JPH06197756A

JPH06197756A - 新規糖転移酵素及びそれをコードする遺伝子並びに該酵素の製造方法

Info

Publication number: JPH06197756A
Application number: JP5237118A
Authority: JP
Inventors: Naoyuki Taniguchi; 直之谷口; Atsushi Nishikawa; 淳西河; Mare Yamaguchi; 希山口
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Ltd
Priority date: 1992-08-24
Filing date: 1993-08-06
Publication date: 1994-07-19
Anticipated expiration: 2022-09-19
Also published as: DE69331484T2; JP3979678B2; DE69331484D1; EP0585109A3; EP0585109A2; US5834284A; DK0585109T3; ES2167326T3; US5707846A; EP0585109B1

Abstract

(57)【要約】【目的】新規な糖転移酵素、β１，６−Ｎ−アセチル
グルコサミニルトランスフェラーゼを提供する。【構成】以下の酵素学的性質：作用；ＵＤＰ−Ｎ−ア
セチルグルコサミンからＮ−アセチルグルコサミンをα
−６−Ｄ−マンノシドに転移する；分子量；約７３，０
００（還元剤非存在下ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）並びに
約７３，０００及び約６０，０００（還元剤存在下ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥによる）；を有するβ１, ６−Ｎ−アセチ
ルグルコサミニルトランスフェラーゼ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル
グルコサミンからＮ−アセチルグルコサミンを α−６
−Ｄ−マンノシドに転移する酵素（ＵＤＰ−Ｎ−アセチ
ルグルコサミン：α−６−Ｄ−マンノシド, β１, ６−
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、以下
ＧｎＴ−Ｖと略称する）、それをコードする遺伝子系、
及びＧｎＴ−Ｖの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】糖タンパク質中に見いだされるアスパラ
ギン型糖鎖（Ａｓｎ型糖鎖）は、その構成糖および分岐
の型から高マンノース型、複合型および混合型の３タイ
プに分類される。これらＡｓｎ型糖鎖の生合成は、先
ず、粗面小胞体の内腔側で脂質中間体からその糖鎖部分
が、翻訳中のポリペプチド鎖のアスパラギンにひとまと
めに転移されることから始まる。

【０００３】その後、粗面小胞体でグルコースと一部の
マンノースが除去されるが、一部の粗面小胞体局在性の
Asn 型糖鎖をもつ糖タンパク質はこのままとどまるた
め、高マンノース型糖鎖のままとなる。その他のオルガ
ネラ糖タンパク質、細胞表層糖タンパク質あるいは分泌
糖タンパク質は、ベシクル輸送によりゴルジ体に移り、
さらにマンノースが除去される。このゴルジ体では、ゴ
ルジ体酵素であるＮ−アセチルグルコサミニルトランス
フェラーゼ群の作用のよりＮ−アセチルグルコサミンが
導入され、分枝構造をとるようになる。この分枝構造の
形成により、高マンノース型糖鎖から混成型糖鎖および
複合型糖鎖への変換が始まり、フコースの導入、また、
トランスゴルジ領域でのガラクトースの導入を経て、最
後に、シアル酸が導入されてＡｓｎ型糖鎖の生合成が完
成する。

【０００４】これら一連のＡｓｎ型糖鎖合成のそれぞれ
のステップで、種々の酵素が触媒として働いていること
がわかっている。そのうち、Ａｓｎ型糖鎖の種々の分枝
構造の形成における、Ｎ−アセチルグルコサミンの転移
導入反応を触媒している酵素として、６種のＮ−アセチ
ルグルコサミニルトランスフェラーゼが知られている。
Ｓｃｈａｃｈｔｅｒら（Ｂｒｏｃｋｈａｕｓｅｎ，
Ｉ．，Ｃａａｒｖｅｒ，Ｊ．，ａｎｄＳｃｈａｃｈｔ
ｅｒ，Ｈ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，
６６，１１３４（１９８８））は、Ｍａｎα１−３（Ｍ
ａｎα１−６）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４Ｇ
ｌｃＮＡｃのトリマンノシル構造のコア構造に、Ｎ−ア
セチルグルコサミンを転移するこの６種の酵素をＧｎＴ
−ＩないしＧｎＴ−ＶＩと命名した。

【０００５】このうち、ＧｎＴ−Ｖは、β（１，６）ｂ
ｒａｎｃｈ構造（−［ＧｌｃＮＡｃ−β（１，６）Ｍａ
ｎ−α（１，６）Ｍａｎ］−）の形成に関わる酵素であ
る。β（１，６）ｂｒａｎｃｈ構造は、細胞の形質転換
株や腫瘍形成性細胞に、顕著に増加している事が知られ
ている（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｍ．，Ａｒａｎｇｏ，Ｊ．，Ｔ
ａｈｉｒ，Ｓ．Ｈ．，ａｎｄＨｉｎｄｓｇａｕｌ，
Ｏ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏ
ｍｍｕｎ．，１４６，６７９−６８４（１９８７）およ
びＡｒａｎｇｏ，Ｊ．，ａｎｄＰｉｅｒｃｃｅ，
Ｍ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５７，１３
４２１−１３４２７（１９８２））。

【０００６】また、腫瘍形成性細胞の癌転移能とβ
（１，６）ｂｒａｎｃｈの出現との間に関連があること
が示されている（Ｈｉｒａｉｚｕｍｉ，Ｓ．，Ｔａｋａ
ｓａｋｉ，Ｓ．，Ｓｈｉｒｏｋｉ，Ｋ．，Ｋｏｃｈｉｂ
ｅ，Ｎ．，ａｎｄＫｏｂａｔａ，Ａ．，Ａｒｃｈ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２８０，９−１９，
（１９９０））。ヒトでも、乳癌の生検例において、５
０％の例でβ（１，６）ｂｒａｎｃｈの発現が亢進して
いると報告されている（Ｄｅｎｎｉｓ，Ｊ．Ｗ．，ａｎ
ｄＬａｆｅｒｔｅ，Ｓ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４
９，９４５−９５０，（１９８９））。

【０００７】いずれの場合でも、β（１，６）ｂｒａｎ
ｃｈ構造の出現は、ＧｎＴ−Ｖ活性の上昇をともなって
いることがわかっている。このように、ＧｎＴ−Ｖは、
糖鎖生合成経路においてβ（１，６）ｂｒａｎｃｈ構造
の形成を触媒する点で重要であるばかりでなく、癌細胞
の易転移能および悪性度と関連するという点において
も、重要な鍵となる酵素である。

【０００８】これら６種のN-アセチルグルコサミニルト
ランスフェラーゼのうちＧｎＴ−Ｉについては、ヒトお
よびウサギのｃＤＮＡ構造が明かとなった（Ｋｕｍａ
ｒ，Ｒ．，Ｙａｎｇ，Ｊ．，Ｌａｒｓｅｎ，Ｒ．Ｄ．，
ａｎｄＳｔａｎｌｅｙ，Ｐ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７，９９４８−９９５
２，（１９９０）およびＳａｒｋａｒ，Ｍ．，Ｈｕｌ
ｌ，Ｅ．，Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｙ．，Ｓｉｍｐｓｏ
ｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｍｏｒｉｔｚ，Ｒ．Ｌ．，Ｄｕｎｎ，
Ｒ．，ａｎｄＳｃｈａｃｈｔｅｒ，Ｈ．，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８，２３
４−２３８，（１９９１））。

【０００９】一方、ＧｎＴ−Ｖについては、酵素活性か
らその存在が推定されており、生体内の各組織から精製
することが試みられているが、本酵素を可溶化する際、
極度に不安定な性質のために精製することが極めて困難
であった（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ａ．，Ｇｕ，Ｊ．，Ｆ
ｕｊｉｉ，Ｓ．，およびＴａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｎ．Ｂｉ
ｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１０３５巻，３
１３−３１８，（１９９０））。しかし最近、ラット腎
よりＧｎＴ−Ｖが単離、精製された例が報告されている
（Ｓｈｏｒｅｉｂａｈ，Ｍ．，Ｇ．，Ｈｉｎｄｇａｕ
ｌ，Ｏ．，ａｎｄＰｉｅｒｃｅ，Ｍ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２６７，２９２０−２９２７，（１９９
２））。

