JPH1033168A - ヒト由来のグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチド及びそれをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒト由来のグリコサミノグリカンスルホトラ
ンスフェラーゼのポリペプチド及びそれをコードするＤ
ＮＡを提供する。 【解決手段】 ニワトリ由来のグリコサミノグリカンス
ルホトランスフェラーゼのｃＤＮＡ断片をプローブとす
るハイブリダイゼーションによりヒト由来ｃＤＮＡライ
ブラリーからグリコサミノグリカンスルホトランスフェ
ラーゼの完全長ｃＤＮＡを得る。また、該ＤＮＡを保持
する細胞を用いてポリペプチドを得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト由来のグリコ
サミノグリカンスルホトランスフェラーゼ（グリコサミ
ノグリカン硫酸基転移酵素）のポリペプチド、及びそれ
をコードするＤＮＡに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】コンドロイチン硫酸は、代表的な硫酸化
ムコ多糖（グリコサミノグリカン）である。コンドロイ
チン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）は軟骨に豊富に
存在し、軟骨細胞(chondrocyte)の表現型の発現および
維持に寄与していると考えられている(Tsukahara, T.,
Okamura, M., Suzuki, S., Iwata, H., Miura, T., and
Kimata, K. (1991) J. Cell Sci. 100, 387-395)。ＣＳ
ＰＧは、また軟骨以外のさまざまな組織中に存在してお
り、細胞間相互作用に重要な役割を果たしていると考え
られる(Kjellen, L., and Lindahl, U. (1991) Annu. R
ev. Biochem. 60, 443-475)。

【０００３】ほ乳類や鳥類の組織に見られる主要なコン
ドロイチン硫酸は、アセチルガラクトサミン残基の６位
または４位に硫酸基を有している。６−硫酸化／４−硫
酸化の割合については、次のような知見が得られてい
る。軟骨の最終分化に伴い、コンドロイチン６−硫酸
／コンドロイチン４−硫酸の比（６／４比）が増加す
る。ラットの皮膚においては、出生後の日齢とともに
ＣＳＰＧで６／４比が減少する。アテローム性動脈硬
化症に抵抗性と感受性のハトの品種から得られた各々の
動脈平滑筋細胞を比較した結果、ＣＳＰＧ、デルマタン
硫酸プロテオグリカン（ＤＳＰＧ）いずれにおいても抵
抗性品種ではコンドロイチン４−硫酸が主成分である
が、感受性品種ではコンドロイチン６−硫酸が主であ
る。単球性白血病細胞(M1)において、培養条件を細胞
増殖、高密度での増殖阻害、マクロファージへの分化誘
導が起きる条件へと変化させてみると、増殖、増殖阻
害、分化誘導と変化するにつれてＣＳＰＧにおける６／
４比が減少し、分化誘導状態ではほとんどコンドロイチ
ン４−硫酸が合成される。ヒト正常結腸組織とヒト結
腸癌組織を比較した結果、癌組織のＰＧでは正常組織に
比べてコンドロイチン６−硫酸とコンドロイチンが増加
する。マウス骨芽細胞において、石灰化が起きる前後
で比較した結果、石灰化後は石灰化前に比べてＤＳＰＧ
の６／４比が減少する。サル動脈平滑筋細胞の培養培
地に血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）を添加すると、バ
ーシカン様ＣＳＰＧにおける６／４比がＰＤＧＦ無添加
の対照よりも増加する（グリコバイオロジーシリーズ
糖鎖の多様な世界 講談社 第１６４、１６６頁）。

【０００４】またコンドロイチン硫酸においては、１つ
の繰り返し２糖単位あたり２つの硫酸基の存在も報告さ
れている。例えば、GlcAβ1→3GalNAc(4,6-bisS)は、継
代培養したニワトリ胚軟骨細胞、マウス脾臓細胞を培養
して得たコンディションドメディウム添加培地で培養す
ることにより骨髄細胞から分化したマウス肥満細胞、ラ
ット糸球体、器官培養したヒト結腸粘膜の培養液、ラッ
ト漿膜肥満細胞、ヒト肺肥満細胞の分泌顆粒、ホルボー
ルミリステートアセテートで活性化されたヒト単球およ
び単球由来のマクロファージ、マウス骨芽細胞、ラット
糸球体脈管膜細胞、ナマコ体壁から見つかっている。ま
た非還元末端GalNAc(4,6-bisS)が、ニワトリ胚骨端軟骨
およびラット剣状突起軟骨、ニワトリ胚軟骨細胞を培養
したときの細胞層から、また非還元末端GalNAc(4,6-bis
S)β1→4GlcAβ1→3GalNAc(4,6-bisS)が、ウサギ肺から
抽出精製したトロンボモジュリンから見つかっている。
さらに、GlcA(2S)-GalNAc(6S)は、マウスリンパ節由来
の肥満細胞から見つかっている（グリコバイオロジーシ
リーズ 糖鎖の多様な世界 講談社 第１６６頁）。

【０００５】このようなコンドロイチン硫酸の硫酸化の
パターンの多様性は、コンドロイチン硫酸の機能の分子
的な基盤を反映していると思われる。また、コンドロイ
チン硫酸の生理活性発現には、硫酸化が重要な役割を果
たしていると考えられる。コンドロイチン硫酸の生理活
性発現における硫酸化の重要性を考えると、コンドロイ
チン硫酸の特異的な部位を硫酸化する方法は、コンドロ
イチン硫酸の生理活性の解析や機能改変に必須であると
考えられる。グリコサミノグリカンの糖残基の特異的な
部位の硫酸化は、その部位に特異的なスルホトランスフ
ェラーゼにより触媒される。

【０００６】グリコサミノグリカンのスルホトランスフ
ェラーゼ遺伝子がクローニングされれば、受容体の基質
特異性についての情報が得られ、グリコサミノグリカン
の構造-機能関係の研究に有用なアプローチを提供する
と思われる。グリコサミノグリカンの合成には、さまざ
まなグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼが
関与しているようである。しかしながら、スルホトラン
スフェラーゼのcDNAのクローニングは困難なものであ
り、ラットの肝臓、ヘパリン産生細胞系(cell line)、
及びマウスの肥満細胞腫からのN-スルホトランスフェラ
ーゼ／N-デアセチラーゼのcDNAがクローニングされてい
るのみである。

【０００７】本発明者らは、既に3'-ホスホアデノシン
5'-ホスホ硫酸からコンドロイチン等のグリコサミノグ
リカンのN-アセチルガラクトサミン残基の６位に硫酸基
を転移するコンドロイチン６−スルホトランスフェラー
ゼ（以下「Ｃ６ＳＴ」と略記することもある）を、無血
清培地で培養したニワトリの軟骨細胞の培養上清から見
かけ上均一に精製した(Habuchi, O., Matsui, Y., Koto
ya, Y., Aoyama, Y., Yasuda, Y., and Noda, M. (199
3) J. Biol. Chem. 268, 21968-21974)。更に、その部
分アミノ酸配列よりオリゴヌクレオチドプライマーを作
成し、ニワトリのｃＤＮＡをクローニングし、そのＤＮ
Ａから得られたポリペプチドがＣ６ＳＴ活性を発現する
ことも証明した。また、該酵素が、ケラタン硫酸のガラ
クトース残基の６位にも硫酸基を転移する活性も有する
ことを見い出した（Fukuta, M., Uchimura. K.,Nakashi
ma, K., Kato, M., Kimata, K., Shinomura, T., and H
abuchi, O. (1995) J. Biol. Chem. 270, 18575-1858
0）。

【０００８】しかし、医薬品への応用が期待できるヒト
由来のコンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼの
ポリペプチドをコードするＤＮＡについては、いまだ知
られていない。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】コンドロイチン硫酸の
生理活性発現における硫酸化の重要性を考えると、コン
ドロイチン硫酸に硫酸基を転移する酵素は、コンドロイ
チン硫酸の機能解析の研究のみならず、ヒトに好ましい
生理活性を有する医薬品の創造を目的としたコンドロイ
チン硫酸を提供するためにも非常に重要である。さら
に、ヒト由来のコンドロイチン６−スルホトランスフェ
ラーゼ（Ｃ６ＳＴ）のポリペプチドやそれをコードする
ＤＮＡが得られれば、コンドロイチン硫酸のＮ−アセチ
ルガラクトサミン残基の６位低硫酸化（本明細書中で、
「低硫酸化」とは硫酸化度が低いことを意味する）、及
びケラタン硫酸のガラクトース残基の６位低硫酸化等に
起因するヒトの疾患に対する、遺伝子治療を含む医薬あ
るいは診断薬としての利用が期待される。

【００１０】すなわち本発明が解決しようとする課題
は、ヒト由来のグリコサミノグリカンスルホトランスフ
ェラーゼのポリペプチド及びその部分ポリペプチド、並
びにヒト由来のグリコサミノグリカンスルホトランスフ
ェラーゼの少なくとも一部をコードするＤＮＡを提供す
ることである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ニワトリ
由来のコンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼを
コードするｃＤＮＡをクローニングし、該ｃＤＮＡに由
来する断片を用いて、ヒトのｃＤＮＡライブラリーより
該酵素をコードするｃＤＮＡのクローニングに成功し、
ヒト由来のグリコサミノグリカンスルホトランスフェラ
ーゼのポリペプチド及びその部分ポリペプチド（以下、
まとめて「本発明ポリペプチド」ともいう）、並びにヒ
ト由来のグリコサミノグリカンスルホトランスフェラー
ゼの少なくとも一部をコードするＤＮＡ（以下、「本発
明ＤＮＡ」ともいう）を提供するに至った。

【００１２】本発明ポリペプチドは、下記の理化学的性
質を有する、ヒト由来のグリコサミノグリカンスルホト
ランスフェラーゼのポリペプチドを含む。 作用：硫酸基供与体から硫酸基を、グリコサミノグリ
カンのＮ−アセチルガラクトサミン残基またはガラクト
ース残基に転移する。

【００１３】 基質特異性：コンドロイチンのＮ−ア
セチルガラクトサミン残基の６位に硫酸基を転移する。
ケラタン硫酸のガラクトース残基の６位に硫酸基を転移
する。

【００１４】分子量：約５００００〜５５０００ダル
トン

【００１５】また、本発明ポリペプチドは、配列番号２
に示すアミノ酸配列の少なくとも一部を有し、硫酸基供
与体から硫酸基をグリコサミノグリカンのＮ−アセチル
ガラクトサミン残基及び／またはガラクトース残基に転
移する活性を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸残基
の置換、欠失または挿入を有していてもよいヒト由来の
グリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリ
ペプチドを含む。好ましくは、好ましくは、配列番号２
に示すアミノ酸配列の少なくとも一部を有するヒト由来
のグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポ
リペプチドである。

【００１６】さらに、本発明ポリペプチドは、上記のポ
リペプチドの部分を含むポリペプチドを含む。本発明Ｄ
ＮＡは、上記グリコサミノグリカンスルホトランスフェ
ラーゼのポリペプチドの少なくとも一部をコードするＤ
ＮＡである。好ましくは、配列番号２においてアミノ酸
番号１〜４７９またはアミノ酸番号２０〜４７９で表さ
れるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、さらに
好ましくは、配列番号１に示す塩基配列の少なくとも一
部またはすべてを有する。

【００１７】

【発明の実施の形態】以下、本発明を、本発明ポリペプ
チド、本発明ＤＮＡの順に詳細に説明する。 ＜１＞本発明ポリペプチド 本発明ポリペプチドは、下記の理化学的性質を有する、
ヒト由来のグリコサミノグリカンスルホトランスフェラ
ーゼのポリペプチドを含む。

【００１８】作用：硫酸基供与体から硫酸基を、グリ
コサミノグリカンのＮ−アセチルガラクトサミン残基ま
たはガラクトース残基に転移する。

【００１９】 基質特異性：コンドロイチンのＮ−ア
セチルガラクトサミン残基の６位に硫酸基を転移する。
ケラタン硫酸のガラクトース残基の６位に硫酸基を転移
する。

【００２０】分子量：約５００００〜５５０００ダル
トン

【００２１】なお、上記硫酸基供与体としては３’−ホ
スホアデノシン ５’−ホスホ硫酸が好ましい。また、
本発明ポリペプチドはII型膜タンパク質であることが好
ましい。

