatattt tctttgcctt 2898

tgtttgattt cttttacgtt gttgtagaat agtcgatgga tctatactct agccatcttt 2958

ctttttcttt ttttaattca tcacctttta aacagtaaaa atgtctaaag aatttttcta 3018

agtcctataa aagaacgtat gttattgcat tctacttcta ctggtgaatt ttacatgata 3078

ttaaaaaatt aaccgaacct taccgctacc gaagagaaac cgacatgatt gggacggttt 3138

cgaaaagtct aattttggtt atacataata gaataaccga aaaattggta tggtacaaat 3198

tttataaaat aaccggccga accgaaccat tgacacccct agtcccaata cctagttgtt 3258

gcagtttgct cattcttact tctatttacg tcactgtttc tctgaatggt ccctttgtgg 3318

tgaaaagagc ttttgctatg tagaaaaact agcaatgatt tcatagctga aacaatttat 3378

ttttacctta catcatgtct tataaaattg cttctaactg tatactttaa ttcttggaga 3438

gatgctttca tgtgaagaaa gttctttcac tccactactg gaagcttgcc gtatgaattt 3498

tacttggcca tattgtggcc gtgctttgat ttatcttcaa attcattttc ttcatatagt 3558

tctttcgagt aattcttttt tcctcttttc tgtttgaaaa aaattcag aca caa ttg 3615

Thr Gln Leu

gag gaa aca tgg aaa gca ctt ttt tca age ctc act tat gct aag aac

3663

Glu Glu Thr Trp Lys Ala Leu Phe Ser Ser Leu Thr Tyr Ala Lys Asn

280

285

290

295

ttt agt ggc cca gtt tgt ttc cgt cat gcc gcc ctc tcg cct ttg gga

3711

Phe Ser Gly Pro Val Cys Phe Arg His Ala Ala Leu Ser Pro Leu Gly

300

305

310

tat.gaa act gcc ctg ttt aag gga ctg tca gaa act ata gat tgt aat

3759

Tyr Glu Thr Ala Leu Phe Lys Gly Leu Ser Glu Thr Ile Asp Cys Asn315 320 325

gga gct tct gcc cat gat ttg tgg caa aat cct gat gat aag aaa act 3807Gly Ala Ser Ala His Asp Leu Trp Gln Asn Pro Asp Asp Lys Lys Thr

330 335 340

gca cgg ttg tcc gag ttt ggg gag atg att agg gca gcc ttt aga ttt 3855Ala Arg Leu Ser Glu Phe Gly Glu Met Ile Arg Ala Ala Phe Arg Phe

345 350 355

cct gtg gat aga cag aac ate cca agg aca gtc aca ggc cct aat gtc 3903Pro Val Asp Arg Gln Asn Ile Pro Arg Thr Val Thr Gly Pro Asn Val360 365 370 375

ctc ttt gtt aga cgt gag gat tat tta gct cac cca cgt cat ggt gga 3951

Leu Phe Val Arg Arg Glu Asp Tyr Leu Ala His Pro Arg His Gly Gly

380 385 390

aag gta cag tct agg ctt age aat gaa gag caa gta ttt gat tcc ata 3999

Lys Val Gln Ser Arg Leu Ser Asn Glu Glu Gln Val Phe Asp Ser Ile

395 400 405

aag age tgg gcc ttg aac cac tcg gag tgc aaa tta aat gta att aac 4047

Lys Ser Trp Ala Leu Asn His Ser Glu Cys Lys Leu Asn Val Ile Asn

410 415 420

gga ttg ttt gcc cac atg tcc atg aaa gag caa gtt cga gca ate caa 4095Gly Leu Phe Ala His Met Ser Met Lys Glu Gln Val Arg Ala Ile Gln

425 430 435

gat gct tct gtc ata gtt ggt gct cat gga gca ggt cta act cac ata 4143Asp Ala Ser Val Ile Val Gly Ala His Gly Ala Gly Leu Thr His Ile440 445 450 455

gtt tct gca gca cca aaa gct gta ata cta gaa att ata age age gaa 4191Val Ser Ala Ala Pro Lys Ala Val Ile Leu Glu Ile Ile Ser Ser Glu

460 465 470

tat agg cgc ccc cat ttt gct ctg att gca caa tgg aaa gga ttg gag 4239Tyr Arg Arg Pro His Phe Ala Leu Ile Ala Gln Trp Lys Gly Leu Glu

475 480 485

tac cat ccc ata tat ttg gag ggg tct tat gcg gat cct cca gtt gtg 4287Tyr His Pro Ile Tyr Leu Glu Gly Ser Tyr Ala Asp Pro Pro Val Val

490 495 500

ate gac aag ctc age age att ttg agg agt ctt ggg tgc taaatctgct 4336

Ile Asp Lys Leu Ser Ser Ile Leu Arg Ser Leu Gly Cys

505 510 515

cgacagttta gttcgtcttt tctctaaaag actgggaagg atagaggaat tcggggttct 4396ggaacctgga gcctgggaat tgtgtaaaat atgtttcaca cgcagttcta tagtcaattg 4456ctgcaatctg gtgttcataa gcttggaaat ttccagcagc tactaactta ttagcccact 4516ctgactcagt tatggactac cagagcaatc atatcaaatg ggagcatgga atcctgattg 4576tggaatggtg agctcattga agageatatt ctttatggtg ttgaagatta cagttgacga 4636gtaacacgtg tatgtgaaag attaggttgt tacactttct tgcaattcat tgtcaattgt 4696ttttcgtcat tcttattaat gatcatagga taagaacatg agaaaaccat ccatgttctc 4756tgttgttttc ccatcaatct ggccaccctc tttcctcttt atgtagagat gatttcaaca 4816gagtttgttt tgtagttgta atacttgtac tcacagttac tgttttgcat tcatcccatc 4876agatgtcgaa gaagcagatt aacaagaacg tcagtatgat gtttcagtga atatatggtt 4936gtaacttgta accaaacaaa agaaatgaga ctttgac 4973

<210> 26<211> 516<212> PRT

<213> Nicotiana tabacum cv. Xanthi<400> 26

Met Asn Lys Lys Lys Leu Lys Ile Leu Val Ser Leu Phe Ala Leu Asn15 10 15

Ser Ile Thr Leu Tyr Leu Tyr Phe Ser Ser His Pro Asp His Phe Arg

20 25 30

His Lys Ser Arg Gln Asn His Phe Ser Leu Ser Glu Asn Arg His His

35 40 45

Asn Phe His Ser Ser Ile Thr Ser Gln Tyr Ser Lys Pro Trp Pro Ile

50 55 60

Leu Pro Ser Tyr Leu Pro Trp Ser Gln Asn Pro Asn Val Val Trp Arg65 .70 75 80Ser Cys Glu Gly Tyr Phe Gly Asn Gly Phe Thr Leu Lys Val Asp Leu