【００１０】しかしながら、純化したラットＧｎＴ−Ｖ
からは、当該酵素の遺伝子に関する詳細な情報は得られ
ていない。さらに、ヒトＧｎＴ−Ｖについては、その酵
素学的性質を含め、何らの情報も得られていない。Ｇｎ
Ｔ−Ｖは、癌化した細胞の悪性度のマーカーとして診断
上非常に有用であるばかりでなく、本酵素を用いて本酵
素の特異的阻害剤のスクリーニング系を確立することに
より癌転移防止剤を設計することが初めて可能となるの
で、ヒト由来のＧｎＴ−Ｖの単離、精製及び遺伝子を含
むその構造解析や大量生産の方法が望まれている。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記の実情を
鑑みてなされたものであり、その目的はヒト由来のＧｎ
Ｔ−Ｖを提供するものである。さらに、本発明は当該酵
素に係る遺伝子を単離し、当該遺伝子を用いて当該酵素
を大量に生産する方法を開発するとともに、遺伝子操作
による有用物質生産における糖鎖の均一生産をも可能に
することを目的とするものである。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、本酵素を
精製するための出発材料として、癌細胞の培養上清に着
目した。しかしながら、本発明者らは、ウシ血清等を添
加しなければ増殖できないような癌細胞の培養上清で
は、精製が困難であると考えた。そこで、各種癌細胞を
無タンパク質培地に馴化するべく鋭意検討を重ね、数十
種の無タンパク質培地に馴化した癌細胞を樹立すること
に成功した。そのうち、ヒト肺癌（小細胞癌）由来のＱ
Ｇ細胞の無タンパク質培地の培養上清中に本酵素活性を
認め、本酵素を精製することに成功した。

【００１３】従って本発明は、以下の酵素学的性質：（１）作用；ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンからＮ
−アセチルグルコサミンをα−６−Ｄ−マンノシドに転
移する；（２）基質特異性；ＧｎＧｎ−ｂｉ−ＰＡを受容体とし
た時を１００とした場合、ＧｎＧｎＦ−ｂｉ−ＰＡで約
７８％、ＧｎＧｎＧｎ−ｔｒｉ−ＰＡで約１２５％、Ｇ
ｎＭ−ＰＡで約６６％の反応性を示す；（３）至適ｐＨ；６．２−６．３；（４）阻害、活性化及び安定化；活性の発現にＭｎ²⁺を
必要とせず、また、２０mMＥＤＴＡ存在下においても活
性は阻害されない；

【００１４】（５）分子量；約７３，０００（還元剤非
存在下ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）並びに約７３，０００
及び約６０，０００（還元剤存在下ＳＤＳ−ＰＡＧＥに
よる）；（６）Ｋｍ値；受容体ＧｎＧｎ−ｂｉ−ＰＡ及び供与体
ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに対するＫｍ値は、各々１３３μ
Ｍ、３．５ｍＭである；並びに（７）以下のペプチドフラグメントを有する：（１）Thr-Pro-Trp-Gly-Lys （２）Asn-Ile-Pro-Ser-Tyr-Val （３）Val-Leu-Asp-Ser-Phe-Gly-Thr-Glu-Pro-Glu-Phe-
Asn-His-Ala-Asn-Tyr-Ala （４）Asp-Leu-Gln-Phe-Leu-Leu 、（５）Asn-Thr-Asp-Phe-Phe-Ile-Gly を有するβ１, ６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトラン
スフェラーゼを提供する。

【００１５】本発明のβ１, ６−Ｎ−アセチルグルコサ
ミニルトランスフェラーゼは、例えば少なくとも配列番
号：８に示すアミノ酸配列を含んで成るアミノ酸配列、
又は該アミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が修
飾されているアミノ酸配列を有する。ここでアミノ酸の
修飾とは、アミノ酸が付加、除去及び／又は置換されて
いることを意味する。本発明はさらにヒト肺癌由来のＱ
Ｇ細胞又はヒト大腸癌細胞ＣＬ０２０１細胞を培養し、
該培養物から該酵素を採取することを特徴とする前記酵
素の製造方法を提供する。

【００１６】本発明はさらに、前記β１, ６−Ｎ−アセ
チルグルコサミニルトランスフェラーゼ酵素の製造方法
において、該酵素をコードするＤＮＡを含んで成る発現
ベクターにより形質転換された宿主を培養又は飼育し、
該宿主から前記酵素を採取することを特徴とする方法を
提供する。本発明はさらに、前記酵素をコードする遺伝
子系、すなわちＤＮＡ、発現ベクター、及び形質転換さ
れた宿主に関する。

【００１７】

【具体的な証明】ヒト肺癌（小細胞癌）由来のＱＧ細胞
は、動物細胞の培養に常用されている任意の方法により
培養することができる。また、タンパク質を全く含まな
い培地を用いて静置培養することも可能である。具体的
な一例を実施例１に記載する。なお、当該ヒト肺癌（小
細胞癌）由来のＱＧ細胞は、Ｈｕｍａｎｌｕｎｇｃ
ａｒｃｉｎｏｍａＳＢＭ３３１と命名され、１９９２
年８月１８日付けで工業技術院微生物工業技術研究所に
受託番号微工研条寄第３９６７号（ＦＥＲＭＢＰ−３
９６７）としてブダペスト条約に基づき国際寄託されて
いる。

【００１８】酵素の活性測定法は、受容体を放射性同位
元素あるいは、蛍光物質により標識した後、当該酵素を
反応させ、反応生成物をＨＰＬＣで分離することにより
容易に測定することができる。具体的には、谷口等の既
報の方法（Ｔａｎｉｇｉｃｈｉ，Ｎ．，Ｎｉｓｈｉｋａ
ｗａ，Ａ．，Ｆｕｊｉｉ，Ｓ．，ａｎｄＧｕ，Ｊ．，
ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１７９，３９７−４
０８（１９８９）；Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ａ．，Ｇｕ，
Ｊ．，Ｆｕｊｉｉ，Ｓ．，ａｎｄＴａｎｉｇｉｃｈ
ｉ，Ｎ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ
１０３５，３１３−３１８（１９９０））に従うことが
できる。

【００１９】即ち、ＧｎＧｎ−２−ａｍｉｎｏｐｙｒｉ
ｄｉｎｅ（ＧｎＧｎ−ｂｉＰＡ）を受容体、ＵＤＰ−Ｇ
ｌｃＮＡｃ（Ｓｉｇｍａ）を供与体として、ＧｎＴ−Ｖ
の酵素活性を測定することができる。活性強度は転移さ
れたＮ−アセチルグルコサミン／時間／ｍｇタンパク質
で表わされる。なお、タンパク質量は既報（Ｒｅｄｉｎ
ｂａｕｇｈ，Ｍ，Ｇ．，ａｎｄＴｕｒｌｅｙ，Ｒ．
Ｂ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５３，２６７−２７
１（１９８６））に従い、ＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ
ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒ
ｄ，ＩＬ）にてウシアルブミンを標準として測定するこ
とができる。

【００２０】培養上清からの本酵素の単離、精製は、タ
ンパク質の精製に常用されている複数の方法を組み合わ
せることにより行なうことができる。また、本酵素の有
用な精製方法として、受容体および供与体に対する親和
性を利用することが可能である。本発明においては、無
タンパク質培養上清を、先ず限外濾過法により濃縮し、
次に、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いる疎水
性クロマトグラフィーにより活性画分を得る。

【００２１】さらにＨｙｄｒｏｘｙｌａｐａｔｉｔｅに
よる吸着後、活性画分を溶出させ、受容体カラムクロマ
トグラフィー（ＵＤＰ−ｈｅｘａｎｏｌａｍｉｎｅ−Ａ
ｇａｒｏｓｅ）および供与体カラムクロマトグラフィー
（ＧｎＧｎ−Ａｓｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）の２つのア
フィニティクロマトグラフィーを行い、還元剤非存在下
ドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミド電気泳動
を行うことにより単一バンドを示すポリペプチドが得ら
れる。これらの単離精製操作の具体例を実施例２に記載
する。