【００２２】上記の分子量は、アミノ酸配列から計算し
た、ポリペプチドの推定分子量である。この酵素は天然
では糖タンパク質であると予想され、糖鎖の付加により
上記分子量よりも分子量が増加すると考えられる。

【００２３】また、II型膜タンパク質とは、アミノ末端
側に疎水性の膜貫通ドメインがあり、カルボキシル末端
側がゴルジ膜内腔に突き出された形状で生合成されるタ
ンパク質を意味する。

【００２４】好ましくは、上記〜の理化学的性質に
加え、さらにアミノ酸残基が４６０〜４７９残基であ
る。また、本発明のポリペプチドは、上記の理化学的性
質の基質特異性において、コンドロイチンのＮ−アセ
チルガラクトサミン残基の６位のみでなく、４位にも硫
酸基を転移する活性を持ち、コンドロイチンのＮ−アセ
チルガラクトサミン残基の６位に硫酸基を転移する活性
（C6ST活性）と、４位に硫酸基を転移する活性（C4ST活
性）との比の値（C6ST活性／C4ST活性）は、１５〜２０
程度である。

【００２５】さらに、本発明ポリペプチドは、配列番号
２に示すアミノ酸配列の少なくとも一部を有し、硫酸基
供与体から硫酸基をグリコサミノグリカンのＮ−アセチ
ルガラクトサミン残基またはガラクトース残基に転移す
る活性を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸残基の置
換、欠失または挿入を有していてもよいヒト由来のグリ
コサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプ
チドを含む。好ましくは、アミノ酸残基の置換、欠失ま
たは挿入を含まない、配列番号２に示すアミノ酸配列の
少なくとも一部を有するヒト由来のグリコサミノグリカ
ンスルホトランスフェラーゼのポリペプチドである。

【００２６】このようなアミノ酸残基の置換、欠失また
は挿入は、配列番号２に示すアミノ酸配列の少なくとも
一部をコードするＤＮＡに１つ又は２以上のアミノ酸残
基の置換、欠失又は挿入を起こすようなヌクレオチドの
置換、欠失又は挿入を導入して得られるＤＮＡを発現さ
せることによって得ることができる。ＤＮＡ配列へのヌ
クレオチドの置換、欠失又は挿入は、両末端に制限酵素
切断末端を持ち、変異点の両側を含む配列を合成し、未
変異ＤＮＡ配列の相当する部分と入れ換える事により、
導入することができる。また、部位特異的変異法（Kram
er,W. and Frits,H.J.,Meth. in Enzymol.,154,350 (19
87); Kunkel,T.A. et al.,Meth. in Enzymol.,154,367
(1987)）などの方法によっても、ＤＮＡ配列に置換、挿
入又は欠失を導入することができる。硫酸基供与体から
硫酸基をグリコサミノグリカンのＮ−アセチルガラクト
サミン残基またはガラクトース残基に転移する活性は、
例えば、後記の酵素活性測定法によって測定することが
でき、当業者は活性を実質的に害さない１つ以上のアミ
ノ酸残基の置換、欠失または挿入を容易に識別すること
ができる。

【００２７】配列番号２に示すアミノ酸配列にはアミノ
酸番号２０にメチオニンが含まれており、アミノ酸番号
１のメチオニンと共に、いずれも本発明ポリペプチドの
Ｎ末端となる可能性がある。従って、本発明ポリペプチ
ドには、配列番号２に示すアミノ酸配列においてアミノ
酸番号１〜４７９及びアミノ酸番号２０〜４７９で表さ
れるアミノ酸配列を有するグリコサミノグリカンスルホ
トランスフェラーゼのポリペプチドが包含され、かつ好
ましい。さらに、配列番号２に示すアミノ酸配列には、
見かけ上NH₂-ターミナルシグナルペプチド配列は含まれ
ていないが、NH ₂-ターミナルシグナルペプチド配列の存
在が完全に排除されるものではない。いずれのメチオニ
ンがＮ末端であるにしても、また、NH₂-ターミナルシグ
ナルペプチド配列の存在の有無に拘わらず、配列番号２
に示すアミノ酸配列は、グリコサミノグリカンスルホト
ランスフェラーゼのポリペプチドを含んでいる。

【００２８】本明細書において、「配列番号２に示すア
ミノ酸配列の少なくとも一部を有する」とは、これらの
観点から、スルホトランスフェラーゼ活性を有する必要
かつ最小のポリペプチドのアミノ酸配列を有することを
意味するものである。

【００２９】さらにまた、本発明ポリペプチドは、上記
のポリペプチドの部分を含むポリペプチドを含む。ここ
で、「部分」とは、好ましくは、スルホトランスフェラ
ーゼ活性を有する、抗原性を有する等の何らかの活性な
いし機能を有する部分を意味する。このような部分を識
別することは当業者であれば容易である。

【００３０】なお、本発明ポリペプチドは必ずしも単独
のポリペプチドでなくてもよく、必要により、融合タン
パク質の一部となっていてもよい。例えば、本発明ポリ
ペプチドと、発現に必要な他のポリペプチドを含む融合
ポリペプチドが例示される。

【００３１】上記の本発明ポリペプチドは、後記の本発
明ＤＮＡを用いて得ることができる。すなわち、本発明
ＤＮＡを保持する細胞を、好適な培地で培養し、グリコ
サミノグリカンスルホトランスフェラーゼを培地中に生
成蓄積させ、その培地からグリコサミノグリカンスルホ
トランスフェラーゼを採取することによって、グリコサ
ミノグリカンスルホトランスフェラーゼを製造すること
ができる。本発明のＤＮＡの発現は、通常タンパク質の
製造に用いられる宿主−ベクター系を使用することがで
きるが、ＣＯＳ−７細胞等の哺乳類細胞が好ましい。発
現は、本発明のＤＮＡを直接発現させてもよいし、他の
タンパク質との融合タンパク質として発現させてもよ
い。また、本発明のＤＮＡは全長を発現させてもよい
し、一部を部分ペプチドとして発現させてもよい。

【００３２】上記のようにして製造されたグリコサミノ
グリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチドもし
くはその部分ポリペプチドまたはこれらと他のタンパク
質との融合タンパク質を用いて、グリコサミノグリカン
スルホトランスフェラーゼに結合する抗体を調製するこ
とができる。抗体の調製は、通常の抗体の調製と同様に
して行えばよい。また、常法によってグリコサミノグリ
カンスルホトランスフェラーゼに結合するモノクローナ
ル抗体を調製することもできる。

【００３３】＜２＞本発明ＤＮＡ 本発明ＤＮＡは、本発明により初めて単離されたヒト由
来のＤＮＡであり、上記のヒト由来のグリコサミノグリ
カンスルホトランスフェラーゼのポリペプチドの少なく
とも一部をコードしている。

【００３４】すなわち、本発明ＤＮＡは、下記の理化学
的性質を有するヒト由来のグリコサミノグリカンスルホ
トランスフェラーゼのポリペプチドの少なくとも一部を
コードしているＤＮＡを含む。

【００３５】作用：硫酸基供与体から硫酸基を、グリ
コサミノグリカンのＮ−アセチルガラクトサミン残基ま
たはガラクトース残基に転移する。

【００３６】 基質特異性：コンドロイチンのＮ−ア
セチルガラクトサミン残基の６位に硫酸基を転移する。
ケラタン硫酸のガラクトース残基の６位に硫酸基を転移
する。

【００３７】分子量：約５００００〜５５０００ダル
トン

【００３８】なお、上記硫酸基供与体としては３’−ホ
スホアデノシン ５’−ホスホ硫酸が好ましい。

【００３９】またこのポリペプチドはII型膜タンパク質
であることが好ましい。また上記ポリペプチドは、上記
〜の理化学的性質に加え、さらにアミノ酸残基が４
６０〜４７９残基であるものが好ましい。

【００４０】また、本発明のポリペプチドは、上記の理
化学的性質の基質特異性において、コンドロイチンの
Ｎ−アセチルガラクトサミン残基の６位のみでなく、４
位にも硫酸基を転移する活性を持ち、コンドロイチンの
Ｎ−アセチルガラクトサミン残基の６位に硫酸基を転移
する活性（C6ST活性）と、４位に硫酸基を転移する活性
（C4ST活性）との比の値（C6ST活性／C4ST活性）は、１
５〜２０程度である。

【００４１】なお、本発明のＤＮＡがコードしているグ
リコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼは、コン
ドロイチンのＮ−アセチルグルコサミン残基の６位に硫
酸基を転移する作用をもつことから、「コンドロイチン
６−スルホトランスフェラーゼ」とも呼ばれることもあ
り、本明細書中でも「コンドロイチン６−スルホトラン
スフェラーゼ」または単に「Ｃ６ＳＴ」と略記すること
もある。

【００４２】本発明ＤＮＡの塩基配列は、前記理化学的
性質を有するグリコサミノグリカンスルホトランスフェ
ラーゼのポリペプチドの少なくとも一部をコードしてい
れば、その塩基配列は特に限定されない。

【００４３】また本発明ＤＮＡは、ヒト由来のグリコサ
ミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチド
の少なくとも一部をコードするＤＮＡであって、配列番
号２に示すアミノ酸配列の全部または一部をコードする
ＤＮＡを含む。

【００４４】そして、本発明ＤＮＡがコードするヒト由
来のスルホトランスフェラーゼのポリペプチドは、硫酸
基供与体から硫酸基をグリコサミノグリカンのＮ−アセ
チルガラクトサミン残基またはガラクトース残基に転移
する活性を実質的に害さないアミノ酸残基の置換、欠
失、挿入を有するものであってもよい。

【００４５】本発明のＤＮＡとして具体的には、配列番
号２においてアミノ酸番号１〜４７９または２０〜４７
９で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有す
るＤＮＡが挙げられ、かつ好ましい。また本発明ＤＮＡ
としてより具体的には、配列番号１に示される塩基配列
の少なくとも一部またはすべてを有するＤＮＡが挙げら
れ、かつ特に好ましい。配列番号１に示す塩基配列に
は、２０番目のアミノ酸に対応する位置にもメチオニン
コドン(ATG)が含まれている。これらのメチオニンコド
ンのうち、最初のメチオニンコドンが開始コドンである
可能性が強いが、他のメチオニンコドンが開始コドンで
ある可能性も残っている。従って、このようなＤＮＡと
して具体的には、配列番号１に示す塩基配列における１
４７位〜１５８３位の塩基配列を有するＤＮＡ、及び配
列番号１に示す塩基配列における２０４位〜１５８３位
の塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。

【００４６】なお、遺伝暗号の縮重による異なった塩基
配列のＤＮＡも本発明のＤＮＡに包含されることは、当
業者であれば容易に理解されるところである。これらの
ＤＮＡのいずれもが本発明ＤＮＡに包含される。

【００４７】さらに、染色体由来のグリコサミノグリカ
ンスルホトランスフェラーゼ遺伝子は、コード領域にイ
ントロンを含むことが予想されるが、そのようなイント
ロンで分断されているＤＮＡ断片であっても、グリコサ
ミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポリペプチド
の少なくとも一部をコードする限り、本発明のＤＮＡ断
片に含まれる。すなわち、本明細書において「コードす
る」とは、転写時にプロッセッシング等を受けて最終的
に目的のポリペプチドを生じ得る塩基配列を有すること
も包含すると理解されたい。

【００４８】また、本明細書において「ポリペプチドの
少なくとも一部をコードする」とは、好ましくは、スル
ホトランスフェラーゼ活性を有する、抗原性を有する等
の何らかの活性ないし機能を有する部分、あるいは、そ
の部分に相当する塩基配列がそのグルコサミノグリカン
スルホトランスフェラーゼに特異的であってプライマー
やプローブとして使用できる部分をコードすることを意
味する。

