JP5977949B2 - コンドロイチンまたはコンドロイチン硫酸を分解する分解方法、高硫酸化オリゴ糖の製造方法、ならびに組成物 - Google Patents

Description

本発明は、コンドロイチンおよびコンドロイチン硫酸の分解技術に関する。

コンドロイチン（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ：ＣＨ）は、アミノ糖誘導体とヘキソース誘導体の繰り返し構造を有する直鎖状の多糖体であるグリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ）の１つであり、Ｎ−アセチルコンドロシンのポリマーである（図１）。また、コンドロイチン硫酸（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ：ＣＳ）は、コンドロイチンが硫酸化されたグリコサミノグリカンの１つである。コンドロイチン硫酸は、コアタンパク質に結合したプロテオグリカンとして動物組織に広く分布しており、動物の発生、分化、成長および再生に重要な役割を担っている。コンドロイチン硫酸は、たとえば軟骨中の主要成分として、水和力や弾性に寄与して軟骨組織形成に役立っている。また、コンドロイチン硫酸は、多様な生理活性分子との結合性を示し、生理活性分子の貯留、安定化あるいはマスキングの役割を持ち、細胞膜受容体と協働して、シグナル伝達機構を制御している。また、コンドロイチン硫酸は、神経系においては神経細胞の軸索の伸展促進や阻害効果を示し、免疫系細胞においては顆粒に存在し、免疫物質の蓄積や放出を制御している。マラリヤ原虫やウイルスなどの感染においては、コンドロイチン硫酸は、受容体となるとともに、感染阻害効果を示すことが知られている。

コンドロイチン硫酸は、分子量数万（糖鎖数２０〜４００個）の直鎖多糖体構造を有する。この構造は、グルクロン酸（ＧｌｃＡ）とＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）とがβ１−３およびβ１−４で交互に結合した二糖の繰り返しを基本構造とする。コンドロイチン硫酸は、コンドロイチンが、たとえば図１に示すような多様な硫酸基修飾を受けた物質である。

具体的には、コンドロイチン硫酸は、上記ＧｌｃＡ−ＧａｌＮＡｃのコンドロイチン二糖単位（０Ｓ構造ともいう）を基本とし、ＧａｌＮＡｃ残基４位が硫酸化（４Ｓ）されたＡ構造（４Ｓ構造ともいう）、ＧａｌＮＡｃ残基６位が硫酸化（６Ｓ）されたＣ構造（６Ｓ構造ともいう）、ＧｌｃＡ残基２位とＧａｌＮＡｃ残基６位の二糖単位のうち２カ所が硫酸化（２Ｓ，６Ｓ）されたＤ構造（ＳＤ構造ともいう）、ＧａｌＮＡｃ残基の４位と６位の２カ所が硫酸化（４Ｓ，６Ｓ）されたＥ構造（ＳＥ構造ともいう）、ＧｌｃＡ残基２位、ＧａｌＮＡｃ残基４位および６位の計３カ所が硫酸化（２Ｓ，４Ｓ，６Ｓ）されたｔｒｉＳ構造など、様々な修飾二糖単位を含む。コンドロイチン硫酸は、図１に示した硫酸基修飾構造が組み合わさった、きわめて複雑な多糖体構造を有する。

グリコサミノグリカンには、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）に加え、デルマタン硫酸（Ｄｅｒｍａｔａｎ ｓｕｌｆａｔｅ：ＤＳ）、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ：ＨＡ）、ヘパラン硫酸、ヘパリン、およびケラタン硫酸（Ｋｅｒａｔａｎ ｓｕｌｆａｔｅ：ＫＳ）が含まれる。デルマタン硫酸は、ＧａｌＮＡｃの４位が硫酸基修飾されＧｌｃＡの５位がエピメリ化してイデュロン酸（ＩｄｏＡ）になった構造（Ｂ構造）を含む、コンドロイチン硫酸と類似の糖鎖である（図１）。ヒアルロン酸（ＨＡ）は、コンドロイチンと類似の糖鎖結合を有するが、ＧａｌＮＡｃに代えてＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を有する（図１）。ヒアルロン酸は、非常に長い直鎖多糖体構造（分子量８０〜２００万）を有する、硫酸化されていない多糖体である。ヘパラン硫酸（およびヘパリン）は、ＧｌｃＡとＧｌｃＮＡｃの繰り返し構造を基本とするが、結合様式がβ１−４およびα１−４であり、ＧｌｃＮ残基の２位アミノ基、６位および３位水酸基、ＧｌｃＡの２位水酸基が硫酸化され、ＧｌｃＡがＩｄｏＡにエピメリ化された複雑な構造を有する。ケラタン硫酸は、他のグリコサミノグリカンとは異なり、ウロン酸に代えてＤ−ガラクトースを有する。

コンドロイチン硫酸分解用酵素は、コンドロイチナーゼとも呼ばれている。コンドロイチン硫酸分解用酵素には、主に動物細胞由来の加水分解酵素と、主に微生物由来の切断糖鎖の非還元末端が不飽和グルクロン酸残基となるリアーゼ（ｌｙａｓｅ）とがある。これらのコンドロイチン硫酸分解用酵素は、コンドロイチン硫酸構造解析用途や組織微細構造解析用途の試薬として市販されており、椎間板ヘルニアや脊椎損傷治療薬として臨床開発も展開されている。

リアーゼ活性を示すコンドロイチン硫酸分解用酵素として、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のコンドロイチナーゼＡＢＣ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のコンドロイチナーゼＡＣＩやコンドロイチナーゼＢ、およびＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ由来のコンドロイチナーゼＡＣＩＩなど、原核生物である真正細菌（バクテリア）由来の酵素が知られている。なお、ウイルス由来の酵素は知られていなかった。

コンドロイチン硫酸分解用酵素のリアーゼ活性には、基質特異性があることが知られている。つまり、コンドロイチナーゼＡＢＣは、Ａ構造（４硫酸）およびＣ構造（６硫酸）をはじめ、ほとんどのコンドロイチン硫酸とＢ構造のデルマタン硫酸を切断する（特許文献１）。一方、コンドロイチナーゼＡＣＩおよびＡＣＩＩは、Ａ構造（４硫酸）およびＣ構造（６硫酸）のコンドロイチン硫酸を切断するが、イデュロン酸を持つデルマタン硫酸は切断しない。なお、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｓｅｓ ｈｙａｌｕｒｏｌｙｔｉｃｕｓ由来のヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸を切断するが、コンドロイチン硫酸は切断しない。