85 90 95

Leu Lys Thr Ser Pro Glu Phe His Arg Lys Phe Gly Glu Asn Thr Val

100 105 110

Ser Gly Asp Gly Gly Trp Phe Arg Cys Phe Phe Ser Glu Thr Leu Gln

115 120 125

Ser Ser Ile Cys Glu Gly Gly Ala Ile Arg Met Asn Pro Asp Glu Ile

130 135 140

Leu Met Ser Arg Gly Gly Glu Lys Leu Glu Ser Val Ile Gly Arg Ser145 150 155 160

Glu Asp Asp Glu Leu Pro Val Phe Lys Asn Gly Ala Phe Gln Ile Lys

165 170 175

Val Thr Asp Lys Leu Lys Ile Gly Lys Lys Leu Val Asp Glu Lys Phe

180 185 190

Leu Asn Lys Tyr Leu Pro Glu Gly Ala Ile Ser Arg His Thr Met Arg

195 200 205

Glu Leu Ile Asp Ser Ile Gln Leu Val Gly Ala Asp Asp Phe His Cys

210 215 220

Ser Glu Trp Ile Glu Glu Pro Ser Leu Leu Ile Thr Arg Phe Glu Tyr225 230 235 240

Ala Asn Leu Phe His Thr Val Thr Asp Trp Tyr Ser Ala Tyr Val Ala

245 250 255

Ser Arg Val Thr Gly Leu Pro Ser Arg Pro His Leu Val Phe Val Asp

260 265 270

Gly His Cys Glu Thr Gln Leu Glu Glu Thr Trp Lys Ala Leu Phe Ser

275 280 285

Ser Leu Thr Tyr Ala Lys Asn Phe Ser Gly Pro Val Cys Phe Arg His

290 295 300

Ala Ala Leu Ser Pro Leu Gly Tyr Glu Thr Ala Leu Phe Lys Gly Leu305 310 315 320

Ser Glu Thr Ile Asp Cys Asn Gly Ala Ser Ala His Asp Leu Trp Gln325 330 335Asn Pro Asp Asp Lys Lys Thr Ala Arg Leu Ser Glu Phe Gly Glu Met

340 345 350

Ile Arg Ala Ala Phe Arg Phe Pro Val Asp Arg Gln Asn Ile Pro Arg

355 360 365

Thr Val Thr Gly Pro Asn Val Leu Phe Val Arg Arg Glu Asp Tyr Leu

370 375 380

Ala His Pro Arg His Gly Gly Lys Val Gln Ser Arg Leu Ser Asn Glu385 390 395 400

Glu Gln Val Phe Asp Ser Ile Lys Ser Trp Ala Leu Asn His Ser Glu

405 410 415

Cys Lys Leu Asn Val Ile Asn Gly Leu Phe Ala His Met Ser Met Lys

420 425 430

Glu Gln Val Arg Ala Ile Gln Asp Ala Ser Val Ile Val Gly Ala His

435 440 445

Gly Ala Gly Leu Thr His Ile Val Ser Ala Ala Pro Lys Ala Val Ile

450 455 460

Leu Glu Ile Ile Ser Ser Glu Tyr Arg Arg Pro His Phe Ala Leu Ile465 470 475 480

Ala Gln Trp Lys Gly Leu Glu Tyr His Pro Ile Tyr Leu Glu Gly Ser

485 490 495

Tyr Ala Asp Pro Pro Val Val Ile Asp Lys Leu Ser Ser Ile Leu Arg

500 505 510

Ser Leu Gly Cys515

Claims

1. Método para produzir uma célula de planta ou planta Nicotia-na tendo um baixo nível de resíduos de beta^l ,2-xilose sobre N-glicanos li-gadas à proteína compreendendo as etapas de:a) introdução de um gene quimérico em células de planta deuma espécie ou cultivar de Nicotiana para gerar células de planta transgêni-ca, o referido gene quimérico compreendendo os seguintes fragmentos deDNA operavelmente ligados:i) um promotor expressível em planta;ii) uma região de DNA passível de transcrição compreen-dendo:(1) uma primeira região sentido de DNA compreendendouma seqüência de nucleotídeo de pelo menos 19 de 20 nucleotídeos conse-cutivos selecionados de uma seqüência de nucleotídeo que codifica umaproteína de XyIT de Nicotiana ou o complemento da mesma, a referida se-qüência de nucleotídeo, de preferência, obtenível da referida espécie ou cul-tivar de Nicotiana, em que os referidos pelo menos 19 de 20 nucleotídeosconsecutivos codificam pelo menos um aminoácido de XyIT espécie ou culti-var de Nicotiana-específico ou selecionado de uma seqüência de nucleotí-deo de um gene de XyIT de Nicotiana ou um cDNA de XyIT de Nicotiana ouo complemento da mesma, a referida seqüência de nucleotídeo, de prefe-rência, obtenível da referida espécie ou cultivar de Nicotiana, em que os re-feridos pelo menos 19 de 20 nucleotídeos consecutivos compreendem pelomenos um nucleotídeo de XyIT espécie de Mcoí/ana-específico;(2) uma segunda região de anti-sentido de DNA compreen-dendo uma seqüência de nucleotídeo de pelo menos 19 nucleotídeos con-secutivos os quais têm pelo menos 95% de identidade de seqüência aocomplemento da referida primeira região de DNA;em que uma molécula de RNA transcrita a partir da referida re-gião de DNA passível de transcrição é capaz de formar uma região de RNAde filamento duplo pelo menos entre uma região de RNA transcrita a partirda referida primeira região de sentido de DNA e uma região de RNA transcritaa partir da referida segunda região de anti-sentido de DNA; eii) uma região de DNA compreendendo um sinal de poliade-nilação e término de transcrição funcional em plantas;b) opcionalmente, identificação de uma célula de planta Nieotia-na transgênica a qual tem um menor nível de resíduos de beta-1,2-xilosesobre N-glicanos ligadas à proteína do que uma célula de planta Nicotiananão-transformada;c) opcionalmente, regeneração das referidas células de plantaNicotiana transgênicas para obter plantas Nicotiana transgênicas; ed) opcionalmente, identificação de uma planta Nieotiana trans-gênica a qual tem um menor nível de resíduos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanos ligadas à proteína do que uma planta Nieotiana não-transformada.