【００４９】なお、本発明には、本発明ＤＮＡに相補的
なＤＮＡまたはＲＮＡが包含される。さらに本発明のＤ
ＮＡは、Ｃ６ＳＴをコードするコード鎖のみの一本鎖で
あってもよいし、この一本鎖及びこれと相補的な配列を
有するＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖とからなる二本鎖であっ
てもよい。

【００５０】また、本発明のＤＮＡは、Ｃ６ＳＴ全体を
コードするコード領域全長を有していてもよいし、Ｃ６
ＳＴの一部のペプチドをコードするものであってもよ
い。本発明のＤＮＡは、その塩基配列が本発明により明
らかにされたので、その配列に基づいて合成し、あるい
はその配列に基づいて作成したオリゴヌクレオチドプラ
イマーを用いるＰＣＲ法（ポリメラーゼ・チェイン・リ
アクション法）によってヒト染色体ＤＮＡあるいはｍＲ
ＮＡから本発明ＤＮＡを増幅することによって、取得す
ることも可能である。なお、本発明ＤＮＡは、後記実施
例に示すように、以下に示す各工程からなるｃＤＮＡク
ローニングによって、初めて得られたものである。

【００５１】（１）ニワトリのＣ６ＳＴのポリペプチド
をコードするｃＤＮＡのクローニング ニワトリ胚軟骨細胞から精製したＣ６ＳＴの部分アミ
ノ酸配列の決定 そのアミノ酸配列に基づいたＰＣＲ用オリゴヌクレオ
チドプライマーの作製 ニワトリ胚の軟骨細胞由来のポリ(A)+RNAからのＣ６
ＳＴ部分ｃＤＮＡのＰＣＲ法による増幅 ニワトリ胚の軟骨細胞由来のｃＤＮＡライブラリーか
らのＣ６ＳＴ完全長ｃＤＮＡの選択

【００５２】（２）ヒト由来のＣ６ＳＴのポリペプチド
をコードするｃＤＮＡのクローニング 上記（１）で単離されたｃＤＮＡの塩基配列解析結
果に基づくヒトｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
用プローブの作製 そのプローブを用いた、ヒト由来のＣ６ＳＴをコード
するｃＤＮＡクローンのスクリーニング 得られたｃＤＮＡの塩基配列解析

【００５３】しかし本発明のＤＮＡの製造方法はこれに
限定されるものではなく、上記のＰＣＲ法や、他の公知
のｃＤＮＡクローニングの手法によっても本発明ＤＮＡ
を製造することができる。

【００５４】以下に、本発明のＤＮＡを得る方法を具体
的に説明する。 （１）ニワトリＣ６ＳＴの部分アミノ酸配列の決定及び
ＰＣＲ用プライマーの調製 ニワトリＣ６ＳＴの精製 コンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼは、ニワ
トリ胚由来の軟骨細胞等、コンドロイチン６−スルホト
ランスフェラーゼを発現する培養細胞から、通常のタン
パク質の精製方法、及び通常のスルホトランスフェラー
ゼの精製方法を組み合わせることによって精製すること
ができる。具体的には、J. Biol. Chem.268,(29),21968
-21974,(1993)に記載された方法に従って行うことが好
ましい。尚、スルホトランスフェラーゼ活性の測定法、
及び硫酸基を転移する位置を調べる方法は、実施例中の
酵素活性測定法に詳述した。

【００５５】ニワトリＣ６ＳＴの部分アミノ酸配列の
決定 精製したＣ６ＳＴには糖鎖が結合していることが知られ
ているので、この糖鎖を除去するために精製Ｃ６ＳＴを
Ｎ−グリカナーゼ等の糖鎖分解酵素で消化する。これに
より脱グリコシル化されたＣ６ＳＴをSDS-PAGE（SDS-ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動）等に付して分離し、ポ
リビニリデンフルオリド(polyvinylidene fluoride; PV
DF)膜やニトロセルロース膜等に転写する。この膜をク
マシー・ブリリアント・ブルーやアミドブラック等のタ
ンパク質を染色する色素で染色し、Ｎ−グリカナーゼ消
化後に形成したタンパク質バンドを切り出して、脱グリ
コシル化されたＣ６ＳＴのアミノ酸配列決定に用いる。
また、Ｃ６ＳＴの内部アミノ酸配列を決定する場合は、
脱グリコシル化されたＣ６ＳＴをSDS-PAGE等に付して分
離し、ゲルをクマシー・ブリリアント・ブルーやアミド
ブラックのようなタンパク質を染色する色素で染色し、
Ｎ−グリカナーゼ消化後に形成したタンパク質バンドを
切り出して断片化に用いる。

【００５６】断片化の方法は特に限定されないが、プロ
テアーゼＶ８(protease V8、sequencing grade, ベーリ
ンガーマンハイム(Boehringer Mannheim)製)等のタンパ
ク質分解酵素を用いることが好ましい。また、切り出し
たゲルをタンパク質分解酵素に接触させ、その後SDS-PA
GE等で分離しても良い。簡便な操作としては、Clevelan
d, D. W., Fischer, S. G., Kirshner, M. W., and Lae
mmli, U. K.(1977) J.Biol. Chem. 252, 1102-1106 の
方法がある。すなわち、タンパク質バンドを切り出して
別のゲルのウェルに挿入し、タンパク質分解酵素を含む
緩衝液を、挿入したゲルにのせてSDS-PAGEを行い、色素
の先端が分離ゲルに入る前に電源を切ることによって泳
動を一時中止し、約30分間酵素消化を行い、その後電気
泳動を再開するという方法である。この方法によれば酵
素消化と消化後のペプチド断片の分離がワンステップで
できるので便利である。プロテアーゼ消化により形成し
たペプチドはPVDF膜やニトロセルロース膜等に転写す
る。この膜をクマシー・ブリリアント・ブルーやアミド
ブラック等のタンパク質を染色する色素で染色した後、
ペプチドバンドを切り出す。タンパク質分解酵素消化後
に生じたペプチドを含むPVDF膜やニトロセルロース膜等
は、公知の方法でペプチドのアミノ末端配列決定を行う
ことができる。

【００５７】オリゴヌクレオチドプライマーの合成 Ｃ６ＳＴの部分的アミノ酸配列が決定されたら、そのア
ミノ酸配列に基づいてＰＣＲ用オリゴヌクレオチドプラ
イマーを作製することができる。アミノ酸配列のうち、
なるべくコドンの縮重の少ない部位を用いるとよい。

【００５８】このようなプライマーの例として、実施例
中の表２に示すような、センスプライマー（プライマー
１ｓ，プライマー２ｓ）およびアンチセンスプライマー
（プライマー３ａ）があげられる。尚、センスプライマ
ー１ｓはHindIII部位を含む配列を、アンチセンスプラ
イマー３ａはEcoRI部位を含む配列を、それぞれ５’末
端に有する。これは、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断
片をベクターに挿入する操作を簡便にするためである。

【００５９】以上のニワトリ胚の軟骨細胞由来のＣ６Ｓ
Ｔの部分的アミノ酸配列の決定とオリゴヌクレオチドプ
ライマーの作成は例えば J. Biol. Chem. 270, 18575-1
8580(1995) に記載されている。

【００６０】（２）Ｃ６ＳＴ部分的ｃＤＮＡの調製 全ＲＮＡの調製 全RNAは、公知の方法(Kingston, R. E., (1991) in Cur
rent Protocols in Molecular Biology, Suppl. 14, Un
it 4.2, Greene Publishing Associates and Wiley Int
erscience, New York 等)で得ることができる。材料
は、コンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼのｍ
ＲＮＡを発現している材料であれば限定されないが、取
扱いの容易さ、および増殖可能な点で培養細胞が好まし
い。培養細胞の中でも特にニワトリ胚の軟骨細胞(chond
rocyte)が好ましい。軟骨細胞は、公知の方法（Kim, J.
J., and Conrad, H. E. (1976) J. Biol. Chem. 251,
6210-6217、Kim, J. J., and Conrad, H. E. (1977) J.
Biol. Chem. 252, 8292-8299、Kim, J. J., and Conra
d, H. E. (1980) J. Biol. Chem. 255, 1586-1597等)で
培養することができる。培地としては、培養細胞が生育
可能な培地であれば特に限定されないが、ダルベッコ改
変イーグル培地等が通常の培養で良く用いられ、入手も
容易であり、なおかつ該培養細胞が生育可能であること
から好ましい。培地のpHは中性域、特にpH7.0に調整す
ることが好ましい。培地には２g/l程度のD-グルコース
を加えることが好ましい。また、微生物の生育を防ぐた
め、ペニシリンやストレプトマイシン等の抗生物質を培
地に添加することが好ましい。また、培地に10％のウシ
胎仔血清を加えることが好ましい。

【００６１】上記のような培地を用い、ローラボトルや
ガラス製あるいはプラスチック製の培養皿を使用して通
常の培養細胞と同様にして培養すれば良い。培養は、炭
酸ガスインキュベーター中で行うことが好ましく、イン
キュベーター中の炭酸ガス濃度が５〜７％、空気が９７
〜９３％となるように調整することが好ましい。また、
温度は３６〜３８℃程度に調整することが好ましい。

【００６２】全ＲＮＡは、前述のように培養した培養細
胞から通常用いられる全ＲＮＡの調製方法により得るこ
とができるが、グアニジンチオシアネート／CsCl法(Kin
gston, R. E., (1991) in Current Protocols in Molec
ular Biology, Suppl. 14, Unit 4.2, Greene Publishi
ng Associates and Wiley Interscience, New York)で
調製するのが好ましい。

【００６３】poly(A)+RNAの調製 poly(A)+RNAは、上記のようにして得られた全RNAから、
オリゴdT（oligo-(dT)）セルロースカラムクロマトグラ
フィーなどによって精製することができる。

【００６４】ＰＣＲ法によるＣ６ＳＴ部分的ｃＤＮＡ
の増幅 上記ポリ(A)+RNAを鋳型とし、オリゴヌクレオチドプラ
イマーを用いた逆転写ＰＣＲ（ポリメラーゼチェインリ
アクション）により、Ｃ６ＳＴ部分的ｃＤＮＡを増幅す
ることができる。ＰＣＲは、通常の方法と同様にして行
えばよいが、具体的方法を示せば以下の通りである。１
μｇのポリ(A)+RNA、50pmolのオリゴヌクレオチド３
ａ、それぞれ500μＭの４種類のデオキシヌクレオシド
三リン酸、200単位のM-MLV逆転写酵素（ギブコＢＲＬ(G
ibco BRL)）、１mM ジチオスレイトール、120単位のＲ
Ｎａｓｅインヒビター(宝酒造(株)製)を含む緩衝液（終
体積20μｌ）を、37℃で60分間インキュベートし、ｃＤ
ＮＡ一次鎖を合成する。次に、上記の逆転写反応混合液
10μｌ、オリゴヌクレオチドプライマー（センス、アン
チセンスそれぞれ50pmol）、それぞれ100μＭの４種類
のデオキシヌクレオシド三リン酸、2.5単位のTaqポリメ
ラーゼを含む反応液（終体積100μｌ）に対し、94℃１
分間、45℃１分間、55℃３分間からなる反応サイクルを
30サイクル行う。

【００６５】このようにして得られた部分的ｃＤＮＡ
は、ｃＤＮＡライブラリーから完全長ｃＤＮＡ（コード
領域全長を含むｃＤＮＡ）をスクリーニングするための
ハイブリダイゼーションプローブとして用いられる。