特開平０６−０９８７６９号公報

しかしながら、従来のコンドロイチン硫酸分解酵素は、基質特異性が低いという問題があった。

たとえば、特許文献１のコンドロイチナーゼＡＢＣや、コンドロイチナーゼＡＣＩおよびＡＣＩＩは、コンドロイチン硫酸だけでなく、ヒアルロン酸も切断してしまうという問題があった。また、従来のコンドロイチナーゼは、ｐＨや温度の至適範囲が狭い場合もあった。そのため、産業上の利用可能性が制限されていた。コンドロイチンの分解に関しても同様の問題があった。

本発明はこうした状況に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、コンドロイチン硫酸類に対する分解反応の特異性が高く、ｐＨや温度の至適範囲が広いコンドロイチン分解用およびコンドロイチン硫酸分解用酵素を提供することにある。

なお、本明細書中で「コンドロイチン硫酸類」というときには、コンドロイチンおよびコンドロイチン硫酸を意味するものとする。

上記課題を解決するために、本発明のある態様のコンドロイチン分解用またはコンドロイチン硫酸分解用の酵素は、下記の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のアミノ酸配列を有することを特徴とする。
アクセッション番号ＡＡＡ８１５８７のアミノ酸配列（ａ）；
アミノ酸配列（ａ）の部分アミノ酸配列（ｂ）；
アミノ酸配列（ａ）または部分アミノ酸配列（ｂ）をコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（ｃ）

この態様によると、コンドロイチンまたはコンドロイチン硫酸に対する分解反応の特異性が高い酵素を提供することができる。

本発明の別の態様は、コンドロイチン分解用またはコンドロイチン硫酸分解用の酵素を含む試薬である。この試薬は、本発明のある態様の酵素を含むことを特徴とする。

この態様によると、コンドロイチンまたはコンドロイチン硫酸に対する分解反応の特異性が高い試薬を提供することができる。

本発明の別の態様は、コンドロイチンまたはコンドロイチン硫酸を分解する分解方法である。この分解方法は、本発明のある態様の酵素を用いてコンドロイチンまたはコンドロイチン硫酸の分解を行うことを特徴とする。

この態様によると、コンドロイチンまたはコンドロイチン硫酸に対する分解反応の特異性が高い分解方法を提供することができる。

本発明の別の態様は、高硫酸化オリゴ糖の製造方法である。この高硫酸化オリゴ糖の製造方法は、本発明のある態様の分解方法にてコンドロイチン硫酸を分解してオリゴ糖を生成することを特徴とする。

この態様によると、高硫酸化されたオリゴ糖を製造することができる。なお、本明細書中で「高硫酸化」とは、分解反応の後における二糖あたりの硫酸基の数が、分解反応の前よりも増加することを意味する。

本発明の別の態様は、高硫酸化オリゴ糖を含む組成物である。この高硫酸化オリゴ糖を含む組成物は、本発明のある態様の製造方法によって得られる。

この態様によると、高硫酸化されたオリゴ糖を含む組成物を提供することができる。

本発明の別の態様は、コンドロイチン分解用またはコンドロイチン硫酸分解用の酵素である。この酵素は、下記の（ａ）、（ｂ）または（ｄ）のアミノ酸配列を有することを特徴とする。
アクセッション番号ＡＡＡ８１５８７のアミノ酸配列（ａ）；
アミノ酸配列（ａ）の部分アミノ酸配列（ｂ）；
アミノ酸配列（ａ）との相同性が３０％以上であるアミノ酸配列（ｄ）

この態様によっても、コンドロイチンまたはコンドロイチン硫酸に対する分解反応の特異性が高い酵素を提供することができる。

本発明によれば、コンドロイチンまたはコンドロイチン硫酸の少なくとも一方に対する分解反応の特異性が高い酵素を提供することができる。

コンドロイチン硫酸類の主な二糖単位構造を示す図である。 図２（Ａ）は、ＯＤＶ−Ｅ６６のアミノ酸配列を示す図であり、図２（Ｂ）は、発現精製タンパク質Ｅ６６−６７のアミノ酸配列を示す図である。 各ｐＨ溶液における発現精製タンパク質Ｅ６６−６７の相対活性値を示すグラフである。 各温度における発現精製タンパク質Ｅ６６−６７の相対活性値を示すグラフである。

以下、本実施の形態に係るコンドロイチン分解用またはコンドロイチン硫酸分解用の酵素について詳細に説明する。

本酵素は、下記の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のアミノ酸配列を有することを特徴とする。
・アクセッション番号ＡＡＡ８１５８７のアミノ酸配列（ａ）；
・アミノ酸配列（ａ）の部分アミノ酸配列（ｂ）；
・アミノ酸配列（ａ）または部分アミノ酸配列（ｂ）をコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（ｃ）
また、本酵素は、アミノ酸配列（ｃ）に代えて、アミノ酸配列（ａ）との相同性が３０％以上であるアミノ酸配列（ｄ）を有してもよい。以下、アミノ酸配列（ａ）〜（ｄ）を順に説明する。

［アミノ酸配列（ａ）を有する酵素］
本酵素は、たとえば昆虫細胞に感染するバキュロウイルスの核多角体病ウイルス（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ：ＮＰＶ）から得られる。ＮＰＶとしては、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ（ＡｃＭＮＰＶ）、Ｇａｌｌｅｒｉａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ（ＧｍＮＰＶ）、Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉａ ｏｕ（ＲｏＮＰＶ）、Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ（ＰｌｘｙＮＰＶ）、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ（ＢｍＮＰＶ）、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａ ＮＰＶ（ＨｅａｒＳＮＰＶ）などが知られている。これらは、主にチョウ目の幼虫に感染するウイルスである。多角体中に包埋される包埋型ウイルス（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｖｉｒｕｓ：ＯＤＶ）は、幼虫の中腸で可溶化遊離され、中腸上皮細胞に感染する。

コンドロイチン分解用またはコンドロイチン硫酸分解用の酵素は、ウイルス由来の酵素またはウイルス由来の酵素とアミノ酸レベルで所定の相同性を有する酵素であれば限定されないが、以下、本酵素として、バキュロウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）由来のエンベロープタンパク質であるＯＤＶ−Ｅ６６（塩基配列のアクセッション番号：Ｍ９６３６０、アミノ酸配列のアクセッション番号：ＡＡＡ８１５８７）を用いて説明する。

