JPWO2004104208A1 - ヘパラン鎖のｉｎｖｉｔｒｏ合成法とその利用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ＧＡＧ−タンパク質結合領域の五糖のうちの少なくともＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβという三糖やＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβという二糖を含み、それらが疎水性アグリコンに結合した構造の重合開始剤を使用してヘパラン鎖をｉｎｖｉｔｒｏでポリマー合成する方法である。重合反応には、分泌型のＥＸＴ１及びＥＸＴ２を共発現させたものを酵素に使用することが好ましいが、一定の重合開始剤を使用する場合には、分泌型ＥＸＴ１単独を使用してもヘパラン鎖を合成することが可能である。
Description
本発明は、糖鎖合成技術に関し、より詳細には、ヘパラン鎖のｉｎ ｖｉｔｒｏ合成法と、同合成法を用いて生産されたヘパラン鎖、ヘパラン硫酸およびヘパリン等の糖鎖に関するものである。
ヘパリンおよびヘパラン硫酸（以下、「Ｈｅｐ／ＨＳ」と略す場合がある。）鎖は、細胞表面や細胞外マトリックスに存在する直鎖状の硫酸化糖鎖で、コアタンパク質に結合し、プロテオグリカン（ＰＧ）として、哺乳動物をはじめとしてショウジョウバエや線虫などの下等生物にまで広く分布している。以前まで、ＰＧは、細胞表面や細胞外マトリックスに存在する分子を安定に維持する因子であると考えられてきたが、最近の研究により、細胞の移動、増殖，分化さらには形態形成など多くの生理現象に積極的に関与していることが明らかになってきた。
Ｈｅｐ／ＨＳ鎖は、コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸（ＣＳ／ＤＳ）鎖とともに硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）と呼ばれ、ウロン酸とアミノ糖からなる二糖単位が数十回も繰り返し重合した構造からなっている。硫酸化ＧＡＧは、構成糖の特定の位置が硫酸化されることや、グルクロン酸（「ＧｌｃＵＡ」又は「ＧｌｃＡ」と表記する場合がある。）からイズロン酸（ＩｄｏＡ）へ異性化されることなどによって、非常に多様な構造を示す。このような修飾は、ＧＡＧ鎖に均一にほどこされるわけではなく、ある特定の部分にのみ行われ、それによって、様々な分子との相互作用が可能となる。なかでもＨｅｐ／ＨＳ鎖は、発生過程において様々な増殖因子や形態形成因子と相互作用することによりシグナル伝達に関わることが、モデル生物を用いた多くの実験から明らかにされてきた。
ＰＧとして存在しているＨｅｐ／ＨＳ鎖とＣＳ／ＤＳ鎖は、どちらもコアタンパク質のセリン残基に、特徴的な四糖からなるいわゆるＧＡＧ−タンパク質結合領域（ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−Ｓｅｒ）を介して共有結合している。Ｈｅｐ／ＨＳ鎖やＣＳ／ＤＳ鎖の生合成は、これらが共有する四糖結合領域のそれぞれの構成糖が、キシロース転移酵素（ＸｙｌＴ）、ガラクトース転移酵素−Ｉ（ＧａｌＴ−Ｉ）、ガラクトース転移酵素−ＩＩ（ＧａｌＴ−ＩＩ）、グルクロン酸転移酵素−Ｉ（ＧｌｃＡＴ−Ｉ）によって転移されることで開始される。その後、四糖結合領域に、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素−Ｉ（ＧｌｃＮＡｃＴ−Ｉ）が作用することによって、ＧｌｃＮＡｃがα１−４で転移されるとＨｅｐ／ＨＳ鎖が合成される。
その後、Ｈｅｐ／ＨＳ鎖の二糖繰り返し領域の重合化は、異なる二つの糖転移酵素（グルクロン酸転移酵素−ＩＩ（ＧｌｃＡＴ−ＩＩ）とＮ−アセチルグルコサミン転移酵素−ＩＩ（ＧｌｃＮＡｃＴ−ＩＩ）によってグルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）とＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が交互に転移されることにより行われるが、どの様な分子によって行われているかは不明であった。
カナダのＴｕｆａｒｏらは、１型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）が細胞に感染する際に、細胞方面のヘパラン硫酸（ＨＳ）と結合することを利用して、ＨＳＶ−１非感受性で、ＨＳ欠損細胞株であるｓｏｇ９細胞にＨｅＬａ細胞由来のｃＤＮＡライブラリーを導入して、ＨＳＶ−１感受性の回復した遺伝子を調べることにより、ＨＳ生合成遺伝子としてｅｘｏｓｔｏｓｉｎ１（ＥＸＴ１）を同定した。また、スウェーデンのＬｉｎｄａｈｌらは、ウシ血清からグルクロン酸転移酵素−ＩＩ（ＧｌｃＡＴ−ＩＩ）とＮ−アセチルグルコサミン転移酵素−ＩＩ（ＧｌｃＮＡｃＴ−ＩＩ）の両活性を合わせ持つタンパク質を、様々なカラムを用いて精製し、その部分アミノ酸配列が、ＥＸＴ１と高い相同性を持つＥＸＴ２の遺伝子産物の一部と一致することを明らかにした。これにより、ＥＸＴ１およびＥＸＴ２はＨＳ生合成に関与することが示された。
ＥＸＴ１およびＥＸＴ２はともにガン抑制遺伝子に分類されており、その機能が明らかになる以前に、遺伝性多発性外骨腫（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｅｘｏｓｔｏｓｅｓ：ＨＭＥ）の原因遺伝子としてポジショナルクローニング法により同定されていた。ＨＭＥは、ＥＸＴ１またはＥＸＴ２のどちらかにおいて、対立遺伝子のうち片方が欠損することにより発症する常染色体優性遺伝病の一つであり、成長期に四肢長管骨の骨端に良性の軟骨腫瘍が多発し、骨格の奇形や低身長を伴う疾患である。発症頻度は約５〜１０万人に１人で、その中の約２％の患者でＥＸＴ遺伝子のヘテロ接合性の消失が見られ、軟骨肉腫への悪性転化が起こる。上述したように、ＥＸＴ１およびＥＸＴ２の機能が明らかになったことで、ＨＳの合成異常により、ＨＭＥが引き起こされることが分かった。
最近、ＥＸＴ１およびＥＸＴ２のノックアウトマウスが作製され、ＥＸＴ１（−／−）とＥＸＴ２（−／−）の変異体マウスにおいては、原腸陥入の異常により、胎仔期に死亡することが確認された。また、ＥＸＴ１（＋／−）とＥＸＴ２（＋／−）の変異体マウスにおいては、野生型マウスの約半分のＨＳしか合成できず、そのうち数％はＨＭＥに似た症状を示した。したがって、ＨＳの生合成機構を解明することは、ＨＭＥや、形態形成におけるＨＳの重要性を明らかにする上で重要である。
最近のヒトゲノム解析の進歩に伴い、ＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ）データベース解析から、ＥＸＴ１やＥＸＴ２にアミノ酸配列上で相同性を持つ遺伝子が単離され、ＥＸＴ−ｌｉｋｅ ｇｅｎｅ １（ＥＸＴＬ１）、ＥＸＴＬ２およびＥＸＴＬ３と名付けられた。これらはあわせてＥＸＴファミリーと呼ばれている。ＥＸＴＬ１、ＥＸＴＬ２およびＥＸＴＬ３については、未だＨＭＥに関与するという報告はされていないが、ＨＳ生合成に関与することが示唆されている。
このようにＨＳ生合成に関与する分子は明らかにされつつあるが、ＨＳ生合成機構の解明は未だ十分なものとはいえない。とりわけ、Ｈｅｐ／ＨＳ鎖のもととなる−（４ＧｌｃＵＡβ１−４ＧｌｃＮＡｃα１）ｎ−の二糖繰り返し領域からなるヘパラン鎖については、上記ＥＸＴ１やＥＸＴ２、さらにＥＸＴファミリー遺伝子産物に属するいずれの酵素を使用しても、ｉｎ ｖｉｔｒｏで重合化することができなかった（Ｓｕｇａｈａｒａ，Ｋ．，ａｎｄ Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｈ．（２００２）ＩＵＢＭＢ Ｌｉｆｅ ５４，１６３−１７５頁参照）。
Ｈｅｐ／ＨＳ鎖は、コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸（ＣＳ／ＤＳ）鎖とともに硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）と呼ばれ、ウロン酸とアミノ糖からなる二糖単位が数十回も繰り返し重合した構造からなっている。硫酸化ＧＡＧは、構成糖の特定の位置が硫酸化されることや、グルクロン酸（「ＧｌｃＵＡ」又は「ＧｌｃＡ」と表記する場合がある。）からイズロン酸（ＩｄｏＡ）へ異性化されることなどによって、非常に多様な構造を示す。このような修飾は、ＧＡＧ鎖に均一にほどこされるわけではなく、ある特定の部分にのみ行われ、それによって、様々な分子との相互作用が可能となる。なかでもＨｅｐ／ＨＳ鎖は、発生過程において様々な増殖因子や形態形成因子と相互作用することによりシグナル伝達に関わることが、モデル生物を用いた多くの実験から明らかにされてきた。
ＰＧとして存在しているＨｅｐ／ＨＳ鎖とＣＳ／ＤＳ鎖は、どちらもコアタンパク質のセリン残基に、特徴的な四糖からなるいわゆるＧＡＧ−タンパク質結合領域（ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−Ｓｅｒ）を介して共有結合している。Ｈｅｐ／ＨＳ鎖やＣＳ／ＤＳ鎖の生合成は、これらが共有する四糖結合領域のそれぞれの構成糖が、キシロース転移酵素（ＸｙｌＴ）、ガラクトース転移酵素−Ｉ（ＧａｌＴ−Ｉ）、ガラクトース転移酵素−ＩＩ（ＧａｌＴ−ＩＩ）、グルクロン酸転移酵素−Ｉ（ＧｌｃＡＴ−Ｉ）によって転移されることで開始される。その後、四糖結合領域に、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素−Ｉ（ＧｌｃＮＡｃＴ−Ｉ）が作用することによって、ＧｌｃＮＡｃがα１−４で転移されるとＨｅｐ／ＨＳ鎖が合成される。
その後、Ｈｅｐ／ＨＳ鎖の二糖繰り返し領域の重合化は、異なる二つの糖転移酵素（グルクロン酸転移酵素−ＩＩ（ＧｌｃＡＴ−ＩＩ）とＮ−アセチルグルコサミン転移酵素−ＩＩ（ＧｌｃＮＡｃＴ−ＩＩ）によってグルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）とＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が交互に転移されることにより行われるが、どの様な分子によって行われているかは不明であった。
カナダのＴｕｆａｒｏらは、１型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）が細胞に感染する際に、細胞方面のヘパラン硫酸（ＨＳ）と結合することを利用して、ＨＳＶ−１非感受性で、ＨＳ欠損細胞株であるｓｏｇ９細胞にＨｅＬａ細胞由来のｃＤＮＡライブラリーを導入して、ＨＳＶ−１感受性の回復した遺伝子を調べることにより、ＨＳ生合成遺伝子としてｅｘｏｓｔｏｓｉｎ１（ＥＸＴ１）を同定した。また、スウェーデンのＬｉｎｄａｈｌらは、ウシ血清からグルクロン酸転移酵素−ＩＩ（ＧｌｃＡＴ−ＩＩ）とＮ−アセチルグルコサミン転移酵素−ＩＩ（ＧｌｃＮＡｃＴ−ＩＩ）の両活性を合わせ持つタンパク質を、様々なカラムを用いて精製し、その部分アミノ酸配列が、ＥＸＴ１と高い相同性を持つＥＸＴ２の遺伝子産物の一部と一致することを明らかにした。これにより、ＥＸＴ１およびＥＸＴ２はＨＳ生合成に関与することが示された。
ＥＸＴ１およびＥＸＴ２はともにガン抑制遺伝子に分類されており、その機能が明らかになる以前に、遺伝性多発性外骨腫（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｅｘｏｓｔｏｓｅｓ：ＨＭＥ）の原因遺伝子としてポジショナルクローニング法により同定されていた。ＨＭＥは、ＥＸＴ１またはＥＸＴ２のどちらかにおいて、対立遺伝子のうち片方が欠損することにより発症する常染色体優性遺伝病の一つであり、成長期に四肢長管骨の骨端に良性の軟骨腫瘍が多発し、骨格の奇形や低身長を伴う疾患である。発症頻度は約５〜１０万人に１人で、その中の約２％の患者でＥＸＴ遺伝子のヘテロ接合性の消失が見られ、軟骨肉腫への悪性転化が起こる。上述したように、ＥＸＴ１およびＥＸＴ２の機能が明らかになったことで、ＨＳの合成異常により、ＨＭＥが引き起こされることが分かった。
最近、ＥＸＴ１およびＥＸＴ２のノックアウトマウスが作製され、ＥＸＴ１（−／−）とＥＸＴ２（−／−）の変異体マウスにおいては、原腸陥入の異常により、胎仔期に死亡することが確認された。また、ＥＸＴ１（＋／−）とＥＸＴ２（＋／−）の変異体マウスにおいては、野生型マウスの約半分のＨＳしか合成できず、そのうち数％はＨＭＥに似た症状を示した。したがって、ＨＳの生合成機構を解明することは、ＨＭＥや、形態形成におけるＨＳの重要性を明らかにする上で重要である。
最近のヒトゲノム解析の進歩に伴い、ＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ）データベース解析から、ＥＸＴ１やＥＸＴ２にアミノ酸配列上で相同性を持つ遺伝子が単離され、ＥＸＴ−ｌｉｋｅ ｇｅｎｅ １（ＥＸＴＬ１）、ＥＸＴＬ２およびＥＸＴＬ３と名付けられた。これらはあわせてＥＸＴファミリーと呼ばれている。ＥＸＴＬ１、ＥＸＴＬ２およびＥＸＴＬ３については、未だＨＭＥに関与するという報告はされていないが、ＨＳ生合成に関与することが示唆されている。
このようにＨＳ生合成に関与する分子は明らかにされつつあるが、ＨＳ生合成機構の解明は未だ十分なものとはいえない。とりわけ、Ｈｅｐ／ＨＳ鎖のもととなる−（４ＧｌｃＵＡβ１−４ＧｌｃＮＡｃα１）ｎ−の二糖繰り返し領域からなるヘパラン鎖については、上記ＥＸＴ１やＥＸＴ２、さらにＥＸＴファミリー遺伝子産物に属するいずれの酵素を使用しても、ｉｎ ｖｉｔｒｏで重合化することができなかった（Ｓｕｇａｈａｒａ，Ｋ．，ａｎｄ Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｈ．（２００２）ＩＵＢＭＢ Ｌｉｆｅ ５４，１６３−１７５頁参照）。