2. Método de acordo com a reivindicação 1 em que o referidoaminoácido de XyIT espécie de Nieotiana-específico é um aminoácido deXyIT Nieotiana benthamiana-específico e a referida espécie Nieotiana é, depreferência, Nieotiana benthamiana.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2 em que a referi-da seqüência de nucleotídeo que codifica uma proteína de XyIT de Nieotianacompreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica a seqüência de a-mínoácido de SEQ ID NO.: 12 ou SEQ ID NO.: 14.

4. Método de acordo com uma das reivindicações 1 a 3 em queo referido nucleotídeo de Nieotiana espécies de Nieotiana-especíüco é umnucleotídeo de XyIT Nieotiana benthamiana-especíilco e a referida espécieNieotiana é, de preferência, Nieotiana benthamiana.

5. Método de acordo com uma das reivindicações 1 a 4 em quea referida seqüência de nucleotídeo do referido gene de XyIT de Nieotianacompreende a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO.: 11, SEQ ID NO.: 13 ou SEQ ID NO. 21.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o referidoaminoácido de XyIT cultivar de Nieotiana-específico é um aminoácido de X-ylT de Nieotiana tabaeum cv. Petite Havana SR1-específico e o referido cul-tivar de Nieotiana é, de preferência, Nieotiana tabaeum cv. Petite HavanaSR1.

7. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 6, em que a refe-rida seqüência de nucleotídeo que codifica a referida proteína de XyIT deNicotiana compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica a se-qüência de aminoácido de SEQ ID NO.: 4, SEQ ID NO.: 6, SEQ ID NO.: 8 ouSEQ ID NO.: 10.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 6ou 7, em que o referido nucleotídeo de XyIT cultivar de Nicotiana-específicoé um nucleotídeo de XyIT de Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1-específico e o referido cultivar de Nicotiana é, de preferência, Nicotiana ta-bacum cv. Petite Havana SR1.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou-6 a 8, em que a referida seqüência de nucleotídeo do referido gene de XyITde Nieotiana ou do referido cDNA de XyIT de Nieotiana compreende a se-qüência de nucleotídeo de SEQ ID NO.: 3, SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 8,SEQ ID NO.: 10 ou SEQ ID NO.: 17.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-9, em que as referidas primeira e segunda regiões de DNA compreendempelo menos 50 nucleotídeos consecutivos.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-9, em que as referidas primeira e segunda regiões de DNA compreendempelo menos 200 nucleotídeos consecutivos.

12. Método para produzir uma célula de planta ou planta Nieoti-ana tendo um baixo nível de resíduos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanosligadas à proteína compreendendo as etapas de:a) fornecimento de uma ou mais moléculas de RNA de filamentoduplo às células de planta ou plantas de uma espécie ou cultivar de Nieotia-na, em que as moléculas de RNA de filamento duplo compreendem dois fi-lamentos de RNA, um filamento de RNA consistindo essencialmente emuma seqüência de núcleo tídeo de RNA de 19 de 20 a 21 nucleotídeos con-secutivos selecionada de uma; seqüência de nucleotídeo que codifica umaproteína de XyIT de Nieotiana, ou o complemento da mesma, a referida se-qüência de nucleotídeo, de preferência, obtenível da referida espécie ou cul-tivar de Nicotiana, em que os referidos 19 de 20 a 21 nucleotídeos consecu-tivos codificam pelo menos um aminoácido de XyIT espécie ou cultivar "deNicotiana-específico ou selecionada da seqüência de nucleotídeo de um ge-ne de XyIT de Nicotiana ou um cDNA de XyIT de Nicotiana, ou o comple-mento da mesma, a referida seqüência de nucleotídeo, de preferência, obte-nível da referida espécie ou cultivar de Nicotiana, em que os referidos 19 de-20 a 21 nucleotídeos consecutivos compreendem pelo menos um nucleotí-deo de XyIT espécie ou cultivar de Mcoí/ana-específico;b) identificação de uma célula de planta ou planta Nicotianacompreendendo a referida molécula ou moléculas de RNA de filamento du-plo as quais têm um menor nível de resíduos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanos ligadas à proteína do que a mesma célula de planta ou planta Nico-tiana a qual não compreende a referida molécula ou moléculas de RNA defilamento duplo.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, em que o referidoRNA de filamento duplo é fornecido às referidas células de planta ou plantasatravés de integração de um gene quimérico no genoma de células de plantada referida espécie ou cultivar de Nicotiana para gerar células de plantatransgênica e. opcionalmente, regeneração das referidas células de plantapara obter plantas transgênicas, o referido gene quimérico compreendendoos seguintes fragmentos de DNA operavelmente ligados:a) um promotor expressível em planta;b) uma região de DNA compreendendo pelo menos 19 de 20nucleotídeos consecutivos selecionados de uma seqüência de nucleotídeoque codifica uma proteína de XyIT de Nicotiana ou o complemento da mes-ma, a referida seqüência de nucleotídeo, de preferência, obtenível da referi-da espécie ou cultivar de Nicotiana, em que os referidos 19 de 20 nucleotí-deos consecutivos codificam pelo menos um aminoácido ou XyIT espécie oucultivar de Mcoí/ana-específico ou selecionada da seqüência de nucleotídeode um gene de XyIT de Nicotiana ou um cDNA de XyIT de Nicotiana ou ocomplemento da mesma, a referida seqüência de nucleotídeo, de preferên-cia, obtenível da referida espécie ou cultivar de Nicotiana, em que os referi-dos 19 de 20 nucleotídeos consecutivos compreendem pelo menos um nu-cleotídeo de XyIT espécie de Nicotiana-específico,' na orientação anti-sentido;c) uma região de DNA compreendendo um sinal de poliadenila-ção e de término de transcrição funcional em plantas.