ＡｃＭＮＰＶのＯＤＶ−Ｅ６６（以下、ＡｃＥ６６ともいう）は、従来よりエンベロープタンパク質の１つとして知られていた。このタンパク質とそれをコードする遺伝子配列とを、Ｔ．Ｈｏｎｇらが報告している（Ｔ．Ｈｏｎｇ， Ｓ．Ｃ．Ｂｒａｕｎａｇｅｌ， Ｍ．Ｄ．Ｓｕｍｍｅｒｓ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０４（１９９４）２１０−２２２）。図２（Ａ）は、ＯＤＶ−Ｅ６６のアミノ酸配列（アクセッション番号：ＡＡＡ８１５８７、配列番号５）を示す図であり、図２（Ｂ）は、発現精製タンパク質Ｅ６６−６７のアミノ酸配列（配列番号６）を示す図である。発現精製タンパク質Ｅ６６−６７は、ＯＤＶ−Ｅ６６のアミノ酸配列の第１〜６６残基を人工的に削除したタンパク質である。

また、Ｖ．Ｖｉｇｄｏｒｏｖｉｃｈらは、ＡｃＭＮＰＶのＯＤＶ−Ｅ６６がヒアルロン酸の分解活性を有すると報告している（Ｖ．Ｖｉｇｄｏｒｏｖｉｃｈ， Ａ．Ｄ．Ｍｉｌｌｅｒ， Ｒ．Ｋ．Ｓｔｒｏｎｇ， Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ８１（２００７）３１２４−３１２９）。しかし、ＯＤＶ−Ｅ６６のヒアルロン酸に対する分解活性の程度、およびそれ以外のグリコサミノグリカンに対する活性の有無は不明であった。

まず、予備的な実験により、バキュロウイルス由来のタンパク質の粗抽出液が、コンドロイチン硫酸の分解活性を有することを発見した。そこで、コンドロイチン硫酸の分解活性を有するタンパク質の同定を試みた。

具体的には、バキュロウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）に感染した昆虫細胞（ｓｆ９）を、ＳＦ９００ＩＩ無血清培地（インビトロゲン社製）１００ｍｌ中にて、２７℃で６日間培養した。その培養上清を集め、限外濾過膜（ＰＭ１０、アミコン社製）により１０ｍｌにまで濃縮した。濃縮液を、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（１．６×１２ｃｍ）に通過させ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，５０ｍＭ ＮａＣｌ含有緩衝液で洗除後、５０〜５００ｍＭのＮａＣｌ含有緩衝液で、ＮａＣｌ濃度勾配溶出を行った。コンドロイチン分解活性画分を集め、限外ろ過で約２００μｌにまで濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラム（１０×３００ｍｍ、ＧＥヘルスケア社製）でゲルろ過を行った。溶出緩衝液として、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．２， ０．１５Ｍ ＮａＣｌ含有緩衝液を用いた。

溶出酵素活性画分に１００％トリクロロ酢酸溶液を加え、析出沈殿を遠心分離により集め、アセトンで洗除後、１０％ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル電気泳動を行った。タンパク質染色により得られた６１ｋＤａ付近のタンパク質バンドを切り出し、一部をトリプシン消化後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（ＡｕｔｏＦＬＥＸ、ブルカー社製）を用いて解析し、Ｍａｓｃｏｔ ｓｅａｒｃｈをした。その結果、６１ｋＤａ付近のタンパク質バンドは、バキュロウイルス由来のエンベロープタンパク質の一つであるＯＤＶ−Ｅ６６と一致した。ゲル電気泳動で得られたタンパク質バンドの残りを気相エドマン分解法によるＮ末端アミノ酸配列決定システム（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ Ｐｒｏｃｉｓｅ ＬＣ−４９２、アプライドバイオシステムズ社製）で解析したところ、ＯＤＶ−Ｅ６６タンパク質の第６７〜７６番目のアミノ酸配列（ＡＦＲＱＮＮＩＱＥＬ）と一致した。

（ＯＤＶ−Ｅ６６タンパク質の発現と酵素活性）
そこで次に、バキュロウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）のＤＮＡを鋳型として、ＯＤＶ−Ｅ６６のＯＲＦ領域のＤＮＡフラグメントをＰＣＲ法にて取得した。具体的には、Ｘｂａ１制限酵素切断サイト（ＴＣＴＡＧＡ）およびＢａｍＨ１制限酵素切断サイト（ＧＧＡＴＣＣ）を含むＯＤＶ−Ｅ６６のＯＲＦの５’末端および３’末端配列を持つオリゴヌクレオチド（５’−ＧＣＧＴＣＴＡＧＡＴＧＴＣＴＡＴＣＧＴＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＴＣＡＴＡＧ−３’および５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＡＣＡＡＴＴＴＣＡＡＡＡＡＴＡＡＡＴＴＧＴＡＡＡＴＣ−３’）をプライマーとして、ＤＨ１０Ｂａｃ大腸菌株から得たバキュロウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）のＢａｃｍｉｄ ＤＮＡを鋳型にして、ＰＣＲ反応を行った。

得られたＤＮＡフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（−）ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ（ストラタジーン社（アジレント・テクノロジー社）製）を用いてクローニングし、ＯＤＶ−Ｅ６６をコードするＤＮＡ全配列（アクセッション番号Ｍ９６３６０の配列に相当）を含むｐＢＳ−Ｅ６６プラスミドを得た。

完全長ＯＤＶ−Ｅ６６（Ｅ６６−１）を発現させるために、それぞれＮｄｅ１制限酵素切断サイト（ＣＡＴＡＴＧ）およびＢａｍＨ１制限酵素切断サイト（ＧＧＡＴＣＣ）を含む２つのプライマー（５’−ＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＡＴＧＴＣＴＡＴＣＧＴＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＴＣＡＴＡＧ−３’と５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＡＣＡＡＴＴＴＣＡＡＡＡＡＴＡＡＡＴＴＧＴＡＡＡＴＣ−３’）を用いて、ｐＢＳ−Ｅ６６を鋳型としてＰＣＲ反応を行った。得られたＤＮＡフラグメントと、Ｎ末端にＨｉｓ６−タグを持つ発現ベクターｐＥＴ１５ｂとをライゲーションして、発現用プラスミド（ｐＥＴ−Ｅ６６−１）を得た。

この発現ベクターをＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌株に形質転換（トランスフォーメーション）し、その形質転換株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリン含有２×ＴＹ培地（２００ｍｌ）中にて、３７℃で３．５時間培養した。次に、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度１ｍＭになるように添加後、２８℃でさらに３時間培養した。培養液を遠心分離し、菌体を集め、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．２，５０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液１０ｍｌに懸濁し、４０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム溶液１００μｌを添加し、氷冷下にて３０分間静置した後、超音波処理により菌体を破砕した。遠心上清をＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（１．６×１２ｃｍ）にアプライし、５０〜５００ｍＭのＮａＣｌ含有５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）緩衝液を用いた食塩濃度勾配により溶出させた。溶出画分のコンドロイチン分解酵素活性を、後述のコンドロイチン分解酵素活性測定方法により測定した。