本発明の目的は、（１）Ｈｅｐ／ＨＳ鎖のもととなるヘパラン鎖のｉｎ ｖｉｔｒｏ合成法を提供すること、および、（２）同合成法を用いて生産されたヘパラン鎖、ヘパラン硫酸およびヘパリン等の糖鎖を提供すること、にある。
本発明者は、上記課題に鑑み鋭意研究を進めた結果、（１）特定の重合開始剤（換言すれば、「受容体基質（ａｃｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）」又は「プライマー基質（ｐｒｉｍｅｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）」）を使用し、かつ、分泌型のＥＸＴ１及びＥＸＴ２を共発現させたものを酵素に使用することで、従来達成できなかったｉｎ ｖｉｔｒｏでのヘパラン鎖の重合化（ポリマー合成）に成功したこと、（２）検討の結果、重合開始剤は、ＧＡＧ−タンパク質結合領域の五糖のうちの少なくともＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβという三糖やＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβという二糖を含み、それらが疎水性アグリコンに結合した構造が重合化に重要と考えられること、（３）一定の重合開始剤を使用する場合には、分泌型ＥＸＴ１のみを酵素に使用したときにもヘパラン鎖をｉｎ ｖｉｔｒｏで重合化できること、等を見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は、産業上有用な方法・物として、下記Ａ）〜Ｉ）の発明を含むものである。
Ａ） 下記（ａ）〜（ｅ）からなる群から選ばれる重合開始剤を用いて合成されたヘパラン鎖。
（ａ） ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−Ｓｅｒ（ＧｌｙＴｒｐＰｒｏＡｓｐＧｌｙ）のように、プロテオグリカンのＧＡＧ−蛋白質結合領域の四糖又は五糖の配列にコア蛋白質のオリゴペプチドが結合したもの、
（ｂ） ＧＡＧ−蛋白質結合領域類似体、即ち、ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚのように、ＧＡＧ−蛋白質結合領域の二糖配列に疎水性アグリコンが結合したもの、
（ｃ） ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚのように、ＧＡＧ−蛋白質結合領域の三糖配列に疎水性アグリコンが結合したもの、
（ｄ） グリピカン等のヘパラン硫酸プロテオグリカンのコア蛋白質配列に、ＧＡＧ−蛋白質結合領域の四糖又は五糖の配列が結合したもの、
（ｅ） α−トロンボモデュリン等のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコア蛋白質配列に、ＧＡＧ−蛋白質結合領域の四糖又は五糖の配列が結合したもの。
Ｂ） ＥＸＴ１及びＥＸＴ２の２つの酵素を野生型より短く可溶性にして共発現させたものを使用して合成された、上記Ａ）記載のヘパラン鎖。
Ｃ） 結合領域五糖配列（ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−）がペプチドに結合したもの、又は（ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−）といった結合領域三糖配列に疎水性アグリコンが結合したものを重合開始剤に使用し、かつ、野生型より短く可溶性にして発現させたＥＸＴ１のみを酵素に使用して合成された、上記Ａ）記載のヘパラン鎖。
Ｄ） 上記Ａ）記載のヘパラン鎖を材料に使用して製造されたヘパラン硫酸。
Ｅ） 上記Ａ）記載のヘパラン鎖を材料に使用して製造されたヘパリン。
Ｆ） 下記（ａ）〜（ｅ）からなる群から選ばれる重合開始剤を用いたヘパラン鎖合成方法。
（ａ） ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−Ｓｅｒ（ＧｌｙＴｒｐＰｒｏＡｓｐＧｌｙ）のように、プロテオグリカンのＧＡＧ−蛋白質結合領域の四糖又は五糖の配列にコア蛋白質のオリゴペプチドが結合したもの、
（ｂ） ＧＡＧ−蛋白質結合領域類似体、即ち、ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚのように、ＧＡＧ−蛋白質結合領域の二糖配列に疎水性アグリコンが結合したもの、
（ｃ） ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚのように、ＧＡＧ−蛋白質結合領域の三糖配列に疎水性アグリコンが結合したもの、
（ｄ） グリピカン等のヘパラン硫酸プロテオグリカンのコア蛋白質配列に、ＧＡＧ−蛋白質結合領域の四糖又は五糖の配列が結合したもの、
（ｅ） α−トロンボモデュリン等のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコア蛋白質配列に、ＧＡＧ−蛋白質結合領域の四糖又は五糖の配列が結合したもの。
Ｇ） ＥＸＴ１及びＥＸＴ２の２つの酵素を野生型より短く可溶性にして共発現させたものを使用することを特徴とする、上記Ｆ）記載のヘパラン鎖合成方法。
Ｈ） 結合領域五糖配列（ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−）がペプチドに結合したもの、又は（ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−）といった結合領域三糖配列に疎水性アグリコンが結合したものを重合開始剤に使用し、かつ、野生型より短く可溶性にして発現させたＥＸＴ１のみを酵素に使用することを特徴とする、上記Ｆ）記載のヘパラン鎖合成方法。
Ｉ） 上記Ｆ）記載の方法により合成されたヘパラン鎖を材料に使用して、（１）遺伝子組み換え技術で調製した硫酸基転移酵素を使用する方法、（２）化学合成法、あるいは、（１）・（２）の方法を組み合わせた半化学合成法によってヘパラン硫酸又はヘパリンを製造する方法。
本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
本発明者は、上記課題に鑑み鋭意研究を進めた結果、（１）特定の重合開始剤（換言すれば、「受容体基質（ａｃｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）」又は「プライマー基質（ｐｒｉｍｅｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）」）を使用し、かつ、分泌型のＥＸＴ１及びＥＸＴ２を共発現させたものを酵素に使用することで、従来達成できなかったｉｎ ｖｉｔｒｏでのヘパラン鎖の重合化（ポリマー合成）に成功したこと、（２）検討の結果、重合開始剤は、ＧＡＧ−タンパク質結合領域の五糖のうちの少なくともＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβという三糖やＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβという二糖を含み、それらが疎水性アグリコンに結合した構造が重合化に重要と考えられること、（３）一定の重合開始剤を使用する場合には、分泌型ＥＸＴ１のみを酵素に使用したときにもヘパラン鎖をｉｎ ｖｉｔｒｏで重合化できること、等を見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は、産業上有用な方法・物として、下記Ａ）〜Ｉ）の発明を含むものである。
Ａ） 下記（ａ）〜（ｅ）からなる群から選ばれる重合開始剤を用いて合成されたヘパラン鎖。
（ａ） ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−Ｓｅｒ（ＧｌｙＴｒｐＰｒｏＡｓｐＧｌｙ）のように、プロテオグリカンのＧＡＧ−蛋白質結合領域の四糖又は五糖の配列にコア蛋白質のオリゴペプチドが結合したもの、
（ｂ） ＧＡＧ−蛋白質結合領域類似体、即ち、ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚのように、ＧＡＧ−蛋白質結合領域の二糖配列に疎水性アグリコンが結合したもの、
（ｃ） ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚのように、ＧＡＧ−蛋白質結合領域の三糖配列に疎水性アグリコンが結合したもの、
（ｄ） グリピカン等のヘパラン硫酸プロテオグリカンのコア蛋白質配列に、ＧＡＧ−蛋白質結合領域の四糖又は五糖の配列が結合したもの、
（ｅ） α−トロンボモデュリン等のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコア蛋白質配列に、ＧＡＧ−蛋白質結合領域の四糖又は五糖の配列が結合したもの。
Ｂ） ＥＸＴ１及びＥＸＴ２の２つの酵素を野生型より短く可溶性にして共発現させたものを使用して合成された、上記Ａ）記載のヘパラン鎖。
Ｃ） 結合領域五糖配列（ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−）がペプチドに結合したもの、又は（ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−）といった結合領域三糖配列に疎水性アグリコンが結合したものを重合開始剤に使用し、かつ、野生型より短く可溶性にして発現させたＥＸＴ１のみを酵素に使用して合成された、上記Ａ）記載のヘパラン鎖。
Ｄ） 上記Ａ）記載のヘパラン鎖を材料に使用して製造されたヘパラン硫酸。
Ｅ） 上記Ａ）記載のヘパラン鎖を材料に使用して製造されたヘパリン。
Ｆ） 下記（ａ）〜（ｅ）からなる群から選ばれる重合開始剤を用いたヘパラン鎖合成方法。
（ａ） ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−Ｓｅｒ（ＧｌｙＴｒｐＰｒｏＡｓｐＧｌｙ）のように、プロテオグリカンのＧＡＧ−蛋白質結合領域の四糖又は五糖の配列にコア蛋白質のオリゴペプチドが結合したもの、
（ｂ） ＧＡＧ−蛋白質結合領域類似体、即ち、ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚのように、ＧＡＧ−蛋白質結合領域の二糖配列に疎水性アグリコンが結合したもの、
（ｃ） ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚのように、ＧＡＧ−蛋白質結合領域の三糖配列に疎水性アグリコンが結合したもの、
（ｄ） グリピカン等のヘパラン硫酸プロテオグリカンのコア蛋白質配列に、ＧＡＧ−蛋白質結合領域の四糖又は五糖の配列が結合したもの、
（ｅ） α−トロンボモデュリン等のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコア蛋白質配列に、ＧＡＧ−蛋白質結合領域の四糖又は五糖の配列が結合したもの。
Ｇ） ＥＸＴ１及びＥＸＴ２の２つの酵素を野生型より短く可溶性にして共発現させたものを使用することを特徴とする、上記Ｆ）記載のヘパラン鎖合成方法。
Ｈ） 結合領域五糖配列（ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−）がペプチドに結合したもの、又は（ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−）といった結合領域三糖配列に疎水性アグリコンが結合したものを重合開始剤に使用し、かつ、野生型より短く可溶性にして発現させたＥＸＴ１のみを酵素に使用することを特徴とする、上記Ｆ）記載のヘパラン鎖合成方法。
Ｉ） 上記Ｆ）記載の方法により合成されたヘパラン鎖を材料に使用して、（１）遺伝子組み換え技術で調製した硫酸基転移酵素を使用する方法、（２）化学合成法、あるいは、（１）・（２）の方法を組み合わせた半化学合成法によってヘパラン硫酸又はヘパリンを製造する方法。
本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
図１は、種々の重合開始剤（受容体基質）を使用してヘパラン鎖の重合化の有無を検討した実験結果を示すグラフである。図中、□印はＮ−ａｃｅｔｙｌｈｅｐａｒｏｓａｎ Ｋ５オリゴ糖を重合開始剤に使用した結果、■印は部分的にＮ−硫酸化されたＮ−ａｃｅｔｙｌｈｅｐａｒｏｓａｎ Ｋ５オリゴ糖、●印はＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚ、▲印はグリピカン−１、○印はα−トロンボモデュリン、◇印はＧｌｃＵＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ−（Ｇｌｙ）Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、△印はＧｌｃＵＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ、をそれぞれ重合開始剤に使用した結果である。
図２は、ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚを重合開始剤に使用して重合反応を行った結果得られた反応生成物について、ヘパリチナーゼＩによる消化を行い、伸長鎖の解析を行った実験結果を示すグラフである。図中、■印は消化前の試料、○印は消化後の試料の結果を示す。矢印は消化により遊離した二糖の溶出位置を示す。