14. Método de acordo com a reivindicação 12, em que o referidoRNA de filamento duplo é fornecido às referidas células de planta ou plantaatravés de integração de um gene quimérico no genoma das referidas célu-Ias de planta para gerar células de planta transgênica e, opcionalmente, re-generação das referidas células de planta para obter plantas transgênicas, oreferido gene quimérico compreendendo os seguintes fragmentos de DNAoperavelmente ligados:a) um promotor expressível em planta;b) uma região de DNA compreendendo pelo menos 19 de 20nucleotídeos consecutivos selecionados de uma seqüência de nucleotídeoque codifica uma proteína de XyIT de Nicotiana ou o complemento da mes-ma, a referida seqüência de nucleotídeo, de preferência, obtenível da referi-da espécie ou cultivar de Nicotiana, em que os referidos 19 de 20 nucleotí-deos consecutivos codificam pelo menos um aminoácido de XyIT espécie oucultivar de Nicotiana-específico ou seu complemento ou selecionada da se-qüência de nucleotídeo de gene de XyIT de Nicotiana ou um cDNA de XyITde Nicotiana ou o complemento da mesma, a referida seqüência de nucleo-tídeo, de preferência, obtenível da referida espécie ou cultivar de Nicotiana,em que os referidos 19 de 20 nucleotídeos consecutivos compreendem pelomenos um nucleotídeo de XyIT espécie de Nicotiana-e specífico, na orienta-ção sentido;c) uma região de DNA compreendendo um sinal de poliadenila-ção e de término de transcrição funcional em plantas.

15. Método de acordo com a reivindicação 12, em que o referidoRNA de filamento duplo é fornecido às referidas células de planta ou plantaatravés de integração de um gene quimérico no genoma das referidas célu-las de planta para gerar células de planta transgênica e, opcionalmente, re-generação das referidas células de planta para obter plantas transgênicas, oreferido gene quimérico compreendendo os seguintes fragmentos de DNAoperavelmente ligados:a) um promotor expressível em planta;b) uma região de DNA passível de transcrição compreendendo:i) uma primeira região de DNA compreendendo pelo menos-19 de 20 nucleotídeos consecutivos selecionados de uma seqüência de nu-cleotídeo que codifica uma proteína de XyIT de Nicotiana ou o complementoda mesma, a referida seqüência de nucleotídeo, de preferência, obtenível dareferida espécie ou cultivar de Nicotiana, em que os referidos 19 de 20 nu-cleotídeos consecutivos codificam pelo menos um aminoácido de XyIT espé-cie ou cultivar de Nicotiana-específtco ou selecionada da seqüência de nu-cleotídeo de um gene de XyIT de Nicotiana ou um cDNA de XyIT de Nicotia-na ou o complemento da mesma, a referida seqüência de nucleotídeo, depreferência, obtenível da referida espécie ou cultivar de Nicotiana, em queos referidos 19 de 20 nucleotídeos consecutivos compreendem pelo menosum nucleotídeo de XyIT espécie de Nicotiana-espectíico, na orientação anti-sentido;ii) uma segunda região de DNA compreendendo pelo menos-19 de 20 nucleotídeos consecutivos selecionados de uma seqüência de nu-cleotídeo que codifica uma proteína de XyIT de Nicotiana ou o complementoda mesma, a referida seqüência de nucleotídeo, de preferência, obtenível dareferida espécie ou cultivar de Nicotiana, em que os referidos 19 de 20 nu-cleotídeos consecutivos codificam pelo menos um aminoácido de XyIT espé-cie ou cultivar de Mcof/a/ia-específico ou selecionada da seqüência de nu-cleotídeo de um gene de XyIT de Nicotiana ou um cDNA de XyIT de Nicotia-na ou o complemento da mesma, a referida seqüência de nucleotídeo, depreferência, obtenível da referida espécie ou cultivar de Nicotiana, em queos referidos 19 de 20 nucleotídeos consecutivos compreendem pelo menosum nucleotídeo de XyIT espécie de Nicotiana-especíüco, na orientação sen-tido, pelo que uma molécula de RNA produzida através de transcrição dareferida região de DNA passível de transcrição é capaz de formar uma regi-ão de RNA de filamento duplo através de emperalhamento de base pelomenos entre uma região de RNA correspondendo à referida primeira regiãode DNA e uma região de RNA correspondendo à referida segunda região deRNA; ec) uma região de DNA compreendendo um sinal de poliadenila-ção e de término de transcrição funcional em plantas.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12a 15, em que o referido aminoácido de XyIT espécie de Nicotiana-espectíicoé um aminoácido de XyIT Nicotiana benthamiana-espectíico e a referida es-pécie de Nicotiana é, de preferência, Nicotiana benthamiana.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12a 16, em que a referida seqüência de nucleotídeo que codifica uma proteínade XyIT de Nicotiana compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifi-ca a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO.: 12 ou SEQ ID NO.: 14.

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12a 17, em que o referido nucleotídeo de XyIT espécie de Nicotiana-espectíicoé um nucleotídeo de XyIT de Nicotiana benthamiana-espectítco e a referidaespécie de Nieotiana é, de preferência, Nieotiana benthamiana.

19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12a 18, em que a referida seqüência de nucleotídeo do referido gene de XyITde Nieotiana compreende a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO.: 11,SEQ ID NO.: 13 ou SEQ ID No. 21.

20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12a 15 em que o referido aminoácido de XyIT cultiva de Nicotiana-espectíico éum aminoácido de XyIT Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1-específicoe o referido cultivar de Nicotiana é, de preferência, Nicotiana tabacum cv.Petite Havana SR1.

21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12a 15 ou 20 em que a referida seqüência de nucleotídeo que codifica a referi-da proteína de XyIT de Nicotiana compreende uma seqüência de nucleotí-deo que codifica a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO.: 4, SEQ ID NO.:- 6, SEQ ID NO.: 8 ou SEQ ID NO.: 10.

22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12a 15, 20 ou 21 em que o referido nucleotídeo de XyIT cultivar de Nieotiana-específico é um nucleotídeo de Nicotiana Nicotiana tabacum cv. Petite Ha-vana SR1 -específico e o referido cultivar de Nicotiana é, de preferência, Ni-cotiana tabacum cv. Petite Havana SR1.

23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12a 15 ou 20 a 22 em que a referida seqüência de nucleotídeo do referido ge-ne de XyIT de Nicotiana ou o referido cDNA de XyIT de Nicotiana compreen-de a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO.: 3, SEQ ID NO.: 5, SEQ IDNO.: 8, SEQ ID NO.: 10 ou SEQ ID NO.: 17.