【００２２】上記のように鋭意検討の結果、本発明者ら
はヒト肺癌（小細胞癌）由来ＱＧ細胞の無タンパク質培
養上清の濃縮液から４段階の精製操作により約２０，０
００倍濃縮純化してＧｎＴ−Ｖを単離、精製することに
成功し、さらに当該酵素の部分アミノ酸配列をも明らか
にした。本発明に係る酵素は常用のタンパク質の単離、
精製方法を特定の組み合わせにより選択し、それを特定
の条件下で行うことにより初めて得られたものである。

【００２３】一旦、精製、単離され、後記のごとくその
物質的、構造的性質が解明されれば、それらの性質を指
標として、常用のタンパク質の分離、精製方法を任意に
組み合わせて、本明細書に記載するものとは異なる種々
の方法により純化することができる。また、本発明によ
り開示された酵素の部分アミノ酸配列に基づいて適当な
合成プローブを作製し、鳥類、両生類、哺乳類等、由来
の染色体ライブラリーやｃＤＮＡライブラリーから常法
により遺伝子を単離し、さらに単離された遺伝子を組換
えＤＮＡ技術により大量に製造することは所謂当業者に
とって容易になしえるものである。

【００２４】単離、精製された酵素は、以下の酵素学的
性質を有する。１．作用；ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンからＮ−
アセチルグルコサミンをα−６−Ｄ−マンノシドに転移
する。２．基質特異性；ＧｎＧｎ−ｂｉ−ＰＡを受容体とした
時を１００とすると、ＧｎＧｎＦ−ｂｉ−ＰＡで約７８
％、ＧｎＧｎＧｎ−ｔｒｉ−ＰＡで約１２５％、ＧｎＭ
−ＰＡで約６６％の反応性を示す。３．至適ｐＨ；６．２−６．３４．阻害、活性化及び安定化；活性の発現にMn²⁺を必要
としない。また、２０mM EDTA 存在下においても活性は
阻害されない。

【００２５】５．分子量；ドデシル硫酸ナトリウムーポ
リアクリルアミド（ＳＤＳ）電気泳動分析の結果、非還
元条件下において分子量が約７３，０００の単一バンド
を示し、還元条件下では、前述のバンドに加えて約６
０，０００の分子量の小さいバンドが認められる。ま
た、単離、精製した該酵素を、ネイティブポリアクリル
アミド電気泳動した後、ゲルより当該バンドを切り出し
て本酵素活性を測定した場合、該当するバンドの濃さに
応じて該酵素活性が認められる。以上のことから単離、
精製されたタンパク質が目的とするＧｎＴ−Ｖであるこ
とが確認された。具体例を実施例３に記載する。

【００２６】また、還元条件下ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミド電気泳動における二つのバンドの各々をＳＤＳポリ
アクリルアミド電気泳動ゲルより切り出し、トリプシン
消化後、逆相高速液体クロマトグラフィーによるペプチ
ドマッピングを試みたところ、６０ｋＤａおよび７３ｋ
Ｄａの溶出パターンについては同様のパターンが得られ
た。この結果より両タンパク質は一部酵素的切断を受け
ている可能性があるものの、同一タンパク質由来と結論
づけられた。具体例を実施例４に記載する。

【００２７】６．Ｋｍ値；受容体ＧｎＧｎ−ｂｉ−ＰＡ
と供与体ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに対するＫｍ値は、各々
１３３μＭ、３．５ｍＭである。７．ペプチドフラグメント；トリプシン消化ポリペプチ
ド断片を用いてアミノ酸配列を同定したところ、以下に
示す部分アミノ酸配列が得られた。（１）Thr-Pro-Trp-Gly-Lys （２）Asn-Ile-Pro-Ser-Tyr-Val （３）Val-Leu-Asp-Ser-Phe-Gly-Thr-Glu-Pro-Glu-Phe-
Asn-His-Ala-Asn-Tyr-Ala （４）Asp-Leu-Gln-Phe-Leu-Leu （５）Asn-Thr-Asp-Phe-Phe-Ile-Gly

【００２８】さらに、上記のペプチドフラグメントを用
いて予想されるオリゴヌクレオチドを作製し、当該オリ
ゴヌクレオチドをプローブとして染色体ライブラリーや
ｃＤＮＡライブラリーを常法によりスクリーニングする
ことにより、本発明に係るＧｎＴ−Ｖをコードする遺伝
子を得ることができる。

【００２９】本発明の遺伝子はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮ
Ａ、化学合成ＤＮＡのいずれであってもよい。ｃＤＮＡ
は、例えば、前記のようにしてヒト細胞、例えばヒト肺
癌由来のＱＧ細胞から精製したＧｎＴ−Ｖの、実施例５
に示すような部分アミノ酸配列に基いて設計したＤＮＡ
（ヌクレオチド）プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖
反応法（ＰＣＲ）によりクローニングすることができ
る。クローニングの具体的な１例を実施例８に示す。

【００３０】本発明の遺伝子はさらに、ＧｎＴ−Ｖ活性
を有する蛋白をコードし、配列番号：８のヌクレオチド
配列とハイブリダイズするＤＮＡも含まれる。実施例８
においてクローニングされた、本発明のＧｎＴ−Ｖをコ
ードするＤＮＡのヌクレオチド配列及び該ヌクレオチド
配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号：８に示
す。

【００３１】こうして、一旦アミノ酸配列が決定されれ
ば、この天然アミノ酸配列に１〜複数のアミノ酸が付加
されておりなおＧｎＴ−Ｖ活性を維持しているポリペプ
チド、前記天然アミノ酸配列から１〜複数個のアミノ酸
が除去されておりなおＧｎＴ−Ｖ活性を維持しているポ
リペプチド、前記天然アミノ酸配列中の１〜複数個のア
ミノ酸が他のアミノ酸により置き換えられておりなおＧ
ｎＴ−Ｖ活性を維持しているポリペプチド、さらには、
上記のアミノ酸付加修飾、アミノ酸除去修飾及びアミノ
酸置換修飾が組合わされた修飾を有しなおＧｎＴ−Ｖ活
性を維持しているポリペプチドなど、種々の修飾型Ｇｎ
Ｔ−Ｖを設計し、それを製造することができる。

【００３２】上記アミノ酸の付加、除去及び置換等の修
飾におけるアミノ酸の数は、特に限定されないが、付加
については、例えば、本発明のＧｎＴ−Ｖとのハイブリ
ッド蛋白に用いられる機能性蛋白のアミノ酸の数（例え
ば、マルト−スバインディングプロテイン（ｍａｌｔｏ
ｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）等の公知の抽
出精製もしくは安定化用蛋白または各種生理活性蛋白、
例えばＩＬ−３，ＩＬ−１１のようなサイトカイン）や
本因子に付加されたシグナルペプチドのそれに依存し、
すなわち、当該修飾の目的に依存して決定される。例え
ば、１〜３０、好ましくは、１〜１０の付加があげられ
る。

【００３３】また、除去については、除去されるアミノ
酸の数は、ＧｎＴ−Ｖ活性が維持されるように設計、決
定され、例えば、１〜３０、好ましくは１〜２０、ま
た、本因子の活性領域以外の領域のアミノ酸の数があげ
られる。さらに、置換については、置換されるアミノ酸
の数は、ＧｎＴ−Ｖが維持されるように設計、決定さ
れ、例えば、１〜１０、好ましくは、１〜５があげられ
る。

【００３４】本発明においては、ＧｎＴ−Ｖをコードす
る遺伝子のヌクレオチド配列として配列番号：８に示す
ヌクレオチド配列を開示するが、本発明のＧｎＴ−Ｖの
遺伝子はこれに限定されない。一旦、天然ＧｎＴ−Ｖの
アミノ酸配列が決定され、又は修飾型ＧｎＴ−Ｖのアミ
ノ酸配列が設計されれば、コドンの縮重に基き、同じア
ミノ酸配列をコードする種々のヌクレオチド配列を設計
し、それを調製することができる。この場合、使用すべ
き宿主により高頻度で用いられるコドンを使用するのが
好ましい。

