JPH104969A - α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】α１，６−フコシルトランスフェラーゼを遺伝
子組換え法により大量に生産する方法を開発し、糖鎖構
造解析、糖鎖工学用試薬、診断薬として安価、かつ安定
供給可能とする。 【解決手段】配列表・配列番号２に示されるアミノ酸配
列をコードする遺伝子を含むブタ由来のα−１，６−フ
コシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、該遺伝
子を含んでなる発現ベクター、該発現ベクターにより宿
主細胞を形質転換した形質転換細胞、該細胞を使用する
組換えα−１，６−フコシルトランスフェラーゼの製造
方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は糖鎖の構造と機能解
析や、糖鎖構造の修飾、糖鎖の合成などの糖鎖工学ある
いは診断用途に有用なα−１，６−フコシルトランスフ
ェラーゼをコードする遺伝子に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、高等生物由来の糖蛋白質、糖脂質
等の複合糖質中の糖鎖部分の構造と機能に関する関心が
高まっており、その研究が盛んに行われている。糖鎖は
糖加水分解酵素および糖転移酵素の作用により形成され
るが、その中でも糖転移酵素が寄与するところが大き
い。糖転移酵素は糖ヌクレオチドを糖供与体として、受
容体となる糖鎖に糖を転移し、糖鎖伸長を行う酵素であ
る。その受容体の糖鎖構造に対する特異性は厳密であ
り、通常、１つのグリコシド結合は対応する１つの転移
酵素によって形成される。それ故、糖転移酵素は複合糖
質の糖鎖部分の構造研究、特定の糖鎖構造の簡便な合
成、天然の糖鎖構造の修飾に利用されている。また、糖
鎖の人工的な改変による複合糖質あるいは細胞の性質の
改変への利用が期待されている。これらのことから、基
質特性の明らかな種々の糖転移酵素の開発が望まれてい
る。

【０００３】α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ
は細胞内小器官のゴルジ体に存在する酵素であり、アス
パラギン結合型糖鎖のプロセッシングを制御する酵素の
うちの１つであると考えられる重要な酵素である。該酵
素をアスパラギン結合型糖鎖に作用させることで、その
制御機構の解明、糖鎖構造形成の制御等に役立つと考え
られる。また、肝臓癌や嚢胞性線維症などのいくつかの
疾病におけるα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ
活性の上昇、及び本酵素反応生成物の割合の増加が知ら
れており、該酵素活性を測定することによる、あるいは
α−１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードする
ｃＤＮＡを用いたノーザンブロット法による、これらの
疾病の診断法の早急な開発が望まれている。

【０００４】α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ
は、各種動物の体液あるは臓器中、各種動物の培養細胞
にその活性は検出されているものの、精製された酵素標
品としては、ヒト嚢胞性線維症細胞破砕物［ジャーナル
オブ バイオロジカル ケミストリー (Journal of
Biological Chemistry) 、第２６６巻、第２１５７２〜
２１５７７頁（１９９１）］由来の酵素以外には知られ
ていない。したがって、該酵素標品を安定に供給するこ
とは事実上困難であった。

【０００５】本発明者らは既に、ブタ脳由来のα−１，
６−フコシルトランスフェラーゼを単一に精製し、その
理化学的性質を明らかにし（特願平 8-10365号) 、該酵
素標品の安定供給を可能にしたが、大量生産までには至
っていない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明はα−１，６−
フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を用いて、α−１，
６−フコシルトランスフェラーゼを大量に生産する方法
を開発することを目的とし、糖鎖構造解析、糖鎖工学用
試薬、診断薬として安価、かつ安定供給可能な該酵素を
提供しようとするするものである。また、該遺伝子を特
定することにより、該酵素をコードするＤＮＡを用いた
ノーザンブロット法による疾病の診断法の開発を可能と
するものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ブタ脳よ
りα−１，６−フコシルトランスフェラーゼを単一に精
製し、このタンパク質のアミノ酸分析を行い、その部分
アミノ酸配列をもとにクローニングを行い、本願発明に
到達した。

【０００８】すなわち、本発明はブタ由来のα−１，６
−フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子であ
る。

【０００９】また、本発明はブタ由来のα−１，６−フ
コシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含んで
なる発現ベクターである。

【００１０】さらに、本発明はブタ由来のα−１，６−
フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含ん
でなる発現ベクターにより宿主細胞を形質転換した形質
転換細胞である。

【００１１】本発明は、ブタ由来のα−１，６−フコシ
ルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含んでなる
発現ベクターにより宿主細胞を形質転換した形質転換細
胞を培養し、該培養物からα−１，６−フコシルトラン
スフェラーゼを採取することを特徴とする組換えα−
１，６−フコシルトランスフェラーゼの製造方法であ
る。