【００６６】（３）ｃＤＮＡライブラリーの作製 cDNAの合成と組換えＤＮＡの作製 cDNAは、poly(A)+RNAを鋳型とした逆転写酵素反応によ
り合成することができる。市販のcDNA合成用キットを用
いるのが便利である。例えばTimeSaver cDNA synthesis
kit(ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー)を用いる
と、cDNAの合成、およびcDNAをクローニングベクター
（例えばEcoRI消化したλｇｔ１１）に連結させること
ができる。本発明においてもEcoRI消化したλｇｔ１１
を用いることが好ましい。なお、逆転写酵素反応のプラ
イマーとしては、ランダムオリゴヌクレオチドプライマ
ーを用いることが好ましい。cDNAをクローニングベクタ
ーに結合させることによって得られた組換えＤＮＡは、
宿主細菌細胞中に導入（トランスフェクション）する。
用いる宿主細菌細胞は、用いるクローニングベクターに
より選択する必要があるが、通常は大腸菌（エシェリキ
ア・コリ：Escherichia coli(E. coli)）を宿主とする
クローニングベクターと大腸菌との組み合わせが頻用さ
れている。

【００６７】トランスフェクションは、通常、組換えＤ
ＮＡと30mM塩化カルシウムの存在下で細胞膜の透過性を
変化させた大腸菌とを混合することにより行われる。λ
ｇｔ１１のようなλファージベクターの場合、組換えＤ
ＮＡを直接塩化カルシウム処理した大腸菌に導入できる
が、あらかじめ試験管中でファージ外殻に入れて（invi
troパッケージングという）、大腸菌に効率よく感染さ
せる方法が一般に使用されており、そのためのキットも
市販されている（Gigapack II packaging extract、ス
トラタジーン(Stratagene) 製等)。本発明でもこの方法
を用いることが好ましい。in vitroパッケージングした
組換えＤＮＡは、大腸菌にトランスフェクションする
が、用いるクローニングベクターによって用いる大腸菌
株を選択する必要がある。すなわち、抗生物質耐性遺伝
子を含むクローニングベクターを用いる場合は、大腸菌
に抗生物質に耐性の性質があってはいけない。また、β
−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）等の遺伝子を含
むクローニングベクターを用いる場合は、β−ガラクト
シダーゼ活性を発現しない大腸菌を選択する必要があ
る。このことは、組換えＤＮＡがトランスフェクション
された大腸菌をスクリーニングするために必要なことで
ある。例えば、クローニングベクターにλｇｔ１１を用
いる場合、E. coli Y1088等のβ−ガラクトシダーゼ活
性を発現しない大腸菌株を選択すれば良い。組換えベク
ターが導入された大腸菌は、抗生物質に対する耐性の獲
得や、β−ガラクトシダーゼ活性の獲得等によりスクリ
ーニングできる。具体的には、大腸菌を寒天培地にま
き、生育したコロニーを選択すれば良い。生育した大腸
菌（組換えＤＮＡがトランスフェクションされた大腸
菌）は、ｃＤＮＡライブラリーを構成する。ベクターに
λｇｔ１１を用いた場合は、指示菌とともに軟寒天培地
に懸濁し、寒天培地上に重層してプラークを形成させれ
ばよい。ＤＮＡ断片が挿入されたベクターを保持するフ
ァージプラークは、β−ガラクトシダーゼ活性を発現し
ないので、容易に選択することができる。

【００６８】Ｃ６ＳＴ完全長ｃＤＮＡクローニング 次に、上記のようにして得られたｃＤＮＡライブラリー
から、Ｃ６ＳＴ完全長ｃＤＮＡを有するファージクロー
ンを、Ｃ６ＳＴ部分的ｃＤＮＡをプローブとしてハイブ
リダイゼーションにより選択することができる。ハイブ
リダイゼーションは、通常の方法に従って行えばよい。

【００６９】選択された陽性クローンから、ファージＤ
ＮＡを調製し、適当な制限酵素で切断することによっ
て、Ｃ６ＳＴｃＤＮＡを切り出すことができる。得られ
たｃＤＮＡは、そのまま、あるいは適当なプラスミドに
サブクローニングして、塩基配列を決定する。

【００７０】（４）ヒト由来のＣ６ＳＴのポリペプチド
をコードするｃＤＮＡのクローニング ハイブリダイゼーション用プローブの作成 上記のようにして得られたヒト以外の生物由来のＣ６Ｓ
ＴのｃＤＮＡを用いて、ランダムプライマーラベル法に
より［³²Ｐ］ｄＣＴＰで標識した cDNAライブラリース
クリーニングのための放射性プローブを作成できる。す
なわち、上記のニワトリｃＤＮＡを、［α-³²Ｐ］ｄＣ
ＴＰ（アマシャム(Amersham)製）およびＤＮＡランダム
ラベリングキット（宝酒造（株）製）を用いたランダム
オリゴヌクレオチドプライムドラベリング法(random ol
igonucleotide-primed labelingmethod(Feinberg, A.
P., and Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132,
6-13)を用いて放射性標識ＤＮＡプローブを得ることが
できる。

【００７１】ヒト由来ｃＤＮＡライブラリーの作成 ヒト由来の組織あるいは細胞から全ＲＮＡを調製し、該
全ＲＮＡからpoly(A)⁺ＲＮＡを調製し、該poly(A)⁺ＲＮ
Ａを鋳型とした逆転写酵素反応により、ヒト由来ｃＤＮ
Ａは合成することができる。これらは全て、遺伝子工学
分野で通常用いられている方法により行うことができ
る。具体的には、前記（２）及び（３）に記載したのと
同様に行ええばよい。

【００７２】ｃＤＮＡはクローニングベクターに連結す
る。クローニングベクターは特に限定されないが、例え
ばEcoRI消化したλｇｔ１１を用いることが好ましい。
なお、市販されているクローニングベクターに連結され
たヒトｃＤＮＡを用いてもよい。具体的には、ラムダベ
クターλｇｔ１１が組み込まれたヒト胎児脳ｃＤＮＡラ
イブラリー（Clontech）が好ましい。

【００７３】ヒト由来のＣ６ＳＴをコードするｃＤＮ
Ａクローンのスクリーニング 上記のようにして得られたヒト由来ｃＤＮＡライブラリ
ーから、Ｃ６ＳＴ完全長ｃＤＮＡを有するファージクロ
ーンを上記で作成した［³²Ｐ］ｄＣＴＰで標識した放
射性プローブを用いたハイブリダイゼーションにより選
択することができる。ハイブリダイゼーションは遺伝子
工学分野で通常用いられる手法、例えばプラークハイブ
リダイゼーション等により行うことができる。プローブ
とハイブリッドを形成したプラークは、プローブに結合
した標識物質を検出することにより、陽性クローンとし
て単離することができる。

【００７４】ｃＤＮＡの塩基配列解析 選択された陽性クローンから、ファージＤＮＡを調製
し、適当な制限酵素で切断することによって、Ｃ６ＳＴ
ｃＤＮＡを切り出すことができる。得られたｃＤＮＡ
は、そのまま、あるいは適当なプラスミドにサブクロー
ニングして、塩基配列を決定することができる。

【００７５】上記のようにして決定されたヒト由来Ｃ６
ＳＴをコードするｃＤＮＡの塩基配列のオープンリーデ
ィングフレーム部分を配列番号１に、アミノ酸配列を配
列番号２に示す。最初のATGコドンで始まる単一のオー
プンリーディングフレームからは、479アミノ酸残基か
らなり、分子量 54,610 のタンパク質が予想される。

【００７６】上記のようにして得られるＤＮＡは、この
ＤＮＡによってコードされるＣ６ＳＴが、硫酸基供与体
から硫酸基をグリコサミノグリカンのＮ−アセチルガラ
クトサミン残基の６位に転移する活性を実質的に害され
ない限り、１つ又は２以上のアミノ酸残基の置換、欠失
又は挿入を起こすようなヌクレオチドの置換、欠失又は
挿入を有していてもよい。ＤＮＡ配列へのヌクレオチド
の置換、欠失又は挿入は、両末端に制限酵素切断末端を
持ち、変異点の両側を含む配列を合成し、未変異ＤＮＡ
配列の相当する部分と入れ換える事により、導入するこ
とができる。また、部位特異的変異法（Kramer,W. and
Frits,H.J.,Meth. in Enzymol.,154,350(1987); Kunke
l,T.A. et.al.,Meth. in Enzymol.,154,367(1987)）な
どの方法によっても、ＤＮＡ配列に置換、挿入又は欠失
を導入することができる。硫酸基供与体から硫酸基をグ
リコサミノグリカンのＮ−アセチルガラクトサミン残基
及び／またはガラクトース残基に転移する活性は、例え
ば、前記の酵素活性測定法によって測定することがで
き、当業者は活性を実質的に害さない１つ以上のアミノ
酸残基の置換、欠失または挿入を容易に識別することが
できる。

【００７７】

【実施例】次に、実施例により本発明をさらに具体的に
説明するが、この実施例は本発明の一例を示すものであ
り、これに限定されるものではない。はじめに、実施例
中で共通して用いる方法に関して説明する。なお、特記
しない限り「％」は重量％である。

【００７８】１．酵素活性測定法 スルホトランスフェラーゼ活性は次のようにして測定し
た。反応液組成は以下の通りとした。2.5μmolのイミダ
ゾール−塩酸，pH6.8，1.25μgのプロタミン塩酸、0.1
μmolのジチオスライトール、25nmol（グルクロン酸の
量として）のコンドロイチン（生化学工業（株））、50
pmolの[³⁵S]PAPS（アデノシン３’-リン酸，５’-ホス
ホ硫酸）、及び酵素を含む50μl。

【００７９】基質としての種々のグリコサミノグリカン
に対する活性は、コンドロイチンの代わりに、25nmol
（コンドロイチン硫酸及びデルマタン硫酸についてはガ
ラクトサミンの量として、ヘパラン硫酸及びケラタン硫
酸についてはグルコサミンの量として）のグリコサミノ
グリカンを用いて測定した。

【００８０】反応液を３７℃で２０分インキュベートし
た後、反応チューブを沸騰水に１分浸けることによって
反応を停止させた。反応停止後、0.1μmol（グルクロン
酸の量として）のコンドロイチン硫酸Ａをキャリアとし
て加え、1.3%酢酸カリウムを含むエタノールを３体積加
えて、³⁵S-標識された多糖類を沈澱させた。混合液を1
0,000×gで10分遠心し、得られた沈澱を70μlの水に溶
解させた。この溶液50μlを0.1M NH₄HCO₃で平衡化した
脱塩カラムに注入し、³⁵S-標識された多糖類を含む溶出
分画を集めた。得られた分画の200μlにシンチレーショ
ンカクテル（クリアゾル(Clearsol)、ナカライテスク社
製）１mlを加え、³⁵S放射活性を測定することにより、
多糖類への³⁵Sの取り込みを測定した。

【００８１】残りの溶液から400μl取り、1.3%酢酸カリ
ウムを含むエタノール800μlを加えて混合した。混合液
を30分氷上に置いた後、10,000×gで10分遠心して³⁵S-
多糖類を沈澱させた。沈澱を0.1mg/mlのBSA、0.05Mトリ
ス−酢酸，pH7.5、10ミリユニットのコンドロイチナー
ゼACII（アースロバクター・アウレッセンス(Arthrobac
ter aurescens)由来、生化学工業(株)）を含む緩衝液25
μlに溶解し、37℃で２時間反応させた。反応物を、0.1
μmolづつの2-アセトアミド-2-デオキシ-3-O-(β-D-グ
ルコ-4-エンピラノシルロン酸)-6-O-スルホ-D-ガラクト
ース（△Di-6S）、及び2-アセトアミド-2-デオキシ-3-O
-(β-D-グルコ-4-エンピラノシルロン酸)-4-O-スルホ-D
-ガラクトース（△Di-4S）（いずれも生化学工業(株)
製）とともに、ワットマン(Whatman)No.1濾紙にスポッ
トし、1-ブタノール／酢酸／1M 水酸化アンモニウム
（2:3:1(V/V/V)）で20時間展開した。

