JP4693998B2 - 膜貫通領域欠如型ｎ−アセチルグルコサミン脱アセチル化酵素をコードするｄｎａ - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、形質転換体において発現しうるN-アセチルグルコサミン脱アセチル化酵素をコードするDNAに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヘパリン及びヘパラン硫酸は硫酸化グリコサミノグリカンの一種であり、抗血液凝固活性、平滑筋増殖抑制活性、増殖因子・サイトカインなどとの特異的な結合活性、ならびに細胞増殖・分化の調節、創傷治癒過程の調節、及び組織形成の調節など広範囲で重要な生物機能を担っている。その基本骨格は、ヘキスロン酸とグルコサミンの二糖繰り返し構造であり、具体的には、通常、ヘキスロン酸α又はβ1-4グルコサミンからなる二糖がα1-4結合した繰り返し構造を基本骨格としている。
【０００３】
ヘパリン及びヘパラン硫酸は、通常、動物の臓器、組織などから抽出することにより調製されており、微生物による生産には成功していない。
【０００４】
ヘパリン及びヘパラン硫酸の生合成においては、グルクロン酸とN-アセチルグルコサミンが結合した基本骨格が生成した後、N-アセチルグルコサミン残基の脱アセチル化・N-硫酸化、グルクロン酸残基のC5エピメリ化（グルクロン酸のイズロン酸化）、グルクロン酸残基又はイズロン酸残基の2-O硫酸化、グルコサミン残基の6-O硫酸化、3-O硫酸化などの修飾を受ける。
【０００５】
このようなヘパリン及びヘパラン硫酸の生合成において、N-アセチルグルコサミン残基のN-脱アセチル化およびN-硫酸化は修飾反応の最初のステップであり、この反応が起こらなければ他の修飾反応は起こらないとされている。従って、脱アセチル化及びN-硫酸化のステップが人工的なヘパリン及びヘパラン硫酸合成において必須の過程であるといえる。
【０００６】
このN-脱アセチル化とN-硫酸化を触媒する酵素は、現在知られている限りは単一の分子で２種類の酵素活性を示すタンパク質として発現しており、N-アセチルグルコサミンN-脱アセチル化・N-硫酸基転移酵素（以下「NDST」とも記載する）と命名されている。この酵素の構造は他のグリコサミノグリカンの硫酸基転移酵素と同様にII型膜タンパク質であり、アミノ末端（以下「Ｎ末端」とも記載）近辺の領域に疎水性アミノ酸が集まった膜貫通ドメインがある。カルボキシル末端（以下「Ｃ末端」とも記載）側はN-硫酸基転移酵素（以下「NST」とも記載する）活性部分であることが知られており、硫酸基供与基質である活性硫酸（PAPS）に特異的な２ヶ所の結合ドメイン（5'-ホスホ硫酸結合ドメインと3'-リン酸結合ドメイン）が存在している（Sueyoshi T., et al. (1998) FEBS Lett. 433,211-4）。N末端側には、N-脱アセチル化酵素（以下「NDA」とも記載する）活性部分が存在すると考えられており、脱アセチル化酵素の共通構造があると言われている（Berninsone P., et al.(1998) J. Biol. Chem. 273, 25556-9）。
【０００７】
NDSTは、現在までに４種類見つかっており、NDST-1（ラット(rNDST-1)；Hashimoto Y., et al. (1992) J. Biol. Chem. 267, 15744-15750、ヒト(hNDST-1)；Dixon J., et al. (1995) Genomics 26, 239-244）、NDST-2（Orellana A., et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 2270-6、Toma L., et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 22458-65）、NDST-3（Aikawa J., et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 2690-5）、NDST-4（Aikawa J., et al. (1999) Glycoconj. J. 16, S40）などの報告がある（これらをまとめて単に「NDST」と以下標記する）。遺伝子操作によるこれらの酵素の組換えタンパク質の発現については、動物細胞では全構造の発現がすでに報告されている（例えば、Cheung W.F., et al. (1996) Biochemistry 35, 5250-6、Pikas D.S., et al. (2000) Biochemistry 39, 4552-8）。しかし、動物細胞で発現させる場合、その生産量は低く、製造コストも掛かるため、工業的な生産を行うには不向きである。
【０００８】
そこで生産性の高い微生物、例えば大腸菌にNDSTの遺伝子を導入し、酵素を生産させる試みもなされているが（Sueyoshi T., et al. (1998) FEBS Letter 433, 211-4、Kakuta Y., et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 10673-6）、C末端側のN-硫酸基転移酵素活性部分のみしか発現には成功しておらず、全構造の発現は不可能であった。そこでN末端側のN-脱アセチル化酵素活性を有すると思われる領域を融合タンパク質として発現させることも試みられているが、活性を有するタンパク質の発現には成功しておらず（Berninsone P., et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 25556-9）、N-脱アセチル化酵素活性を担うと考えられる領域の微生物での発現は不可能であると考えられている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