図３は、重合化反応生成物の大きさ（分子サイズ）を解析した結果を示すグラフである。▲印はグリピカン−１、○印はα−トロンボモデュリン、●印はＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚ、をそれぞれ重合開始剤に使用した結果である。
図４は、ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚを重合開始剤に使用してヘパラン鎖の重合化の有無を検討した実験結果を示すグラフである。
図２は、ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚを重合開始剤に使用して重合反応を行った結果得られた反応生成物について、ヘパリチナーゼＩによる消化を行い、伸長鎖の解析を行った実験結果を示すグラフである。図中、■印は消化前の試料、○印は消化後の試料の結果を示す。矢印は消化により遊離した二糖の溶出位置を示す。
図３は、重合化反応生成物の大きさ（分子サイズ）を解析した結果を示すグラフである。▲印はグリピカン−１、○印はα−トロンボモデュリン、●印はＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚ、をそれぞれ重合開始剤に使用した結果である。
図４は、ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚを重合開始剤に使用してヘパラン鎖の重合化の有無を検討した実験結果を示すグラフである。
本発明は、ＧＡＧ−タンパク質結合領域の五糖のうちの少なくともＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβという三糖やＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβという二糖を含み、それらが疎水性アグリコン（糖以外の疎水性物質）に結合した構造の重合開始剤を使用してヘパラン鎖をｉｎ ｖｉｔｒｏでポリマー合成する方法である。具体的には前述のように、下記（ａ）〜（ｅ）の何れかに記載の重合開始剤を使用してヘパラン鎖を合成する。
（ａ） ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−Ｓｅｒ（ＧｌｙＴｒｐＰｒｏＡｓｐＧｌｙ）のように、プロテオグリカンのＧＡＧ−蛋白質結合領域の四糖又は五糖の配列にコア蛋白質のオリゴペプチドが結合したもの、
（ｂ） ＧＡＧ−蛋白質結合領域類似体、即ち、ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚ（ここでＣｂｚは「ベンジルオキシカルボニル基（ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｇｒｏｕｐ）」を表す。以下同じ。）のように、ＧＡＧ−蛋白質結合領域の二糖配列に疎水性アグリコンが結合したもの、
（ｃ） ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚのように、ＧＡＧ−蛋白質結合領域の三糖配列に疎水性アグリコンが結合したもの、
（ｄ） グリピカン（Ｇｌｙｐｉｃａｎ）等のヘパラン硫酸プロテオグリカンのコア蛋白質配列に、ＧＡＧ−蛋白質結合領域の四糖又は五糖の配列が結合したもの、
（ｅ） α−トロンボモデュリン（α−ＴＭ）等のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコア蛋白質配列に、ＧＡＧ−蛋白質結合領域の四糖又は五糖の配列が結合したもの。
上記（ａ）については、ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１という五糖配列にオリゴペプチドが結合したものを使用してもよい。オリゴペプチドは、疎水性アグリコンとして、疎水性アミノ酸を１以上含むものが好ましく、具体的には、ベンゼン環を有するトリプトファン（Ｔｒｐ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、あるいは環式α−イミノ酸であるプロリン（Ｐｒｏ）といった疎水性アミノ酸を含むペプチド配列であることが好ましい。配列の長さは特に限定されるものではない。例えば、上記ペプチド配列のほか、ＧＡＧ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｓｉｔｅ近傍の報告されているペプチド配列（Ｌｉｊｕａｎ Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｄ．Ｅｓｋｏ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１９２９５−１９２９９，１９９４参照）をもとに配列を決定するとよい。
上記（ｂ）（ｃ）は、重合開始剤として、ベンゼン環を有するＣ２Ｈ４ＮＨＣｂｚのような疎水性アグリコンを使用する。疎水性アグリコンの他の例としては、既にヘパラン硫酸合成のキシロシドのアグリコンとして報告されたｅｓｔｒａｄｉｏｌやそれを含む構造（Ｆｕｌｇｅｎｔｉｕｓ Ｎ．Ｌｕｇｅｍｗａ ａｎｄ Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｄ．Ｅｓｋｏ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２３９，２８５−２９０，１９９３参照）、あるいは、ｎａｐｈｔｏｌのようなベンゼン環を２つ以上含む構造（Ｔｉｍｏｔｈｙ Ａ．Ｆｒｉｔｚ，Ｆｕｌｇｅｎｔｉｕｓ Ｎ．Ｌｕｇｅｍｗａ，Ａｒｕｎ Ｋ．Ｓａｒｋａｒ ａｎｄ Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｄ．Ｅｓｋｏ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，３００−３０７，１９９４、および、Ａｒｕｎ Ｋ．Ｓａｒｋａｒ ａｎｄ Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｄ．Ｅｓｋｏ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２７９，１６１−１７１，１９９５参照）の利用が挙げられる。
上記（ｄ）（ｅ）は、重合開始剤として、グリピカン−１（Ｇｌｙｐｉｃａｎ−１）等のヘパラン硫酸プロテオグリカン、あるいは、α−トロンボモデュリン（α−ＴＭ）等のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコア蛋白質配列に、ＧＡＧ−蛋白質結合領域の四糖又は五糖の配列が結合したものを使用する。
ヘパラン硫酸プロテオグリカンの他の例としては、グリピカン−２〜−６、シンデカン−１〜−４、パールカン、ベーターグリカンなどを挙げることができる。また、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの他の例としては、アグリカン、バーシカン、ニューロカン、ブレビカン、フォスファカン、デコリン、ビグリカン、セルグリシン、アピカン、ＮＧ２などを挙げることができ、これらのコアタンパク質を使用するものであってもよい。
後述の実施例に示すように、上記いずれの重合開始剤を使用する場合にも、ヘパラン鎖の合成反応には、分泌型のＥＸＴ１及びＥＸＴ２を共発現させたものを酵素に使用することが好ましい。ただし、一定の重合開始剤を使用する場合には、分泌型ＥＸＴ１単独を使用してもヘパラン鎖を合成することが可能である。例えば、上記（ｃ）に掲げるＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚを重合開始剤に使用する場合には、ＥＸＴ１のみであってもヘパラン鎖を合成することができた（後述の実施例５参照）。対照的に、上記（ｂ）に掲げるＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚを重合開始剤に使用する場合には、ＥＸＴ１単独ではヘパラン鎖を合成することができなかった（後述の表１参照）。
上記実験結果から、四糖結合領域のグルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）にＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を転移する反応については、ＥＸＴ１及びＥＸＴ２のコンプレックスが重要であるが、その後の二糖繰り返し領域の伸長反応については、ＥＸＴ１単独でも糖鎖を伸長させることが可能と考えられた。したがって、結合領域五糖配列（ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−）がペプチド（又はプロテオグリカンのコア蛋白質配列）に結合したもの、あるいは（ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−）といった結合領域三糖配列に疎水性アグリコンが結合したものを重合開始剤に使用するときには、ＥＸＴ１のみを酵素に使用してヘパラン鎖を合成してもよい。
ヘパラン鎖合成反応のその他の条件、使用する試薬などは後述の実施例記載のものに限定されるものではなく、公知の糖鎖合成反応に用いられている各種条件、試薬などから最適なものを選択すればよい。
また、上記方法により合成されたヘパラン鎖を材料に使用してヘパラン硫酸（又はヘパリン）を製造する方法としては、（１）遺伝子組み換え技術で調製した硫酸基転移酵素を使用する方法、（２）化学合成法、あるいは、（１）・（２）の方法を組み合わせた半化学合成法、の３つの方法を挙げることができる。
上記（１）の方法としては、遺伝子組み換え技術で調製した各種硫酸基転移酵素（例えば、Ｗｕ ＺＬ，Ｚｈａｎｇ Ｌ，Ｂｅｅｌｅｒ ＤＬ，Ｋｕｂｅｒａｎ Ｂ，ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＲＤ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．，１６，５３９−５４５，２００２、および、Ｋｕｂｅｒａｎ Ｂ，Ｌｅｃｈ ＭＺ，Ｂｅｅｌｅｒ ＤＬ，Ｗｕ ＺＬ，ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＲＤ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１，１３４３−１３４６，２００３参照）を使用して所望の位置に硫酸基を転移する方法が挙げられる。
上記（２）の化学合成法としては、例えば、Ｂ．Ｃａｓｕ，Ａ．Ｎａｇｇｉ，ａｎｄ Ｇ．Ｔｏｒｒｉ，Ｓｙｎｈｔｅｓｉｓ ｏｆ ｓｕｌｆａｔｅｄ ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ，ｉｎ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＩＩＩ，ｐｐ．１８９５−１９０３，２００１，Ｅｄ．ｂｙ Ｂｅｒｔｒａｍ Ｆｒａｓｅｒ−Ｒｅｉｄ，Ｋｕｎｉａｋｉ Ｔａｔｓｕｔａ ａｎｄ Ｊｏａｃｈｉｍ Ｔｈｉｅｍ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒに記載される、化学的にヘパランからヘパラン硫酸を生産する方法が挙げられる。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。尚、各実施例における詳しい実験方法については、最後の項においてまとめて説明する。
〔実施例１：Ｎ−ａｃｅｔｙｌｈｅｐａｒｏｓａｎオリゴ糖は、ＥＸＴ１とＥＸＴ２を共発現させた複合体によって数糖のみ伸長する〕
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＳ重合化について検討するため、様々なＥＸＴタンパク質を組み合わせたり、組換え型ＥＸＴタンパク質の発現方法を検討したり、重合化反応に適した開始基質を探すため、様々な重合化反応条件を予備的に実験してきた。
ＥＸＴ１とＥＸＴ２がヘテロオリゴマー複合体を形成し触媒活性を強めることや、小胞体からゴルジ装置へ細胞内局在をシフトすることが知られている。また、全長の一部が切断された分泌型のＥＸＴ１とＥＸＴ２とを共発現させると、ＥＸＴ１とＥＸＴ２とをそれぞれ単独で発現させた場合と比較して、Ｎ−ａｃｅｔｙｌｈｅｐａｒｏｓａｎオリゴ糖アクセプター基質へのＧｌｃＮＡｃまたはＧｌｃＵＡ単独の糖転移活性を強めることも報告されている。この結果から、糖鎖重合化活性は検出されていなかったが、膜貫通領域や細胞質領域を欠くＥＸＴ１およびＥＸＴ２の切断型は、複合体を形成するのに十分であると考えられた。
したがって、本実施例および後述の各実施例では、内因性酵素や他のタンパク質からの酵素タンパク質の精製を容易にするため、全長型ではなく切断型のＥＸＴ１とＥＸＴ２をＰｒｏｔｅｉｎ Ａタグの付いた融合タンパク質として発現させた。この分泌型タンパク質は、ＥＸＴ１とＥＸＴ２を単独もしくは共にＣＯＳ−１細胞に導入することによって発現分泌させ、精製後様々なプライマー基質とともに酵素反応に用いた。
Ｎ−ａｃｅｔｙｌｈｅｐａｒｏｓａｎ Ｋ５オリゴ糖（ＧｌｃＮＡｃα１−（４ＧｌｃＵＡβ１−４ＧｌｃＮＡｃα１）ｎ−４ＧｌｃＵＡβ１−Ｏ−２，５−ａｎｈｙｄｒｏＭａｎ）は、ヘパリン／ヘパラン硫酸の二糖繰り返し領域と同じ構造を持ち、それゆえグルクロン酸転移酵素−ＩＩやＧｌｃＮＡｃＴ−ＩＩ活性を測定するための有用なアクセプター基質として用いられているので、まず初めに、ＵＤＰ−［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃとＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ共存下でＥＸＴ１とＥＸＴ２を共発現（ＥＸＴ１−ＥＸＴ２）させ重合化を行ったが、重合化の開始基質とならないことが分かった。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅカラムでのゲルろ過クロマトグラフィーによる反応生成物の溶出位置から、高い［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃの組込みがなく、使用したオリゴ糖の非還元末端に数糖だけ付加したものと判断された（図１の□印参照）。