【００３５】本発明の天然ＧｎＴ−Ｖをコードする遺伝
子を得るには、実施例８に記載する様にしてｃＤＮＡを
得ることができるが、これに限定されない。すなわち、
天然ＧｎＴ−Ｖのアミノ酸配列をコードする１つのヌク
レオチド配列が決定されれば天然ＧｎＴ−Ｖをコードす
る遺伝子は、本発明に具体的に開示するストラテジーと
は異なるストラテジーによりｃＤＮＡとしてクローニン
グすることができ、さらにはそれを生産する細胞のゲノ
ムからクローニングすることもできる。

【００３６】ゲノムからクローニングする場合、実施例
８において使用した種々のプライマーヌクレオチド又は
プローブヌクレオチドを、ゲノムＤＮＡ断片の選択のた
めプローブとして使用することができる。また、配列番
号：８に記載するヌクレオチド配列に基いて設計された
他のプローブを用いることもできる。ゲノムから目的と
するＤＮＡをクローニングするための一般的方法は当業
界においてよく知られている（Current Protocols In M
olecular Biology, John Wiley & Sons 社、第５章及び
第６章）。

【００３７】本発明の天然ＧｎＴ−Ｖをコードする遺伝
子はまた、化学合成によっても調製することができる。
ＤＮＡの化学合成は当業界において自動ＤＮＡ合成機、
例えばアプライドバイオシステム社３９６ＤＮＡ／ＲＮ
Ａ合成機など採用して容易である。従って、当業者は、
配列番号：８に示されるヌクレオチド配列のＤＮＡを容
易に合成することができる。

【００３８】本発明の天然型ＧｎＴ−Ｖを生来のコドン
とは異なるコドンによりコードする遺伝子、及び修飾型
ＧｎＴ−Ｖをコードする遺伝子は、前記のごとく化学合
成により調製することもでき、また配列番号：８に示す
ヌクレオチド配列を有するＤＮＡ又はＲＮＡを鋳型とし
て変異誘発プライマーと共に用いる部位特定変異誘発法
（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔｎｇｅｎｅｓｉ
ｓ）等常法に従って得ることもできる（例えば、Curren
t Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Son
s 社、第８章を参照のこと）。

【００３９】上記のようにして本発明のＧｎＴ−Ｖの遺
伝子が得られると、これを用いて、常用の遺伝子組換え
法により組換えＧｎＴ−Ｖを製造することができる。す
なわち、本発明のＧｎＴ−ＶをコードするＤＮＡを適当
な発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを適当な宿主
細胞に導入し、該宿主細胞を培養し、そして得られた培
養物（細胞又は培地）から目的とするＧｎＴ−Ｖを採取
する。

【００４０】宿主としては原核生物又は真核生物を用い
ることができる。原核生物としては細菌、特に大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、バシルス属
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌、例えばバシルス・ズブチリ
ス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等を用いることができる。
真核生物としては酵母、例えばサッカロミセス（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母、例えばサッカロミセス
・セレビシエー（Ｓ．ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、等の真
核性微生物、昆虫細胞、例えば、ヨガ細胞（Ｓｐｏｄｏ
ｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、キャベツルーパ
ー細胞（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ）、カイコ細
胞（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）、動物細胞、例えばヒト
細胞、サル細胞、マウス細胞等を使用することができ
る。本発明においてはさらに、生物体それ自体、例えば
昆虫、例えばカイコ、キャベツルーパー等を用いること
もできる。

【００４１】発現ベクターとしては、プラスミド、ファ
ージ、ファージミド、ウィルス（バキュロ（昆虫）、ワ
クチニア（動物細胞））等が使用できる。発現ベクター
中のプロモーターは宿主細菌に依存して選択され、例え
ば細菌用プロモーターとしてはｌａｃプロモーター、ｔ
ｒｐプロモーター等が使用され、酵母用プロモーターと
しては、例えば、ａｄｈｌプロモーター、ｐｑｋプロモ
ーター等が使用される。また、昆虫用プロモーターとし
てはバキュロウィルスポリヘドリンプロモーター等、動
物細胞としてはＳｉｍｉａｎＶｉｒｕｓ４０のｅａｒ
ｌｙまたはｌａｔｅプロモーター等があげられる。

【００４２】発現ベクターによる宿主の形質転換は、当
業界においてよく知られている常法により行うことがで
き、これらの方法は例えば、Current Protocols in Mol
ecular Biology, John Wiley & Sons 社、に記載されて
いる。形質転換体の培養も常法に従って行うことができ
る。培養物からのＧｎＴ−Ｖの精製は、タンパク質を単
離・精製するための常法に従って、例えば、限外濾過、
各種カラムクロマトグラフィー、例えばセフアロースを
用いるクロマトグラフィー等により行うことができる。

【００４３】

【実施例】以下、実施例により本発明を詳細に説明す
る。実施例１．ＧｎＴ−Ｖ産生細胞の培養と培養上清の調製ヒト肺癌（小細胞癌）由来のＱＧ細胞（微工研条寄第３
９６７号）をオプチセル５３００（ＣｈａｒｌｅｓＲ
ｉｖｅｒＩｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）に
て培養した。多孔性のセラミック成育チャンバー（有効
表面積＞３２，０００cm² ）に２Ｘ１０⁹ 細胞を植え、
５％子牛血清（ＧＩＢＣＯ）含有Ｈａｍ，ｓＦ−１２培
養液（Ｆｌｏｗ）を用いて、コンフルエントになるまで
培養した。

【００４４】次に、１０^-8Ｍｓｏｄｉｕｍｓｅｌｅ
ｎｉｔｅ含有タンパク質無添加Ｈａｍ，ｓＦ−１２
培養液を連続的に添加することにより、血清量を逓減さ
せた。２週間の培養後、１４０Ｌの培養上清が得られ
た。この培養上清をＵＦ−メンブレン（Ｍｉｌｉｐｏｒ
ｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を濾過膜とする超濾過装置
を用いて約１００倍濃縮した。濃縮した培養上清１．４
リットルを精製材料に供した。

【００４５】実施例２．濃縮した培養上清からの本酵素
の精製（１）ＵＤＰ−ヘキサノルアミンアガロースとＧｌｃＮ
Ａｃβ１−２Ｍａｎα１−３−（ＧｌｃＮＡｃβ１−２
Ｍａｎα１−６）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４
ＧｌｃＮＡｃ−アスパラギン（ＧｎＧｎ−Ａｓｎ）セフ
ァロースの調製ＵＤＰ−ヘキサノルアミンアガロースは、Ｓｉｇｍａ社
（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より購入した。ＧｎＧｎ−
Ａｓｎはヒトトランスフェリンから調製した。先ず、ヒ
トトランスフェリンを０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．
０）中３７℃でプロナーゼ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭ
ａｎｎｈｅｉｍ社）で１２時間、２回繰り返し消化した
後、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で予め平衡化し
たゲル濾過カラム（ＴｏｙｏｐｅｒｌＨＷ−４０、
２．６ｘ１００ｃｍ、Ｔｏｓｏｈ、Ｔｏｋｙｏ）によ
り、糖ペプチドを分離した。

【００４６】次に、分離した糖ペプチドをシアリターゼ
（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｕｒｅａｆａｃｉｅｎｃ
ｅ、ＮａｃａｌａｉＴｅｓｑｕｅ、Ｋｙｏｔｏ）及び
β−ガラクトシダーゼ（ｊａｃｋｂｅａｎ、Ｓｅｉｋ
ａｇａｋｕＣｏ、Ｊａｐａｎ）で酵素消化することに
よりＧｎＧｎ−Ａｓｎを得た。ＧｎＧｎ−Ａｓｎセファ
ロースは１００μｍｏｌのＧｎＧｎ−Ａｓｎに１０ｍｌ
の活性化ＣＨ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を
反応させることにより結合させて得た。