従って、ヘパリン及びヘパラン硫酸の遺伝子組換えによる調製を工業的規模で行う上で必要とされるNDSTの発現及びNDA活性を担う領域の単独での発現は未だに成功していない。そこで、本発明は、特に、NDAを効率よく得ることを課題とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、微生物にヘパリン及びヘパラン硫酸を効率的に合成させるために必要なNDA活性を発現させるべく、鋭意検討した結果、NDSTのN-脱アセチル化酵素活性領域及びN-硫酸化酵素活性領域のそれぞれをコードするDNAの領域を特定し、更にNDSTのN末端の膜貫通領域を含む領域及びC末端のN-硫酸化酵素活性領域を含む領域を除去し、適当な微生物発現ベクターと結合させることにより、NDA活性を維持した組換えタンパク質が微生物において発現することを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１） 配列番号３、配列番号６、配列番号３の塩基番号１〜１３１７、又は配列番号６の塩基番号１〜１３１７に示す塩基配列からなるＤＮＡ。
（２） （１）に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
（３） グルコサミン残基のアミノ基に硫酸基を転移する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを更に含む（２）に記載の発現ベクター。
（４） （２）又は（３）に記載の発現ベクターで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
（５） 宿主細胞が微生物である（４）に記載の形質転換体。
（６） 微生物が大腸菌である（５）記載の形質転換体。
（７） （４）乃至（６）のいずれかに記載の形質転換体の増殖により得られる酵素であって、ヘパリン骨格を有する糖鎖のN-アセチルグルコサミン残基を脱アセチル化する作用を有する膜貫通領域欠如型N-アセチルグルコサミン脱アセチル化酵素。
（８） 配列番号２のアミノ酸番号４１〜４７９、配列番号２のアミノ酸番号４１〜５５７、配列番号５のアミノ酸番号４１〜４７９、又は配列番号５のアミノ酸番号４１〜５５７に示すポリペプチドからなるＮ−アセチルグルコサミン脱アセチル化酵素。
（９） （７）又は（８）に記載の膜貫通領域欠如型N-アセチルグルコサミン脱アセチル化酵素と、N-硫酸基転移酵素とを含む組成物。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明をその実施の形態により詳細に説明する。
【００１３】
＜１＞本発明DNA
本発明DNAは、NDSTのポリペプチドの部分ポリペプチドをコードするDNAであって、該DNAを発現ベクターに挿入して発現させた際に得られる該部分ポリペプチドが、ヘパリン骨格を有する糖鎖のN-アセチルグルコサミン残基を脱アセチル化する作用を有し得る程度に、NDSTのポリペプチドのＮ末端領域及びＣ末端領域を有しないことを特徴とするDNAである。
【００１４】
N-脱アセチル化・N-硫酸基転移酵素とは、ヘパリン骨格を有する糖鎖のN-アセチルグルコサミン残基のN-脱アセチル化およびN-硫酸化の両方の反応を触媒する酵素であり、２種類の酵素活性を示す単一のポリペプチドからなるものを意味する。
【００１５】
本明細書中におけるヘパリン骨格とはヘキスロン酸とグルコサミンがα又はβ1,4グリコシド結合した二糖を基本単位とし、特にこの基本単位がα1,4グリコシド結合により2個以上結合した構造を指称する。本発明DNAがコードする部分ポリペプチドは、上記ヘパリン骨格を構成するN-アセチルグルコサミン残基を脱アセチル化する作用（本明細書においては、「NDA活性」ともいう）を有する。
【００１６】
なお、NDA活性を有するとは、部分ポリペプチドをコードするDNAを発現ベクターに挿入して宿主細胞（好ましくは微生物細胞）で発現させたときにその宿主細胞の抽出液においてNDA活性が検出されることをいい、より具体的には、後述の実施例に記載された方法に従ってNDA活性を測定した際に、該活性が検出されることをいう。
【００１７】
本発明DNAは、N-脱アセチル化・N-硫酸基転移酵素(NDST)のポリペプチドにおいて、そのＮ末端領域及びＣ末端領域を欠如したポリペプチドをコードする。Ｎ末端領域及びＣ末端領域は、それらが無いときに、発現により得られるポリペプチドがNDA活性を有する領域である。この様な活性を有するNDSTの部分ポリペプチドを以下「本発明ポリペプチド」と記載する。
【００１８】
Ｎ末端領域は、例えば、NDSTのポリペプチドのＮ末端膜貫通領域及びその領域からＮ末端までの部分を含むＮ末端領域である。Ｎ末端領域は、発現により得られる本発明ポリペプチドがNDA活性を有する限り、膜貫通領域よりＣ末端側の領域を含んでいてもよい。
【００１９】