【００８２】△Di-6S及び△Di-4Sの位置を紫外線ランプ
で調べ、それぞれの部位を濾紙から切り出し、１Ｌのト
ルエンにジフェニルオキサゾール5g、ジメチル１，４−
ビス(2-(5-フェニルオキサゾール))ベンゼン0.25gを溶
解させたシンチレーターに入れ、放射活性を測定した。
コンドロイチナーゼACIIで消化した試料では、濾紙の原
点に残った放射活性はスポットした放射活性の1%以下で
あった。△Di-6S及び△Di-4Sへの³⁵Sの取り込みから、
それぞれコンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼ
活性及びコンドロイチン４−トランスフェラーゼ活性を
算出した。1pmol硫酸基／分の転移を触媒する活性を１
ユニットとした。

【００８３】様々な基質に対してスルホトランスフェラ
ーゼ活性を測定したところ、以下の実施例の＜１＞で得
られたコンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼ
（Ｃ６ＳＴ）は、コンドロイチン、ニワトリ胚軟骨由来
のコンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンド
ロイチン硫酸Ｃ、角膜由来のケラタン硫酸には硫酸基を
転移するが、コンドロイチン硫酸Ｅ、デルマタン硫酸、
ヘパラン硫酸には硫酸基をわずかにしか転移しないこと
が示された。なお、本Ｃ６ＳＴは、コンドロイチン、コ
ンドロイチン硫酸には、そのＮ−アセチルガラクトサミ
ン残基の６位に硫酸基を転位し、ケラタン硫酸の場合
は、そのガラクトース残基の６位に硫酸基を転移するこ
とが本発明者らにより確認されている。

【００８４】次に、本発明ＤＮＡの製造例を説明する。 ＜１＞ニワトリ胚由来のコンドロイチン６−スルホトラ
ンスフェラーゼの調製およびアミノ酸配列分析 （１）コンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼの
調製 ニワトリ胚の軟骨細胞を、培養皿に5.6×10⁴ 個細胞／
皿となるように接種し、２ｇ／ＬのＤ−グルコース、１
００ユニット／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのス
トレプトマイシン、10％ウシ胎仔血清（FBS）を含むｐ
Ｈ７．０に調整したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)
中で、７ vol％CO₂、93 vol％空気、38℃の条件下で11
日間培養した。培養開始から２、４、７、９、１０日目
に、pH7.4の新鮮な培地に交換した。

【００８５】１０日目に、FBSを60℃で60分加熱して調
製した熱不活化血清を10%含む培地を用いた。１１日目
には5.0×10⁶ 個細胞／皿にまで生育した。それ以後
は、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸ナトリウムを添加
したコスメディウム(Cosmedium)−００１（コスモバイ
オ社から購入）を用い、毎日培地を交換しながら１０日
間培養を続けた。

【００８６】使用したコスメディウム培地を集め、10,0
00×gで10分遠心し、上清の組成が10mM Tris-HCl,pH7.
2、0.1％ Triton X-100、20mM MgCl₂、10mM 2-メルカプ
トエタノール、20％グリセロールとなるように調製し
た。

【００８７】上記培養上清を、0.15M NaClを含む緩衝液
Ａ(10mM Tris-HCl,pH7.2、0.1％ Triton X-100、20mM M
gCl2、2mM CaCl2、10mM 2-メルカプトエタノール、20％
グリセロール)で平衡化したヘパリン−セファロースＣ
Ｌ６Ｂカラム（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー
社製、2.2×28cm）にアプライした。カラムを0.15M NaC
lを含む緩衝液Ａで洗浄した後、0.15〜0.75MのＮａＣｌ
を含む緩衝液Ａの直線グラジエント１Ｌで溶出し、12ml
／フラクションで分画した。

【００８８】スルホトランスフェラーゼ活性を有する分
画を集め、0.15MのNaClを含む緩衝液Ａで平衡化したコ
ムギ胚芽アグルチニン−アガロースカラム（生化学工業
（株）製、1.2×15cm）にアプライした。カラムを0.15M
のNaClを含む緩衝液Ａ200mlで洗浄した後、0.15MのNaCl
及び0.3MのＮ−アセチルグルコサミンを含む緩衝液Ａ20
0mlで溶出した。溶出分画を集め、0.05MのNaClを含む緩
衝液Ａに対して透析した。

【００８９】上記溶出分画を、0.05MのNaClを含む緩衝
液Ａで平衡化した3',5'-ADP-アガロースカラム（シグマ
社製、1.2×11.8cm、1.9μmol 3',5'-ADP／mlゲル）に
アプライした。カラムを0.05MのNaClを含む緩衝液Ａ150
mlで洗浄した後、０〜0.2mMの3',5'-ADPを含む0.05M Na
Clを含む緩衝液Ａの直線グラジエント300mlで溶出し
た。スルホトランスフェラーゼ活性を有する分画を集
め、1M NaClを含む緩衝液Ａ、続いて0.05M NaClを含む
緩衝液Ａに対して透析した。

【００９０】上記精製工程において、前記酵素活性測定
法に記載した方法で、スルホトランスフェラーゼ活性を
測定した。その結果、コンドロイチン６−スルホトラン
スフェラーゼの比活性は4.3×10⁵ユニット／mgであり、
コンドロイチン４−スルホトランスフェラーゼ活性／コ
ンドロイチン６−トランスフェラーゼ活性の比は0.02で
あった。

【００９１】上記のようにして精製されたＣ６ＳＴは、
還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドを形成
し、分子量は75,000と決定された。また、スーパロース
12 HR10/30ゲル濾過クロマトグラフィー（溶出液：10mM
Tris-HCl,pH7.2、2M NaCl、20mM MgCl₂、2mM CaCl₂、
0.1% Triton X-100、20％グリセロール）で測定したと
ころ、160,000であった。このことから、2M NaCl存在下
ではダイマーを形成していることが示唆された。

【００９２】また、本Ｃ６ＳＴは、プロタミンおよびMn
Cl₂により活性化された。上記測定系におけるＣ６ＳＴ
の至適反応ｐＨはおよそ6.4であった。

【００９３】（２）ニワトリ胚由来Ｃ６ＳＴのアミノ酸
配列分析 精製したＣ６ＳＴをＮ−グリカナーゼで消化した。すな
わち、１ｍｌ（タンパク質として１０μｇ）のＣ６ＳＴ
溶液に２００μｌのトリクロロ酢酸を加え、氷上に３０
分置いた後、１０，０００×ｇで２０分遠心分離した。
沈澱を１ｍｌのアセトンで２回洗浄し、真空デシケータ
で乾燥した。乾燥されたＣ６ＳＴタンパク質を０．５％
ＳＤＳを含む０．１５Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ７．８）
１０μｌに溶解し、１００℃で３分加熱した後、冷却
し、５μｌの７．５％（ｗ／ｖ）ノニデットＰ−４０，
１．２μｌの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８），０．３
μｌのフェニルメタンスルホフォニルフルオライド，１
０．５μｌの水，及び３μｌ（０．７５単位）のリコン
ビナントＮ−グリカナーゼ（ジェンザイム(Genzyme)社
製）を加えた。混合液を３７℃で１２時間インキュベー
トし、脱グリコシル化反応を行った。

【００９４】アミノ酸配列分析のためには、SDS-PAGE
後、ゲルを染色せずにポリビニリデンフルオリド(polyv
inylidene fluoride; PVDF)膜に転写した。この膜をク
マシーブルーで染色した。Ｎ−グリカナーゼ消化後のタ
ンパク質のバンド（49および47kDa）および未消化のタ
ンパク質のバンド（75kDa）を膜から切り出して、アミ
ノ酸配列決定に用いた。

【００９５】一方、Ｃ６ＳＴの内部アミノ酸配列を決定
するため、プロテアーゼで部分消化したＣ６ＳＴペプチ
ドの調製を行った。これは、クリーブランドらの方法
（Cleveland, D. W., Fischer, S. G., Kirshner, M.
W., and Laemmli, U. K.(1977)J. Biol. Chem. 252, 11
02-1106）に従って行った。すなわち、精製したタンパ
ク質（30μｇ）を10％ゲルによるSDS-PAGEで分離した。
ゲルをクマシーブルーで染色した後、75kDaのタンパク
質バンドを切り出して、別の16％ゲルのウェルに挿入し
た。このウェルに、プロテアーゼＶ８(protease V8、se
quencing grade,ベーリンガーマンハイム製)を0.05μｇ
／μｇ精製タンパク質の比で含む緩衝液を重層し、SDS-
PAGEを開始した。色素の先端が分離ゲルの端に到達した
時に電源を切った。30分後、電気泳動を再開した。プロ
テアーゼ消化により形成したペプチドは、PVDF膜にトラ
ンスブロットした。この膜をクマシーブルーで染色した
後、19kDaのペプチドバンドを切り出した。

【００９６】上記のようにして調製した、Ｎ−グリカナ
ーゼ消化後に生じたタンパク質、完全なタンパク質、プ
ロテアーゼＶ８消化後に生じたペプチドをPVDFフィルタ
ーに固定化し、アミノ末端のアミノ酸配列を決定した。
結果を表１に示す。

【００９７】

【表１】 表１ ─────────────────────────────── 49-kDaタンパク質 LVIXXXXNNFIXXV 配列番号３ 47-kDaタンパク質 XVIXEXXNNFIXXV 配列番号４ 完全なタンパク質 LVIXEKENNFISRVSDKLKXXPXV 配列番号５ 19-kDaペプチド SFISPAPEEXLTA 配列番号６ ───────────────────────────────

【００９８】＜２＞ニワトリ胚由来のＣ６ＳＴ部分ｃＤ
ＮＡのＰＣＲによる増幅 （１）ＰＣＲ用プライマーの作製 上記のようにして決定されたアミノ酸配列に基づいて、
ｃＤＮＡライブラリーからＣ６ＳＴｃＤＮＡクローンを
ＰＣＲにより増幅するためのオリゴヌクレオチドプライ
マーを作製した（表２）。２種類のセンスプライマー
（プライマー１ｓ及び２ｓ）は完全なニワトリ胚Ｃ６Ｓ
Ｔタンパク質（75kDa）から得られたアミノ配列（配列
番号５）に基づいてデザインし、アンチセンスプライマ
ー（プライマー3a）はプロテアーゼ消化で得られたペプ
チド（19kDa）から得られたアミノ酸配列（配列番号
６）に基づいてデザインし、各ヌクレオトドプライマー
を合成した。

【００９９】

【表２】 表２ ───────────────────────────────── プライマー１ｓ CAAAGCTTGA RAARGARAAY AAYTTYAT 配列番号７ プライマー２ｓ MGKGTKWSKG AYAARCTNAA 配列番号８ プライマー３ａ AARTADWSKG GKCGKGGKCT TCTTAAGCT 配列番号９ ─────────────────────────────────

【０１００】なお、プライマー１ｓの５’末端にはHind
III認識配列を含むヌクレオチド配列を、プライマー３
ａの５’末端にはEcoRI認識配列を含むヌクレオチド配
列を導入した。

【０１０１】（２）ポリ(A)+RNAの調製 全RNAは、公知の方法(Kim, J. J., and Conrad, H. E.
(1976) J. Biol. Chem. 251, 6210-6217、Kim, J. J.,
and Conrad, H. E. (1977) J.Biol. Chem. 252, 8292-8
299、Kim, J. J., and Conrad, H. E. (1980) J. Biol.
Chem. 255, 1586-1597)で10％ウシ胎仔血清を含むダル
ベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で11日間培養したニワ
トリ胚の軟骨細胞(chondrocyte)から、グアニジンチオ
シアネート／CsCl法(Kingston, R. E., (1991) in Curr
ent Protocols in Molecular Biology, Suppl. 14, Uni
t 4.2, Greene Publishing Associates and Wiley Inte
rscience, New York)により調製した。得られた全RNAか
らポリ(A)+RNAを、オリゴ(dT)セルロースカラムクロマ
トグラフィーにより精製した。