次に、コンドロイチン分解酵素活性測定方法によって同定された活性画分を集め、Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（１ｍｌ）にアプライし、２０ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ含有２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５ｍｌで洗除後、５００ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ含有２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出し、１ｍｌごとに分画し、溶出液の酵素活性とタンパク質濃度を測定した。

（コンドロイチン分解酵素活性測定方法）
食塩濃度勾配の溶出画分のコンドロイチン分解酵素活性は、以下のコンドロイチン分解酵素活性測定方法により測定する。他のグリコサミノグリカン（コンドロイチン硫酸やヒアルロン酸等）の分解酵素活性の測定も同様である。

酵素検体１〜１０μｌと、化学的に脱硫酸化したコンドロイチン（生化学工業社製）１００μｇとを、５０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ６．８）５０μｌ中にて、３７℃で３０分間反応させた後、１００℃で１分間加熱処理し、室温まで冷却する。あらかじめ加熱処理して失活させた酵素検体を用いた反応液をブランクとして、波長２３２ｎｍの紫外吸収値を測定する。不飽和グルクロン酸のモル吸光係数を５５００として、分解により生成した不飽和グルクロン酸残基量を算出して、コンドロイチン分解酵素活性とする。

その結果、アミノ酸配列（ａ）を有する酵素のコンドロイチンに対する分解活性は、比活性が０．０３１μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎであった。

［アミノ酸配列（ｂ）を有する酵素］
（Ｅ６６−６７：アミノ酸配列（ｂ１）を有する酵素）
さらに解析を行った結果、アミノ酸配列（ａ）の第１〜６６残基のアミノ酸を欠失させたアミノ酸配列（ｂ１）を有する酵素であるＥ６６−６７の方が、アミノ酸配列（ａ）を有する酵素に比べて、コンドロイチン分解酵素活性がさらに高いことが明らかとなった。

Ｅ６６−６７を発現させるために、それぞれＮｄｅ１制限酵素切断サイト（ＣＡＴＡＴＧ）およびＢａｍＨ１制限酵素切断サイト（ＧＧＡＴＣＣ）を含む２つのプライマー（５’−ＣＧＧＴＴＧＧＣＡＴＡＴＧＧＣＣＴＴＴＣＧＧＣＡＡＡＡＣＡＡＣＡＴＴＣＡＡＧ−３’と５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＡＣＡＡＴＴＴＣＡＡＡＡＡＴＡＡＡＴＴＧＴＡＡＡＴＣ−３’）を用いて、ｐＢＳ−Ｅ６６を鋳型としてＰＣＲ反応を行った。得られたＤＮＡフラグメントと、Ｎ末端にＨｉｓ６−タグを持つ発現ベクターｐＥＴ１５ｂとをライゲーションして、発現用プラスミド（ｐＥＴ−Ｅ６６−６７）を得た。以降の手順は、Ｅ６６−１と同様である。

発現および精製により得られた画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動で分子量約６１ｋＤａの単一バンドを示し（アミノ酸組成からの算出分子量は７４．３ｋＤａ）、比活性６７．２１±２．１２μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎのコンドロイチン分解酵素活性を持つタンパク質であった。この場合、Ｅ６６−６７のコンドロイチン分解酵素活性は、ヒアルロン酸分解酵素活性に比べて、約６００倍以上高かった。

（Ｅ６６−２４：アミノ酸配列（ｂ２）を有する酵素）
また、アミノ酸配列（ａ）のシグナルペプチド領域（１−２３）を欠失させ第２４〜７０４残基のアミノ酸のみを使用したアミノ酸配列（ｂ２）を有する酵素であるＥ６６−２４でも、Ｅ６６−６７と同様の一連の手順で酵素活性とタンパク質濃度を測定した。

Ｅ６６−２４を発現させるために、それぞれＮｄｅ１制限酵素切断サイト（ＣＡＴＡＴＧ）およびＢａｍＨ１制限酵素切断サイト（ＧＧＡＴＣＣ）を含む２つのプライマー（５’−ＣＣＴＧＴＣＧＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡＡＴＡＡＡＡＡＴＧＡＴＧＣＣＡＡＴＡＡＡＡＡＣ−３’と５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＡＣＡＡＴＴＴＣＡＡＡＡＡＴＡＡＡＴＴＧＴＡＡＡＴＣ−３’）を用いて、ｐＢＳ−Ｅ６６を鋳型としてＰＣＲ反応を行った。得られたＤＮＡフラグメントと、Ｎ末端にＨｉｓ６−タグを持つ発現ベクターｐＥＴ１５ｂとをライゲーションして、発現用プラスミド（ｐＥＴ−Ｅ６６−２４）を得た。以降の手順は、Ｅ６６−１と同様である。

発現および精製により得られた画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動で分子量約７０ｋＤａの単一バンドを示し（アミノ酸組成からの算出分子量は７８．７ｋＤａ）、比活性８．９１±０．１８μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎのコンドロイチン分解酵素活性を持つタンパク質であった。この場合、Ｅ６６−２４のコンドロイチン分解酵素活性は、ヒアルロン酸分解酵素活性に比べて、約４００倍以上高かった。

（Ｅ６６−７０：アミノ酸配列（ｂ３）を有する酵素）
また、アミノ酸配列（ａ）の第１〜６９残基のアミノ酸を欠失させ第７０〜７０４残基のアミノ酸のみを使用したアミノ酸配列（ｂ３）を有する酵素であるＥ６６−７０でも同様の解析を行った。

Ｅ６６−７０を発現させるために、それぞれＮｄｅ１制限酵素切断サイト（ＣＡＴＡＴＧ）およびＢａｍＨ１制限酵素切断サイト（ＧＧＡＴＣＣ）を含む２つのプライマー（５’−ＧＧＴＧＧＣＣＣＡＴＡＴＧＣＡＡＡＡＣＡＡＣＡＴＴＣＡＡＧＡＡＣＴＡＣＡＡＡＡＣ−３’と５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＡＣＡＡＴＴＴＣＡＡＡＡＡＴＡＡＡＴＴＧＴＡＡＡＴＣ−３’）を用いて、ｐＢＳ−Ｅ６６を鋳型としてＰＣＲ反応を行った。得られたＤＮＡフラグメントと、Ｎ末端にＨｉｓ６−タグを持つ発現ベクターｐＥＴ１５ｂとをライゲーションして、発現用プラスミド（ｐＥＴ−Ｅ６６−７０）を得た。以降の手順は、Ｅ６６−１と同様である。