【００１２】

【発明の実施態様】本発明はブタ由来のα−１，６−フ
コシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子であり、
その一実施態様は配列表・配列番号２に示されるアミノ
酸配列をコードする遺伝子を含むα−１，６−フコシル
トランスフェラーゼをコードする遺伝子である。また、
別な態様は配列表・配列番号１に示される塩基配列を含
むα−１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードす
る遺伝子である。

【００１３】本発明の一実施態様は配列表・配列番号２
に示されるアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸
が、置換、挿入、削除、又は付加されているアミノ酸配
列をコードする遺伝子を含むα−１，６−フコシルトラ
ンスフェラーゼをコードする遺伝子である。また、本発
明の別の実施態様は、配列表・配列番号１に示される塩
基配列の少なくとも１つが置換、挿入、削除、又は付加
されている塩基配列を含むα−１，６−フコシルトラン
スフェラーゼをコードする遺伝子である。さらに、本発
明の実施態様は、配列表・配列番号１に示される塩基配
列を含むα−１，６−フコシルトランスフェラーゼをコ
ードする遺伝子の少なくとも一部にハイブリダイズする
遺伝子である。

【００１４】本発明の発現ベクターは上記したα−１，
６−フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を
含んでなる発現ベクターである。また、本発明の形質転
換細胞は、上記した発現ベクターにより宿主細胞を形質
転換したものである。宿主細胞としては、微生物、例え
ば大腸菌、酵母、細菌などの細胞が挙げられる。動物細
胞、例えば昆虫細胞、ＣＯＳ−１、ＣＨＯ細胞などが挙
げられる。また、植物細胞、例えば綿植物細胞、アラビ
ドプシス細胞などが挙げられる。ベクターとしては、形
質転換する宿主に応じて、様々なものが使用できる。例
えば大腸菌では、ｐＵＣ１９など、酵母では、ｐＹＥＵ
ｒａ３^TMなど、昆虫細胞では、ｐＢＬＵＥ Ｂａｃ４な
ど、ＣＯＳ−１細胞では、ｐＳＶＫ３など、綿植物細
胞、アラビドプシス細胞では、ｐＢＩなどが挙げられ
る。

【００１５】さらに、本発明の組換えα−１，６−フコ
シルトランスフェラーゼの製造方法は上記した形質転換
細胞を培養し、該培養物からα−１，６−フコシルトラ
ンスフェラーゼを採取する方法である。

【００１６】本発明の酵素の精製出発材料としては、フ
コシルトランスフェラーゼ活性を有するブタの臓器また
は体液がある。臓器の具体例としては、例えば脳、精
巣、膵臓、肺、腎臓などが挙げられる。本発明では、例
えばブタ脳よりα−１，６−フコシルトランスフェラー
ゼを単一に精製し、このタンパク質のアミノ酸分析を行
い、その部分アミノ酸配列を決定し、そのアミノ酸配列
より、ＰＣＲ用のプライマーを調製する。このプライマ
ーを用い、ブタ脳由来のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを
おこない、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼを
コードする遺伝子を増幅して、プローブを作成する。続
いて、該プローブを用いてブタ脳由来のｃＤＮＡライブ
ラリー中よりα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ
をコードするｃＤＮＡを含有するクローン体を検索し、
α−１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードする
ｃＤＮＡを単離し、次いで該ｃＤＮＡを用いたα−１，
６−フコシルトランスフェラーゼの発現を行う。

【００１７】ブタ脳よりα−１，６−フコシルトランス
フェラーゼを精製する方法としては、ブタ脳の破砕物か
ら粗酵素抽出物を調製し、次に、この粗酵素抽出物から
該酵素を精製する。この場合、ブタ脳中のα１−６フコ
シルトランスフェラーゼは、膜結合型酵素であるので、
脳破砕物より適当な界面活性剤を用いて粗酵素抽出液を
得ることが、通常、採用される。さらに、この粗酵素抽
出液から公知の精製手段を組み合わせて、精製酵素標品
を得ることができる。例えば、限外濾過膜による濃縮や
脱塩、基質類似体を固定化したアフィニティカラムクロ
マトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィ
ー、疎水結合カラムクロマトグラフィーなどの組み合わ
せにより精製を行い、他のトランスフェラーゼの夾雑活
性のない実質的に単一の酵素標品を得ることができる。
例えば、ブタ脳をリン酸緩衝液中でワーリングブレンダ
ーを用いて破砕、超遠心分離により膜画分を集めた後、
この膜画分より界面活性剤、トリトン (Triton) Ｘ−１
００を含むリン酸緩衝液で目的酵素を抽出し、さらに超
遠心分離によって上清を集めて、粗酵素抽出液を得るこ
とができる。ＧＤＰ−ヘキサノールアミン−セファロー
ス、ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→６（ＧｌｃＮＡ
ｃβ１→２Ｍａｎα１→３）Ｍａｎβ１→４ＧｌｃＮＡ
ｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃ−アスパラギン−セファロース
等のアフィニティーカラムクロマトグラフィーに供し、
フコシルトランスフェラーゼ活性を示す各画分を集めて
精製することができる。