本発明におけるＮ末端膜貫通領域とは、通常用いられるJ. KyteとR. F. Doolittleのハイドロパシープロット（J. Mol. Biol. 157(1982), 105-132）により、上記NDSTのポリペプチドのアミノ酸配列を解析した際に（ヒト及びラットに由来するNDSTのハイドロパシープロットによる解析結果の例を図１に示す）、疎水性領域として認識される20残基以上のアミノ酸からなる領域であって、一般的にII型膜タンパク質のＮ末端近辺に存在する領域を指称する（図１中の矢印で表した領域）。
【００２０】
Ｃ末端領域は、通常には、NDSTのポリペプチドのN-硫酸基転移酵素(NST)活性を担う領域及びその領域からNDSTのポリペプチドのＣ末端までの部分を含む領域である。Ｃ末端領域は、発現により得られる本発明ポリペプチドがNDA活性を有する限り、さらに長いものであっても短いものであってもよい。
【００２１】
翻訳されるNDSTのポリペプチドのＮ末端及びＣ末端を任意の長さで欠失させること自体は、通常の遺伝子組換え技術によって行うことができるので、本明細書の教示に基づいて、適切なＮ末端領域及びＣ末端領域を特定することは当業者にとって容易である。
【００２２】
また、本発明DNAの翻訳される領域は2000bp（2kbp）以下であることが好ましく、より好ましくは1700bp以下であり、最も好ましくは1600bp以下である。
【００２３】
この様な本発明DNAの好ましい例としては、例えば配列番号１に記載されたラットの塩基配列のうち塩基番号567〜1882又は567〜2116からなるDNA、又は配列番号４に記載されたヒトの塩基配列のうち塩基番号337〜1653又は337〜1887からなるDNA等が例示される。
【００２４】
本発明DNAは、NDA活性を示す本発明ポリペプチドをコードする限り、NDAのDNAの塩基配列（好ましくは配列番号３もしくは６に示す塩基配列又は配列番号３もしくは６の塩基番号１〜１３１７からなる塩基配列）又はそれに相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列を有する2kbp以下のDNAも包含する。このようなDNAも、上述したＮ末端領域に対応する配列を有しない。
【００２５】
尚、上記ストリンジェントな条件下とは、一般にハイブリダイゼーション法による核酸の検出法に用いられる条件を指称するが、例えば37.5％ホルムアミド、5×SSPE（塩化ナトリウム／リン酸ナトリウム／EDTA（エチレンジアミン四酢酸）緩衝液）、５×デンハルト溶液(Denhardt's solution)、0.5％ SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）存在下での42℃の条件が例示される。
【００２６】
本発明DNAによりコードされる本発明ポリペプチドは、NDA活性が害されない限り、他のポリペプチドと融合した融合タンパク質として調製してもよい。
【００２７】
本発明DNAによりコードされる本発明ポリペプチドは、NDA活性を有し、膜貫通領域を欠如しているので、膜貫通領域欠如型N-アセチルグルコサミン脱アセチル化酵素ともいう。
【００２８】
＜２＞本発明ベクター
本発明ベクターは上述の本発明DNAを含む発現ベクターである。
【００２９】
本発明ベクターは、本発明DNAを発現させることが可能な適当な発現ベクター（ファージベクター或いはプラスミドベクター等）に本発明DNAを導入したベクターである。上述の発現ベクターとしては本発明DNAを発現させる宿主細胞に適したものが選択される。そのような宿主＝ベクター系としては、COS細胞（例えばCOS-1細胞、COS-7細胞）、3LL-HK46細胞などの哺乳類細胞と、pEF-BOS、pCXN2(Niwa, H., Yamanura, K. and Miyazaki, J. (1991) Gene 108, 193-200)、pCMV-2（イーストマン コダック(Eastman Kodak)製）、pCEV18、pME18S（丸山ら,Med. Immunol., 20, 27(1990)）又はpSVL（ファルマシア バイオテック社製）等の哺乳類細胞用発現ベクターの組み合わせ、大腸菌（E. coli）と、pTrcHis（インビトロゲン社製）、pGEX（ファルマシア バイオテック社製）、pTrc99（ファルマシア バイオテック社製）、pKK233-3（ファルマシア バイオテック社製）、pEZZZ18（ファルマシア バイオテック社製）、pCH110（ファルマシア バイオテック社製）、pET（ストラタジーン社製）、pBAD（インビトロゲン社製）、pRSET（インビトロゲン社製）、及びpSE420（インビトロゲン社製）等の原核細胞用の発現ベクターとの組み合わせが挙げられる。その他、宿主細胞として昆虫細胞、酵母、枯草菌などが例示され、これらに対応する各種ベクターが例示される。特に宿主細胞としては大腸菌等の原核細胞が好ましく、ベクターとしてはそのような宿主細胞に本発明DNAを導入することができるファージベクター及びプラスミドベクターが好ましい。
【００３０】