発現および精製により得られた画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動で分子量約６０ｋＤａの単一バンドを示し（アミノ酸組成からの算出分子量は７３．９ｋＤａ）、比活性６１．７６±３．８２μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎのコンドロイチン分解酵素活性を持つタンパク質であった。この場合、Ｅ６６−７０のコンドロイチン分解酵素活性は、ヒアルロン酸分解酵素活性に比べて、約５００倍以上高かった。

なお、第１〜９９残基のアミノ酸を欠失させ第１００〜７０４残基のアミノ酸のみを使用したＥ６６−１００では、コンドロイチン分解活性を検出することができなかった。また、Ｅ６６−６７のＣ末端５１残基を欠失させ、第６７〜６５３残基のアミノ酸のみを使用した場合にも、コンドロイチン分解活性を検出することができなかった。

［アミノ酸配列（ｃ）を有する酵素］
本酵素に関し、ＡｃＭＮＰＶのＯＤＶ−Ｅ６６を用いて説明を行うが、ＡｃＭＮＰＶのＯＤＶ−Ｅ６６と類似の機能を有するウイルス由来のタンパク質であれば、これに限られない。

コンドロイチン硫酸分解活性を有するコンドロイチン硫酸分解用酵素は、ＯＤＶ−Ｅ６６遺伝子またはＯＤＶ−Ｅ６６遺伝子とアミノ酸配列のレベルで所定の相同性がある遺伝子をコードするＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるタンパク質であってもよい。この相同性は、約６０％以上であることが好ましく、約７０％以上であることがより好ましく、約８０％以上であることがさらに好ましい。

ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、アクセッション番号Ｍ９６３６０の塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡ、またはアクセッション番号ＡＡＡ８１５８７のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるＤＮＡをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ Ｅｄ．やＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９８７−１９９７などに記載されている方法を利用することができる。

本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれであってもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。これらの条件では、温度を上げるほど高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。

ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては、温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられる。当業者であれば、これら要素を適宜選択することで、同様のストリンジェンシーを実現することができる。

アミノ酸配列（ｃ）を有する酵素として、たとえば上述したＢｍＮＰＶのＯＤＶ−Ｅ６６（以下、ＢｍＥ６６ともいう）が挙げられる。ＢｍＥ６６とＡｃＥ６６とのアミノ酸レベルの相同性は、約９２．７％である。

なお、ＯＤＶ−Ｅ６６の発現精製タンパク質は、一部が人工的に置換されていてもよい。また、ここではアミノ酸配列（ａ）または部分アミノ酸配列（ｂ）をコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を、アミノ酸配列（ｃ）とした。変形例としては、ＢｍＥ６６のアミノ酸配列（アクセッション番号ＮＰ＿０４７４５２）またはＨｅａｒＳＮＰＶのＯＤＶ−Ｅ６６（以下、ＨａＥ６６ともいう）のアミノ酸配列（アクセッション番号ＮＰ＿２０３６５１）をアミノ酸配列（ａ）とし、これらの部分アミノ酸配列を部分アミノ酸配列（ｂ）とする。この場合に、これらのアミノ酸配列（ａ）または部分アミノ酸配列（ｂ）をコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を、アミノ酸配列（ｃ）としてもよい。

［その他のアミノ酸配列（ｄ）を有する酵素］
本実施の形態に係るコンドロイチン分解用またはコンドロイチン硫酸分解用の酵素は、アミノ酸配列（ａ）を有する酵素、アミノ酸配列（ｂ）を有する酵素、アミノ酸配列（ｃ）を有する酵素に加え、アミノ酸配列（ｄ）を有する酵素であってもよい。

ＮＣＢＩのＣＤＤ（Ｍａｒｃｈｌｅｒ−Ｂａｕｅｒ Ａ ｅｔ ａｌ．，“ＣＤＤ：ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｄｏｍａｉｎ Ｄａｔａｂａｓｅ．”， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７（Ｄ）（２００９）２０５−２１０． ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｃｄｄ／ｃｄｄ．ｓｈｔｍｌ）によると、ＯＤＶ−Ｅ６６は、第８７〜７０２残基のアミノ酸が、ｏｄｖ−ｅ６６ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙに属するとされる。このｏｄｖ−ｅ６６ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙに属する遺伝子によってコードされるアミノ酸配列（ｄ）を有する酵素であれば、ＡｃＭＮＰＶのＯＤＶ−Ｅ６６と同様に、コンドロイチンおよびコンドロイチン硫酸の分解活性を有する可能性がある。

たとえば、ＡｃＭＮＰＶのＯＤＶ−Ｅ６６と、同じｏｄｖ−ｅ６６ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙに属するＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ ＭＮＰＶのＯＲＦ１１４ ｏｄｖ−ｅ６６（アクセッション番号：ＮＰ＿０３７８７４）との相同性は、比較的相同性の高いＯＤＶ−Ｅ６６の第１０６〜６４３残基において、約３０％である。ＡｃＭＮＰＶのＯＤＶ−Ｅ６６とアミノ酸レベルで少なくとも約３０％の相同性を有するアミノ酸配列（ｄ）を有する酵素であれば、コンドロイチンおよびコンドロイチン硫酸の分解活性を有する可能性がある。

ＡｃＥ６６とのアミノ酸レベルでの相同性は、約３５％以上であることがより好ましく、約４０％以上であることがさらに好ましい。この条件を満たすアミノ酸配列（ｄ）として、たとえば上述したＨａＥ６６が挙げられる。ＨａＥ６６とＡｃＥ６６とのアミノ酸レベルの相同性は、約４１．９％である。なお、ＨａＥ６６とある程度の相同性を有するアミノ酸配列を有する酵素であれば、ＡｃＥ６６との相同性が約３０％未満であっても、コンドロイチンおよびコンドロイチン硫酸の分解活性を有する可能性がある。このようなＨａＥ６６との相同性は、約５０％以上であることが好ましく、約６０％以上であることがより好ましい。

本発明者は、本実施の形態に係るアミノ酸配列（ａ）、アミノ酸配列（ｂ）またはアミノ酸配列（ｃ）を有するコンドロイチン分解用またはコンドロイチン硫酸分解用の酵素が、特に以下の（１）〜（３）の性質を有することを見いだした。
（１）ウイルスのエンベロープタンパク質である本酵素は、コンドロイチンおよびコンドロイチン硫酸に対して高い分解活性を有する。
（２）本酵素は、Ｎ末端側の一部を削除すると、コンドロイチンおよびコンドロイチン硫酸に対する分解活性がさらに高くなる場合がある。
（３）本酵素は、コンドロイチンおよびコンドロイチン硫酸に対する反応の特異性が高い。つまり、本酵素のコンドロイチンおよびコンドロイチン硫酸に対する分解活性は、本酵素のヒアルロン酸に対する分解活性に比べ、著しく高い（ヒアルロン酸に対する分解活性の約６００倍）。