マウスの肥満細胞腫由来の酵素源を用いると、続いて起こるＮ−ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ／Ｎ−ｓｕｌｆｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＮＤＳＴ）反応がヘパリン鎖の重合化を数倍促進することが報告されているため、部分的にＮ−硫酸化されたＫ５オリゴ糖誘導体を開始剤として調べたが良い開始剤にはならなかった（図１の■印参照）。これらの結果から、さらに糖以外の何か別の成分がＨＳポリメラーゼ反応に必要であること、例えば、コアタンパク質またはその一部オリゴペプチドといったタンパク質成分などが重合化に有用な開始剤であると考えられた。
〔実施例２：ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヘパラン重合化にはＥＸＴ１−ＥＸＴ２の共発現に加えて結合領域類似体が必要である〕
ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚやＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−ナフタレンメタノールのような結合領域類似体合成物が、ＥＸＴＬ２やＥＸＴＬ３のＧｌｃＮＡｃＴ−Ｉ活性のアクセプター基質となることから、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）−タンパク質の結合領域四糖部分に最初のＧｌｃＮＡｃを転移する反応さらに重合化反応においても、上記類似体、あるいはコアタンパク質（とりわけその疎水的な領域）が必要であると考えられた。それゆえ、本実施例では、まず、分泌型ＥＸＴ１とＥＸＴ２を共発現させた重合化反応の開始剤としてＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚを用いた。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅカラムでゲルろ過クロマトグラフィーを行ったところ、顕著な糖鎖の重合化が起こり（図１の●印参照）、上記類似体が、反応の開始だけでなく糖鎖の重合化にも重要であることが示された。また、ＧｌｃＮＡｃＴ−Ｉ活性を持つＥＸＴＬ２とＥＸＴＬ３は、本重合化反応では不必要であった。
ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚは人工的な基質であるため、次に、天然のＨＳプロテオグリカンのコアタンパク質を用いて実験を行った。しかし、結合領域四糖または六糖を有するＨＳプロテオグリカンは手に入らないため、代表的なＨＳプロテオグリカンの一種であるグリピカン−１を、ＨＳが欠損したｓｏｇ９細胞にタグの付いた分泌型タンパク質として発現させ、短いＨＳオリゴ糖の結合したコアタンパク質として調製した。ｓｏｇ９細胞はＥＸＴ１遺伝子の変異不活性化のためにＨＳ合成が不完全であり、それゆえ、ＨＳ重合体による修飾を受けていないグリピカン−１が細胞培養上清中に分泌される。グリピカン−１の発現は抗Ｍｙｃ抗体を用いたウェスタンブロット法によって確認した。このようにＨＳ欠損ｓｏｇ９細胞によって合成された組換え型グリピカン−１を、Ｎｉ−ＮＴＡを用いて精製し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ重合化に用いたところ、良好なヘパラン重合化の開始剤となった（図１の▲印参照）。本重合化反応に用いたグリピカン−１の濃度が低いことを考慮すると、ｉｎ ｖｉｖｏでは、グリピカン−１には人工基質に比べてはるかに高いヘパラン受容体としての活性があると考えられた。
次に、巨大なコアタンパク質に結合領域四糖を持つパートタイムプロテオグリカンであるα−トロンボモデュリン（α−ＴＭ）を開始剤に用いて、ヘパラン鎖の重合化（伸長反応）の有無を検討した。その結果、トロンボモデュリン（ＴＭ）はｉｎ ｖｉｖｏではコンドロイチン硫酸（ＣＳ）のみを有し、ＨＳ鎖は持たないことが知られているにもかかわらず、顕著な重合化が観察された（図１の○印参照）。対照的に、ＴＭ由来の結合領域四糖ペプチドＧｌｃＵＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ−（Ｇｌｙ）Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（図１の◇印参照）や結合領域四糖−Ｓｅｒ（下記の表１参照）のどちらも、糖鎖重合化の開始剤にならなかった。他方、ＨＳまたはＣＳが結合するβグリカンに相当する結合領域五糖ペプチドＧｌｃＵＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙについては、弱い開始剤としての活性を示した（図１の△印参照）。
以上の実験結果を下記の表１にまとめた。
表１に示された結果から、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヘパラン鎖の合成開始あるいは重合化（伸長反応）の促進には、疎水性ペプチドなどの疎水性アグリコンが重要であると考えられた。また、表１に示すように、分泌型ＥＸＴ１またはＥＸＴ２を単独で用いたり、分泌型ＥＸＴ１、ＥＸＴ２をそれぞれ別に発現させたものの混合物を用いた実験では、いずれの基質を用いても重合化は起こらなかった。このように、ヘパラン鎖の重合化反応にはＥＸＴ１−ＥＸＴ２の相互作用と疎水性アグリコンが重要であることが示された。
〔実施例３：重合化生成物の同定〕
重合化反応生成物は、典型的なヘパラン鎖とＨＳ鎖のα１，４−ＧｌｃＮＡｃでＧｌｃＵＡに結合した部分を切断するヘパリチナーゼＩ消化を行い、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅカラムでゲルろ過クロマトグラフィーを行った。プライマー基質としてのグリピカン−１やα−ＴＭ、ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚから得られた未消化の重合化反応生成物はそれぞれ高分子領域に溶出され、ヘパリチナーゼＩ消化後の生成物は二糖の溶出位置に溶出し、完全に消化されたことから、重合化反応生成物は−（４ＧｌｃＵＡβ１−４ＧｌｃＮＡｃα１）ｎ−から構成されていることが分かった（図２参照）。グリピカン−１とα−ＴＭから得られた重合化反応生成物もヘパリチナーゼＩによって完全に分解された。
〔実施例４：重合化反応生成物の大きさの解析〕
次に、グリピカン−１、α−ＴＭ、ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚ上に合成された重合化反応生成物をＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムでゲルろ過クロマトグラフィーを行うことにより鎖長を測定した。グリピカン−１やα−ＴＭから得られた反応生成物の場合、アルカリ還元によって糖鎖を切り離し、ゲルろ過分析にかけた。両方のアクセプター上に合成されたヘパラン鎖は、予備実験おいてＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラムの高分子領域に溶出されたため、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムにかけたところ、３つの基質上すべてに非常に長い糖鎖が合成されたことが明らかになった（図３参照）。ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚ上に合成されたヘパラン鎖は平均分子量１７０ｋＤａ付近に溶出され、グリピカン−１やα−ＴＭ上に合成された糖鎖はＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムの分画範囲を超えた高分子領域（〜２００ｋＤａ）に現れ（図３）、様々な組織で見られるＨＳ鎖（１０−７０ｋＤａ）よりも長く分子量が大きいことが示唆された。これらの結果から、分泌型ＥＸＴ１、ＥＸＴ２を共発現させて調製した酵素は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでα−ＴＭやＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚ上に生体内と同様に長いヘパラン重合体を合成することができることが示された。
〔実施例５：ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚを重合開始剤に用いたヘパラン鎖の重合化反応〕
ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚを後述の方法によって調製し、これを重合開始剤に使用してヘパラン鎖の重合化反応を行った。方法は概略以下のとおりである。まず、１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地で培養したＣＯＳ−１細胞に、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてＰｒｏｔｅｉｎ Ａが融合した分泌型ＥＸＴ１あるいはＥＸＴ２、もしくは分泌型ＥＸＴ１とＥＸＴ２を共発現させた。４８時間後、培養上清に分泌したタンパク質をＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓを用いて精製した。タンパク質が結合したＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓを、１００ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ，ｐＨ６．５の緩衝液に懸濁し、酵素源として使用した。
重合化反応は、精製した酵素が結合したＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓ １０μｌ、１００ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ，ｐＨ６．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＡＴＰ、３１μＭ ＵＤＰ−［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃ（約０．７Ｘ１０５ｄｐｍ）、３１μＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡそしてＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚ（０．６５ｎｍｏｌ）を加え、総量２０μｌで行った。３７℃で１８時間反応後、反応生成物をＳｕｐｅｒｄｅｘ ｐｅｐｔｉｄｅ ＨＲ １０／３０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にかけ、０．２Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３を溶出液に用いて分画後（０．４ｍＬ／Ｆｒ．）、放射活性を測定した。その結果を図４に示す。図中の括弧内の数字は、使用した培養上清の容量を示す。
同図に示すように、分泌型ＥＸＴ１とＥＸＴ２を共発現させると（ＥＸＴ１／２）、非常に強い重合化反応が観察された。また、ＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＨＣｂｚを基質に用いた場合と異なり、ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚを基質に用いると、ＥＸＴ１単独でも、弱いながらも重合化反応が観察された。しかしながら、ＥＸＴ２単独ではどちらの基質を用いても重合反応は観察できなかった。
〔実験方法〕
（１）材料
ＵＤＰ−［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃはＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。ラベルされていないＵＤＰ−ＧｌｃＵＡとＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃはＳｉｇｍａから、Ｈｅｐａｒｉｔｉｎａｓｅ Ｉは生化学工業（東京）から購入した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ５菌株の莢膜の多糖から調製したＮ−Ａｃｅｔｙｌｈｅｐａｒｏｓａｎオリゴ糖（ＧｌｃＮＡｃα１−（４ＧｌｃＵＡβ１−４ＧｌｃＮＡｃα１）ｎ−４ＧｌｃＵＡβ１−Ｏ−２，５−ａｎｈｙｄｒｏＭａｎ）と、その一部がＮ−硫酸化された誘導体は、スウェーデンのウプサラ大学のＭａｒｉｏｎ Ｋｕｓｃｈｅ−Ｇｕｌｌｂｅｒｇ氏とＵｌｆ Ｌｉｎｄａｈｌ氏から譲り受けた。ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−Ｓｅｒ、ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−（Ｇｌｙ）Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙの３種の重合開始剤は化学的に合成した。ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚも化学合成した。精製されたα−ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎは第一製薬（東京）から恵与された。マウスｓｏｇ９細胞はＦｒａｎｋ Ｔｕｆａｒｏ氏から譲り受けた。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ＰｅｐｔｉｄｅとＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ１０／３０カラムはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製のものを使用した。