24. Método para produzir uma célula de planta ou planta 1 Nico-tiana tendo um baixo nível de resíduos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanosligadas à proteína compreendendo as etapas de:a) identificação de um fragmento de uma proteína de XyIT quecodifica uma seqüência de DNA obtenível de uma primeira espécie ou culti-var de Nicotiana usando um meio selecionado do seguinte grupo:i) um fragmento de DNA compreendendo uma seqüência denucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO.: 4, SEQID NO.: 6, SEQ ID NO.: 8, SEQ ID NO.: 10, SEQ ID NO.: 12 ou SEQ ID NO.:- 14, para uso como uma sonda;ii) um fragmento de DNA compreendendo a seqüência denucleotídeo de qualquer uma de SEQ ID NO.: 3, SEQ ID NO.: 5, SEQ IDNO.: 7, SEQ ID NO.: 9, SEQ ID NO.: 11, SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 17ou SEQ ID NO.: 21, para uso como uma sonda;iii) um fragmento de DNA ou oligonucleotídeo compreenden-do uma seqüência de nucleotídeo consistindo em entre 20 a 1513 nucleotí-deos consecutivos selecionados de uma seqüência de nucleotídeo que codi-fica a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO.: 4 ou SEQ ID NO.: 6, parauso como uma sonda;iv) um fragmento de DNA ou oligonucleotídeo compreenden-do uma seqüência de nucleotídeo consistindo em entre 20 a 3574 nucleotí-deos consecutivos selecionados de uma seqüência de nucleotídeo que codi-fica a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO.: 8, SEQ ID NO.: 10, SEQ IDNO.: 12 ou SEQ ID NO.: 14 para uso como uma sonda;v) um fragmento de DNA ou oligonucleotídeo compreenden-do uma seqüência de nucleotídeo consistindo em entre 20 a 3574 nucleotí-deos consecutivos selecionados de uma seqüência de nucleotídeo de qual-quer uma de SEQ ID NO.: 3, SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 7, SEQ ID NO.: 9,SEQ ID NO.: 11, SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 17 ou SEQ ID NO.: 21 parauso como uma sonda;vi) uma seqüência de oligonucleotídeo tendo uma seqüênciade nucleotídeo compreendendo entre 20 a 200 nucleotídeos consecutivosselecionados de uma seqüência de nucleotídeo que codifica a seqüência deaminoácido de SEQ ID NO.: 4 ou SEQ ID NO.: 6, para uso como um inicia-dor em uma reação de PCR;vii) uma seqüência de oligonucleotídeo tendo uma seqüênciade nucleotídeo compreendendo entre 20 a 200 nucleotídeos consecutivosselecionados de uma seqüência de nucleotídeo que codifica a seqüência deaminoácido de SEQ ID NO.: 8, SEQ ID NO.: 10, SEQ ID NO.: 12 ou SEQ IDNO.: 14 , para uso como um iniciador em uma reação de PCR;viii) uma seqüência de oligonucleotídeo tendo uma seqüên-cia de nucleotídeo compreendendo entre 20 a 200 nucleotídeos consecuti-vos selecionada da seqüência de nucleotídeo de qualquer uma de SEQ IDNO.: 3, SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 7, SEQ ID NO.: 9, SEQ ID NO.: 11,SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 17 ou SEQ ID NO.: 21, para uso como uminiciador em uma reação de PCR; ouix) um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo dequalquer uma de SEQ ID NO.: 1, SEQ ID NO.: 2, SEQ ID NO.: 15 ou SEQ IDNO.: 16, SEQ ID NO.: 19 ou SEQ ID No.20 para uso como um iniciador emuma reação de PCR;b) fornecimento de uma ou mais moléculas de RNA de filamentoduplo às células de planta ou plantas das referidas primeira ou segunda es-pécie ou cultivar de Nicotiana, em que as referidas moléculas de RNA defilamento duplo compreendem duas fitas de RNA, uma fita de RNA consis-tindo essencialmente em uma seqüência de nucleotídeo de RNA de 20 a 21nucleotídeos consecutivos selecionada de uma seqüência de nucleotídeo dareferida proteína de XyIT que codifica um fragmento de DNA ou o comple-mento da mesma, em que os referidos 20 a 21 nucleotídeos consecutivoscodificam pelo menos um aminoácido de XyIT espécie ou cultivar de Nicotia-na-específico, respectivamente ou em que os referidos 20 a 21 nucleotídeosconsecutivos compreendem pelo menos um nucleotídeo de Nicotiana espé-cie ou cultivar de Mcoí/ana-específico, respectivamente; ec) identificação de uma célula de planta ou planta Nicotianacompreendendo a referida molécula ou moléculas de RNA de filamento du-plo a qual tem um menor nível de resíduos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanos ligadas à proteína do que a mesma célula de planta ou planta deNicotiana, a qual não compreende a referida molécula ou moléculas de RNAde filamento duplo.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, em que o forne-cimento da referida molécula ou moléculas de RNA de filamento duplo é ob-tida através de fornecimento, às referidas células de planta ou plantas, deuma molécula ou moléculas de RNA de filamento duplo compreendendouma primeira seqüência de nucleotídeo de pelo menos 19 de 20 nucleotí-deos consecutivos selecionada da seqüência de nucleotídeo de a referidaproteína de XyIT que codifica um fragmento de DNA ou o complemento damesma, em que os referidos pelo menos 19 de 20 nucleotídeos consecuti-vos codificam pelo menos um aminoácido de XyIT espécie ou cultivar de Ni-cotiana-específico ou em que os referidos pelo menos 19 de 20 nucleotídeosconsecutivos compreendem pelo menos um nucleotídeo de XyIT espécie oucultivar de Mcoí/ana-específico e uma segunda seqüência de nucleotídeo aqual é o complemento da referida primeira seqüência de nucleotídeo.