本酵素は、さらに以下の性質も有する。
（４）本酵素は、デルマタン硫酸（ＤＳ）、ヘパリン（Ｈｅｐ）、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、Ｎ−アセチルヘパロサン（ＨＰＲ）に対する分解活性を有さない。
（５）本酵素は、ｐＨ４〜９の広い範囲で、８０％以上の高い相対活性を示す。
（６）本酵素は、３０〜６０℃の広い範囲で、８０％以上の高い相対活性を示す。
（７）本酵素は、二価金属塩やキレート剤が存在しても、活性に影響を受けにくい。また、
低濃度（１５０ｍＭ）のＮａＣｌ存在下では、酵素活性が低下しないが、高濃度（５００ｍＭ）のＮａＣｌ存在下では、酵素活性が低下する。
（８）本酵素は、その分解特性により、高硫酸化オリゴ糖を特異的に産生する。

（アミノ酸配列（ａ）、アミノ酸配列（ｂ）またはアミノ酸配列（ｃ）を有するコンドロイチン分解用またはコンドロイチン硫酸分解用の酵素の用途）
本実施の形態に係る酵素には、用途として、研究用試薬、医薬、農薬、オリゴ糖製造用酵素が挙げられる。以下、これらを順に説明する。

本実施の形態に係る酵素は、各種の研究用試薬として利用できる。たとえば、本酵素は、きわめて高い基質特異性を持つことから、コンドロイチン硫酸の構造解析に利用できる。また、本酵素は、コンドロイチン硫酸の０Ｓおよび６Ｓ構造のみを切断することから、０Ｓおよび６Ｓ構造のみを切断することによる細胞や組織への影響を調べる研究用試薬としても有用である。また、本酵素は、ヒアルロン酸に対する分解活性がコンドロイチンに対する分解活性に比べて著しく低い（約６００分の１）ことから、ヒアルロン酸を分解せずコンドロイチン硫酸を選択的に分解する酵素試薬としても利用できる。

椎間板ヘルニアや脊椎損傷治療薬として微生物由来のコンドロイチナーゼＡＢＣが臨床治験されている。本実施の形態に係る酵素は、コンドロイチン硫酸に対する分解活性の特異性が高く、椎体軟骨のコンドロイチン硫酸を分解するが、関節膜などの周囲組織のヒアルロン酸はほとんど分解しない。そのため、本酵素を医薬として用いることにより、目的外の組織破壊や投与箇所からの漏出を防ぐことができる。また、本酵素のコンドロイチン硫酸に対する分解活性は、広いｐＨ活性範囲を持ち、高温でも活性が維持されるなど安定性が高い。そのため、本酵素をコンドロイチン硫酸分解用の医薬として用いることにより、治療効果を高めることができる。

バキュロウイルス核多角体は、昆虫（主に蛾の幼虫）の食物（草木葉）とともに採取される。バキュロウイルス核多角体は、塩基性のため昆虫の中腸に達すると多核体が解離し、溶出された包埋ウイルスが中腸上皮細胞に感染すると考えられている。本実施の形態に係る酵素は、包埋ウイルスのエンベロープタンパク質の１つである。昆虫消化管がコンドロイチン硫酸で防御されているとすると、その消化管膜のコンドロイチン硫酸を分解することにより、本酵素がウイルス感染を助けている可能性が高い。したがって、本酵素を単独で、または既知農薬と混合して散布すれば、昆虫の腸管膜透過性を亢進して、薬物浸透性を高めることができる。そのため、本酵素を含む有用な農薬（防虫剤）を開発できる。

本実施の形態に係る酵素をコンドロイチン硫酸に作用させると、その分解特性から、高硫酸化オリゴ糖を特異的に産生する。高硫酸化オリゴ糖は、神経作用・免疫作用などの生理活性が期待されている。そのため、本酵素は、医薬として有用なオリゴ糖製造用酵素として利用可能である。

［評価試験］

（評価試験１：ｐＨと酵素活性との関係）
ｐＨを変化させて、発現精製タンパク質Ｅ６６−６７の酵素活性を測定した。酵素活性は上述のコンドロイチン分解酵素活性測定方法に準じて測定した。緩衝液として、Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（グリシン−塩酸：ｐＨ３〜５）、ＮａＯＡｃ−ＡｃＯＨ（酢酸−酢酸ナトリウム：ｐＨ５〜７）、ＮａＫ−ＰＯ_４（リン酸ナトリウム・カリウム：ｐＨ６〜７）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（トリス−塩酸：ｐＨ７〜９）、ＣＡＰＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ９〜１１）を用いた。緩衝液は、すべて最終濃度が５０ｍＭとなるように調製した。反応液には酵素水溶液と基質（コンドロイチン）溶液を加えるため、最終ｐＨは緩衝液のｐＨとは異なると予想された。そのため、混合・反応後のｐＨを測定し、反応液のｐＨとした。２３２ｎｍの紫外線吸収を測定し、ブランク値との吸光度差から分解活性を求め、最大活性（ｐＨ７付近）を１００としたときの各ｐＨ溶液における相対活性値を算出した。

図３は、各ｐＨ溶液における発現精製タンパク質Ｅ６６−６７の相対活性値を示すグラフである。発現精製タンパク質Ｅ６６−６７は、ｐＨ約４〜約９の範囲で、相対活性８０％以上の高い酵素活性を示した。また、ｐＨ約３〜約１０の範囲で、相対活性４０％以上の酵素活性を示した。

（評価試験２：反応温度と酵素活性との関係）
反応温度を変化させて、発現精製タンパク質Ｅ６６−６７の酵素活性を測定した。酵素活性はコンドロイチン分解酵素活性測定方法に準じて測定した。反応温度をそれぞれ４℃、１６℃、２５℃、３０℃、３７℃、４５℃、５２℃、６０℃、６５℃、７０℃、および７５℃にして３０分間反応させ、２３２ｎｍの紫外線吸収の吸光度変化を測定した。最大の活性を示した３７℃における活性値を１００としたときの各温度における相対活性（％）を算出した。

図４は、各温度における発現精製タンパク質Ｅ６６−６７の相対活性（％）を示すグラフである。発現精製タンパク質Ｅ６６−６７の相対活性は、３７℃で最高値を示したが、約３０〜約６０℃までの広い範囲で、８０％以上の高い相対活性を示した。また、約１４〜６５℃までの範囲で、４０％以上の相対活性を示した。