本発明ベクターは、本発明DNAが転写され、ポリペプチドに翻訳された際にNDAとしての活性を示す方向に本発明DNAが挿入されていることが好ましい。また、本発明DNAがコードする本発明ポリペプチドを様々な融合タンパク質として発現させるように本発明ベクターを構築することも可能であるが、本発明ポリペプチドの融合タンパク質のみを発現させ、他の酵素活性を有するポリペプチドとの融合タンパク質を発現をさせないベクターを選択することが好ましい。本発明ベクターが本発明ポリペプチドの融合タンパク質を発現するように構築されている場合は、前記融合タンパク質は、本発明DNAがコードする本発明ポリペプチドと各種タグペプチド（例えばHis、FLAG、Protein A、CBP（Calmodulin Binding Protein）、GST（Glutathione S-Transferase）など）との融合タンパク質であることが好ましい。
【００３１】
また、本発明ベクターには、上述の本発明DNAの他に、NST活性を有するポリペプチドをコードするDNA（以下NST-DNA）を更に含んでも良いが、その場合は、NST-DNAと本発明DNAは上述のように本発明ポリペプチドと硫酸基転移酵素とが融合タンパク質として発現されないように、すなわち、別個のタンパク質として発現するように本発明ベクターを構築する必要がある。このような本発明ベクターを使用して、後述の形質転換体を調製し、これを増殖させることによって、後述の本発明酵素とNSTとの組成物（本発明組成物）を調製することも可能である。
【００３２】
本発明組成物により、例えばN-アセチルヘパロサンを脱アセチル化すると共にN-硫酸化することで、N-硫酸化ヘパロサンを得ることができる。
【００３３】
上記NST-DNAとしては好適には配列番号１の塩基番号1884〜3095もしくは2118〜3095からなる塩基配列を有するDNA、又は配列番号４の塩基番号1654〜2865もしくは1888〜2865からなる塩基配列を有するDNAが例示される。
【００３４】
＜３＞本発明形質転換体
本発明形質転換体は、本発明発現ベクターで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体、すなわち、本発明ベクターにより組換えられ、少なくとも本発明ポリペプチドを発現する形質転換体である。
【００３５】
上記宿主細胞の由来は、微生物の他、ほ乳類、鳥類、は虫類、甲殻類、昆虫類などでもよいが、特に増殖速度が速いことと、培養が容易であることから微生物が好ましく、特に大腸菌であることが好ましい。
【００３６】
本発明形質転換体は、常法に従って本発明ベクターを用いて宿主細胞を形質転換することにより容易に調製することができる。
【００３７】
尚、本発明形質転換体を増殖させることによって、本発明ポリペプチドを大量に発現させることが可能である。この増殖は形質転換体に応じて培養液等で行うことができるが、生体内で細胞を増殖させてもよい。
【００３８】
本発明形質転換体を培養液等の培地で増殖させる場合を培養と称するが、このような培養によって得られた培養物は、本発明形質転換体を、本発明DNAが発現するのに適した条件で培養することにより得ることができる。培養物（通常には培養後の培地及び細胞）から、酵素の精製に通常に使用される方法を組み合わせることによって、本発明酵素を得ることができる。
【００３９】
＜４＞本発明酵素
本発明酵素は、本発明形質転換体の増殖により得られうる酵素であって、ヘパリン骨格を有する糖鎖のN-アセチルグルコサミン残基を脱アセチル化する作用を有する膜貫通領域欠如型N-アセチルグルコサミン脱アセチル化酵素である。
【００４０】
本発明酵素は、本発明DNAによってコードされる本発明ポリペプチドを含み、通常には、公知のNDSTからそのＮ末端領域及びＣ末端領域が欠失した構造、例えば、公知のNDSTのNDA領域であって、該領域からＮ末端膜貫通領域及びＮ末端細胞内領域を欠失した構造を有する酵素である。
従って、本発明酵素は、公知のNDSTとは異なりNST活性を有しない。
【００４１】
このような本発明酵素のポリペプチド（すなわち、本発明ポリペプチド）のアミノ酸配列は配列番号２で示されるラットのNDSTのポリペプチドのアミノ酸番号41乃至479もしくは同41乃至557、又は配列番号５で示されるヒトのNDSTのポリペプチドのアミノ酸番号41乃至479、又は同41乃至557からなるポリペプチドが好ましくは例示されるが、上記酵素学的特徴及び構造的特徴を具備する限りにおいて特に限定はされない。
【００４２】
＜５＞本発明DNA等の調製法
本発明DNA、本発明発現ベクター、本発明形質転換体及び本発明酵素は、例えば下記調製法により調製することが可能である。
【００４３】
(1)全RNAの調製
本発明DNAは、NDSTを発現する細胞、好ましくはほ乳類の細胞の全RNAから調製することが可能である。そのような細胞としては例えば肝臓、脳などの動物の組織が好適である。これらの組織はほ乳類の組織であることが好ましく、より好ましくはヒト、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ヤギ、ブタ、マウス、ラット、及びモルモットがあげられるが、特に限定はされない。
【００４４】
全RNAの調製は、例えばトリアゾール試薬などを用いた方法、グアニジン・ホットフェノール法等の常法に従って行うことができる。
【００４５】
(2)全RNAから、本発明DNAの選択的増幅
(1)により得られた全RNAを用いてRT-PCR法等によって本発明DNAを選択的に増幅することができる。全RNAをRT-PCR法による増幅に用いてもよいが、オリゴdTカラム等を用いて予めmRNAのみを精製してRT-PCR法に用いてもよい。
【００４６】