【００１８】この精製されたα−１，６−フコシルトラ
ンスフェラーゼを用い、アミノ酸配列の解析を行う。例
えばＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、
エレクトロブロッティング法によりＰＶＤＦ膜に転写し
た後、６０ｋＤａのバンドを含有するＰＶＤＦ膜を切り
出し、プロテインシークエンサーにより配列決定を行
う。配列表・配列番号３で示されるα−１，６−フコシ
ルトランスフェラーゼのアミノ末端のアミノ酸配列を得
る。

【００１９】また、精製α−１，６−フコシルトランス
フェラーゼをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
に供し、エレクトロブロッティング法によりＰＶＤＦ膜
に転写した後、６０ｋＤａのバンドを含有するＰＶＤＦ
膜を切り出し、該ＰＶＤＦ膜切片上でプロテアーゼ、例
えばリジルエンドペプチダーゼを用い分解を行った後、
該ＰＶＤＦ膜切片より分解物を抽出し、該抽出液を逆相
高速液体クロマトグラフィーにより分離することにより
分解物を得る。該分解物のアミノ酸配列を解析すること
により、配列表・配列番号４〜６で示されるα−１，６
−フコシルトランスフェラーゼの部分アミノ酸配列を得
る。

【００２０】次にこれらのアミノ酸配列より、ＰＣＲ用
のミックスプライマーを作成する。例えば配列番号３の
アミノ酸配列より、配列番号７で表されるミックスプラ
イマー、配列番号４のアミノ酸配列より、配列番号８で
表されるミックスプライマーをそれぞれＤＮＡ合成機で
合成し、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼｃＤ
ＮＡの検索に使用する。例えば、ブタ脳由来のｃＤＮＡ
を鋳型とし、配列番号７のミックスプライマーと配列番
号８のミックスプライマーを使用し、９４℃（１分
間）、５５℃（２分間）、７２℃（３分間）を１サイク
ルとして、ＰＣＲを２５サイクル行うことにより、約
１．４５ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅する。

【００２１】増幅された該ＤＮＡ断片をプローブとして
用い、プラークハイブリダイゼイション法により、ブタ
脳由来のｃＤＮＡライブラリー中よりα−１，６−フコ
シルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡを含有す
るクローン体を検索する。これらのクローン体からα−
１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードするｃＤ
ＮＡの単離を行うことができる。得られた該ｃＤＮＡの
塩基配列および該塩基配列から推測されるアミノ酸配列
を配列番号１および２に示す。

【００２２】また、該ｃＤＮＡは発現ベクター、例えば
ｐＳＶＫ３にサブクローニングされる。サブクローニン
グされた該プラスミドにより形質転換された宿主細胞、
例えばＣＯＳ−１細胞を培養し、該培養物からα−１，
６−フコシルトランスフェラーゼを得ることができる。

【００２３】本発明では、上記した形質転換細胞を培養
し、該培養物からα−１，６−フコシルトランスフェラ
ーゼを採取することにより、組換えα−１，６−フコシ
ルトランスフェラーゼを製造する。培養物から該酵素を
採取する方法は、通常の方法に従う。

【００２４】本発明のブタ由来のα−１，６−フコシル
トランスフェラーゼをコードする遺伝子およびその分解
物であるＤＮＡ断片は、α−１，６−フコシルトランス
フェラーゼの生体中での発現過程の測定に使用すること
もでき、肝臓癌や嚢胞性線維症などのいくつかの疾病の
遺伝子診断においても有用である。また、これらの遺伝
子がコードするポリペプチドを用いて、種々の抗体を免
疫学的に作成することもでき、これらの抗体も診断用途
や、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼの精製な
どに有用である。