（評価試験３：酵素活性における金属塩の影響）
発現精製タンパク質Ｅ６６−６７の反応液に金属塩等を添加して、酵素活性を測定した。酵素活性はコンドロイチン分解酵素活性測定方法に準じて測定したが、ＣａＣｌ_２、ＭｇＣｌ_２、ＭｎＣｌ_２、ＣｏＣｌ_２、ＥＤＴＡ（最終濃度２０ｍＭ）、ＮａＣｌ（最終濃度１５０ｍＭまたは５００ｍＭ）のいずれか１つの金属塩等を追加して酵素反応を行った点が、コンドロイチン分解酵素活性測定方法と異なる。測定結果を表１に示す。表１に記載の相対活性（％）は、金属塩などを添加していない標準溶液（５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．８）の活性（１００．０％）に対する比率である。

二価金属塩（ＣａＣｌ_２、ＭｇＣｌ_２、ＭｎＣｌ_２、ＣｏＣｌ_２）およびキレート剤（ＥＤＴＡ）の添加による酵素活性への影響は比較的小さかったが、ＣａＣｌ_２を添加した場合には７％以上、ＥＤＴＡを添加した場合には約６％、それぞれ相対活性が上昇した。

一方、ＮａＣｌを添加した場合には、低濃度（１５０ｍＭ）では酵素活性が約７％上昇したが、高濃度（５００ｍＭ）では酵素活性が４０％近く低下した。

（評価試験４：基質特異性）
発現精製タンパク質Ｅ６６−６７の酵素活性の基質特異性を、各種グリコサミノグリカン標品を用いて測定した。酵素活性はコンドロイチン分解酵素活性測定方法に準じて測定した。グリコサミノグリカン基質として、化学的脱硫酸化コンドロイチン（ＣＨ）、クジラ軟骨由来コンドロイチン硫酸（ＣＳＡ）、サメ軟骨由来コンドロイチン硫酸（ＣＳＣ）、ウシ鼻軟骨由来コンドロイチン硫酸（ＣＳＴ）、サメヒレ軟骨由来コンドロイチン硫酸（ＣＳＤ）、イカ軟骨由来コンドロイチン硫酸（ＣＳＥ）、ブタ皮膚由来デルマタン硫酸（ＤＳ）、ニワトリ鶏冠由来ヒアルロン酸（ＨＡ）、ブタ小腸由来ヘパリン（Ｈｅｐ）、ブタ腎臓由来ヘパラン硫酸（ＨＳ）、大腸菌Ｋ５由来Ｎ−アセチルヘパロサン（ＨＰＲ）をそれぞれ１００μｇ用い、分解活性を測定した。ＣＨを基質にしたときの活性を１００．０％とした場合の、それぞれの基質に対する相対活性（％）を表２に示す。

発現精製タンパク質Ｅ６６−６７は、コンドロイチンに対して最も高い分解活性を示した。また、各種コンドロイチン硫酸（ＣＳＡ、ＣＳＣ、ＣＳＴ、ＣＳＤ、ＣＳＥ）に対しても、１６〜３０％程度の高い分解活性を示した。

一方、発現精製タンパク質Ｅ６６−６７は、ヒアルロン酸（ＨＡ）に対してはコンドロイチンの約６００分の１以下の分解活性（０．１６％）しか示さなかった。上述のとおり、ＡｃＭＮＰＶのＯＤＶ−Ｅ６６がヒアルロン酸の分解活性を有するとの報告がある（Ｖ．Ｖｉｇｄｏｒｏｖｉｃｈ， Ａ．Ｄ．Ｍｉｌｌｅｒ， Ｒ．Ｋ．Ｓｔｒｏｎｇ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．８１（２００７）３１２４−３１２９）。しかし、本評価試験により、発現精製タンパク質Ｅ６６−６７は、ヒアルロン酸（ＨＡ）に対してはわずかな分解活性しか有さず、コンドロイチンおよびコンドロイチン硫酸に対してはヒアルロン酸よりも著しく高い分解活性を有することが明らかとなった。

表２の通り、Ｅ６６−６７はコンドロイチンに対する分解活性を１００とした場合、ヒアルロン酸に対する活性は０．１６％に過ぎなかった。Ｅ６６−２４もコンドロイチンに対する分解活性を１００とした場合、ヒアルロン酸に対する活性は０．２４％に過ぎず、Ｅ６６−７０もコンドロイチンに対する分解活性を１００とした場合、ヒアルロン酸に対する活性は０．１８％に過ぎなかった。

また、発現精製タンパク質Ｅ６６−６７は、デルマタン硫酸（ＤＳ）、ヘパリン（Ｈｅｐ）、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、Ｎ−アセチルヘパロサン（ＨＰＲ）に対しては、全く分解活性を示さなかった。

（評価試験５：分解産物の分析）
発現精製タンパク質Ｅ６６−６７を用いて、コンドロイチン（ＣＨ）およびコンドロイチン硫酸（ＣＳＡ、ＣＳＣ、ＣＳＴ、ＣＳＤ、ＣＳＥ）を基質（原料）として、一晩反応させた。反応生成物をＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅカラム（１０×３００ｍｍ、ＧＥヘルスケア社製）でゲルろ過して、二糖画分、四糖画分、および多糖画分に分離した。四糖画分および多糖画分はさらにコンドロイチナーゼＡＢＣで完全に不飽和二糖に分解した。次に、二糖画分およびコンドロイチナーゼＡＢＣにより分解された四糖画分および多糖画分の二糖組成を、ポストカラム微量蛍光二糖分析ＨＰＬＣシステム（Ｔｏｙｐｄａ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（２０００）２２６９−２２７５）を使用して定量し、原料の二糖組成値と比較した。その結果を表３に示す。

表３は、コンドロイチンおよびコンドロイチン硫酸それぞれにおける二糖組成を、原料および各画分ごとに百分率（％）で算出した結果である。表３に示すように、コンドロイチン（ＣＨ）の分解産物の二糖および四糖画分の二糖組成は、ほぼ完全に未硫酸化不飽和二糖（０Ｓ）であった。つまり、発現精製タンパク質Ｅ６６−６７は、コンドロイチン（ＣＨ）を、非還元末端が不飽和の二糖と四糖まで完全に分解した。

一方、コンドロイチン硫酸（ＣＳＡ、ＣＳＣ、ＣＳＴ、ＣＳＤ、ＣＳＥ）の場合、二糖画分、四糖画分、多糖画分のいずれも検出された。つまり、二糖から不完全分解多糖体まで多様な分解産物が生成されることが確認された。