具体的には、逆転写反応により合成されたcDNAを用いて、例えばPCR法の様な常法により本発明DNAを調製することができる。上記cDNAを鋳型としてPCR法により本発明DNAを増幅する場合は、目的とする本発明DNAの両端の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を有するプライマーを用いることが好ましい。このようなプライマーの好ましい例としては配列番号８（ラット用プライマー2）又は配列番号14（ヒト用プライマー２）に示す塩基配列を有するものと、配列番号12（ラット用プライマー6）、配列番号18（ヒト用プライマー6）、配列番号19（ヒト用プライマー7）又は配列番号13（ラット用プライマー7）に示す塩基配列を有するものとの組み合わせが挙げられる。このようにして特異的に増幅された本発明DNAは、例えばゲル電気泳動などの分子サイズや電荷などによる振り分け手段により分画し、目的の画分を常法に従って回収することができる。
【００４７】
(3)本発明DNAからの本発明ベクターの調製
上記で得られた本発明DNAを、宿主細胞に適した適当なベクターに常法に従って挿入する。例えば本発明DNAを大腸菌に導入する場合は、大腸菌において発現可能な発現ベクターに本発明DNAを挿入する。大腸菌TOP10株の場合はpTrcHisなどの発現ベクターが例示される。
【００４８】
(4)宿主細胞からの本発明酵素の調製
上記本発明ベクターの宿主細胞への導入は常法に従って行うことができる。例えば上述のpTrcHisに本発明を導入した本発明ベクターを使用して、本発明酵素の調製を行う場合は、本発明ベクターで例えば大腸菌TOP10を形質転換した後、アンピシリンを含有する培地（例えばLB培地など）で培養し、例えば37℃で5時間培養した後にイソプロピルチオ-β-D-ガラクトシド（IPTG）を添加して更に適当な条件（例えば37℃で3時間）培養する。培養液を分離して遠心分離し、菌体を回収した後、常法によりリン酸緩衝液で菌体を洗浄し、例えば凍結融解法等により菌体を破砕する。この菌体破砕液から本発明酵素を精製することが可能である。上記pTrcHisを使用して創製した本発明ベクターを使用する本発明酵素の調製法の態様においては、本発明酵素はタグペプチドであるHisタグとの融合タンパク質として発現しているため、例えば磁性ニッケルアガロースビーズを担体として使用するアフィニティークロマトグラフィーなどの方法により容易に本発明酵素を精製することが可能であり、また、抗His抗体を用いることで、容易に本発明酵素を識別することが可能である。
【００４９】
【実施例】
以下に、本発明を実施例により更に具体的に説明する。
【００５０】
＜１＞DNAフラグメントと発現用プラスミドの調製
ラット肝臓を採取し直ちに液体窒素で凍結しホモゲナイズした後、トリアゾール試薬（ギブコBRL社製）による方法で全RNAを抽出した。この全RNAからオリゴ(dT)-celluloseカラム（ファルマシア社製）を用いる方法でmRNAを精製した。このラット肝臓由来mRNA、オリゴ(dT)12-18あるいはランダムプライマー及び逆転写酵素（ギブコBRL社製）を用いて、55℃で60分間逆転写反応を行った後、リボヌクレアーゼ（RNase）H（ギブコBRL社製）でRNAを切断除去して、cDNAを調製した。
【００５１】
上記で得られたcDNAを鋳型として、pfu-DNAポリメラーゼ（ストラタジーン社製）を用いて、表１に示すセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを組み合わせて、PCR法を行い、それぞれ両端にHindIII切断配列を持つDNAフラグメントを増幅した。PCR反応は、まず94℃１分間の変性後、94℃で45秒間の変性、58℃で30秒間のアニーリング及び74℃で3分間の伸長からなる増幅反応を25サイクル行い、最後に74℃で10分間の伸長を行う条件で行った。このPCR反応液を、1.2% アガロースゲル電気泳動に付した後、Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）を使って精製し、各NDSTのDNAフラグメントを含むPCR産物を調製した（表１）。
【００５２】
【表１】
【００５３】
尚、ヒト由来のNDST（ヒト由来のNDSTをコードする塩基配列を配列番号４に示す）に関して同様に逆転写PCR法を行う場合、例えばヒトの脳、肝臓等の組織から抽出した全RNA又はmRNAを用い、プライマー１を配列番号14、プライマー２を配列番号15、プライマー３を配列番号16、プライマー４を配列番号17、プライマー６を配列番号19、プライマー７を配列番号18に示す塩基配列を有するものにそれぞれ変更することで同様に行うことができる。
【００５４】
各PCR産物を制限酵素HindIIIで処理し、挿入用DNAフラグメントを調製した。大腸菌発現ベクターpTrcHis（インビトロゲン社製）を制限酵素HindIIIで処理し、更に仔ウシ小腸由来アルカリ性フォスファターゼ（CIAP；NEB社製）で処理した後、上記制限酵素処理DNAフラグメントとT4DNAリガーゼ（NEB社製）を用いて連結（16℃、16時間）し、大腸菌コンピテント細胞（TOP10株）に導入してトランスフォーメーションし、アンピシリン耐性の陽性コロニーをクローニングした。クローニングした大腸菌からプラスミドを精製し、PCRや制限酵素処理、及び塩基配列の解析を行い、挿入DNAフラグメントが正方向で、タンパク質発現コドンのフレームが正しく入っている目的の発現プラスミドが導入された以下の大腸菌クローンを選択した。