【００２５】

【実施例】以下に、実施例を用いて本発明を具体的に説
明する。本発明では、酵素活性を下記のようにして測定
する。糖鎖末端のアスパラギンを４−（２−ピリジルア
ミノ）ブチルアミン〔ＰＡＢＡ：−ＮＨ−（ＣＨ₂ ）₄
−ＮＨ−ｐｙｒｉｄｉｎｅ〕で蛍光標識してある下記化
１で示される化合物を酵素活性の測定基質として用い
た。該基質を用いることにより、フコースがα１−６結
合で転移した酵素反応の生成物の高速液体クロマトグラ
フィーによる蛍光検出が可能となる。

【００２６】

【化１】

【００２７】具体的な測定方法は、上記化１で示される
受容体蛍光標識基質６２．５μＭ、供与体基質（ＧＤＰ
−フコース）６２５μＭを含む２５０ｍＭメス（ＭＥ
Ｓ）緩衝液、ｐＨ７．０、４０μｌに、試料液１０μｌ
および１．２５％トリトンＸ−１００を添加混合する。
３７℃で１時間反応させた後、５分間の煮沸により反応
を停止させ、反応液を高速液体クロマトグラフィーに供
し、生成物のピークを蛍光検出器で定量する。酵素量１
単位は、この条件下で、１分間に１ｐｍｏｌのＧｌｃＮ
Ａｃβ１→２Ｍａｎα１→６（ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍ
ａｎα１→３）Ｍａｎβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→４
（Ｆｕｃα１→６）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ〔ＲはＡｓｎ−Ｎ
Ｈ−（ＣＨ₂ ）₄ −ＰＡ〕を生じるものとした。

【００２８】実施例１ α−１，６−フコシルトランスフェラーゼのアミノ末端
アミノ酸配列の決定 ５μｇの精製α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ
をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した
後、エレクトロブロッティング法によりＰＶＤＦ膜（ミ
リポア社製）に蛋白質を転写した。該ＰＶＤＦ膜をクー
マシーブリリアントブルーＧ２５０により染色し、６０
ｋＤａの位置に単一のα−１，６−フコシルトランスフ
ェラーゼのバンドを検出した。次に該バンドを含むＰＶ
ＤＦ膜を切り取り、５０％メタノールで脱染色した後、
バイオシステム４７３Ａプロテインシークエンサー（ア
プライドバイオシステム社製）に供し、α−１，６−フ
コシルトランスフェラーゼのアミノ末端アミノ酸配列を
決定した。決定されたアミノ酸配列は配列表・配列番号
３に示す。

【００２９】実施例２ α−１，６−フコシルトランスフェラーゼの部分アミノ
酸配列の決定 １３μｇの精製α−１，６−フコシルトランスフェラー
ゼをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した
後、エレクトロブロッティング法によりＰＶＤＦ膜（ミ
リポア社製）に蛋白質を転写した。該ＰＶＤＦ膜をクー
マシーブリリアントブルーＧ２５０により染色し、６０
ｋＤａの位置に単一のα−１，６−フコシルトランスフ
ェラーゼのバンドを検出した。次に、該バンドを含むＰ
ＶＤＦ膜を切り取り、５０％メタノールで脱染色した
後、該ＰＶＤＦ膜切片を１μｇのリジルエンドペプチダ
ーゼを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液−５％アセトニ
トリル（ｐＨ８．２）中、３７℃で１２時間処理し、タ
ンパク分解を行った。分解処理を行った該ＰＶＤＦ膜切
片を超音波処理することにより分解物の抽出を行った。
得られた該分解物をＣ−１８カラムを用いた逆相高速液
体クロマトグラフィーによって分離し、３つのペプチド
断片を得た。該ペプチド断片を含む逆相高速液体クロマ
トグラフィー分離物をポリブレンコートしたトリフルオ
ロ酢酸活性化プレサイクルドグラスファイバーフィルタ
ーに供して乾燥させた後に、バイオシステム４７３Ａプ
ロテインシークエンサー（アプライドバイオシステム社
製）に供し、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ
の部分アミノ酸配列を決定した。決定されたアミノ酸配
列は配列表・配列番号４〜６に示す。