【００４７】（２）フェニル−セファロースカラムクロ
マトグラフィー 4.5 ｘ 18 cm のカラムに２８０ｍｌのフェニル−セフ
ァロースを充填し、１．５Ｌの２０ｍＭリン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ６．８，４０％飽和硫安含有）で平衡化さ
せた。実施例１で調製した濃縮細胞培養上清１．３リッ
トルを硫安４０％飽和にし、３０００ｇで３０分間の遠
心操作後、遠心上清を当該カラムに吸着させた。

【００４８】溶出は、硫安４０％を含む２０ｍＭリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）を用いて、硫安濃度を０
％まで下げるリニアグラジエントで行なった。その時の
流速は、３ｍｌ／分とした。溶出画分の２８０ｎｍの吸
光度とＧｎＴ−Ｖ酵素活性を測定した。図１に示したご
とく、ＧｎＴ−Ｖ酵素活性のピークは、２８０ｎｍの吸
収ピークより後半に溶出された。

【００４９】（３）ハイドロキシアパタイトカラムクロ
マトグラフィーフェニル−セファロースカラムクロマトグラフィーより
溶出させたＧｎＴ−Ｖ酵素活性画分を集め、さらに、Ａ
ｍｉｃｏｎＹＭ−３０メンブランを用いて濃縮と同時
に、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）と
の溶媒交換を行なった。これを、３００ｍｌの２０ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で予め平衡化した
５５ｍｌのハイドロキシルアパタイトに吸着させた。溶
出は、３ｍｌ／分で５０ｍＭ−３００ｍＭのリン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ６．８）のリニアグラジエントにより
行なった。ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー
の溶出パターンを図２に示す。ＧｎＴ−Ｖ酵素活性ピー
クは、他の大部分の蛋白質から分離して溶出された。

【００５０】（４）ＵＤＰ−ヘキサノールアミンアガロ
ース−カラムクロマトグラフフィー次に、ハイドロキシアパタイトカラムからの活性画分を
集め、ＡｍｉｃｏｎＹＭ−３０メンブランを用いて、１
０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．２５）に溶媒を
変換したものを、１００ｍｌの１０ｍＭリン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ６．２５）で予め平衡化した２０ｍｌのＵ
ＤＰ−ヘキサノールアミンアガロース−カラムに吸着さ
せた。酵素は、０．３ＭＮａＣｌ含有１０ｍＭリン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ６．２５）を流速１５ｍｌ／時間で
流して溶出した。この溶出パターンを図３に示す。

【００５１】（５）ＧｎＧｎ−Ａｓｎセファロース−カ
ラムクロマトグラフィー最後に、ＧｎＧｎ−Ａｓｎセファロース−カラムクロマ
トグラフィーを実施した。ＵＤＰ−ヘキサノールアミン
アガロース−カラムからの活性画分を２０ｍｌの０．３
ＭＮａＣｌ含有１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
６．２５）で平衡化した４ｍｌのＧｎＧｎ−Ａｓｎセフ
ァロースに吸着させ、同じ緩衝液で洗った後に、０．３
ＭＮａＣｌ含有３０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．
０）流速３ｍｌ／時間で溶出した。この結果を図４に示
す。以上、いままでの精製の収率を表１に示した。各ス
テップとも、７０％以上の収率で、最終的に約２０，０
００倍精製された。

【００５２】

【表１】

【００５３】実施例３．ＳＤＳポリアクリルアミド電気
泳動およびネイティブポリアクリルアミド電気泳動ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動は、既報の方法（Ｌ
ａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８
０−６８５，（１９７０））に従い、１０−１５％のグ
ラディエントポリアクリルアミドゲルを用いて還元なら
びに非還元条件下で行なった。α−Ｌａｃｔｏａｌｂｕ
ｍｉｎ，Ｓｏｙｂｅａｎｔｒｙｐｓｉｎｉｎｈｉｂ
ｉｔｏｒ，Ｃａｒｂｏｎｉｃａｎｈｙｄｒａｓｅ，Ｏ
ｖａｌｂｕｍｉｎ，Ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂ
ｕｍｉｎ，Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅｂをそれぞ
れ分子量１４，４００、２０，１００、３０，０００、
４３，０００、６７，０００、９４，０００の分子量マ
ーカーとして用いた。

【００５４】最終精製した本酵素を、クマシ−ブリリア
ントブルーで染色したこのゲルの写真を図５に示す。非
還元条件下でのＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動で
は、上述の分子量マーカーに基づいて、７３ｋＤａの単
一なバンドが確認された。一方、還元条件下でのＳＤＳ
ポリアクリルアミド電気泳動では、ゲル上に７３ｋＤａ
以外に６０ｋＤａのバンドを確認した。また、ネイティ
ブポリアクリルアミド電気泳動のクマシ−ブリリアント
ブルーで染色したゲルの写真及びネイティブポリアクリ
ルアミド電気泳動ゲルから切り出した本酵素活性を図６
に示す。バンドの濃さに応じて本酵素活性が認められ
た。以上のことより単離、精製されたタンパク質が目
的のＧｎＴ−Ｖであることが確認された。

【００５５】実施例４．ペプチドマッピング分析還元条件下でＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を行な
い、そのゲルから６０ｋＤａおよび７３ｋＤａに該当す
るバンドを、それぞれ、切り出した。スライスしたゲル
片に０．５％ＳＤＳを含む３０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ６．５）を加え、ボイルした後、手製の電気抽出
装置でタンパク質を抽出した。抽出後、５０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した２００ｎｇのトリ
プシン（Ｓｉｇｍａ，ＳｔＬｏｕｉｓ，ＭＯ）と３７
℃で１１時間反応させた。

【００５６】酵素消化後、逆相高速液体クロマトグラフ
ィーカラム（Ｃｈｅｍｃｏｓｏｒｂ３ＯＤＳ−Ｈ，Ｏ
ｓａｋａ，Ｊａｐａｎ，２．１×７５ｍｍ）にかけ、酸
性条件下（０．１％ＴＦＡ）０−６０％のアセトニトリ
ルのグラジエントで溶出した。その時の溶出パターンを
図７に示す。６０ｋＤａおよび７３ｋＤａの溶出パター
ンは、同様のパターンを示し、このことから、両タンパ
ク質は、一部酵素的消化を受けている可能性もあるが、
大部分は共通のポリペプチドからなると結論づけられ
た。

【００５７】実施例５．部分アミノ酸配列の決定アミノ酸配列を知るために、上記実施例２で得られた精
製ＧｎＴ−Ｖのペプチド断片をＧａｓ−ｐｈａｓｅシー
クエンサー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍＩ
ｎｃ．、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）にかけたとこ
ろ、以下に示すペプチドフラグメントが得られた。（１）Thr-Pro-Trp-Gly-Lys （２）Asn-Ile-Pro-Ser-Tyr-Val （３）Val-Leu-Asp-Ser-Phe-Gly-Thr-Glu-Pro-Glu-Phe-
Asn-His-Ala-Asn-Tyr-Ala （４）Asp-Leu-Gln-Phe-Leu-Leu （５）Asn-Thr-Asp-Phe-Phe-Ile-Gly

【００５８】実施例６．基質特異性糖受容体として次に示したものを用いて、前述の酵素活
性の測定法に従い基質特異性を測定した。

【００５９】

【化１】

【００６０】

【化２】

【００６１】

【化３】

【００６２】ＧｎＧｎＦ−，ＧｎＧＦ−，ＧＧｎＦ−，
Ｇｎ（Ｇｎ）ＧｎＦ−，Ｇｎ（Ｇｎ）Ｇｎ−，ＧＧ−，
ＧｎＧｎ−，ＭＭ−およびＧｎＭ−は、ウシＩｇＧを無
水ヒドラジン処理した後、Ｈａｓｅらの方法（Ｈａｓ
ｅ，ｓ．，Ｉｂｕｋｉ，Ｔ．，ａｎｄＩｋｅｈａｒ
ａ，Ｔ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９５，１９７−２０３
（１９８４））により蛍光標識した。精製したＧｎＴ−
ＶはＰＢＳ緩衝液にて最終濃度０．１ｍｇ蛋白質／ｍｌ
になるように希釈した後、各蛍光標識糖受容体との反応
を行なった。結果を表２に示した。