26. Método de acordo com a reivindicação 24, em que as referi-das moléculas de RNA de filamento duplo são fornecidas às referidas célu-las de planta ou plantas através de integração de um DNA quimérico no ge-noma das referidas células de planta para gerar células de planta transgêni-ca e, opcionalmente, regeneração das referidas células de planta para obterplantas transgênicas, o referido DNA quimérico compreendendo os seguin-tes fragmentos de DNA operaveimente ligados:a) um promotor expressível em planta;b) uma região de DNA passível de transcrição compreendendo:i) uma primeira região de DNA sentido compreendendo umaseqüência de nucleotídeo de pelo menos 19 de 20 nucleotídeos consecuti-vos selecionada da seqüência de nucleotídeo da referida proteína de XyITque codifica um fragmento de DNA ou o complemento da mesma, em que osreferidos pelo menos 19 de 20 nucleotídeos consecutivos codificam pelomenos um aminoácido de XyIT espécie ou cultivar de Mcof/ana-específico,respectivamente ou em que os referidos pelo menos 19 de 20 nucleotídeosconsecutivos compreendem pelo menos um nucleotídeo de XyIT espécie oucultivar de Nicotiana-especitico, respectivamente;ii) uma segunda região de anti-sentido de DNA compreen-dendo uma seqüência de nucleotídeo de pelo menos 19 nucleotídeos con-secutivos a qual têm pelo menos 95% de identidade de seqüência ao com-plemento da referida primeira região de DNA;em que uma molécula de RNA transcrita a partir da referida re-gião passível é transcrição é capaz de formar uma região de RNA de fila-mento duplo pelo menos entre uma região de RNA transcrita a partir da refe-rida primeira região de sentido de DNA e uma região de RNA transcrita apartir da referida segunda região de anti-sentido de DNA; ec) uma região de DNA compreendendo um sinal de poliadenila-ção e de término de transcrição funcional em plantas.

27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-26, ainda compreendendo a etapa de cruzamento da referida planta Nicotia-na tendo um baixo nível de resíduos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanos li-gadas à proteína com outra planta Nicotiana para obter plantas de prole Ni-cotiana tendo um baixo nível de resíduos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanosligadas à proteína.

28. Método para identificar um fragmento de DNA de XyIT deNicotiana compreendendo as etapas de:a) fornecimento de DNA genômico ou cDNA obtenível de umaespécie ou cultivar de Nicotiana;b) seleção de um meio do seguinte grupo:i) um fragmento de DNA compreendendo uma seqüência denucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO.: 4, SEQID NO.: 6, SEQ ID NO.: 8, SEQ ID NO.: 10, SEQ ID NO.: 12 ou SEQ ID NO.:-14, para uso como uma sonda;ii) um fragmento de DNA compreendendo a seqüência denucleotídeo de qualquer uma de SEQ ID NO.: 3, SEQ ID NO.: 5, SEQ IDNO.: 7, SEQ ID NO.: 9, SEQ ID NO.: 11, SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 17ou SEQ ID NO.: 21, para uso como uma sonda;iii) um fragmento de DNA ou oligonucleotídeo compreenden-do uma seqüência de nucleotídeo consistindo em entre 20 a 1513 nucleotí-deos consecutivos selecionados de uma seqüência de nucleotídeo que codi-fica a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO.: 4 ou SEQ ID NO.: 6, parauso como uma sonda;iv) um fragmento de DNA ou oligonucleotídeo compreenden-do uma seqüência de nucleotídeo consistindo em entre 20 a 3574 nucleotí-deos consecutivos selecionados de uma seqüência de nucleotídeo que codi-fica a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO.: 8, SEQ ID NO.: 10, SEQ IDNO.: 12 ou SEQ ID NO.: 14 para uso como uma sonda;v) um fragmento de DNA ou oligonucleotídeo compreenden-do uma seqüência de nucleotídeo consistindo em entre 20 a 3574 nucleotí-deos consecutivos selecionados de uma seqüência de nucleotídeo de qual-quer uma de SEQ ID NO.: 3, SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 7, SEQ ID NO.: 9,SEQ ID NO.: 11, SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 17 ou SEQ ID NO.: 21 parauso como uma sonda;vi) uma seqüência de oligonucleotídeo tendo uma seqüênciade nucleotídeo compreendendo entre 20 a 200 nucleotídeos consecutivosselecionados de uma seqüência de nucleotídeo que codifica a seqüência deaminoácido de SEQ ID NO.: 4 ou SEQ ID NO.: 6, para uso como um inicia-dor em uma reação de PCR;vii) uma seqüência de oligonucleotídeo tendo uma seqüênciade nucleotídeo compreendendo entre 20 a 200 nucleotídeos consecutivosselecionados de uma seqüência de nucleotídeo que codifica a seqüência deaminoácido de SEQ ID NO.: 8, SEQ ID NO.: 10, SEQ ID NO.: 12 ou SEQ IDNO.: 14 , para uso como um inicíador em uma reação de PCR;viii) uma seqüência de oligonucleotídeo tendo uma seqüên-cia de nucleotídeo compreendendo entre 20 a 200 nucleotídeos consecuti-vos selecionada da seqüência de nucleotídeo de qualquer uma de SEQ IDNO.: 3, SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 7, SEQ ID NO.: 9, SEQ ID NO.: 11,SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 17 ou SEQ ID NO.: 21, para uso como uminiciador em uma reação de PCR; ouix) um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo dequalquer uma de SEQ ID NO.: 1, SEQ ID NO.: 2, SEQ ID NO.: 15 ou SEQ IDNO.: 16, SEQ ID NO.: 19 ou SEQ ID No.20 para uso como um iniciador emuma reação de PCR;c) identificação de um fragmento de DNA de XyIT da referidaespécie ou cultivar de Nicotiana realizando uma PCR usando o referido DNAgenômico ou o referido cDNA e os referidos iniciadores ou realizando hibridi-zação usando o referido DNA genômico ou o referido cDNA e as referidassondas.

29. Método para isolar um fragmento de DNA de XyIT de Nieoti-ana compreendendo as etapas de:a) identificação do referido fragmento de DNA de XyIT de Nicoti-ana de acordo com o método como definido na reivindicação 28; eb) isolamento do referido fragmento de DNA de XyIT de Nieotia-na.

30. Método para identificar um alelo de XyIT de Nieotiana corre-lacionado a um baixo nível de resíduos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanosligadas à proteína compreendendo as etapas de:(a) fornecimento de uma população, opcionalmente uma popula-ção com mutação, de diferentes linhagens de planta de uma espécie ou cul-tivar de Nicotiana;(b) identificação, em cada linhagem de planta, da referida popu-lação de um alelo de XyIT de Nicotiana de acordo com o método como defi-nido na reivindicação 28;(c) análise do nível de resíduos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanos ligadas à proteína de cada linhagem de planta da referida popula-ção e identificação daquelas linhagens de planta tendo um menor nível deresíduos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanos ligadas à proteína do que ou-tras linhagens de planta;(d) correlação do baixo nível de resíduos de beta-1,2-xilose so-bre N-glicanos ligadas à proteína na linhagem de planta com relação à pre-sença de um alelo de XyIT de Nicotiana.