【００３０】実施例３ ＰＣＲによるプローブＤＮＡの作成 実施例１および２で得られたアミノ酸配列を元にして、
配列表・配列番号７および８に示されるミックスプライ
マーを合成した。配列表・配列番号７で示されるミック
スプライマーはセンスプライマーとして、配列表・配列
番号８で表されるミックスプライマーはアンチセンスプ
ライマーとしてＰＣＲ反応に使用した。ＰＣＲ反応は２
μｇブタ脳由来のｃＤＮＡ、２５ｐｍｏｌｅセンスプラ
イマー（配列番号７で示されるミックスプライマー）、
２５ｐｍｏｌｅアンチセンスプライマー（配列番号８で
示されるミックスプライマー）、および２．５単位Ｔａ
ｑＤＮＡポリメラーゼを含む５０ｍＭ塩化カリウム−１
０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）−１．５ｍＭ
塩化マグネシウム−０．００１％ゼラチン−２００μＭ
ｄＮＴＰ反応溶液５０μｌ中、９４℃（１分間）、５５
℃（２分間）、７２℃（３分間）を１サイクルとしてＰ
ＣＲを２５サイクル行った。ＰＣＲ反応後の反応液１０
μｌを、０．７％アガロースゲル電気泳動に供すること
により、ＰＣＲ反応産物であるＤＮＡ断片の確認を行っ
た。配列番号７で表されるミックスプライマーと配列番
号８で表されるミックスプライマーの組み合わせで行っ
たＰＣＲ反応の結果、アガロースゲル電気泳動において
１．４５ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片が確認された。

【００３１】該ＤＮＡ断片をプラスミドｐＴ７ＢＬＵＥ
ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（ノバジェン社製）にサブクローニン
グし、塩基配列の確認を行った結果、配列表の配列番号
３〜６に記載のアミノ酸配列に相当するＤＮＡが検出さ
れ、該ＤＮＡ断片がα−１，６−フコシルトランスフェ
ラーゼ遺伝子の一部分であることが確認された。

【００３２】実施例４ α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の単離 実施例３で得られたＤＮＡ断片を α−³²ＰｄＣＴＰ
（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、アマシャム社製）でラベル
したものをプローブとして用い、ブタ脳由来のλｇｔ１
１ ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社製）からプ
ラークハイブリダイゼイション法により、α−１，６−
フコシルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡを含
有するクローン体の検索を行った。約４０万個のプラー
クを検索した結果、５個の陽性クローン体ｃ１、ｃ２、
ｃ３、ｃ４、及びｃ５が得られた。該クローン体ｃ１及
びｃ２はその長さから全長のα−１，６−フコシルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子含んでいると推測されたのでｃ１
及びｃ２の塩基配列の決定を行った結果、配列番号１に
示される塩基配列が得られた。

【００３３】実施例５ α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現 実施例４で得られたα−１，６−フコシルトランスフェ
ラーゼをコードするｃＤＮＡを含むクローン体よりα−
１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子のコード領
域を発現べクターｐＳＶＫ３にサブクローニンした。該
α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む
発現ベクターをＣＯＳ−１細胞に導入し、４８時間培養
後、培養細胞を集め、該細胞を破砕し、得られた破砕物
のα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ酵素活性を
測定した。コントロールとしてｍｏｃｋ ｐＳＶＫ３を
導入したＣＯＳ−１細胞の破砕物のα−１，６−フコシ
ルトランスフェラーゼ酵素活性を測定した。コントロー
ルではほとんど活性が検出されなかったのに対し、該α
−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む発
現ベクターを導入されたＣＯＳ−１細胞では２３６０ｎ
ｍｏｌｅ／ｈ／ｍｇ蛋白質と高い活性を示した。

【００３４】

【発明の効果】本発明により糖鎖構造解析試薬、糖鎖工
学試薬として有用なα−１，６−フコシルトランスフェ
ラーゼの大量かつ安価に供給が可能になる。また、本発
明のα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を
特定することにより癌などの疾病の診断方法の開発が可
能になる。