（２）重合化反応の基質としての組換え型グリピカン−１の精製
Ｃ末端側の１９アミノ酸をコードした配列を除いたヒトグリピカン−１のｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１（−）ＭｙｃＨｉｓ Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＥｃｏＲＩサイトとＢａｍＨＩサイトの間に組み込み、マウスｓｏｇ９細胞をレシピエント細胞として安定発現細胞を作製した。得られた安定発現細胞は、Ｃ末端側でＭｙｃ−Ｈｉｓタグと融合した組み換え型タンパク質としてグリピカン−１を細胞培養上清中に分泌した。分泌されたタンパク質はＮｉ−ＮＴＡ−ａｇａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓ（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、重合化反応の基質として用いた。
（３）分泌型ＥＸＴ１及びＥＸＴ２の発現と重合化反応
ＣＯＳ−１細胞を、ウシ胎仔血清を１０％加えたＤＭＥＭで培養し、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて分泌型のＥＸＴ１とＥＸＴ２をそれぞれ単独、または共発現させ、４８時間後、分泌されたＰｒｏｔｅｉｎ Ａタグの付いたタンパク質をＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて精製した。そして、酵素が結合したＩｇＧ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅをｐＨ６．５の１００ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨで懸濁し、酵素源として用いた。
重合化反応には、精製した酵素が結合したＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ １０μＬ、１００ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、１ｍＭ ＡＴＰ、２５０μＭ ＵＤＰ−［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃ（約５．５×１０５ｄｐｍ）、２５０μＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡとアクセプター基質で総量が２０μＬになるように混合した。アクセプター基質は以下のうち１つを用いた。ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚ（１００ｎｍｏｌ）、非還元末端にＧｌｃＮＡｃを持つＮ−ａｃｅｔｙｌｈｅｐａｒｏｓａｎオリゴ糖（２０μｇ）、部分的にＮ−硫酸化されたＮ−ａｃｅｔｙｌｈｅｐａｒｏｓａｎオリゴ糖誘導体（２０μｇ）、α−ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ（α−ＴＭ）（１ｎｍｏｌ）、ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−Ｓｅｒ（１ｎｍｏｌ）、ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ（１ｎｍｏｌ）、ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−（Ｇｌｙ）Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（１ｎｍｏｌ）、さらに、グリピカン−１、ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚのいずれかである。
反応産物は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＨＲ １０／３０カラムでゲルろ過し、これを０．４ｍＬずつ分取し、１．２％（ｗ／ｖ）２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｏｘａｚｏｌｅと３３％（ｗ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むカクテルを用いて液体シンチレーションカウンター（ＴＲＩ−ＣＡＲＢ ２９００ＴＲ，Ｐａｃｋｅｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．）で放射能を定量することで解析を行った。高分子領域に溶出されたラベルされた反応生成物は更に解析を行うため乾燥した。
（４）重合化反応生成物のキャラクタリゼーション
重合化した糖鎖の同定を行うため、乾燥させた放射活性産物（二糖として７０ｐｍｏｌ）を、３７℃ ｏｖｅｒｎｉｇｈｔでヘパリチナーゼ消化を行った。消化条件は６ｍＩＵ ｈｅｐａｒｉｔｉｎａｓｅ Ｉ、２０μＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）、２ｍＭ酢酸カルシウムを含む、総量１００μＬとした。消化産物はＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅカラムで解析をし、重合化した産物の鎖長を決定するため、グリピカン−１とα−ＴＭ上に生成した転移反応産物を、室温で２０時間、０．５Ｍ ＬｉＯＨを用いてコアタンパク質から切り離した。グリピカン−１、α−ＴＭ、ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚから得られた試料は、分子量マーカーとして市販のデキストラン製品（平均分子量１７０，０００〜２００，０００のものはＮａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ Ｉｎｃ．から、６５，０００、３７，５００、１８，１００のものはＳｉｇｍａから）を用いてＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムで解析した。
（５）分泌型ＥＸＴＬ３を用いた３糖合成基質（ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ− Ｃ ２ Ｈ ４ ＮＨＣｂｚ）の調製
ＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚは、化学合成したものを用いた。Ｎｏｖａ−ＰａｋＣ１８ ｃｏｌｕｍｎ（３．９Ｘ１５０ｍｍ）は、Ｗａｔｅｒｓ社より購入した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａが融合した分泌型ＥＸＴＬ３は、以前報告した様に調製した（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２００１ ９８：７１７６−７１８１）。概略、以下のとおりである。１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地で培養したＣＯＳ−１細胞に、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてＰｒｏｔｅｉｎ Ａが融合した分泌型ＥＸＴＬ３を発現させた。４８時間後、培養上精に分泌したタンパク質をＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓを用いて精製した。タンパク質が結合したＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓを、１００ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ，ｐＨ６．５の緩衝液に懸濁し、酵素源として使用した。
酵素反応は、精製したＥＸＴＬ３が結合したＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓ １０μｌ、１００ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ，ｐＨ６．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＡＴＰ、６ｐｍｏｌのＵＤＰ−［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃ（ａｂｏｕｔ ７．９Ｘ１０５ｄｐｍ）、９０ｎｍｏｌのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃそしてＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚ（９０ｎｍｏｌ）を加え、総量２０μｌで行った。３７℃で１８時間反応後、反応生成物はＮｏｖａ−Ｐａｋ Ｃ１８カラムを用いたＨＰＬＣにより精製した。精製画分は凍結乾燥した。
（６）β−グルクロニダーゼを用いた、反応生成物画分に含まれる未反応基質の除 去
りんご貝由来のβ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ（ＥＣ ３．２．１．３１）は、東京臓器製薬（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）より恵与された。上記で精製した反応生成物には、約３０ｎｍｏｌの未反応基質が含まれていた。そこで、未反応基質（ＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚ）を除くために、反応生成物画分を５０μｌの０．０５Ｍ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ４．５に溶解し、りんご貝由来のβ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ（７．３７ｍＩＵ）を加え、３７℃で１２時間処理した（Ｓｕｇａｈａｒａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．１９９２ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８３，９９−１０４）。処理した溶液をＳｕｐｅｒｄｅｘ ｐｅｐｔｉｄｅ ＨＲ １０／３０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にかけ、０．２Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３を溶出液に用いて放射活性のある画分を単離した。
尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、次に記載する特許請求の範囲内で、様々に変更して実施することができる。
産業上の利用の可能性
以上のように、本発明は、ヘパラン鎖のｉｎ ｖｉｔｒｏ合成法、並びに、同合成法を用いて生産されたヘパラン鎖、ヘパラン硫酸およびヘパリン等の糖鎖を提供するものであり、ヘパラン硫酸やヘパリンといった有用生理活性を有する硫酸化グリコサミノグリカンの糖鎖骨格の人工合成などに利用することができ、その他研究開発用などに種々の有用性を有するものである。
（ａ） ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−Ｓｅｒ（ＧｌｙＴｒｐＰｒｏＡｓｐＧｌｙ）のように、プロテオグリカンのＧＡＧ−蛋白質結合領域の四糖又は五糖の配列にコア蛋白質のオリゴペプチドが結合したもの、
（ｂ） ＧＡＧ−蛋白質結合領域類似体、即ち、ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚ（ここでＣｂｚは「ベンジルオキシカルボニル基（ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｇｒｏｕｐ）」を表す。以下同じ。）のように、ＧＡＧ−蛋白質結合領域の二糖配列に疎水性アグリコンが結合したもの、
（ｃ） ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚのように、ＧＡＧ−蛋白質結合領域の三糖配列に疎水性アグリコンが結合したもの、
（ｄ） グリピカン（Ｇｌｙｐｉｃａｎ）等のヘパラン硫酸プロテオグリカンのコア蛋白質配列に、ＧＡＧ−蛋白質結合領域の四糖又は五糖の配列が結合したもの、
（ｅ） α−トロンボモデュリン（α−ＴＭ）等のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコア蛋白質配列に、ＧＡＧ−蛋白質結合領域の四糖又は五糖の配列が結合したもの。