【０１０２】（３）ＰＣＲ反応 上記ポリ(A)+RNAを鋳型とし、オリゴヌクレオチド３ａ
をプライマーとして用いた逆転写反応によりｃＤＮＡ一
次鎖を合成した。逆転写反応は、終体積20μｌに１μｇ
のポリ(A)+RNA、50pmolのオリゴヌクレオチド３ａ、そ
れぞれ500μＭの４種類のデオキシヌクレオシド三リン
酸、200単位のM-MLV逆転写酵素(ギブコBRL(Gibco BRL)
製)、１mM ジチオスレイトール、120単位のRNase イン
ヒビター(宝酒造(株)製)を含む緩衝液を、37℃で60分間
インキュベートすることにより行った。

【０１０３】ＰＣＲ反応は、上記の逆転写反応混合液10
μｌ、オリゴヌクレオチド１ｓ及び３ａをそれぞれ50pm
ol、それぞれ100μＭの４種類のデオキシヌクレオシド
三リン酸、2.5単位のTaqポリメラーゼ（AmpliTaq polym
erase、パーキン−エルマー(Perkin-Elmer)製)を含む反
応液（終体積100μｌ）中で行った。増幅反応は、94℃
１分間、45℃１分間、55℃３分間からなる反応サイクル
を30サイクル行った。

【０１０４】＜３＞ニワトリ胚由来Ｃ６ＳＴの完全長ｃ
ＤＮＡの取得 （１）ハイブリダイゼーション用プローブの作製 上記ＰＣＲ増幅断片を回収し、HindIIIおよびEcoRIで消
化し、プラスミドベクターであるブルースクリプト(Blu
escript、ストラタジーン(Stratagene)製)のこれらの制
限酵素切断部位にサブクローニングした。サブクローン
はＴ３プライマー(T3 primer)もしくはM13-20プライマ
ーを用いた配列決定により確認した。

【０１０５】cDNAライブラリースクリーニングのための
放射性プローブは、上記のＰＣＲ生成物を、［α-³²P］
dCTP（アマシャム(Amersham)製）およびDNAランダムラ
ベリングキット（宝酒造（株）製）を用いたランダムオ
リゴヌクレオチドプライムドラベリング法(random olig
onucleotide-primed labeling method(Feinberg, A.P.,
and Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132, 6-1
3)を用いて放射性標識することによって得た。

【０１０６】（２）ｃＤＮＡライブラリーの構築 次に、Ｃ６ＳＴのコード領域全長を含むｃＤＮＡを得る
ために、ラムダベクターλｇｔ１１を用いてｃＤＮＡク
ローニングを行った。

【０１０７】前記＜２＞（２）と同様にして、ニワトリ
胚の軟骨細胞(chondrocyte)からポリ(A)+RNAを調製し、
これを鋳型として二本鎖ｃＤＮＡを合成し、EcoRI消化
したλｇｔ１１(EcoRI-digested λｇｔ１１、ファルマ
シア(Pharmacia)社製)に連結した。ｃＤＮＡの合成とベ
クターへの連結には、ｃＤＮＡ合成キット（TimeSaver
cDNA synthesis kit、ファルマシア社製)を使用した。
逆転写反応のプライマーには、ランダムオリゴヌクレオ
チドプライマーを用いた。

【０１０８】ｃＤＮＡが挿入された組換えファージベク
ターは、インビトロパッケージングキット（Gigapack I
I packaging extract、ストラタジーン製）を用いてフ
ァージ粒子にパッケージした。このファージ粒子を、Es
cherichia coli Y1088に感染させ、プレートに重層し、
プラークを形成させた。こうして得られたファージライ
ブラリーはさらに増幅させることなしに、cDNAスクリー
ニングに用いた。

【０１０９】（３）Ｃ６ＳＴｃＤＮＡクローンのスクリ
ーニング 上記のようにして得られたλｇｔ１１cDNAライブラリー
のプラーク約５×１０ ⁵ 個について、スクリーニングを
行った。プラークを市販のナイロン膜(HybondN⁺ nylon
membrane、アマシャム社製)に転写し、製品に添付され
ている説明書中で推奨されているアルカリ固定法により
ファージＤＮＡをナイロン膜に固定した。

【０１１０】ファージＤＮＡを固定した膜を、50％ホル
ムアミド、５×SSPE（１×SSPEの組成：10mM NaH2PO4(p
H7.4), 150mM NaCl, 1mM EDTA）、５×Denhardt's solu
tion（１×Denhardt's solutionの組成：0.02%フィコー
ル４００、0.02%ポリビニルピロリドン、0.02% BSA）、
0.5％ SDS、0.04mg／mlの変性サケ精子DNA、0.004mg／m
lの E. coli DNAを含む溶液中で、3.5時間、42℃でプレ
ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションは、32Ｐ
標識したプローブを含む上記と同じ緩衝液中で16時間、
42℃で行った。続いて、フィルターを１×SSPE、0.1％
SDS中、次いで0.1×SSPE、0.1％ SDS中で、55℃で洗浄
した後、オートラジオグラフィーによりハイブリダイゼ
ーション陽性クローンを検出した。５×10⁵個のプラー
クから約90個の陽性クローンが得られた。

【０１１１】（４）ニワトリ胚由来Ｃ６ＳＴｃＤＮＡの
塩基配列解析 ハイブリダイゼーション陽性λｇｔ１１クローンから16
個の独立クローンを選択し、各々ファージＤＮＡを調製
し、ベクターＤＮＡからcDNA挿入断片を単一断片で切り
出すEcoRIで切断した。これらのｃＤＮＡ断片をブルー
スクリプトにサブクローニングした。これらのｃＤＮＡ
断片のうち、もっとも長い断片(2.3kb)のヌクレオチド
配列を決定した。

【０１１２】ブルースクリプトにｃＤＮＡをサブクロー
ニングした組換えプラスミドから、欠失クローンをDNA
deletion kit（宝酒造（株）製）を用いて既知の方法(H
enikoff, S.(1984) Gene 28, 351-359、Yanisch-Perro
n, C., Viera, J., and Messing, J. (1985) Gene 33,
103-109)により調製した。その際、3'-突出末端を残す
制限酵素、及び5'-突出末端を残す制限酵素として、そ
れぞれSacI及びXbaIを用いた。

【０１１３】得られた欠失クローンを用いて、［α-³²
Ｐ］dCTP及びＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（Sequenase、U.
S.バイオケミカル(U.S. Biochemical)製)を用いたジデ
オキシチェーンターミネーション法(Sanger, F., Nickl
ens, S., and Coulson, A. R.(1977) Proc. Natl. Aca
d. Sci. U.S.A. 74, 5463-5467)により、両方の鎖のヌ
クレオチド配列を独立に決定した。

【０１１４】＜４＞ヒト由来Ｃ６ＳＴｃＤＮＡのクロー
ニング （１）ハイブリダイゼーション用プローブの作製 前記＜３＞（４）で得られた、ニワトリ胚由来ＣＳ６Ｔ
のｃＤＮＡをランダムプライマーラベル法により
［³²Ｐ］ｄＣＴＰで標識した cDNAライブラリースクリ
ーニングのための放射性プローブを作成した。すなわ
ち、上記のニワトリｃＤＮＡを、［α-³²Ｐ］ｄＣＴＰ
（アマシャム(Amersham)製）およびＤＮＡランダムラベ
リングキット（宝酒造（株）製）を用いたランダムオリ
ゴヌクレオチドプライムドラベリング法(random oligon
ucleotide-primed labeling method(Feinberg, A.P., a
nd Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132, 6-13)
を用いて放射性標識することによって得た。

【０１１５】（２）ヒト由来ｃＤＮＡライブラリー ヒトＣ６ＳＴのコード領域全長を含むｃＤＮＡを得るた
めに、ラムダベクターλｇｔ１１が組み込まれたヒト胎
児脳ｃＤＮＡライブラリー（Clontech）を用いた。

【０１１６】ｃＤＮＡが挿入された組換えファージベク
ターは、インビトロパッケージングキット（Gigapack I
I packaging extract、ストラタジーン製）を用いてフ
ァージ粒子にパッケージした。このファージ粒子を、Es
cherichia coli Y1088に感染させ、プレートに重層し、
プラークを形成させた。こうして得られたファージライ
ブラリーはさらに増幅させることなしに、cDNAスクリー
ニングに用いた。

【０１１７】（３）Ｃ６ＳＴｃＤＮＡクローンのスクリ
ーニング ｃＤＮＡクローニングは前記＜３＞（３）と同様にし
て、λｇｔ１１cDNAライブラリーのプラークから行っ
た。すなわち、プラークを市販のナイロン膜(Hybond N⁺
nylon membrane、アマシャム社製)に転写し、アルカリ
固定法によりファージＤＮＡをナイロン膜に固定した。

【０１１８】ファージＤＮＡを固定した膜を、50％ホル
ムアミド、５×SSPE、５×Denhardt's solution、0.5％
SDS、0.04mg／mlの変性サケ精子DNA、0.004mg／mlの
E. coli DNAを含む溶液中で、3.5時間、42℃でプレハイ
ブリダイズした。ハイブリダイゼーションは、³²Ｐ標識
したプローブを含む上記と同じ緩衝液中で16時間、42℃
で行った。続いて、フィルターを１×SSPE、0.1％ SDS
中、次いで0.1×SSPE、0.1％ SDS中で、55℃で洗浄した
後、オートラジオグラフィーによりハイブリダイゼーシ
ョン陽性クローンを検出した。

【０１１９】（４）Ｃ６ＳＴｃＤＮＡの塩基配列解析 上記により得られた陽性λｇｔ１１クローンから独立ク
ローンを選択し、各々ファージＤＮＡを調製し、ベクタ
ーＤＮＡからcDNA挿入断片を単一断片で切り出すEcoRI
で切断した。これらのｃＤＮＡ断片をブルースクリプト
にサブクローニングした。

【０１２０】ブルースクリプトにｃＤＮＡをサブクロー
ニングした組換えプラスミドから、欠失クローンをDNA
deletion kit（宝酒造（株）製）を用いて既知の方法(H
enikoff, S.(1984) Gene 28, 351-359、Yanisch-Perro
n, C., Viera, J., and Messing, J. (1985) Gene 33,
103-109)により調製した。

【０１２１】得られた欠失クローンを用いて、［α-³²
Ｐ］ｄＣＴＰ及びＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（Sequenas
e、U.S.バイオケミカル(U.S. Biochemical)製）を用い
たジデオキシチェーンターミネーション法(Sanger, F.,
Nicklens, S., and Coulson,A. R. (1977) Proc. Nat
l. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463-5467)により、両方の
鎖のヌクレオチド配列を独立に決定した。こうして決定
されたヒトＣ６ＳＴ ｃＤＮＡのオープンリーディング
フレーム(open reading frame)に相当するヌクレオチド
配列を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に示し
た。

【０１２２】決定されたDNA配列について、ジーンワー
クス コンピュータープログラム(Gene Works computer
programs、インテリジェネティクス(IntelliGenetics)
製)を用いて解析した。Ｃ６ＳＴｃＤＮＡのオープンリ
ーディングフレームの５’末端部には、２つのイン・フ
レームのATGコドンが含まれている。最初のATGコドンで
始まる単一のオープンリーディングフレーム(open read
ing frame)からは、479アミノ酸残基からなり、分子量
54,610 のタンパク質が予測される。前記ニワトリＣ６
ＳＴとのアミノ酸配列の相同性は７４％であった。特に
本発明で得られたヒトＣ６ＳＴにはニワトリ由来のＣ６
ＳＴにはみられなかった親水性に富む１７アミノ酸より
なる特異な挿入配列が存在していた（配列番号２のアミ
ノ酸番号114〜130 のアミノ酸配列）。