それぞれのコンドロイチン硫酸の不飽和二糖画分を分析すると、実質的には未硫酸化二糖（０Ｓ）とＧａｌＮＡｃ残基６位硫酸化二糖（６Ｓ）だけしか検出されなかった。また、四糖画分の二糖組成を解析すると、いずれのコンドロイチン硫酸においても、少なくとも５０％は０Ｓと６Ｓが占めていた。逆に分解が不完全な多糖画分の二糖組成は、原料のコンドロイチン硫酸の二糖組成に比べ、ＧａｌＮＡｃ残基４位硫酸化二糖（４Ｓ）および多硫酸化二糖（ＳＥ、ＳＤ、ｔｒｉＳ）の割合が増加していた。つまり、ＯＤＶ−Ｅ６６は、その分解特性により、高硫酸化オリゴ糖を特異的に産生することが明らかとなった。

（評価試験６：ＢｍＥ６６およびＨａＥ６６のコンドロイチン／コンドロイチン硫酸分解酵素活性）
カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）のバキュロウイルス（ＢｍＮＰＶ）およびオオタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａ）のＮＰＶ（ＨｅａｒＳＮＰＶ）のＤＮＡを鋳型として使用した。ＡｃＭＮＰＶの発現精製タンパク質Ｅ６６−６７に対応するように、ＯＤＶ−Ｅ６６のＯＲＦのうちそれぞれＮ末端のアミノ酸残基の一部を欠くＤＮＡフラグメントをＰＣＲ法にて取得した（ＢｍＥ６６は、アクセッション番号ＮＰ＿０４７４５２のアミノ酸配列の第６５残基〜第７０２残基、ＨａＥ６６は、アクセッション番号ＮＰ＿２０３６５１のアミノ酸配列の第３７残基〜第６７２残基）。ＢｍＮＰＶでは、ＯＲＦの第６５残基〜第７０２残基に相当する５’末端および３’末端配列を持つオリゴヌクレオチド（５’−ＣＧＴＧＴＧＣＣＡＴＡＴＧＧＣＴＴＴＴＣＡＧＣＡＡＡＡＣＡＡＣＡＴＴＣＡＡＧ−３’と５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＡＣＡＡＴＴＴＣＡＡＡＡＡＴＡＡＡＴＴＧＴＡＡＡＴＣ−３’）をプライマーとした。ＨｅａｒＳＮＰＶでは、ＯＲＦの第３７残基〜第６７２残基に相当する５’末端および３’末端配列を持つオリゴヌクレオチド（５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＧＴＧＣＴＧＣＣＴＧＣＧＣＣＣＣＣＡＣＡＡＧＡＴＧ−３’および５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＡＴＴＴＴＡＡＡＴＴＴＡＡＡＣＴＧＡＴＴＡＧＣＧ−３’）をプライマーとした。得られたＤＮＡフラグメントと、Ｎ末端にＨｉｓ６−タグを持つ発現ベクターｐＥＴ１５ｂとをライゲーション後、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ クローニングキット（クロンテック社）を用いてクローニングを行い、各ウイルス由来の発現用プラスミド（ｐＥＴ−ＢｍＥ６６およびｐＥＴ−ＨａＥ６６）を得た。

これらの発現ベクターをＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌株に形質転換（トランスフォーメーション）し、その形質転換株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリン含有２×ＴＹ培地（２００ｍｌ）中にて、３７℃で３〜４時間培養した。次に、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度１ｍＭになるように添加後、２６℃でさらに１６時間培養した。培養液を遠心分離し、菌体を集め、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ジチオスレイトール、０．４ｍＭ ＰＭＳＦ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、および０．１５Ｍ ＮａＣｌ含有２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁し、４０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム溶液１００μｌを添加し、氷冷下にて３０分間静置した後、超音波処理により菌体を破砕した。遠心上清をＮｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア社）カラム（１ｍｌ）にアプライし、２０ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ含有２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５ｍｌで洗除後、５００ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ含有２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出した。

ＡｃＥ６６と同様にして溶出酵素液中の発現タンパク質濃度を測定し、各発現タンパク質濃度を調整した。各発現タンパク質０．２μｇと、化学的に脱硫酸化したコンドロイチン、クジラ軟骨由来ＣＳＡ、またはサメ軟骨由来ＣＳＣ（いずれも生化学工業社製）１００μｇとを、５０ｍＭのリン酸緩衝溶液（ｐＨ６．８）５０μｌ中にて、３７℃で１時間反応させた後、１００℃にて１分間加熱処理し、室温まで冷却した。あらかじめ加熱処理して失活させた酵素検体を用いた反応液をブランクとして、波長２３２ｎｍの紫外吸収値を測定した。不飽和グルクロン酸のモル吸光係数を５５００として、分解により生成した不飽和グルクロン酸残基量を算出して、コンドロイチン分解酵素活性とした。

その結果、表２に示したＡｃＥ６６のＣＨに対する活性を１００とした場合、それぞれの相対活性は、ＢｍＥ６６では、ＣＨで約７３．２、ＣＳＡで約１３．０、ＣＳＣで約２５．６であった。また、ＨａＥ６６では、ＣＨで約６９．７、ＣＳＡで約５．３、ＣＳＣで約２２．５であった。つまり、ＡｃＥ６６と約９２．７％の相同性を有するＢｍＥ６６だけではなく、相同性が約４１．９％と比較的低いＨａＥ６６でも、コンドロイチンおよびコンドロイチン硫酸に対して高い活性を有することが明らかとなった。

以上、本発明を上述の実施の形態や各評価試験を参照して説明したが、本発明は上述の実施の形態や各評価試験に限定されるものではなく、実施の形態や各評価試験の構成を適宜組み合わせたものや置換したものについても本発明に含まれるものである。また、当業者の知識に基づいて実施の形態や各評価試験における組合せや工程の順番を適宜組み替えることや各種の設計変更等の変形を実施の形態に対して加えることも可能であり、そのような変形が加えられた実施の形態や各評価試験も本発明の範囲に含まれうる。

Claims (6)

1. 下記の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有するコンドロイチン分解用またはコンドロイチン硫酸分解用の酵素を用いてコンドロイチンまたはコンドロイチン硫酸を分解する分解方法。
   配列番号６のアミノ酸配列（ａ）；
   前記アミノ酸配列（ａ）をコードするＤＮＡと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（ｂ）
2. 分解時のｐＨが４〜９である請求項１に記載の分解方法。
3. 分解時の温度が３０〜６０℃である請求項１または２に記載の分解方法。
4. ５００ｍＭ未満のＮａＣｌ濃度にて分解する請求項１〜３のいずれか１項に記載の分解方法。
5. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の分解方法にてコンドロイチン硫酸を分解してオリゴ糖を生成する高硫酸化オリゴ糖の製造方法。
6. 請求項５に記載の製造方法によって得られる高硫酸化オリゴ糖を含む組成物。