【００６３】

【表２】

【００６４】本酵素はＧｎＧｎＦ−ｂｉ−ＰＡ、ＧｎＭ
−ＰＡ及びＧｎＧｎＧｎ−ｔｒｉ−ＰＡの何れとも反応
することが判明した。

【００６５】実施例７．至適pH pH６．０、６．２５、６．５及び７．０の０．２５Ｍリ
ン酸カリウム緩衝液に、最終濃度０．２ＭＧｌｃＮＡ
ｃ，４０mM ＥＤＴＡ，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１０
０，４０mM ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを含むアッセイ混液
を調製した。アッセイ混液２５μｌに対して被験サンプ
ル１５μｌおよび基質（ＧｎＧｎ−ｂｉ−ＰＡ）１０μ
ｌを加え、３７℃で４時間インキュベーションした。結
果を図８に示す。

【００６６】実施例８．ＧｎＴ−ＶｃＤＮＡの単離・同
定及び発現ベクターの作製実施例５で得られた配列番号３で表されるアミノ酸配列
を基に配列表・配列番号６で表されるオリゴマーＳ１８
を合成し、さらに配列表・配列番号５で表されるアミノ
酸配列を基に配列表・配列番号７で表されるオリゴマー
Ａ２１を合成した。

【００６７】ＱＧ細胞のポリＡを有するＲＮＡから、ｃ
ＤＮＡ Synthesis kit (Pharmacia社製) を用いて２本
鎖ｃＤＮＡを合成した。次に、このｃＤＮＡを鋳型とし
てオリゴマーＳ１８とＡ２１を用いてAmpli-Taq （Taka
ra 社製）にてＰＣＲを行った。その結果、ＧｎＴ−Ｖ
ｃＤＮＡ断片である約５００塩基対のＤＮＡ断片を得
た。

【００６８】次に、得られたｃＤＮＡ断片をプローブと
して、さらに、ｃＤＮＡのクローニングを実施した。即
ち、このｃＤＮＡを鋳型にしてランダムプライマーラベ
リングキット(Amersham 社製) でα³²Ｐ−ＣＴＰラベル
した。得られたプローブを用い、ヒト胎児肝ｃＤＮＡラ
イブラリー（クローンテック社製）を常法によりスクリ
ーニングした。得られたクローンのうち、最も長いクロ
ーンをEcoRI で切り出し、pBluescript II ks (+) (S
trategene 社製）にサブクローニングした。インサート
内にEcoRI サイトがあるため、２つの断片が得られた。
２つの断片のそれぞれを、シークエンスした結果、約８
００ｂｐのＢフラグメント及び約１２００ｂｐのＦフラ
グメントが得られた。

【００６９】以上のようにして得られたＤＮＡ断片のシ
ークエンスをSequenase （USB 社製）で決定した結果を
配列表・配列番号８に示す。このＤＮＡ断片は、実施例
５で得られた５つのアミノ酸配列をコードする塩基配列
を全て含むことが確認された。なお、今回得られたＧｎ
Ｔ−ＶｃＤＮＡ断片は３’末端が終止コドンに達してい
ない。従って、３’末端に未決定の塩基対が存在するこ
とは明らかであるが、当該未決定の塩基対を決定するこ
とは、当業者にとって容易なことである。

【００７０】次に、ＧｎＴ−ＶｃＤＮＡ断片を動物細胞
で発現するために、発現ベクターに組み込んだ。即ち、
発現ベクターｐＳＶＫ３（Pharmacia 社製）をEcoRI 及
びSmaIで酵素的に消化したのち、前述のＦフラグメント
をEcoRI サイト及びインサート内のSmaIサイトで切り出
して挿入した（図９参照）。次いで、Ｆフラグメントを
挿入したベクターをEcoRI で切断したのち、Self-ligat
ion を防ぐためにＣＩＰ（Calf intestinal phosphatas
e ）処理後、EcoRIサイトで切り出したＢフラグメント
を挿入することにより、発現ベクターに組み込んだ。

【００７１】実施例９．クローニングしたＧｎＴ−Ｖｃ
ＤＮＡの発現及び発現した蛋白質の酵素活性実施例８で作製した発現ベクターを用いて、ＧｎＴ−Ｖ
ｃＤＮＡ断片を動物細胞に発現させ、発現した蛋白質に
ＧｎＴ−Ｖ酵素活性があるか否か検討した。発現用動物
細胞としてＣＯＳ−１細胞を用い、エレクトロポレーシ
ョン法によりＧｎＴ−ＶｃＤＮＡ断片を含む発現ベクタ
ーをトランスフェクションした。即ち、予め用意したＣ
ＯＳ−１細胞約５×１０⁶細胞をＨＥＢＳ緩衝液（20 m
M Hepes, 137 mM NaCl, 5mM KCl, 0.7 mM Na₂HPO₄, 6mM
Dexrose, pH 7.05 ）に浮遊させ、上述のプラスミド６
０μｇを加え、終容量８００μｌをエレクトロポレータ
ー（Bio-Rad 社製）で２５０Ｖ、９６０ｍＦの条件で実
施した。

【００７２】次に、ＧｎＴ−Ｖ遺伝子をトランスフェク
ションしたＣＯＳ−１細胞の全量を直径６cmのシャーレ
にまき、３７℃、５％ＣＯ₂存在下、４８時間培養し
た。培養した細胞は、ラバーポリスマンで集め、５０μ
ｌのＰＢＳ緩衝液に懸濁した後、ソニケーターで細胞を
破砕した。その後、遠心操作により上清を集め、そのう
ちの１５μｌにつき前述の方法により、酵素活性を測定
した。測定結果を図１０に示す。以上の結果から、今回
クローニングしたＧｎＴ−ＶｃＤＮＡ断片は、活性発現
に最低必要な長さを含むことが確認された。

【００７３】

【発明の効果】ヒト肺癌（小細胞癌）由来のＱＧ細胞の
無タンパク質培養上清から、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグル
コサミン：α−６−Ｄ−マンノシド, β１, ６−Ｎ−ア
セチルグルコサミニルトランスフェラーゼを単離精製
し、その性質、部分アミノ酸構造を決定した。また、本
発明者らは、今回初めて精製した酵素を用いて、各種糖
受容体に対しての基質特異性を明らかにした。これらの
特異性を持った糖転移酵素は、生体内における糖鎖生合
成経路の調節を担う重要な酵素の一つである。また、細
胞の癌化あるいは悪性化に伴い、本酵素が糖鎖の修飾に
関与していることが明らかになりつつある。

【００７４】このことから、本発明に係る酵素は癌化し
た細胞の悪性度のマーカーとして診断上の有用性を有す
るばかりでなく、本酵素を用いて本酵素の特異的阻害剤
のスクリーニング系を確立することにより癌転移防止剤
を設計することが初めて可能となる。さらに、本酵素を
用いて例示した各種糖受容体にβ（１，６）ｂｒａｎｃ
ｈ構造を導入することができるため、反応生成物として
のβ（１，６）ｂｒａｎｃｈ構造を持ったオリゴサッカ
ライドを工業的に製造できるようになった。また、糖鎖
工学上の観点から、本酵素を大量に生産することによ
り、遺伝子操作による有用物質の生産において糖鎖の均
一生産をも可能にすることができる。

【００７５】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【００７６】配列番号：２配列の長さ：６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【００７７】配列番号：３配列の長さ：１７配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Val Leu Asp Ser Phe Gly Thr Glu Pro Glu Phe Asn His Ala Asn 5 10 15 Tyr Ala

【００７８】配列番号：４配列の長さ：６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【００７９】配列番号：５配列の長さ：７配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【００８０】配列番号：６配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列： GGAATTC TTY AAY CAY GCN AAY TAY GC Phe Asn His Ala Asn Tyr Ala 27 5