上記（ａ）については、ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１という五糖配列にオリゴペプチドが結合したものを使用してもよい。オリゴペプチドは、疎水性アグリコンとして、疎水性アミノ酸を１以上含むものが好ましく、具体的には、ベンゼン環を有するトリプトファン（Ｔｒｐ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、あるいは環式α−イミノ酸であるプロリン（Ｐｒｏ）といった疎水性アミノ酸を含むペプチド配列であることが好ましい。配列の長さは特に限定されるものではない。例えば、上記ペプチド配列のほか、ＧＡＧ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｓｉｔｅ近傍の報告されているペプチド配列（Ｌｉｊｕａｎ Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｄ．Ｅｓｋｏ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１９２９５−１９２９９，１９９４参照）をもとに配列を決定するとよい。
上記（ｂ）（ｃ）は、重合開始剤として、ベンゼン環を有するＣ２Ｈ４ＮＨＣｂｚのような疎水性アグリコンを使用する。疎水性アグリコンの他の例としては、既にヘパラン硫酸合成のキシロシドのアグリコンとして報告されたｅｓｔｒａｄｉｏｌやそれを含む構造（Ｆｕｌｇｅｎｔｉｕｓ Ｎ．Ｌｕｇｅｍｗａ ａｎｄ Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｄ．Ｅｓｋｏ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２３９，２８５−２９０，１９９３参照）、あるいは、ｎａｐｈｔｏｌのようなベンゼン環を２つ以上含む構造（Ｔｉｍｏｔｈｙ Ａ．Ｆｒｉｔｚ，Ｆｕｌｇｅｎｔｉｕｓ Ｎ．Ｌｕｇｅｍｗａ，Ａｒｕｎ Ｋ．Ｓａｒｋａｒ ａｎｄ Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｄ．Ｅｓｋｏ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，３００−３０７，１９９４、および、Ａｒｕｎ Ｋ．Ｓａｒｋａｒ ａｎｄ Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｄ．Ｅｓｋｏ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２７９，１６１−１７１，１９９５参照）の利用が挙げられる。
上記（ｄ）（ｅ）は、重合開始剤として、グリピカン−１（Ｇｌｙｐｉｃａｎ−１）等のヘパラン硫酸プロテオグリカン、あるいは、α−トロンボモデュリン（α−ＴＭ）等のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコア蛋白質配列に、ＧＡＧ−蛋白質結合領域の四糖又は五糖の配列が結合したものを使用する。
ヘパラン硫酸プロテオグリカンの他の例としては、グリピカン−２〜−６、シンデカン−１〜−４、パールカン、ベーターグリカンなどを挙げることができる。また、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの他の例としては、アグリカン、バーシカン、ニューロカン、ブレビカン、フォスファカン、デコリン、ビグリカン、セルグリシン、アピカン、ＮＧ２などを挙げることができ、これらのコアタンパク質を使用するものであってもよい。
後述の実施例に示すように、上記いずれの重合開始剤を使用する場合にも、ヘパラン鎖の合成反応には、分泌型のＥＸＴ１及びＥＸＴ２を共発現させたものを酵素に使用することが好ましい。ただし、一定の重合開始剤を使用する場合には、分泌型ＥＸＴ１単独を使用してもヘパラン鎖を合成することが可能である。例えば、上記（ｃ）に掲げるＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚを重合開始剤に使用する場合には、ＥＸＴ１のみであってもヘパラン鎖を合成することができた（後述の実施例５参照）。対照的に、上記（ｂ）に掲げるＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚを重合開始剤に使用する場合には、ＥＸＴ１単独ではヘパラン鎖を合成することができなかった（後述の表１参照）。
上記実験結果から、四糖結合領域のグルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）にＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を転移する反応については、ＥＸＴ１及びＥＸＴ２のコンプレックスが重要であるが、その後の二糖繰り返し領域の伸長反応については、ＥＸＴ１単独でも糖鎖を伸長させることが可能と考えられた。したがって、結合領域五糖配列（ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−）がペプチド（又はプロテオグリカンのコア蛋白質配列）に結合したもの、あるいは（ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−）といった結合領域三糖配列に疎水性アグリコンが結合したものを重合開始剤に使用するときには、ＥＸＴ１のみを酵素に使用してヘパラン鎖を合成してもよい。
ヘパラン鎖合成反応のその他の条件、使用する試薬などは後述の実施例記載のものに限定されるものではなく、公知の糖鎖合成反応に用いられている各種条件、試薬などから最適なものを選択すればよい。
また、上記方法により合成されたヘパラン鎖を材料に使用してヘパラン硫酸（又はヘパリン）を製造する方法としては、（１）遺伝子組み換え技術で調製した硫酸基転移酵素を使用する方法、（２）化学合成法、あるいは、（１）・（２）の方法を組み合わせた半化学合成法、の３つの方法を挙げることができる。
上記（１）の方法としては、遺伝子組み換え技術で調製した各種硫酸基転移酵素（例えば、Ｗｕ ＺＬ，Ｚｈａｎｇ Ｌ，Ｂｅｅｌｅｒ ＤＬ，Ｋｕｂｅｒａｎ Ｂ，ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＲＤ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．，１６，５３９−５４５，２００２、および、Ｋｕｂｅｒａｎ Ｂ，Ｌｅｃｈ ＭＺ，Ｂｅｅｌｅｒ ＤＬ，Ｗｕ ＺＬ，ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＲＤ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１，１３４３−１３４６，２００３参照）を使用して所望の位置に硫酸基を転移する方法が挙げられる。
上記（２）の化学合成法としては、例えば、Ｂ．Ｃａｓｕ，Ａ．Ｎａｇｇｉ，ａｎｄ Ｇ．Ｔｏｒｒｉ，Ｓｙｎｈｔｅｓｉｓ ｏｆ ｓｕｌｆａｔｅｄ ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ，ｉｎ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＩＩＩ，ｐｐ．１８９５−１９０３，２００１，Ｅｄ．ｂｙ Ｂｅｒｔｒａｍ Ｆｒａｓｅｒ−Ｒｅｉｄ，Ｋｕｎｉａｋｉ Ｔａｔｓｕｔａ ａｎｄ Ｊｏａｃｈｉｍ Ｔｈｉｅｍ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒに記載される、化学的にヘパランからヘパラン硫酸を生産する方法が挙げられる。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。尚、各実施例における詳しい実験方法については、最後の項においてまとめて説明する。
〔実施例１：Ｎ−ａｃｅｔｙｌｈｅｐａｒｏｓａｎオリゴ糖は、ＥＸＴ１とＥＸＴ２を共発現させた複合体によって数糖のみ伸長する〕
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＳ重合化について検討するため、様々なＥＸＴタンパク質を組み合わせたり、組換え型ＥＸＴタンパク質の発現方法を検討したり、重合化反応に適した開始基質を探すため、様々な重合化反応条件を予備的に実験してきた。
ＥＸＴ１とＥＸＴ２がヘテロオリゴマー複合体を形成し触媒活性を強めることや、小胞体からゴルジ装置へ細胞内局在をシフトすることが知られている。また、全長の一部が切断された分泌型のＥＸＴ１とＥＸＴ２とを共発現させると、ＥＸＴ１とＥＸＴ２とをそれぞれ単独で発現させた場合と比較して、Ｎ−ａｃｅｔｙｌｈｅｐａｒｏｓａｎオリゴ糖アクセプター基質へのＧｌｃＮＡｃまたはＧｌｃＵＡ単独の糖転移活性を強めることも報告されている。この結果から、糖鎖重合化活性は検出されていなかったが、膜貫通領域や細胞質領域を欠くＥＸＴ１およびＥＸＴ２の切断型は、複合体を形成するのに十分であると考えられた。
したがって、本実施例および後述の各実施例では、内因性酵素や他のタンパク質からの酵素タンパク質の精製を容易にするため、全長型ではなく切断型のＥＸＴ１とＥＸＴ２をＰｒｏｔｅｉｎ Ａタグの付いた融合タンパク質として発現させた。この分泌型タンパク質は、ＥＸＴ１とＥＸＴ２を単独もしくは共にＣＯＳ−１細胞に導入することによって発現分泌させ、精製後様々なプライマー基質とともに酵素反応に用いた。
Ｎ−ａｃｅｔｙｌｈｅｐａｒｏｓａｎ Ｋ５オリゴ糖（ＧｌｃＮＡｃα１−（４ＧｌｃＵＡβ１−４ＧｌｃＮＡｃα１）ｎ−４ＧｌｃＵＡβ１−Ｏ−２，５−ａｎｈｙｄｒｏＭａｎ）は、ヘパリン／ヘパラン硫酸の二糖繰り返し領域と同じ構造を持ち、それゆえグルクロン酸転移酵素−ＩＩやＧｌｃＮＡｃＴ−ＩＩ活性を測定するための有用なアクセプター基質として用いられているので、まず初めに、ＵＤＰ−［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃとＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ共存下でＥＸＴ１とＥＸＴ２を共発現（ＥＸＴ１−ＥＸＴ２）させ重合化を行ったが、重合化の開始基質とならないことが分かった。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅカラムでのゲルろ過クロマトグラフィーによる反応生成物の溶出位置から、高い［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃの組込みがなく、使用したオリゴ糖の非還元末端に数糖だけ付加したものと判断された（図１の□印参照）。
マウスの肥満細胞腫由来の酵素源を用いると、続いて起こるＮ−ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ／Ｎ−ｓｕｌｆｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＮＤＳＴ）反応がヘパリン鎖の重合化を数倍促進することが報告されているため、部分的にＮ−硫酸化されたＫ５オリゴ糖誘導体を開始剤として調べたが良い開始剤にはならなかった（図１の■印参照）。これらの結果から、さらに糖以外の何か別の成分がＨＳポリメラーゼ反応に必要であること、例えば、コアタンパク質またはその一部オリゴペプチドといったタンパク質成分などが重合化に有用な開始剤であると考えられた。
〔実施例２：ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヘパラン重合化にはＥＸＴ１−ＥＸＴ２の共発現に加えて結合領域類似体が必要である〕
ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚやＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−ナフタレンメタノールのような結合領域類似体合成物が、ＥＸＴＬ２やＥＸＴＬ３のＧｌｃＮＡｃＴ−Ｉ活性のアクセプター基質となることから、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）−タンパク質の結合領域四糖部分に最初のＧｌｃＮＡｃを転移する反応さらに重合化反応においても、上記類似体、あるいはコアタンパク質（とりわけその疎水的な領域）が必要であると考えられた。それゆえ、本実施例では、まず、分泌型ＥＸＴ１とＥＸＴ２を共発現させた重合化反応の開始剤としてＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚを用いた。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅカラムでゲルろ過クロマトグラフィーを行ったところ、顕著な糖鎖の重合化が起こり（図１の●印参照）、上記類似体が、反応の開始だけでなく糖鎖の重合化にも重要であることが示された。また、ＧｌｃＮＡｃＴ−Ｉ活性を持つＥＸＴＬ２とＥＸＴＬ３は、本重合化反応では不必要であった。
ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚは人工的な基質であるため、次に、天然のＨＳプロテオグリカンのコアタンパク質を用いて実験を行った。しかし、結合領域四糖または六糖を有するＨＳプロテオグリカンは手に入らないため、代表的なＨＳプロテオグリカンの一種であるグリピカン−１を、ＨＳが欠損したｓｏｇ９細胞にタグの付いた分泌型タンパク質として発現させ、短いＨＳオリゴ糖の結合したコアタンパク質として調製した。ｓｏｇ９細胞はＥＸＴ１遺伝子の変異不活性化のためにＨＳ合成が不完全であり、それゆえ、ＨＳ重合体による修飾を受けていないグリピカン−１が細胞培養上清中に分泌される。グリピカン−１の発現は抗Ｍｙｃ抗体を用いたウェスタンブロット法によって確認した。このようにＨＳ欠損ｓｏｇ９細胞によって合成された組換え型グリピカン−１を、Ｎｉ−ＮＴＡを用いて精製し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ重合化に用いたところ、良好なヘパラン重合化の開始剤となった（図１の▲印参照）。本重合化反応に用いたグリピカン−１の濃度が低いことを考慮すると、ｉｎ ｖｉｖｏでは、グリピカン−１には人工基質に比べてはるかに高いヘパラン受容体としての活性があると考えられた。
次に、巨大なコアタンパク質に結合領域四糖を持つパートタイムプロテオグリカンであるα−トロンボモデュリン（α−ＴＭ）を開始剤に用いて、ヘパラン鎖の重合化（伸長反応）の有無を検討した。その結果、トロンボモデュリン（ＴＭ）はｉｎ ｖｉｖｏではコンドロイチン硫酸（ＣＳ）のみを有し、ＨＳ鎖は持たないことが知られているにもかかわらず、顕著な重合化が観察された（図１の○印参照）。対照的に、ＴＭ由来の結合領域四糖ペプチドＧｌｃＵＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ−（Ｇｌｙ）Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（図１の◇印参照）や結合領域四糖−Ｓｅｒ（下記の表１参照）のどちらも、糖鎖重合化の開始剤にならなかった。他方、ＨＳまたはＣＳが結合するβグリカンに相当する結合領域五糖ペプチドＧｌｃＵＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙについては、弱い開始剤としての活性を示した（図１の△印参照）。
以上の実験結果を下記の表１にまとめた。
〔実施例３：重合化生成物の同定〕
重合化反応生成物は、典型的なヘパラン鎖とＨＳ鎖のα１，４−ＧｌｃＮＡｃでＧｌｃＵＡに結合した部分を切断するヘパリチナーゼＩ消化を行い、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅカラムでゲルろ過クロマトグラフィーを行った。プライマー基質としてのグリピカン−１やα−ＴＭ、ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚから得られた未消化の重合化反応生成物はそれぞれ高分子領域に溶出され、ヘパリチナーゼＩ消化後の生成物は二糖の溶出位置に溶出し、完全に消化されたことから、重合化反応生成物は−（４ＧｌｃＵＡβ１−４ＧｌｃＮＡｃα１）ｎ−から構成されていることが分かった（図２参照）。グリピカン−１とα−ＴＭから得られた重合化反応生成物もヘパリチナーゼＩによって完全に分解された。
〔実施例４：重合化反応生成物の大きさの解析〕
次に、グリピカン−１、α−ＴＭ、ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚ上に合成された重合化反応生成物をＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムでゲルろ過クロマトグラフィーを行うことにより鎖長を測定した。グリピカン−１やα−ＴＭから得られた反応生成物の場合、アルカリ還元によって糖鎖を切り離し、ゲルろ過分析にかけた。両方のアクセプター上に合成されたヘパラン鎖は、予備実験おいてＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラムの高分子領域に溶出されたため、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムにかけたところ、３つの基質上すべてに非常に長い糖鎖が合成されたことが明らかになった（図３参照）。ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚ上に合成されたヘパラン鎖は平均分子量１７０ｋＤａ付近に溶出され、グリピカン−１やα−ＴＭ上に合成された糖鎖はＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムの分画範囲を超えた高分子領域（〜２００ｋＤａ）に現れ（図３）、様々な組織で見られるＨＳ鎖（１０−７０ｋＤａ）よりも長く分子量が大きいことが示唆された。これらの結果から、分泌型ＥＸＴ１、ＥＸＴ２を共発現させて調製した酵素は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでα−ＴＭやＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚ上に生体内と同様に長いヘパラン重合体を合成することができることが示された。
〔実施例５：ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚを重合開始剤に用いたヘパラン鎖の重合化反応〕
ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚを後述の方法によって調製し、これを重合開始剤に使用してヘパラン鎖の重合化反応を行った。方法は概略以下のとおりである。まず、１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地で培養したＣＯＳ−１細胞に、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてＰｒｏｔｅｉｎ Ａが融合した分泌型ＥＸＴ１あるいはＥＸＴ２、もしくは分泌型ＥＸＴ１とＥＸＴ２を共発現させた。４８時間後、培養上清に分泌したタンパク質をＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓを用いて精製した。タンパク質が結合したＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓを、１００ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ，ｐＨ６．５の緩衝液に懸濁し、酵素源として使用した。
重合化反応は、精製した酵素が結合したＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓ １０μｌ、１００ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ，ｐＨ６．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＡＴＰ、３１μＭ ＵＤＰ−［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃ（約０．７Ｘ１０５ｄｐｍ）、３１μＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡそしてＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚ（０．６５ｎｍｏｌ）を加え、総量２０μｌで行った。３７℃で１８時間反応後、反応生成物をＳｕｐｅｒｄｅｘ ｐｅｐｔｉｄｅ ＨＲ １０／３０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にかけ、０．２Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３を溶出液に用いて分画後（０．４ｍＬ／Ｆｒ．）、放射活性を測定した。その結果を図４に示す。図中の括弧内の数字は、使用した培養上清の容量を示す。
同図に示すように、分泌型ＥＸＴ１とＥＸＴ２を共発現させると（ＥＸＴ１／２）、非常に強い重合化反応が観察された。また、ＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＨＣｂｚを基質に用いた場合と異なり、ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚを基質に用いると、ＥＸＴ１単独でも、弱いながらも重合化反応が観察された。しかしながら、ＥＸＴ２単独ではどちらの基質を用いても重合反応は観察できなかった。
〔実験方法〕
（１）材料
ＵＤＰ−［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃはＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。ラベルされていないＵＤＰ−ＧｌｃＵＡとＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃはＳｉｇｍａから、Ｈｅｐａｒｉｔｉｎａｓｅ Ｉは生化学工業（東京）から購入した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ５菌株の莢膜の多糖から調製したＮ−Ａｃｅｔｙｌｈｅｐａｒｏｓａｎオリゴ糖（ＧｌｃＮＡｃα１−（４ＧｌｃＵＡβ１−４ＧｌｃＮＡｃα１）ｎ−４ＧｌｃＵＡβ１−Ｏ−２，５−ａｎｈｙｄｒｏＭａｎ）と、その一部がＮ−硫酸化された誘導体は、スウェーデンのウプサラ大学のＭａｒｉｏｎ Ｋｕｓｃｈｅ−Ｇｕｌｌｂｅｒｇ氏とＵｌｆ Ｌｉｎｄａｈｌ氏から譲り受けた。ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−Ｓｅｒ、ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−（Ｇｌｙ）Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙの３種の重合開始剤は化学的に合成した。ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚも化学合成した。精製されたα−ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎは第一製薬（東京）から恵与された。マウスｓｏｇ９細胞はＦｒａｎｋ Ｔｕｆａｒｏ氏から譲り受けた。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ＰｅｐｔｉｄｅとＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ１０／３０カラムはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製のものを使用した。
（２）重合化反応の基質としての組換え型グリピカン−１の精製
Ｃ末端側の１９アミノ酸をコードした配列を除いたヒトグリピカン−１のｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１（−）ＭｙｃＨｉｓ Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＥｃｏＲＩサイトとＢａｍＨＩサイトの間に組み込み、マウスｓｏｇ９細胞をレシピエント細胞として安定発現細胞を作製した。得られた安定発現細胞は、Ｃ末端側でＭｙｃ−Ｈｉｓタグと融合した組み換え型タンパク質としてグリピカン−１を細胞培養上清中に分泌した。分泌されたタンパク質はＮｉ−ＮＴＡ−ａｇａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓ（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、重合化反応の基質として用いた。
（３）分泌型ＥＸＴ１及びＥＸＴ２の発現と重合化反応
ＣＯＳ−１細胞を、ウシ胎仔血清を１０％加えたＤＭＥＭで培養し、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて分泌型のＥＸＴ１とＥＸＴ２をそれぞれ単独、または共発現させ、４８時間後、分泌されたＰｒｏｔｅｉｎ Ａタグの付いたタンパク質をＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて精製した。そして、酵素が結合したＩｇＧ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅをｐＨ６．５の１００ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨで懸濁し、酵素源として用いた。
重合化反応には、精製した酵素が結合したＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ １０μＬ、１００ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、１ｍＭ ＡＴＰ、２５０μＭ ＵＤＰ−［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃ（約５．５×１０５ｄｐｍ）、２５０μＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡとアクセプター基質で総量が２０μＬになるように混合した。アクセプター基質は以下のうち１つを用いた。ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚ（１００ｎｍｏｌ）、非還元末端にＧｌｃＮＡｃを持つＮ−ａｃｅｔｙｌｈｅｐａｒｏｓａｎオリゴ糖（２０μｇ）、部分的にＮ−硫酸化されたＮ−ａｃｅｔｙｌｈｅｐａｒｏｓａｎオリゴ糖誘導体（２０μｇ）、α−ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ（α−ＴＭ）（１ｎｍｏｌ）、ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−Ｓｅｒ（１ｎｍｏｌ）、ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ（１ｎｍｏｌ）、ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−（Ｇｌｙ）Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（１ｎｍｏｌ）、さらに、グリピカン−１、ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚのいずれかである。