【０１２３】（５）ヒト由来Ｃ６ＳＴ発現プラスミドの
構築 ヒトＣ６ＳＴｃＤＮＡを発現させるために、発現ベクタ
ーにｃＤＮＡ断片を挿入し、組換えプラスミドを構築し
た。発現ベクターには、哺乳類細胞用発現ベクターｐＣ
ＸＮ２（東京大学の宮崎純一博士により構築され(Niwa,
H., Yamamura,K., and Miyazaki, J. (1991) Gene 10
8, 193-200)、東京都臨床医学総合研究所の橋本康弘博
士より恵与された）を用いた。ｐＣＸＮ２は、ストレプ
トマイシン耐性遺伝子及びペニシリン耐性遺伝子を有
し、EcoRI部位に挿入されたＤＮＡ断片をβ−アクチン
遺伝子プロモーターにより発現させることができるベク
ターである。ｐＣＸＮ２のEcoRI部位へ2354bpのcDNA断
片（配列番号１に示す塩基配列を含む）を連結させた。
E. coli JM109を、この連結反応液を用いて形質転換
し、アンピシリンを含むLB プレートに塗布した。形質
転換体から組換えプラスミドを回収し、３回のCsCl／エ
チジウムブロマイド平衡遠心により精製した。ベクター
のプロモーターの向きとｃＤＮＡの向きが一致している
組換えプラスミドをｐＣＸＮｈＣ６ＳＴ、ｃＤＮＡが逆
向きに挿入されている組換えプラスミドをｐＣＸＮｈＣ
６ＳＴ２と名付けた。ｃＤＮＡの向きは、BamHIを用い
た制限マッピングにより解析した。

【０１２４】（６）ＣＯＳ−７細胞中でのヒトＣ６ＳＴ
ｃＤＮＡの一過性な発現 ヒトＣ６ＳＴｃＤＮＡの発現の宿主にはＣＯＳ−７細胞
を用いた。ＣＯＳ−７細胞（理研細胞バンク(筑波)から
入手した）を８×１０⁵ 細胞／皿の密度で直径100 mmの
培養皿にまいた。培養液には、ペニシリン(100単位／m
l)、ストレプトマイシン(50μｇ／ml)及び10％ウシ胎仔
血清(ギブコBRL製）を含むダルベッコ改変イーグル培地
(DMEM)を培養皿１枚当たり10ml用い、５vol％ＣＯ₂、95
vol％空気中で37℃で培養した。

【０１２５】培養48時間後、ＣＯＳ−７細胞をｐＣＸＮ
ｈＣ６ＳＴもしくはｐＣＸＮｈＣ６ＳＴ２でトランスフ
ェクトした。トランスフェクションは、DEAE-デキスト
ラン法(Aruffo, A.(1991) in Current Protocols in Mo
lecular Biology, Suppl. 14, Unit 16.13, Greene Pub
lishing Associates and Wiley Interscience, New Yor
k)により行った。10％のNu serum（低タンパク質濃度の
血清代用品：コラボレーティブ・バイオメディカル・プ
ロダクツ(Collaborative Biomedical Products)）を含
む予め加温しておいた５mlのDMEMを、10mg／ml DEAE-デ
キストランと2.5mMクロロキン(chloroquine)溶液を含む
0.2ml のＰＢＳ(リン酸緩衝生理食塩水）と混合した。
この溶液と15μｇの組換えプラスミドを混合し、その混
合液を細胞懸濁液に添加した。上記細胞を、ＣＯ₂イン
キュベーター中で４時間インキュベートした後、培養液
を５mlの10％ジメチルスルホキシドを含むＰＢＳ溶液で
置換した。この細胞を室温で２分間放置した後、ジメチ
ルスルホキシド溶液をアスピレートにより除去し、ペニ
シリン(100単位／ml)、ストレプトマイシン(50μｇ／m
l)及び10％ウシ胎仔血清を含む25mlのDMEMを加えた。こ
の細胞を67時間インキュベートした後、DMEMのみで洗浄
した。細胞を集めて、培養皿１枚分の細胞当たり1.5ml
の0.25Mスクロース、10mM Tris-HCl,pH7.2、及び0.5％
Triton X-100中でダウンスホモジナイザー(Dounce homo
genizer)によりホモジナイズした。得られたホモジネー
トを10,000×ｇで20分間遠心し、上清分画中のＣ６ＳＴ
活性、コンドロイチン４−スルホトランスフェラーゼ
（Ｃ４ＳＴ）活性及びケラタン硫酸スルホトランスフェ
ラーゼ（ＫＳＳＴ）活性を測定した。これらの活性は、
硫酸基受容体としてのコンドロイチンまたはケラタン硫
酸の存在下または非存在下で測定した。また、発現プラ
スミドでトランスフェクトしてないＣＯＳ−７細胞につ
いても同様に行った。結果を表３に示す。

【０１２６】

【表３】 表３ ────────────────────────────────── プラスミド Ｃ６ＳＴ活性 Ｃ４ＳＴ活性 ＫＳＳＴ活性 ────────────────────────────────── (pmol/分/mgタンハ゜ク) なし 6.4 ± 2.5 0.8 ± 0.2 2.0 ± 0.3 pCXNhC6ST2 5.7 ± 1.2 0.9 ± 0.2 1.5 ± 0.2 pCXNhC6ST 102.4 ± 3.5 4.7 ± 1.0 30.5 ± 2.1 ──────────────────────────────────

【０１２７】表３に示したように、上記で単離されたｃ
ＤＮＡを正しい方向で発現させる発現ベクターを保持す
る細胞のＣ６ＳＴ活性及びＫＳＳＴ活性は、ｃＤＮＡが
逆向きに挿入された発現ベクターを保持する細胞のそれ
ぞれ約16倍、約20倍であった。これに対して、トランス
フェクション細胞のＣ４ＳＴ活性はわずかに増加しただ
けであった。これらの結果から、単離されたｃＤＮＡが
Ｃ６ＳＴ活性およびＫＳＳＴ活性を持つタンパク質をコ
ードしていることが証明された。

【０１２８】

【発明の効果】本発明により、ヒト由来のコンドロイチ
ンのN-アセチルガラクトサミン残基の６位に硫酸基を転
移するコンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼ
（Ｃ６ＳＴ）をコードするＤＮＡ、および該ＤＮＡ由来
のＤＮＡ断片から発現されるポリペプチドが得られる。

【０１２９】本発明により、ヒト由来のＣ６ＳＴをコー
ドするＤＮＡが得られたので、ヒト由来Ｃ６ＳＴを工業
的に使用可能な程度まで大量生産できることが期待され
る。このヒト由来Ｃ６ＳＴのＤＮＡ及びＣ６ＳＴ酵素蛋
白を用いた医薬用途への利用が期待される。

【０１３０】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：2156 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 起源 生物名：ヒト 組織の種類：胎児脳 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：147..1583 特徴を決定した方法：S 配列 GCGGAGGGTC GGGGCCGCCG GTGGAGTCTC GGCGGCCGGG GACAAGGGTG TCCCCCACCT 60 GAAGACGGCA AGCTGGGTCC TGAGTGATGC CCCTCAGCTG AGTGTCCAAG GCTGGCCCGA 120 GGAGCCCCAC GGCCCCACCT TTCCCC ATG GAG AAA GGA CTC ACT TTG CCC CAG 173 Met Glu Lys Gly Leu Thr Leu Pro Gln 1 5 GAC TGC CGG GAC TTT GTG CAC AGC CTG AAG ATG AGA AGC AAA TAC GCC 221 Asp Cys Arg Asp Phe Val His Ser Leu Lys Met Arg Ser Lys Tyr Ala 10 15 20 25 CTT TTC TTG GTT TTT GTG GTG ATA GTT TTT GTC TTC ATC GAA AAG GAA 269 Leu Phe Leu Val Phe Val Val Ile Val Phe Val Phe Ile Glu Lys Glu 30 35 40 AAT AAA ATC ATA TCA AGG GTC TCA GAC AAG CTG AAG CAG ATT CCC CAA 317 Asn Lys Ile Ile Ser Arg Val Ser Asp Lys Leu Lys Gln Ile Pro Gln 45 50 55 GCT CTA GCA GAT GCC AAC AGC ACC GAC CCA GCC CTG ATC TTA GCT GAG 365 Ala Leu Ala Asp Ala Asn Ser Thr Asp Pro Ala Leu Ile Leu Ala Glu 60 65 70 AAC GCA TCT CTC TTG TCC CTG AGC GAG CTC GAT TCA GCC TTC TCC CAG 413 Asn Ala Ser Leu Leu Ser Leu Ser Glu Leu Asp Ser Ala Phe Ser Gln 75 80 85 CTT CAG AGC CGT CTC CGC AAC CTC AGC TTG CAG CTG GGC GTG GAG CCA 461 Leu Gln Ser Arg Leu Arg Asn Leu Ser Leu Gln Leu Gly Val Glu Pro 90 95 100 105 GCC ATG GAG GCC GCA GGG GAG GAA GAG GAA GAG CAG AGA AAG GAG GAG 509 Ala Met Glu Ala Ala Gly Glu Glu Glu Glu Glu Gln Arg Lys Glu Glu 110 115 120 GAG CCG CCC AGA CCG GCC GTG GCG GGG CCC CGG CGC CAC GTG CTG CTC 557 Glu Pro Pro Arg Pro Ala Val Ala Gly Pro Arg Arg His Val Leu Leu 125 130 135 ATG GCC ACC ACG CGC ACC GGC TCC TCG TTC GTG GGC GAG TTC TTC AAC 605 Met Ala Thr Thr Arg Thr Gly Ser Ser Phe Val Gly Glu Phe Phe Asn 140 145 150 CAG CAG GGC AAC ATC TTC TAC CTC TTC GAG CCG CTG TGG CAC ATC GAG 653 Gln Gln Gly Asn Ile Phe Tyr Leu Phe Glu Pro Leu Trp His Ile Glu 155 160 165 CGC ACA GTG TCC TTC GAG CCG GGG GGC GCC AAC GCC GCG GGC TCG GCC 701 Arg Thr Val Ser Phe Glu Pro Gly Gly Ala Asn Ala Ala Gly Ser Ala 170 175 180 185 CTG GTG TAC CGC GAC GTG CTC AAG CAG CTC TTC CTG TGC GAC CTG TAC 749 Leu Val Tyr Arg Asp Val Leu Lys Gln Leu Phe Leu Cys Asp Leu Tyr 190 195 200 GTG CTG GAG CAC TTC ATC ACG CCG CTG CCC GAG GAC CAC CTG ACT CAG 797 Val Leu Glu His Phe Ile Thr Pro Leu Pro Glu Asp His Leu Thr Gln 205 210 215 TTC ATG TTC CGC CGG GGC TCC AGC CGC TCC CTG TGC GAG GAC CCC GTC 845 Phe Met Phe Arg Arg Gly Ser Ser Arg Ser Leu Cys Glu Asp Pro Val 220 225 230 TGT ACG CCC TTC GTC AAG AAG GTC TTC GAG AAG TAC CAC TGC AAG AAC 893 Cys Thr Pro Phe Val Lys Lys Val Phe Glu Lys Tyr His Cys Lys Asn 235 240 245 CGC CGC TGC GGC CCC CTC AAC GTG ACG CTG GCC GCA GAG GCC TGC CGC 941 Arg Arg Cys Gly Pro Leu Asn Val Thr Leu Ala Ala Glu Ala Cys Arg 250 255 260 265 CGC AAG GAG CAC ATG GCC CTC AAG GCG GTG CGC ATC CGG CAG CTG GAG 989 Arg Lys Glu His Met Ala Leu Lys Ala Val Arg Ile Arg Gln Leu Glu 270 275 280 TTC CTG CAG CCG CTG GCC GAG GAC CCC CGC CTG GAC CTG CGC GTC ATC 1037 Phe Leu Gln Pro Leu Ala Glu Asp Pro Arg Leu Asp Leu Arg Val Ile 285 290 295 CAG CTG GTG CGC GAC CCC CGG GCC GTG CTG GCC TCG CGC ATG GTG GCC 1085 Gln Leu Val Arg Asp Pro Arg Ala Val Leu Ala Ser Arg Met Val Ala 300 305 310 TTC GCC GGC AAG TAT AAG ACC TGG AAG AAG TGG CTG GAC GAC GAG GGC 1133 Phe Ala Gly Lys Tyr Lys Thr Trp Lys Lys Trp Leu Asp Asp Glu Gly 315 320 325 CAG GAC GGC CTG AGG GAA GAG GAG GTG CAG CGG CTG CGG GGC AAC TGC 1181 Gln Asp Gly Leu Arg Glu Glu Glu Val Gln Arg Leu Arg Gly Asn Cys 330 335 340 345 GAG AGC ATC CGC CTG TCC GCG GAG CTG GGG CTG CGG CAG CCC GCC TGG 1229 Glu Ser Ile Arg Leu Ser Ala Glu Leu Gly Leu Arg Gln Pro Ala Trp 350 355 360 CTG CGG GGC CGC TAC ATG CTG GTG CGC TAC GAG GAC GTG GCA CGC GGG 1277 Leu Arg Gly Arg Tyr Met Leu Val Arg Tyr Glu Asp Val Ala Arg Gly 365 370 375 CCG CTG CAG AAG GCC CGC GAG ATG TAC CCG TTC GCC GGC ATC CCC CTG 1325 Pro Leu Gln Lys Ala Arg Glu Met Tyr Pro Phe Ala Gly Ile Pro Leu 380 385 390 ACC CCG CAG GTG GAA GAC TGG ATC CAA AAG AAC ACG CAG GCG GCC CAC 1373 Thr Pro Gln Val Glu Asp Trp Ile Gln Lys Asn Thr Gln Ala Ala His 395 400 405 GAC GGC AGC GGC ATC TAC TCC ACG CAG AAG AAC TCC TCG GAG CAG TTC 1421 Asp Gly Ser Gly Ile Tyr Ser Thr Gln Lys Asn Ser Ser Glu Gln Phe 410 415 420 425 GAG AAG TGG CGC TTC AGC ATG CCC TTC AAG CTG GCC CAG GTG GTG CAG 1469 Glu Lys Trp Arg Phe Ser Met Pro Phe Lys Leu Ala Gln Val Val Gln 430 435 440 GCC CCG TGC GGC CCT GCC ATG CGC CTC TTC GGC TAC AAA CTG GCG CGG 1517 Ala Pro Cys Gly Pro Ala Met Arg Leu Phe Gly Tyr Lys Leu Ala Arg 445 450 455 GAC GCC GCC GCC CTC ACC AAC CGC TCA GTC AGC CTG CTG GAG GAG AGG 1565 Asp Ala Ala Ala Leu Thr Asn Arg Ser Val Ser Leu Leu Glu Glu Arg 460 465 470 GGC ACC TTC TGG GTC ACG TAGGGGGGTC TGGGGCCGTA TGCCCTCCTT 1613 Gly Thr Phe Trp Val Thr 475 GTGGAAAGGC CTGGGCCCGT CTTTCTGGCT GAAAGGCCTG CCCCGTCTTT CTGCCCCAGC 1673 CCTCGCAGCA GAGAGCCGGC ACAGCGCCAT GAGCGGAGCA GCGCCTCCTG TAGCAGTAGG 1733 GCCCCCAGCC AGCGCTCCAG CCAAAGCGGC GGCCCCAAGG GTTAATGTGG CGGAGAAACA 1793 GGGACAGGTG CCCGAGGTCC CCTTGGAAGG GCCATCACAC CCAGACCCAA CGGGTTGCAG 1853 CCTCCTGAGC AGGCCTAGGC AGGCCCGGGC CTGTTGGCAA GCTTCGATCT CGAACTACAA 1913 CAACCAGAAA CATACATTCG TGCCTGGAGA CCCTGCAGGC CAGAGTCCAA ATATTTAACA 1973 ATCAGAAGGG GCAAGGCTCT GACCAGTGAC AGTCAGACCT CCTGCTTTAT TTGGTGTTAA 2033 CCGTTTCTTG TCTGGATGGT GAAGTCTGGA ATCTGGGTGG GCTCCTTGGA GGAGGGGCTA 2093 GGACAGCCGT GGGTGTCAAA GGTGGCATTT GAGGCTCGTT TGAGGTGACA GTGGCTGTTT 2153 CCG 2156