【００８１】配列番号：７配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡアンチセンス：Ｙｅｓ

【００８２】配列番号：８配列の長さ：２０９５配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 配列

【００８３】 CCGGCTGAAG CATCAGAATG GAAGTGAGGA AAGGCAACCA GCTGACACAG GAGCCAGAGT 60 GAGACCAGCA GACTCTCACA CTCAACCTAC ACCATGAATT TGTGTCTATC TTCTACGCGT 120 TAAGAGCCAA GGACAGGTGA AGTTGCCAGA GAGCA ATG GCT CTC TTC ACT CCG 173 Met Ala Leu Phe Thr Pro 1 5 TGG AAG TTG TCC TCT CAG AAG CTG GGC TTT TTC CTG GTG ACT TTT GGC 221 Trp Lys Leu Ser Ser Gln Lys Leu Gly Phe Phe Leu Val Thr Phe Gly 10 15 20 TTC ATT TGG GGT ATG ATG CTT CTG CAC TTT ACC ATC CAG CAG CGA ACT 269 Phe Ile Trp Gly Met Met Leu Leu His Phe Thr Ile Gln Gln Arg Thr 25 30 35 CAG CCT GAA AGC AGC TCC ATG CTG CGC GAG CAG ATC CTG GAC CTC AGC 317 Gln Pro Glu Ser Ser Ser Met Leu Arg Glu Gln Ile Leu Asp Leu Ser 40 45 50 AAA AGG TAC ATC AAG GCA CTG GCA GAA GAA AAC AGG AAT GTG GTG GAT 365 Lys Arg Tyr Ile Lys Ala Leu Ala Glu Glu Asn Arg Asn Val Val Asp 55 60 65 70 GGG CCA TAC GCT GGA GTC ATG ACA GCT TAT GAT CTG AAG AAA ACC CTT 413 Gly Pro Tyr Ala Gly Val Met Thr Ala Tyr Asp Leu Lys Lys Thr Leu 75 80 85 GCT GTG TTA TTA GAT AAC ATT TTG CAG CGC ATT GGC AAG TTG GAG TCG 461 Ala Val Leu Leu Asp Asn Ile Leu Gln Arg Ile Gly Lys Leu Glu Ser 90 95 100 AAG GTG GAC AAT CTT GTT GTC AAT GGC ACC GGA ACA AAC TCA ACC AAC 509 Lys Val Asp Asn Leu Val Val Asn Gly Thr Gly Thr Asn Ser Thr Asn 105 110 115 TCC ACT ACA GCT GTT CCC AGC TTG GTT GCA CTT GAG AAA ATT AAT GTG 557 Ser Thr Thr Ala Val Pro Ser Leu Val Ala Leu Glu Lys Ile Asn Val 120 125 130 GCA GAT ATC ATT AAC GGA GCT CAA GAA AAA TGT GTA TTG CCT CCT ATG 605 Ala Asp Ile Ile Asn Gly Ala Gln Glu Lys Cys Val Leu Pro Pro Met 135 140 145 150 GAC GGC TAC CCT CAC TGT GAG GGA AAG ATC AAG TGG ATG AAA GAC ATG 653 Asp Gly Tyr Pro His Cys Glu Gly Lys Ile Lys Trp Met Lys Asp Met 155 160 165 TGG CGT TCA GAT CCC TGC TAC GCA GAC TAT GGA GTG GAT GGA TCC ACC 701 Trp Arg Ser Asp Pro Cys Tyr Ala Asp Tyr Gly Val Asp Gly Ser Thr 170 175 180 TGC TCT TTT TTT ATT TAC CTC AGT GAG GTT GAA AAT TGG TGT CCT CAT 749 Cys Ser Phe Phe Ile Tyr Leu Ser Glu Val Glu Asn Trp Cys Pro His 185 190 195 TTA CCT TGG AGA GCA AAA AAT CCC TAC GAA GAA GCT GAT CAT AAT TCA 797 Leu Pro Trp Arg Ala Lys Asn Pro Tyr Glu Glu Ala Asp His Asn Ser 200 205 210 TTG GCG GAA ATT CGT ACA GAT TTT AAT ATT CTC TAC AGT ATG ATG AAA 845 Leu Ala Glu Ile Arg Thr Asp Phe Asn Ile Leu Tyr Ser Met Met Lys 215 220 225 230 AAG CAT GAA GAA TTC CGG TGG ATG AGA CTA CGG ATC CGG CGA ATG GCT 893 Lys His Glu Glu Phe Arg Trp Met Arg Leu Arg Ile Arg Arg Met Ala 235 240 245 GAC GCA TGG ATC CAA GCA ATC AAG TCC CTG GCA GAA AAG CAG AAC CTT 941 Asp Ala Trp Ile Gln Ala Ile Lys Ser Leu Ala Glu Lys Gln Asn Leu 250 255 260 GAA AAG AGA AAG CGG AAG AAA GTC CTC GTT CAC CTG GGA CTC CTG ACC 989 Glu Lys Arg Lys Arg Lys Lys Val Leu Val His Leu Gly Leu Leu Thr 265 270 275 AAG GAA TCT GGA TTT AAG ATT GCA GAG ACA GCT TTC AGT GGT GGC CCT 1037 Lys Glu Ser Gly Phe Lys Ile Ala Glu Thr Ala Phe Ser Gly Gly Pro 280 285 290 CTT GGT GAA TTA GTT CAA TGG AGT GAT TTA ATT ACA TCT CTG TAC TTA 1085 Leu Gly Glu Leu Val Gln Trp Ser Asp Leu Ile Thr Ser Leu Tyr Leu 295 300 305 310 CTG GGC CAT GAC ATT AGG ATT TCA GCT TCA CTG GCT GAG CTC AAG GAA 1133 Leu Gly His Asp Ile Arg Ile Ser Ala Ser Leu Ala Glu Leu Lys Glu 315 320 325 ATC ATG AAG AAG GTT GTA GGA AAC CGA TCT GGC TGC CCA ACT GTA GGA 1181 Ile Met Lys Lys Val Val Gly Asn Arg Ser Gly Cys Pro Thr Val Gly 330 335 340 GAC AGA ATT GTT GAG CTC ATT TAC ATT GAT ATT GTA GGA CTT GCT CAA 1229 Asp Arg Ile Val Glu Leu Ile Tyr Ile Asp Ile Val Gly Leu Ala Gln 345 350 355 TTC AAG AAA ACT CTT GGA CCA TCC TGG GTT CAT TAC CAG TGC ATG CTC 1277 Phe Lys Lys Thr Leu Gly Pro Ser Trp Val His Tyr Gln Cys Met Leu 360 365 375 CGA GTC CTT GAT TCA TTT GGT ACT GAA CCC GAA TTT AAT CAT GCA AAT 1325 Arg Val Leu Asp Ser Phe Gly Thr Glu Pro Glu Phe Asn His Ala Asn 380 385 390 395 TAT GCC CAA TCG AAA GGC CAC AAG ACC CCT TGG GGA AAA TGG AAT CTG 1373 Tyr Ala Gln Ser Lys Gly His Lys Thr Pro Trp Gly Lys Trp Asn Leu 400 405 410 AAC CCT CAG CAG TTT TAT ACC ATG TTC CCT CAT ACC CCA GAC AAC AGC 1421 Asn Pro Gln Gln Phe Tyr Thr Met Phe Pro His Thr Pro Asp Asn Ser 415 420 425 TTT CTG GGG TTT GTG GTT GAG CAG CAC CTG AAC TCC AGT GAT ATC CAC 1469 Phe Leu Gly Phe Val Val Glu Gln His Leu Asn Ser Ser Asp Ile His 430 435 440 CAC ATT AAT GAA ATC AAA AGG CAG AAC CAG TCC CTT GTG TAT GGC AAA 1517 His Ile Asn Glu Ile Lys Arg Gln Asn Gln Ser Leu Val Tyr Gly Lys 445 450 455 GTG GAT AGC TTC TGG AAG AAT AAG AAG ATC TAC TTG GAC ATT ATT CAC 1565 Val Asp Ser Phe Trp Lys Asn Lys Lys Ile Tyr Leu Asp Ile Ile His 460 465 470 475 ACA TAC ATG GAA GTG CAT GCA ACT GTT TAT GGC TCC AGC ACA AAG AAT 1613 Thr Tyr Met Glu Val His Ala Thr Val Tyr Gly Ser Ser Thr Lys Asn 480 485 490 ATT CCC AGT TAC GTG AAA AAC CAT GGT ATC CTC AGT GGA CGG GAC CTG 1661 Ile Pro Ser Tyr Val Lys Asn His Gly Ile Leu Ser Gly Arg Asp Leu 495 500 505 CAG TTC CTT CTT CGA GAA ACC AAG TTG TTT GTT GGA CTT GGG TTC CCT 1709 Gln Phe Leu Leu Arg Glu Thr Lys Leu Phe Val Gly Leu Gly Phe Pro 510 515 520 TAC GAG GGC CCA GCT CCC CTG GAA GCT ATC GCA AAT GGA TGT GCT TTT 1757 Tyr Glu Gly Pro Ala Pro Leu Glu Ala Ile Ala Asn Gly Cys Ala Phe 525 530 535 CTG AAT CCC AAG TTC AAC CCA CCC AAA AGC AGC AAA AAC ACA GAC TTT 1805 Leu Asn Pro Lys Phe Asn Pro Pro Lys Ser Ser Lys Asn Thr Asp Phe 540 545 550 555 TTC ATT GGC AAG CCA ACT CTG AGA GAG CTG ACA TCC CAG CAT CCT TAC 1853 560 565 570 GCT GAA GTT TTC ATC GGG CGG CCA CAT GTG TGG ACT GTT GAC CTC AAC 1901 Ala Glu Val Phe Ile Gly Arg Pro His Val Trp Thr Val Asp Leu Asn 575 580 585 AAT CAG GAG GAA GTA GAG GAT GCA GTG AAA GCA ATT TTA AAT CAG AAG 1949 Asn Gln Glu Glu Val Glu Asp Ala Val Lys Ala Ile Leu Asn Gln Lys 590 595 600 ATT GAG CCA TAC ATG CCA TAT GAA TTT ACG TGC GAG GGG ATG CTA CAG 1997 Ile Glu Pro Tyr Met Pro Tyr Glu Phe Thr Cys Glu Gly Met Leu Gln 605 610 615 AGA ATC AAT GCT TTC ATT GAA AAA CAG GAC TTC TGC CAT GGG CAA GTG 2045 Arg Ile Asn Ala Phe Ile Glu Lys Gln Asp Phe Cys His Gly Gln Val 620 625 630 635 ATG TGG CCA CCC CTC AGC GCC CTA CAG GTC AAG CTT GCT GAG CCC GGG 2093 Met Trp Pro Pro Leu Ser Ala Leu Gln Val Lys Leu Ala Glu Pro Gly 640 645 650 CC 2095