【００３５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：1725 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列の特徴 起源 生物名：ブタ 配列 ATG CGG CCA TGG ACT GGT TCG TGG CGT TGG ATT ATG CTC ATT CTT TTT 48 Met Arg Pro Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe 1 5 10 15 GCC TGG GGG ACC TTG CTA TTT TAC ATA GGT GGT CAC TTG GTA CGA GAT 96 Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp 20 25 30 AAT GAC CAC TCT GAT CAC TCT AGC CGA GAA CTG TCC AAG ATT TTG GCA 144 Asn Asp His Ser Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala 35 40 45 AAG CTG GAA CGC TTA AAA CAA CAA AAT GAA GAC TTG AGG AGA ATG GCT 192 Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala 50 55 60 GAA TCT CTC CGA ATA CCA GAA GGC CCC ATT GAT CAG GGG CCA GCT TCA 240 Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp Gln Gly Pro Ala Ser 65 70 75 80 GGA AGA GTT CGT GCT TTA GAA GAG CAA TTT ATG AAG GCC AAA GAA CAG 288 Gly Arg Val Arg Ala Leu Glu Glu Gln Phe Met Lys Ala Lys Glu Gln 85 90 95 ATT GAA AAT TAT AAG AAA CAA ACT AAA AAT GGT CCA GGG AAG GAT CAT 336 Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Thr Lys Asn Gly Pro Gly Lys Asp His 100 105 110 GAA ATC CTA AGG AGG AGG ATT GAA AAT GGA GCT AAA GAG CTC TGG TTT 384 Glu Ile Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys Glu Leu Trp Phe 115 120 125 TTT CTA CAA AGT GAG TTG AAG AAA TTA AAG AAT TTA GAA GGA AAT GAA 432 Phe Leu Gln Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys Asn Leu Glu Gly Asn Glu 130 135 140 CTC CAA AGA CAT GCA GAT GAA TTT CTA TCA GAT TTG GGA CAT CAT GAA 480 Leu Gln Arg His Ala Asp Glu Phe Leu Ser Asp Leu Gly His His Glu 145 150 155 160 AGG TCT ATA ATG ACG GAT CTA TAC TAC CTC AGT CAA ACA GAT GGG GCA 528 Arg Ser Ile Met Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Gln Thr Asp Gly Ala 165 170 175 GGT GAT TGG CGT GAA AAG GAG GCC AAA GAT CTG ACA GAG CTG GTC CAG 576 Gly Asp Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Leu Val Gln 180 185 190 CGG AGA ATA ACA TAT CTT CAG AAT CCC AAG GAC TGC AGC AAA GCC AAG 624 Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys Ser Lys Ala Lys 195 200 205 AAG CTA GTG TGT AAT ATC AAC AAA GGC TGT GGC TAT GGC TGT CAG CTC 672 Lys Leu Val Cys Asn Ile Asn Lys Gly Cys Gly Tyr Gly Cys Gln Leu 210 215 220 CAT CAT GTA GTG TAC TGC TTT ATG ATT GCA TAT GGC ACC CAG CGA ACA 720 His His Val Val Tyr Cys Phe Met Ile Ala Tyr Gly Thr Gln Arg Thr 225 230 235 240 CTC GCC TTG GAA TCT CAC AAT TGG CGC TAC GCT ACT GGG GGA TGG GAA 768 Leu Ala Leu Glu Ser His Asn Trp Arg Tyr Ala Thr Gly Gly Trp Glu 245 250 255 ACT GTG TTT AGA CCT GTA AGT GAG ACG TGC ACA GAC AGA TCT GGC AGC 816 Thr Val Phe Arg Pro Val Ser Glu Thr Cys Thr Asp Arg Ser Gly Ser 260 265 270 TCC ACT GGA CAT TGG TCA GGT GAA GTA AAG GAC AAA AAT GTT CAG GTG 864 Ser Thr Gly His Trp Ser Gly Glu Val Lys Asp Lys Asn Val Gln Val 275 280 285 GTT GAG CTC CCC ATT GTA GAC AGT GTT CAT CCT CGT CCT CCA TAT TTA 912 Val Glu Leu Pro Ile Val Asp Ser Val His Pro Arg Pro Pro Tyr Leu 290 295 300 CCC CTG GCT GTC CCA GAA GAC CTT GCA GAT CGA CTT GTA CGA GTC CAT 960 Pro Leu Ala Val Pro Glu Asp Leu Ala Asp Arg Leu Val Arg Val His 305 310 315 320 GGT GAT CCT GCA GTG TGG TGG GTA TCC CAG TTT GTC AAG TAC TTG ATT 1008 Gly Asp Pro Ala Val Trp Trp Val Ser Gln Phe Val Lys Tyr Leu Ile 325 330 335 CGC CCA CAA CCC TGG CTG GAA AAG GAA ATA GAA GAG GCC ACC AAG AAG 1056 Arg Pro Gln Pro Trp Leu Glu Lys Glu Ile Glu Glu Ala Thr Lys Lys 340 345 350 CTA GGC TTC AAA CAT CCA GTT ATT GGA GTC CAT GTT AGA CGC ACA GAC 1104 Leu Gly Phe Lys His Pro Val Ile Gly Val His Val Arg Arg Thr Asp 355 360 365 AAA GTG GGA GCG GAA GCA GCC TTC CAT CCC ATT GAG GAA TAC ACG GTG 1152 Lys Val Gly Ala Glu Ala Ala Phe His Pro Ile Glu Glu Tyr Thr Val 370 375 380 CAC GTT GAA GAA GAC TTT CAG CTT CTT GCT CGC AGA ATG CAA GTG GAT 1200 His Val Glu Glu Asp Phe Gln Leu Leu Ala Arg Arg Met Gln Val Asp 385 390 395 400 AAA AAA AGG GTG TAT TTG GCC ACA GAT GAC CCT GCT TTG TTA AAA GAG 1248 Lys Lys Arg Val Tyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro Ala Leu Leu Lys Glu 405 410 415 GCA AAA ACA AAG TAC CCC AGT TAT GAA TTT ATT AGT GAT AAC TCT ATC 1296 Ala Lys Thr Lys Tyr Pro Ser Tyr Glu Phe Ile Ser Asp Asn Ser Ile 420 425 430 TCT TGG TCA GCT GGA CTA CAT AAT CGA TAT ACA GAA AAT TCA CTT CGG 1344 Ser Trp Ser Ala Gly Leu His Asn Arg Tyr Thr Glu Asn Ser Leu Arg 435 440 445 GGT GTG ATC CTG GAT ATA CAC TTT CTC TCC CAG GCA GAC TTC CTA GTG 1392 Gly Val Ile Leu Asp Ile His Phe Leu Ser Gln Ala Asp Phe Leu Val 450 455 460 TGT ACT TTT TCA TCG CAG GTC TGT AGA GTT GCT TAT GAA ATC ATG CAA 1440 Cys Thr Phe Ser Ser Gln Val Cys Arg Val Ala Tyr Glu Ile Met Gln 465 470 475 480 GCG CTG CAT CCT GAT GCC TCT GCG AAC TTC CGT TCT TTG GAT GAC ATC 1488 Ala Leu His Pro Asp Ala Ser Ala Asn Phe Arg Ser Leu Asp Asp Ile 485 490 495 TAC TAT TTT GGA GGC CCA AAT GCC CAC AAC CAA ATT GCC ATT TAT CCT 1536 Tyr Tyr Phe Gly Gly Pro Asn Ala His Asn Gln Ile Ala Ile Tyr Pro 500 505 510 CAC CAA CCT CGA ACT GAA GGA GAA ATC CCC ATG GAA CCT GGA GAT ATT 1584 His Gln Pro Arg Thr Glu Gly Glu Ile Pro Met Glu Pro Gly Asp Ile 515 520 525 ATT GGT GTG GCT GGA AAT CAC TGG GAT GGC TAT CCT AAA GGT GTT AAC 1632 Ile Gly Val Ala Gly Asn His Trp Asp Gly Tyr Pro Lys Gly Val Asn 530 535 540 AGA AAA CTG GGA AGG ACG GGC CTA TAT CCC TCC TAC AAA GTT CGA GAG 1680 Arg Lys Leu Gly Arg Thr Gly Leu Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Arg Glu 545 550 555 560 AAG ATA GAA ACA GTC AAG TAC CCC ACA TAT CCC GAG GCT GAC AAG TAA 1728 Lys Ile Glu Thr Val Lys Tyr Pro Thr Tyr Pro Glu Ala Asp Lys 565 570 575