【００５５】
【表２】
【００５６】
＜２＞組換えタンパク質の発現
＜１＞でクローニングされた各々の発現プラスミドを持つ大腸菌をアンピシリン（50 μg/ml）含有LB培地（50 ml）にて37℃で5時間培養し、イソプロピルチオ-β-D-ガラクトシド (IPTG)を最終濃度1 mMとなるように添加して更に37℃で３時間培養して、それぞれの組換えタンパク質の発現を誘導した。培養液を一部(1.5 ml) 採り、遠心分離で菌体を集め、20 mMのリン酸緩衝液（pH 7）100μlで懸濁し、液体窒素と40℃の水浴に交互に投入することによる凍結融解を３回繰り返して得た細胞懸濁液を、10%SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、ニトロセルロース膜を用いてウエスタンブロッティングを行った。発現された組換えタンパク質は、６残基のヒスチジンからなるHisタグを有している融合タンパク質なので、抗His抗体（QIAGEN社製）を用いた染色で確認することができる。
【００５７】
【表３】
【００５８】
発現タンパク質のうち、His-A, His-B, His-C及びHis-Dは予想される分子量位置でのバンドは実質的に検出されなかった。この原因としては発現量が少ないか、分解されたか、極端に不溶化された等が考え得るが、His-E、His-F、His-G、His-Hはバンドが現れたので分解されたという可能性は低く、又、膜貫通領域を有しないHis-Bもバンドが検出されなかったことから極端に不溶化されている可能性も低いと考えられる。これらの結果よりNDAのポリペプチド及びNSTのポリペプチドの両方のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド及び膜貫通領域を有するNDAのポリペプチドは活性を有する酵素を大量に調製する目的には適さないことが判明した。しかし、発現タンパク質His-E, His-F, His-G及びHis-Hははっきりした抗His抗体陽性バンドが、予想される分子量位置に見られ、目的の組換えタンパク質が生産されていることが分かった。
【００５９】
＜３＞NDA及びNSTの大腸菌発現用ベクターの構築
同種の（同一の複製起点を持つ）プラスミドは一細胞に一種類しか保持されないとする不和合性の原則があり（新遺伝子操作の基礎技術 (1996) 太田美智男編、菜根出版；p23）、同一大腸菌に両酵素活性を同時に発現させるためには、複製起点の異なるプラスミドを２種類使うか、一つのプラスミドに、翻訳され得る２種のタンパク質をコードするDNA配列を別々のポリペプチドを発現するように並べて挿入することが考えられる。本実施例では、後者の方法を検討した。
【００６０】
プラスミドpTrcHis-Eを鋳型として、プライマー8（塩基配列を配列番号20に示す）とプライマー9（塩基配列を配列番号21に示す）を用いて、PCR法により両端に制限酵素NcoI切断配列を持つHis-Eに相当するDNAフラグメントを増幅した。PCR反応は、合成酵素としてpfu-DNAポリメラーゼ（ストラタジーン社製）を用い、まず94℃，１分間の変性後、94℃，45秒間の変性、55℃，30秒間のアニーリング及び74℃, 1分50秒の伸長からなる増幅反応を10サイクル行い、次いで94℃，45秒間の変性、58℃，30秒間のアニーリング及び74℃, 1分50秒の伸長からなる増幅反応を20サイクル行い、最後に74℃，10分間の伸長を行う条件で行った。そのPCR反応液を、1.2% アガロースゲル電気泳動に付した後、Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）を使って精製し、各NDSTのDNAフラグメントを含むPCR産物を調製した。更にNcoIで処理して、挿入用DNAフラグメントを作成した。
【００６１】
プラスミドpTrcHis-H(2μg)をNcoI(50 U)で37℃において３時間処理した後、仔ウシ小腸由来アルカリ性フォスファターゼ（CIAP；NEB社製）で処理した。その開環プラスミドと上記制限酵素処理DNAフラグメントをT4DNAリガーゼ（NEB社製）を用いて連結（16℃、16時間）し、大腸菌コンピテント細胞（TOP10株）に導入してトランスフォーメーションし、アンピシリン耐性の陽性コロニーをクローニングした。クローニングした大腸菌からプラスミドを精製し、PCRや制限酵素処理、及び塩基配列の解析を行い、挿入DNAフラグメントが正方向で、タンパク質発現コドンのフレームが正しく入っている目的の発現プラスミド（pTrcHis-E:His-H）が導入された大腸菌をクローニングした。なお、プライマー９には、リボソーム結合サイトであるSD配列に相当する配列があり、得られた発現プラスミド中のHis-Hに相当する翻訳配列のすぐ上流にもSD配列が存在するように設計されている。
【００６２】
得られた発現プラスミドを持つ大腸菌を、＜２＞と同様に操作して組換えタンパク質発現を誘導させ、ウエスタンブロッティングを行ったところ、His-E(64 kDa)及びHis-H(43 kDa)に相当するバンドが見られ、両タンパク質（His-E及びHis-H）とも発現されていることが示された。
【００６３】
＜４＞酵素活性の測定