31. Método para obter uma célula de planta ou planta Nicotianacom um baixo nível de resíduos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanos ligadasà proteína compreendendo as etapas de:a) identificação de um alelo de XyIT de Nicotiana correlacionadoa um baixo nível de resíduos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanos ligadas àproteína de acordo com o método como definido na reivindicação 30;b) introdução do referido alelo de XyIT de Nicotiana em uma Ii-nhagem de planta Nicotiana de escolha.

32. Fragmento de DNA isolado que codifica uma proteína com-preendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO.: 12 ou SEQ ID NO.:ou qualquer parte da mesma que codifica pelo menos um aminoácido deXyIT Nicotiana benthamiana-específico.

33. Fragmento de DNA específico de acordo com a reivindicação-32, compreendendo a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO.: 11, SEQ IDNO.: 13 ou SEQ ID NO.: 21 ou qualquer parte da mesma compreendendopelo menos um nucleotídeo de XyIT Nicotiana benthamiana-especíüco.

34. Fragmento de DNA isolado que codifica uma proteína com-preendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO.: 4 ou SEQ ID NO.:-6, SEQ ID NO.: 8,. SEQ ID NO.: 10 ou qualquer parte da mesma que codifi-cam pelo menos um aminoácido de XyIT Nicotiana tabacum cv. Petite Hava-na SR1-específico.

35. Fragmento de DNA isolado de acordo com a reivindicação 34, compreendendo a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO.: 3 ou SEQID NO.: 5, SEQ ID NO.: 7, SEQ ID NO.: 9 ou SEQ ID NO.: 17 ou qualquerparte da mesma compreendendo pelo menos um nucleotídeo de XyIT Nico-tiana tabacum cv. Petite Havana SR1 -específico.

36. Fragmento de DNA isolado obtenível através do método co-mo definido na reivindicação 28 que codifica pelo menos um aminoácido deXyIT espécie de Nicotiana- ou cultivar de Nicotiana-específtco.

37. Fragmento de DNA isolado de acordo com a reivindicação 36, compreendendo pelo menos um nucleotídeo de XyIT espécie de Nieotia-na- ou cultivar de Nicotiana-específico.

38. Gene quimérico compreendendo os seguintes fragmentos deDNA operavelmente ligados:a) um promotor expressível em planta;b) uma região de DNA passível de transcrição compreendendo:i) uma primeira região de DNA compreendendo pelo menos 19 de 20 nucleotídeos consecutivos selecionados de uma seqüência de nu-cleotídeo que codifica uma proteína de XyIT de Nicotiana ou o complementoda mesma, em que os referidos 19 de 20 nucleotídeos consecutivos codifi-cam pelo menos um aminoácido de XyIT espécie ou cultivar de Nicotiana-específico ou selecionada da seqüência de nucleotídeo de um gene de XyITde Nieotiana ou um cDNA de XyIT de Nieotiana ou o complemento da mes-ma, em que os referidos 19 de 20 nucleotídeos consecutivos compreendempelo menos um nucleotídeo de XyIT espécie de Nicotiana-e specífico, na ori-entação de sentido;ii) uma segunda região de DNA compreendendo pelo menos 19 de 20 nucleotídeos consecutivos selecionados de uma seqüência de nu-cleotídeo que codifica uma proteína de XyIT de Nieotiana ou o complementoda mesma, em que os referidos 19 de 20 nucleotídeos consecutivos codifi-cam pelo menos um aminoácido de XyIT espécie ou cultivar de Nieotiana-específico ou selecionada da seqüência de nucleotídeo de um gene de XyITde Nicotiana ou um cDNA de XyIT de Nicotiana ou o complemento da mes-ma, em que os referidos 19 de 20 nucleotídeos consecutivos compreendempelo menos um nucleotídeo de XyIT espécie de Nicotiana-específico, na ori-entação de sentido, pelo que uma molécula de RNA produzida através detranscrição da referida região de DNA passível de transcrição é capaz deformação de uma região de RNA de filamento duplo através de emparelha-mento de base pelo menos entre uma região de RNA correspondendo à re-ferida primeira região de DNA e uma região de RNA correspondendo à refe-rida segunda região de RNA; ec) uma região de DNA compreendendo um sinal de poliadenila-ção e de término de transcrição funcional em plantas.

39. Gene quimérico compreendendo os seguintes fragmentos deDNA operavelmente ligados:a) um promotor expressível em planta;b) uma região de DNA compreendendo pelo menos 19 de 20nucleotídeos consecutivos selecionados de uma seqüência de nucleotídeoque codifica uma proteína de XyIT de Nicotiana ou o complemento da mes-ma, em que os referidos 19 de 20 nucleotídeos consecutivos codificam pelomenos um aminoácido de XyIT espécie ou cultivar de Nicotiana-específlcoou selecionada da seqüência de nucleotídeo de um gene de XyIT de Nieoti-ana ou um cDNA de XyIT de Nieotiana ou o complemento da mesma, emque os referidos 19 de 20 nucleotídeos consecutivos compreendem pelomenos um nucleotídeo de XyIT espécie de /V/cof/ana-específico, na orienta-ção de sentido; ec) uma região de DNA compreendendo um sinal de poliadenila-ção e de término de transcrição funcional em plantas.

40. Gene quimérico compreendendo os seguintes fragmentos deDNA operavelmente ligados:a) um promotor expressível em planta;b) uma região de DNA compreendendo pelo menos 19 de 20nucleotídeos consecutivos selecionados de uma seqüência de nucleotídeoque codifica uma proteína de XyIT de Nieotiana ou o complemento da mes-ma, em que os referidos 19 de 20 nucleotídeos consecutivos codificam pelomenos um aminoácido de XyIT espécie ou cultivar de Nicotiana-específicoou selecionada da seqüência de nucleotídeo de um gene de XyIT de Nicoti-ana ou um cDNA de XyIT de Nicotiana ou o complemento da mesma, emque os referidos 19 de 20 nucleotídeos consecutivos compreendem pelomenos um nucleotídeo de XyIT espécie de Nicotiana-espec\T\co, na orienta-ção de anti-sentido; ec) uma região de DNA compreendendo um sinal de poliadenila-ção e de término de transcrição funcional em plantas.

41. Gene quimérico de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 38 a 40, em que o referido aminoácido de XyIT espécie de Nieotiana-específico é um aminoácido de XyIT Nicotiana bentamiana-especíilco.

42. Gene quimérico de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 38 a 41, em que a referida seqüência de nucleotídeo que codifica umaproteína de XyIT de Nieotiana compreende uma seqüência de nucleotídeoque codifica a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO.: 12 ou SEQ ID NO.:14.