【００３６】配列番号：２ 配列の長さ：575 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Arg Pro Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe 1 5 10 15 Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp 20 25 30 Asn Asp His Ser Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala 35 40 45 Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala 50 55 60 Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp Gln Gly Pro Ala Ser 65 70 75 80 Gly Arg Val Arg Ala Leu Glu Glu Gln Phe Met Lys Ala Lys Glu Gln 85 90 95 Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Thr Lys Asn Gly Pro Gly Lys Asp His 100 105 110 Glu Ile Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys Glu Leu Trp Phe 115 120 125 Phe Leu Gln Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys Asn Leu Glu Gly Asn Glu 130 135 140 Leu Gln Arg His Ala Asp Glu Phe Leu Ser Asp Leu Gly His His Glu 145 150 155 160 Arg Ser Ile Met Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Gln Thr Asp Gly Ala 165 170 175 Gly Asp Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Leu Val Gln 180 185 190 Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys Ser Lys Ala Lys 195 200 205 Lys Leu Val Cys Asn Ile Asn Lys Gly Cys Gly Tyr Gly Cys Gln Leu 210 215 220 His His Val Val Tyr Cys Phe Met Ile Ala Tyr Gly Thr Gln Arg Thr 225 230 235 240 Leu Ala Leu Glu Ser His Asn Trp Arg Tyr Ala Thr Gly Gly Trp Glu 245 250 255 Thr Val Phe Arg Pro Val Ser Glu Thr Cys Thr Asp Arg Ser Gly Ser 260 265 270 Ser Thr Gly His Trp Ser Gly Glu Val Lys Asp Lys Asn Val Gln Val 275 280 285 Val Glu Leu Pro Ile Val Asp Ser Val His Pro Arg Pro Pro Tyr Leu 290 295 300 Pro Leu Ala Val Pro Glu Asp Leu Ala Asp Arg Leu Val Arg Val His 305 310 315 320 Gly Asp Pro Ala Val Trp Trp Val Ser Gln Phe Val Lys Tyr Leu Ile 325 330 335 Arg Pro Gln Pro Trp Leu Glu Lys Glu Ile Glu Glu Ala Thr Lys Lys 340 345 350 Leu Gly Phe Lys His Pro Val Ile Gly Val His Val Arg Arg Thr Asp 355 360 365 Lys Val Gly Ala Glu Ala Ala Phe His Pro Ile Glu Glu Tyr Thr Val 370 375 380 His Val Glu Glu Asp Phe Gln Leu Leu Ala Arg Arg Met Gln Val Asp 385 390 395 400 Lys Lys Arg Val Tyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro Ala Leu Leu Lys Glu 405 410 415 Ala Lys Thr Lys Tyr Pro Ser Tyr Glu Phe Ile Ser Asp Asn Ser Ile 420 425 430 Ser Trp Ser Ala Gly Leu His Asn Arg Tyr Thr Glu Asn Ser Leu Arg 435 440 445 Gly Val Ile Leu Asp Ile His Phe Leu Ser Gln Ala Asp Phe Leu Val 450 455 460 Cys Thr Phe Ser Ser Gln Val Cys Arg Val Ala Tyr Glu Ile Met Gln 465 470 475 480 Ala Leu His Pro Asp Ala Ser Ala Asn Phe Arg Ser Leu Asp Asp Ile 485 490 495 Tyr Tyr Phe Gly Gly Pro Asn Ala His Asn Gln Ile Ala Ile Tyr Pro 500 505 510 His Gln Pro Arg Thr Glu Gly Glu Ile Pro Met Glu Pro Gly Asp Ile 515 520 525 Ile Gly Val Ala Gly Asn His Trp Asp Gly Tyr Pro Lys Gly Val Asn 530 535 540 Arg Lys Leu Gly Arg Thr Gly Leu Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Arg Glu 545 550 555 560 Lys Ile Glu Thr Val Lys Tyr Pro Thr Tyr Pro Glu Ala Asp Lys 565 570 575