＜２＞及び＜３＞で得られた組換えタンパク質誘導大腸菌培養液を遠心処理して菌体を分離し、2 mlの酵素用緩衝液（10 mM TrisHCl pH 7.5, 0.1% Triton X100,10 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 20% グリセロール, 50 mM NaCl）を加え、氷冷下30秒３回超音波処理して菌体を破壊し、細胞懸濁液を調製した。これらを酵素液として用いた。酵素活性の測定には、受容体基質としてNST活性にはCDS（全脱硫酸化）-ヘパリン（生化学工業株式会社製）を、NDA活性とNST活性のカップリング活性にはK5（N-アセチルヘパロザン；大腸菌K5株から調製した莢膜多糖体）を各50μg/バイアル用いた。供与体基質としては[35S]-PAPS（3'-ホスホアデノシン5'-ホスホ硫酸；NEN社製）を１nmol（約 1.6μCi）/バイアル用い、50 mM HEPES (pH 7)、0.15 M NaCl, 0.75 mg/ml プロタミン塩酸を含む緩衝液中（全量 50μl/バイアル）で、上記酵素液は５ないし10μlを用いた。酵素反応は37℃で20分間行い、反応液をエタノール沈殿後、蒸留水20μlに懸濁し濾紙（東洋濾紙No.50）にスポットし、エタノール：1 M 酢酸アンモニウム混液（65:35(v/v)）を展開溶媒とした濾紙クロマトグラフィーを行い（室温２日間）、PAPSから高分子受容体基質に転移された硫酸基の量を、原点に残った[35S]-硫酸の放射活性を測定することで求めた。結果を表４に示す。
【００６４】
【表４】
【００６５】
以上により、His-GおよびHis-HはNST活性を持ち、それらと組み合わせてカップリング活性が出ることから、His-EとHis-FはNDA活性を持つことが分かった。また、His-EとHis-Hを共に別々のポリペプチドとして発現する大腸菌由来の酵素液(His-E:His-H)はNDA活性とNST活性の両活性を持つことが分かった。
【００６６】
【発明の効果】
本発明により、微生物においても発現可能な、NDAをコードするDNA及びそれを含むベクター等が提供され、NDAを大量調製することが可能となった。
【００６７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ヒト及びラットのNDSTのハイドロパシープロットを示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、形質転換体において発現しうるN-アセチルグルコサミン脱アセチル化酵素をコードするDNAに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヘパリン及びヘパラン硫酸は硫酸化グリコサミノグリカンの一種であり、抗血液凝固活性、平滑筋増殖抑制活性、増殖因子・サイトカインなどとの特異的な結合活性、ならびに細胞増殖・分化の調節、創傷治癒過程の調節、及び組織形成の調節など広範囲で重要な生物機能を担っている。その基本骨格は、ヘキスロン酸とグルコサミンの二糖繰り返し構造であり、具体的には、通常、ヘキスロン酸α又はβ1-4グルコサミンからなる二糖がα1-4結合した繰り返し構造を基本骨格としている。
【０００３】
ヘパリン及びヘパラン硫酸は、通常、動物の臓器、組織などから抽出することにより調製されており、微生物による生産には成功していない。
【０００４】
ヘパリン及びヘパラン硫酸の生合成においては、グルクロン酸とN-アセチルグルコサミンが結合した基本骨格が生成した後、N-アセチルグルコサミン残基の脱アセチル化・N-硫酸化、グルクロン酸残基のC5エピメリ化（グルクロン酸のイズロン酸化）、グルクロン酸残基又はイズロン酸残基の2-O硫酸化、グルコサミン残基の6-O硫酸化、3-O硫酸化などの修飾を受ける。
【０００５】
このようなヘパリン及びヘパラン硫酸の生合成において、N-アセチルグルコサミン残基のN-脱アセチル化およびN-硫酸化は修飾反応の最初のステップであり、この反応が起こらなければ他の修飾反応は起こらないとされている。従って、脱アセチル化及びN-硫酸化のステップが人工的なヘパリン及びヘパラン硫酸合成において必須の過程であるといえる。
【０００６】
このN-脱アセチル化とN-硫酸化を触媒する酵素は、現在知られている限りは単一の分子で２種類の酵素活性を示すタンパク質として発現しており、N-アセチルグルコサミンN-脱アセチル化・N-硫酸基転移酵素（以下「NDST」とも記載する）と命名されている。この酵素の構造は他のグリコサミノグリカンの硫酸基転移酵素と同様にII型膜タンパク質であり、アミノ末端（以下「Ｎ末端」とも記載）近辺の領域に疎水性アミノ酸が集まった膜貫通ドメインがある。カルボキシル末端（以下「Ｃ末端」とも記載）側はN-硫酸基転移酵素（以下「NST」とも記載する）活性部分であることが知られており、硫酸基供与基質である活性硫酸（PAPS）に特異的な２ヶ所の結合ドメイン（5'-ホスホ硫酸結合ドメインと3'-リン酸結合ドメイン）が存在している（Sueyoshi T., et al. (1998) FEBS Lett. 433,211-4）。N末端側には、N-脱アセチル化酵素（以下「NDA」とも記載する）活性部分が存在すると考えられており、脱アセチル化酵素の共通構造があると言われている（Berninsone P., et al.(1998) J. Biol. Chem. 273, 25556-9）。
【０００７】