【図面の簡単な説明】

【図１】フェニルセファロースカラムクロマトグラフィ
ーの溶出パターンを示すグラフである。白丸実線はタン
パク質の溶出パターンを、黒丸実線はＧｎＴ−Ｖ活性を
示す。溶出は、４０％から０％へ硫安濃度を下げること
により行なった。硫安濃度を点線で示す。

【図２】ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフ
ィーの溶出パターンを示すグラフである。白丸実線はタ
ンパク質の溶出パターンを、黒丸実線はＧｎＴ−Ｖ活性
を示す。図中の矢印は、溶出バッファーの開始点を示
す。溶出は、５０ｍＭから３００ｍＭのリン酸緩衝液の
濃度勾配を形成させることにより行なった。リン酸緩衝
液の濃度を点線で示した。

【図３】ＵＤＰ−ヘキサノールアミンアガロース−カラ
ムクロマトグラフフィーの溶出パターンを示すグラフで
ある。白丸実線はタンパク質の溶出パターンを、黒丸実
線はＧｎＴ−Ｖ活性を示す。図中の矢印は、溶出バッフ
ァーの開始点を示す。溶出は、０．３ＭＮａＣｌを３ｍ
ｌ／時間流すことにより行なった。

【図４】ＧｎＧｎ−Ａｓｎセファロース−カラムクロマ
トグラフィーの溶出パターンを示すグラフである。白丸
実線はタンパク質の溶出パターンを、黒丸実線はＧｎＴ
−Ｖ活性を示す。図中の矢印は、溶出バッファーの開始
点を示す。溶出は、０．３ＭＮａＣｌを３ｍｌ／時間流
すことにより行なった。

【図５】ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動の結果を示
す図面に代る写真である。

【図６】ネイティブポリアクリルアミド電気泳動の結果
を示す図面に代る写真である。

【図７】ペプチドマッピング分析の結果を示す図であ
る。

【図８】本発明の酵素の至適pHを示すグラフである。

【図９】図９は本発明の発現ベクターの作製を示す図で
ある。

【図１０】図１０は、本発明の発現生成物であるＧｎＴ
−Ｖにより基質（ＧｎＧｎ−ｂｉ−ＰＡ）から生成物
（ＧｎＧｎＧｎ−ｔｒｉ′−ＰＡ）が生成したことを示
す高速液体クロマトグラフィーの溶出図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者山口希京都府京都市北区鞍馬口通り寺町西入ル新御霊口町285−79

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の酵素学的性質：（１）作用；ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンからＮ
−アセチルグルコサミンをα−６−Ｄ−マンノシドに転
移する；（２）基質特異性；ＧｎＧｎ−ｂｉ−ＰＡを受容体とし
た時を１００とした場合、ＧｎＧｎＦ−ｂｉ−ＰＡで約
７８％、ＧｎＧｎＧｎ−ｔｒｉ−ＰＡで約１２５％、Ｇ
ｎＭ−ＰＡで約６６％の反応性を示す；（３）至適ｐＨ；６．２−６．３；（４）阻害、活性化及び安定化；活性の発現にＭｎ²⁺を
必要とせず、また、２０mMＥＤＴＡ存在下においても活
性は阻害されない；（５）分子量；約７３，０００（還元剤非存在下ＳＤＳ
−ＰＡＧＥによる）並びに約７３，０００及び約６０，
０００（還元剤存在下ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）；（６）Ｋｍ値；受容体ＧｎＧｎ−ｂｉ−ＰＡ及び供与体
ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに対するＫｍ値は、各々１３３μ
Ｍ、３．５ｍＭである；並びに（７）以下のペプチドフラグメントを有する：（１）Thr-Pro-Trp-Gly-Lys （２）Asn-Ile-Pro-Ser-Tyr-Val （３）Val-Leu-Asp-Ser-Phe-Gly-Thr-Glu-Pro-Glu-Phe-
Asn-His-Ala-Asn-Tyr-Ala （４）Asp-Leu-Gln-Phe-Leu-Leu 、（５）Asn-Thr-Asp-Phe-Phe-Ile-Gly を有するβ１, ６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトラン
スフェラーゼ。
【請求項２】少なくとも配列番号：８で示されるアミ
ノ酸配列を含んで成るアミノ酸配列、又はこのアミノ酸
配列において１又は複数のアミノ酸が修飾されているア
ミノ酸配列を有するβ１, ６−Ｎ−アセチルグルコサミ
ニルトランスフェラーゼ。
【請求項３】請求項１又は２に記載のβ１, ６−Ｎ−
アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードす
るＤＮＡ。
【請求項４】配列番号：８に示す塩基配列を有する請
求項３に記載のＤＮＡ。
【請求項５】請求項３又は４に記載のＤＮＡを含んで
成る発現ベクター。
【請求項６】請求項５に記載の発現ベクターにより形
質転換された宿主。
【請求項７】ヒト肺癌由来のＱＧ細胞を培養し、該培
養物から該酵素を採取することを特徴とする請求項１記
載の酵素の製造方法。
【請求項８】請求項１又は２に記載のβ１, ６−Ｎ−
アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ酵素の製造
方法において、該酵素をコードするＤＮＡを含んで成る
発現ベクターにより形質転換された宿主を培養又は飼育
し、該宿主から前記酵素を採取することを特徴とする方
法。