【００３７】配列番号：３ 配列の長さ：26 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Lys Gln Thr Lys Asn Gly Pro Gly Lys Asp His Glu Ile Leu Arg Arg 5 10 15 Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys Glu Leu Gln 20 25

【００３８】配列番号：４ 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【００３９】配列番号：５ 配列の長さ：12 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【００４０】配列番号：６ 配列の長さ：14 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Lys Arg Val Tyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro Ala Leu Leu Lys 5 10

【００４１】配列番号：７ 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 AARSAR ACNAA RAAYG GNCC 19

【００４２】配列番号：８ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 TCNGG RTANG TNGGR TAYTT 20

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ブタ由来のα−１，６−フコシルトラン
   スフェラーゼをコードする遺伝子。
2. 【請求項２】 配列表・配列番号２に示されるアミノ酸
   配列をコードする遺伝子を含む請求項１記載のα−１，
   ６−フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子。
3. 【請求項３】 配列表・配列番号１に示される塩基配列
   を含む請求項１記載のα−１，６−フコシルトランスフ
   ェラーゼをコードする遺伝子。
4. 【請求項４】 配列表・配列番号２に示されるアミノ酸
   配列の少なくとも１つのアミノ酸が、置換、挿入、削
   除、又は付加されているアミノ酸配列をコードする遺伝
   子を含む請求項１記載のα−１，６−フコシルトランス
   フェラーゼをコードする遺伝子。
5. 【請求項５】 配列表・配列番号１に示される塩基配列
   の少なくとも１つが置換、挿入、削除、又は付加されて
   いる塩基配列を含む請求項１記載のα−１，６−フコシ
   ルトランスフェラーゼをコードする遺伝子。
6. 【請求項６】 配列表・配列番号１に示される塩基配列
   を含むα−１，６−フコシルトランスフェラーゼをコー
   ドする遺伝子の少なくとも一部にハイブリダイズする遺
   伝子。
7. 【請求項７】 請求項１〜６のいずれか１項に記載され
   るα−１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードす
   る遺伝子を含んでなる発現ベクター。
8. 【請求項８】 請求項７に記載の発現ベクターにより宿
   主細胞を形質転換した形質転換細胞。
9. 【請求項９】 請求項８に記載の形質転換細胞を培養
   し、該培養物からα−１，６−フコシルトランスフェラ
   ーゼを採取することを特徴とする組換えα−１，６−フ
   コシルトランスフェラーゼの製造方法。