反応産物は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＨＲ １０／３０カラムでゲルろ過し、これを０．４ｍＬずつ分取し、１．２％（ｗ／ｖ）２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｏｘａｚｏｌｅと３３％（ｗ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むカクテルを用いて液体シンチレーションカウンター（ＴＲＩ−ＣＡＲＢ ２９００ＴＲ，Ｐａｃｋｅｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．）で放射能を定量することで解析を行った。高分子領域に溶出されたラベルされた反応生成物は更に解析を行うため乾燥した。
（４）重合化反応生成物のキャラクタリゼーション
重合化した糖鎖の同定を行うため、乾燥させた放射活性産物（二糖として７０ｐｍｏｌ）を、３７℃ ｏｖｅｒｎｉｇｈｔでヘパリチナーゼ消化を行った。消化条件は６ｍＩＵ ｈｅｐａｒｉｔｉｎａｓｅ Ｉ、２０μＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）、２ｍＭ酢酸カルシウムを含む、総量１００μＬとした。消化産物はＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅカラムで解析をし、重合化した産物の鎖長を決定するため、グリピカン−１とα−ＴＭ上に生成した転移反応産物を、室温で２０時間、０．５Ｍ ＬｉＯＨを用いてコアタンパク質から切り離した。グリピカン−１、α−ＴＭ、ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚから得られた試料は、分子量マーカーとして市販のデキストラン製品（平均分子量１７０，０００〜２００，０００のものはＮａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ Ｉｎｃ．から、６５，０００、３７，５００、１８，１００のものはＳｉｇｍａから）を用いてＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムで解析した。
（５）分泌型ＥＸＴＬ３を用いた３糖合成基質（ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ− Ｃ ２ Ｈ ４ ＮＨＣｂｚ）の調製
ＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚは、化学合成したものを用いた。Ｎｏｖａ−ＰａｋＣ１８ ｃｏｌｕｍｎ（３．９Ｘ１５０ｍｍ）は、Ｗａｔｅｒｓ社より購入した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａが融合した分泌型ＥＸＴＬ３は、以前報告した様に調製した（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２００１ ９８：７１７６−７１８１）。概略、以下のとおりである。１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地で培養したＣＯＳ−１細胞に、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてＰｒｏｔｅｉｎ Ａが融合した分泌型ＥＸＴＬ３を発現させた。４８時間後、培養上精に分泌したタンパク質をＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓを用いて精製した。タンパク質が結合したＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓを、１００ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ，ｐＨ６．５の緩衝液に懸濁し、酵素源として使用した。
酵素反応は、精製したＥＸＴＬ３が結合したＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓ １０μｌ、１００ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ，ｐＨ６．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＡＴＰ、６ｐｍｏｌのＵＤＰ−［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃ（ａｂｏｕｔ ７．９Ｘ１０５ｄｐｍ）、９０ｎｍｏｌのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃそしてＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚ（９０ｎｍｏｌ）を加え、総量２０μｌで行った。３７℃で１８時間反応後、反応生成物はＮｏｖａ−Ｐａｋ Ｃ１８カラムを用いたＨＰＬＣにより精製した。精製画分は凍結乾燥した。
（６）β−グルクロニダーゼを用いた、反応生成物画分に含まれる未反応基質の除 去
りんご貝由来のβ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ（ＥＣ ３．２．１．３１）は、東京臓器製薬（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）より恵与された。上記で精製した反応生成物には、約３０ｎｍｏｌの未反応基質が含まれていた。そこで、未反応基質（ＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚ）を除くために、反応生成物画分を５０μｌの０．０５Ｍ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ４．５に溶解し、りんご貝由来のβ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ（７．３７ｍＩＵ）を加え、３７℃で１２時間処理した（Ｓｕｇａｈａｒａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．１９９２ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８３，９９−１０４）。処理した溶液をＳｕｐｅｒｄｅｘ ｐｅｐｔｉｄｅ ＨＲ １０／３０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にかけ、０．２Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３を溶出液に用いて放射活性のある画分を単離した。
尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、次に記載する特許請求の範囲内で、様々に変更して実施することができる。
産業上の利用の可能性
以上のように、本発明は、ヘパラン鎖のｉｎ ｖｉｔｒｏ合成法、並びに、同合成法を用いて生産されたヘパラン鎖、ヘパラン硫酸およびヘパリン等の糖鎖を提供するものであり、ヘパラン硫酸やヘパリンといった有用生理活性を有する硫酸化グリコサミノグリカンの糖鎖骨格の人工合成などに利用することができ、その他研究開発用などに種々の有用性を有するものである。
Claims (9)
- 下記（ａ）〜（ｅ）からなる群から選ばれる重合開始剤を用いて合成されたヘパラン鎖。
（ａ） ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−Ｓｅｒ（ＧｌｙＴｒｐＰｒｏＡｓｐＧｌｙ）のように、プロテオグリカンのＧＡＧ−蛋白質結合領域の四糖又は五糖の配列にコア蛋白質のオリゴペプチドが結合したもの、
（ｂ） ＧＡＧ−蛋白質結合領域類似体、即ち、ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚのように、ＧＡＧ−蛋白質結合領域の二糖配列に疎水性アグリコンが結合したもの、
（ｃ） ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚのように、ＧＡＧ−蛋白質結合領域の三糖配列に疎水性アグリコンが結合したもの、
（ｄ） グリピカン等のヘパラン硫酸プロテオグリカンのコア蛋白質配列に、ＧＡＧ−蛋白質結合領域の四糖又は五糖の配列が結合したもの、
（ｅ） α−トロンボモデュリン等のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコア蛋白質配列に、ＧＡＧ−蛋白質結合領域の四糖又は五糖の配列が結合したもの。 - ＥＸＴ１びＥＸＴ２の２つの酵素を野生型より短く可溶性にして共発現させたものを使用して合成された、請求項１記載のヘパラン鎖。
- 結合領域五糖配列（ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−）がペプチドに結合したもの、又は（ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−）といった結合領域三糖配列に疎水性アグリコンが結合したものを重合開始剤に使用し、かつ、野生型より短く可溶性にして発現させたＥＸＴ１のみを酵素に使用して合成された、請求項１記載のヘパラン鎖。
- 請求項１記載のヘパラン鎖を材料に使用して製造されたヘパラン硫酸。
- 請求項１記載のヘパラン鎖を材料に使用して製造されたヘパリン。
- 下記（ａ）〜（ｅ）からなる群から選ばれる重合開始剤を用いたヘパラン鎖合成方法。
（ａ） ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−Ｓｅｒ（ＧｌｙＴｒｐＰｒｏＡｓｐＧｌｙ）のように、プロテオグリカンのＧＡＧ−蛋白質結合領域の四糖又は五糖の配列にコア蛋白質のオリゴペプチドが結合したもの、
（ｂ） ＧＡＧ−蛋白質結合領域類似体、即ち、ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚのように、ＧＡＧ−蛋白質結合領域の二糖配列に疎水性アグリコンが結合したもの、
（ｃ） ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨＣｂｚのように、ＧＡＧ−蛋白質結合領域の三糖配列に疎水性アグリコンが結合したもの、
（ｄ） グリピカン等のヘパラン硫酸プロテオグリカンのコア蛋白質配列に、ＧＡＧ−蛋白質結合領域の四糖又は五糖の配列が結合したもの、
（ｅ） α−トロンボモデュリン等のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコア蛋白質配列に、ＧＡＧ−蛋白質結合領域の四糖又は五糖の配列が結合したもの。 - ＥＸＴ１及びＥＸＴ２の２つの酵素を野生型より短く可溶性にして共発現させたものを使用することを特徴とする、請求項６記載のヘパラン鎖合成方法。
- 結合領域五糖配列（ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−）がペプチドに結合したもの、又は（ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−）といった結合領域三糖配列に疎水性アグリコンが結合したものを重合開始剤に使用し、かつ、野生型より短く可溶性にして発現させたＥＸＴ１のみを酵素に使用することを特徴とする、請求項６記載のヘパラン鎖合成方法。
- 請求項６記載の方法により合成されたヘパラン鎖を材料に使用して、（１）遺伝子組み換え技術で調製した硫酸基転移酵素を使用する方法、（２）化学合成法、あるいは、（１）・（２）の方法を組み合わせた半化学合成法によってヘパラン硫酸又はヘパリンを製造する方法。
Applications Claiming Priority (3)
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|---|---|---|---|
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| JP2005506411A Withdrawn JPWO2004104208A1 (ja) | 2003-05-23 | 2004-05-20 | ヘパラン鎖のｉｎｖｉｔｒｏ合成法とその利用 |
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2004
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|---|---|
| WO2004104208A1 (ja) | 2004-12-02 |
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