43. Gene quimérico de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 38 a 42 em que o referido nucleotídeo de XyIT espécie de Nieotiana-específico é um nucleotídeo de XyIT Nieotiana bentamiana-específico.

44. Gene quimérico de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 38 a 43 em que a referida seqüência de nucleotídeo do referido genede XyIT de Nieotiana compreende a seqüência de nucleotídeo de SEQ IDNO.: 11, SEQ ID NO.: 13 ou SEQ ID No. 21.

45. Gene quimérico de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 38 a 40, em que o referido aminoácido de XyIT cultivar de Nieotiana-específico é um aminoácido de XyIT Nieotiana tabaeum cv. Petite HavanaSR1-específico.

46. Gene quimérico de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 38 a 40 ou 45, em que a referida seqüência de nucleotídeo que codificaa referida proteína de XyIT de Nicotiana compreende uma seqüência de nu-cleotídeo que codifica a seqüência de aminoácidò de SEQ ID NO.: 4, SEQID NO.: 6, SEQ ID NO.: 8 ou SEQ ID NO.: 10.

47. Gene quimérico de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 38 a 40, 45 ou 46, em que o referido nucleotídeo de XyIT cultivar deNicotiana-específico é um nucleotídeo de XyIT Nicotiana tabacum cv. PetiteHavana SR1 -específico.

48. Gene quimérico de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 38 a 40 ou 45 a 47, em que a referida seqüência de nucleotídeo do re-ferido gene de XyIT de Nicotiana ou o referido cDNA de XyIT de Nicotianacompreende a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO.: 3, SEQ ID NO.: 5,SEQ ID NO.: 8, SEQ ID NO.: 10 ou SEQ ID NO.: 17.

49. Célula de planta Nicotiana compreendendo o gene quiméricocomo definido em qualquer uma das reivindicações 38 a 48.

50. Planta Nieotiana consistindo essencialmente nas células deplanta Nieotiana como definidas na reivindicação 49.

51. Célula de planta ou planta Nieotiana obtida através do méto-do como definido na reivindicação 31.

52. Semente de uma planta Nieotiana como definida na reivindi-cação 50 ou 51.

53. Uso de uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma pro-teína compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO.: 4, SEQID NO.: 6, SEQ ID NO.: 8, SEQ ID NO.: 10, SEQ ID NO.: 12 ou SEQ ID NO.:-14 ou qualquer parte da mesma compreendendo pelo menos 19 de 20 nu-cleotídeos consecutivos que codificam pelo menos um aminoácido de XyITespécie ou cultivar de Nieotiana-especfílco para diminuir o nível de resíduosde beta-1,2-xilose sobre N-glicanos ligadas à proteína em uma planta Nieotiana.

54. Uso de uma seqüência de nucleotídeo compreendendo aseqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO.: 3, SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 7,SEQ ID NO.: 9, SEQ ID NO.: 11, SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 17 ou SEQID NO.: 21 ou qualquer parte da mesma compreendendo pelo menos 19 de-20 nucleotídeos consecutivos compreendendo pelo menos um nucleotídeode XyIT espécie ou cultivar de Mcof/a/ia-específico, para diminuir o nível deresíduos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanos ligadas à proteína em umaplanta Nicotiana.

55. Uso de uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma pro-teína compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO.: 4, SEQID NO.: 6, SEQ ID NO.: 8, SEQ ID NO.: 10, SEQ ID NO.: 12 ou SEQ ID NO.:-14 ou qualquer parte da mesma que codifica pelo menos um aminoácido deXyIT espécie ou cultivar de Mcof/ana-específico, para identificar um gene deXyIT ou cDNA de XyIT em uma espécie ou cultivar de Nicotiana.

56. Uso de uma seqüência de nucleotídeo compreendendo aseqüência da SEQ ID NO.: 3, SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 7, SEQ ID NO.:-9, SEQ ID NO.: 11, SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 17 ou SEQ ID NO.: 21,ou qualquer parte das mesmas, compreendendo pelo menos um nucleotídeoXyIT espécie ou cultivar-específico de Nicotiana, pra identificar um gene XyITou um CDNA XyIT em uma espécie ou cultivar Nicotiana.

57. Uso de uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma pro-teína compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO.: 4, SEQID NO.: 6, SEQ ID NO.: 8, SEQ ID NO.: 10, SEQ ID NO.: 12 ou SEQ ID NO.:-14 ou qualquer parte da mesma que codifica pelo menos um aminoácido deXyIT espécie ou cultivar de Nicotiana-especíiico, para identificar um alelo deum gene XyIT correlacionado a um baixo nível de resíduos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanos ligadas à proteína em uma espécie ou cultivar deNicotiana.

58. Uso de uma seqüência de nucleotídeo compreendendo aseqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO.: 3, SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 7,SEQ ID NO.: 9, SEQ ID NO.: 11, SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 17 ou SEQID NO.: 21 ou qualquer parte da mesma compreendendo pelo menos umnucleotídeo de XyIT espécie ou cultivar de Nicotiana-especíi\co, para identi-ficar um alelo de um gene XyiT correlacionado a um baixo nível de resíduosde beta-1,2-xilose sobre N-glicanos ligadas à proteína em uma espécie oucultivar de Nicotiana.

59. Uso de uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma pro-teína compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO.: 4, SEQID NO.: 6, SEQ ID NO.: 8, SEO ID NO.: 10, SEQ ID NO.: 12 ou SEQ ID NO.:- 14 ou qualquer parte da mesma que codificam pelo menos um aminoácidode XyIT espécie ou cultivar de Nicotiana-especíüco, para introduzir um alelode um gene XyIT correlacionado a um baixo nível de resíduos de beta-1,2-xilose sobre N-glicanos ligadas à proteína em uma espécie ou cultivar deNicotiana.

60. Uso de uma seqüência de nucleotídeo compreendendo aseqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO.: 3, SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 7,SEQ ID NO.: 9, SEQ ID NO.: 11, SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 17 ou SEQID NO.: 21 ou qualquer parte da mesma compreendendo pelo menos umnucleotídeo de XyIT espécie ou cultivar de Nicotiana-especítico, para intro-duzir um alelo de um gene XyITcorrelacionado a um baixo nível de resíduosde beta-1,2-xilose sobre N-glicanos ligadas à proteína em uma espécie oucultivar de Nicotiana.