【０１３１】配列番号：２ 配列の長さ：479 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Glu Lys Gly Leu Thr Leu Pro Gln Asp Cys Arg Asp Phe Val His 1 5 10 15 Ser Leu Lys Met Arg Ser Lys Tyr Ala Leu Phe Leu Val Phe Val Val 20 25 30 Ile Val Phe Val Phe Ile Glu Lys Glu Asn Lys Ile Ile Ser Arg Val 35 40 45 Ser Asp Lys Leu Lys Gln Ile Pro Gln Ala Leu Ala Asp Ala Asn Ser 50 55 60 Thr Asp Pro Ala Leu Ile Leu Ala Glu Asn Ala Ser Leu Leu Ser Leu 65 70 75 80 Ser Glu Leu Asp Ser Ala Phe Ser Gln Leu Gln Ser Arg Leu Arg Asn 85 90 95 Leu Ser Leu Gln Leu Gly Val Glu Pro Ala Met Glu Ala Ala Gly Glu 100 105 110 Glu Glu Glu Glu Gln Arg Lys Glu Glu Glu Pro Pro Arg Pro Ala Val 115 120 125 Ala Gly Pro Arg Arg His Val Leu Leu Met Ala Thr Thr Arg Thr Gly 130 135 140 Ser Ser Phe Val Gly Glu Phe Phe Asn Gln Gln Gly Asn Ile Phe Tyr 145 150 155 160 Leu Phe Glu Pro Leu Trp His Ile Glu Arg Thr Val Ser Phe Glu Pro 165 170 175 Gly Gly Ala Asn Ala Ala Gly Ser Ala Leu Val Tyr Arg Asp Val Leu 180 185 190 Lys Gln Leu Phe Leu Cys Asp Leu Tyr Val Leu Glu His Phe Ile Thr 195 200 205 Pro Leu Pro Glu Asp His Leu Thr Gln Phe Met Phe Arg Arg Gly Ser 210 215 220 Ser Arg Ser Leu Cys Glu Asp Pro Val Cys Thr Pro Phe Val Lys Lys 225 230 235 240 Val Phe Glu Lys Tyr His Cys Lys Asn Arg Arg Cys Gly Pro Leu Asn 245 250 255 Val Thr Leu Ala Ala Glu Ala Cys Arg Arg Lys Glu His Met Ala Leu 260 265 270 Lys Ala Val Arg Ile Arg Gln Leu Glu Phe Leu Gln Pro Leu Ala Glu 275 280 285 Asp Pro Arg Leu Asp Leu Arg Val Ile Gln Leu Val Arg Asp Pro Arg 290 295 300 Ala Val Leu Ala Ser Arg Met Val Ala Phe Ala Gly Lys Tyr Lys Thr 305 310 315 320 Trp Lys Lys Trp Leu Asp Asp Glu Gly Gln Asp Gly Leu Arg Glu Glu 325 330 335 Glu Val Gln Arg Leu Arg Gly Asn Cys Glu Ser Ile Arg Leu Ser Ala 340 345 350 Glu Leu Gly Leu Arg Gln Pro Ala Trp Leu Arg Gly Arg Tyr Met Leu 355 360 365 Val Arg Tyr Glu Asp Val Ala Arg Gly Pro Leu Gln Lys Ala Arg Glu 370 375 380 Met Tyr Pro Phe Ala Gly Ile Pro Leu Thr Pro Gln Val Glu Asp Trp 385 390 395 400 Ile Gln Lys Asn Thr Gln Ala Ala His Asp Gly Ser Gly Ile Tyr Ser 405 410 415 Thr Gln Lys Asn Ser Ser Glu Gln Phe Glu Lys Trp Arg Phe Ser Met 420 425 430 Pro Phe Lys Leu Ala Gln Val Val Gln Ala Pro Cys Gly Pro Ala Met 435 440 445 Arg Leu Phe Gly Tyr Lys Leu Ala Arg Asp Ala Ala Ala Leu Thr Asn 450 455 460 Arg Ser Val Ser Leu Leu Glu Glu Arg Gly Thr Phe Trp Val Thr 465 470 475 479

【０１３２】配列番号：３ 配列の長さ：14 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Leu Val Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Asn Phe Ile Xaa Xaa Val 1 5 10

【０１３３】配列番号：４ 配列の長さ：14 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Xaa Val Ile Xaa Glu Xaa Xaa Asn Asn Phe Ile Xaa Xaa Val 1 5 10

【０１３４】配列番号：５ 配列の長さ：24 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Leu Val Ile Xaa Glu Lys Glu Asn Asn Phe Ile Ser Arg Val Ser Asp 1 5 10 15 Lys Leu Lys Xaa Xaa Pro Xaa Val 20

【０１３５】配列番号：６ 配列の長さ：13 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Phe Ile Ser Pro Ala Pro Asn Asn Xaa Leu Thr Ala 1 5 10

【０１３６】配列番号：７ 配列の長さ：28 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CAAAGCTTGA RAARGARAAY AAYTTYAT 28

【０１３７】配列番号：８ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 MGKGTKWSKG AYAARCTNAA 20

【０１３８】配列番号：９ 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 AARTADWSKG GKCGKGGKCT TCTTAAGCT 29

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の理化学的性質を有する、ヒト由来
   のグリコサミノグリカンスルホトランスフェラーゼのポ
   リペプチド。 作用：硫酸基供与体から硫酸基を、グリコサミノグリ
   カンのＮ−アセチルガラクトサミン残基またはガラクト
   ース残基に転移する。 基質特異性：コンドロイチンのＮ−アセチルガラク
   トサミン残基の６位に硫酸基を転移する。ケラタン硫酸
   のガラクトース残基の６位に硫酸基を転移する。 分子量：約５００００〜５５０００ダルトン
2. 【請求項２】 II型膜タンパク質である請求項１に記
   載のポリペプチド。
3. 【請求項３】 配列番号２に示すアミノ酸配列の少な
   くとも一部を有し、硫酸基供与体から硫酸基をグリコサ
   ミノグリカンのＮ−アセチルガラクトサミン残基または
   ガラクトース残基に転移する活性を実質的に害さない１
   つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入を有して
   いてもよいヒト由来のグリコサミノグリカンスルホトラ
   ンスフェラーゼのポリペプチド。
4. 【請求項４】 配列番号２に示すアミノ酸配列の少なく
   とも一部を有するヒト由来のグリコサミノグリカンスル
   ホトランスフェラーゼのポリペプチド。
5. 【請求項５】 配列番号２においてアミノ酸番号１〜４
   ７９で表されるアミノ酸配列を有する請求項１〜４のい
   ずれか１項に記載のポリペプチド。
6. 【請求項６】 配列番号２においてアミノ酸番号２０〜
   ４７９で表されるアミノ酸配列を有する請求項１〜４の
   いずれか１項に記載のポリペプチド。
7. 【請求項７】 請求項１〜６のいずれか１項に記載のポ
   リペプチドの部分を含むポリペプチド。
8. 【請求項８】 請求項１〜７のいずれか１項に記載のポ
   リペプチドと、発現に必要な他のポリペプチドを含む融
   合ポリペプチド。
9. 【請求項９】 請求項１〜８のいずれか１項に記載のポ
   リペプチドの少なくとも一部をコードするＤＮＡ。
10. 【請求項１０】 配列番号２においてアミノ酸番号１〜
    ４７９で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を
    有する請求項９に記載のＤＮＡ。
11. 【請求項１１】 配列番号２においてアミノ酸番号２０
    〜４７９で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列
    を有する請求項９に記載のＤＮＡ。
12. 【請求項１２】 配列番号１において塩基番号１４７〜
    １５８３で表される塩基配列の少なくとも一部またはす
    べてを有する請求項９〜１１のいずれか１項に記載のＤ
    ＮＡ。
13. 【請求項１３】 配列番号１において塩基番号２０４〜
    １５８３で表される塩基配列の少なくとも一部またはす
    べてを有する請求項９〜１１のいずれか１項に記載のＤ
    ＮＡ。