NDSTは、現在までに４種類見つかっており、NDST-1（ラット(rNDST-1)；Hashimoto Y., et al. (1992) J. Biol. Chem. 267, 15744-15750、ヒト(hNDST-1)；Dixon J., et al. (1995) Genomics 26, 239-244）、NDST-2（Orellana A., et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 2270-6、Toma L., et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 22458-65）、NDST-3（Aikawa J., et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 2690-5）、NDST-4（Aikawa J., et al. (1999) Glycoconj. J. 16, S40）などの報告がある（これらをまとめて単に「NDST」と以下標記する）。遺伝子操作によるこれらの酵素の組換えタンパク質の発現については、動物細胞では全構造の発現がすでに報告されている（例えば、Cheung W.F., et al. (1996) Biochemistry 35, 5250-6、Pikas D.S., et al. (2000) Biochemistry 39, 4552-8）。しかし、動物細胞で発現させる場合、その生産量は低く、製造コストも掛かるため、工業的な生産を行うには不向きである。
【０００８】
そこで生産性の高い微生物、例えば大腸菌にNDSTの遺伝子を導入し、酵素を生産させる試みもなされているが（Sueyoshi T., et al. (1998) FEBS Letter 433, 211-4、Kakuta Y., et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 10673-6）、C末端側のN-硫酸基転移酵素活性部分のみしか発現には成功しておらず、全構造の発現は不可能であった。そこでN末端側のN-脱アセチル化酵素活性を有すると思われる領域を融合タンパク質として発現させることも試みられているが、活性を有するタンパク質の発現には成功しておらず（Berninsone P., et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 25556-9）、N-脱アセチル化酵素活性を担うと考えられる領域の微生物での発現は不可能であると考えられている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
従って、ヘパリン及びヘパラン硫酸の遺伝子組換えによる調製を工業的規模で行う上で必要とされるNDSTの発現及びNDA活性を担う領域の単独での発現は未だに成功していない。そこで、本発明は、特に、NDAを効率よく得ることを課題とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、微生物にヘパリン及びヘパラン硫酸を効率的に合成させるために必要なNDA活性を発現させるべく、鋭意検討した結果、NDSTのN-脱アセチル化酵素活性領域及びN-硫酸化酵素活性領域のそれぞれをコードするDNAの領域を特定し、更にNDSTのN末端の膜貫通領域を含む領域及びC末端のN-硫酸化酵素活性領域を含む領域を除去し、適当な微生物発現ベクターと結合させることにより、NDA活性を維持した組換えタンパク質が微生物において発現することを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１） 配列番号３、配列番号６、配列番号３の塩基番号１〜１３１７、又は配列番号６の塩基番号１〜１３１７に示す塩基配列からなるＤＮＡ。
（２） （１）に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
（３） グルコサミン残基のアミノ基に硫酸基を転移する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを更に含む（２）に記載の発現ベクター。
（４） （２）又は（３）に記載の発現ベクターで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
（５） 宿主細胞が微生物である（４）に記載の形質転換体。
（６） 微生物が大腸菌である（５）記載の形質転換体。
（７） （４）乃至（６）のいずれかに記載の形質転換体の増殖により得られる酵素であって、ヘパリン骨格を有する糖鎖のN-アセチルグルコサミン残基を脱アセチル化する作用を有する膜貫通領域欠如型N-アセチルグルコサミン脱アセチル化酵素。
（８） 配列番号２のアミノ酸番号４１〜４７９、配列番号２のアミノ酸番号４１〜５５７、配列番号５のアミノ酸番号４１〜４７９、又は配列番号５のアミノ酸番号４１〜５５７に示すポリペプチドからなるＮ−アセチルグルコサミン脱アセチル化酵素。
（９） （７）又は（８）に記載の膜貫通領域欠如型N-アセチルグルコサミン脱アセチル化酵素と、N-硫酸基転移酵素とを含む組成物。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明をその実施の形態により詳細に説明する。
【００１３】
＜１＞本発明DNA
本発明DNAは、NDSTのポリペプチドの部分ポリペプチドをコードするDNAであって、該DNAを発現ベクターに挿入して発現させた際に得られる該部分ポリペプチドが、ヘパリン骨格を有する糖鎖のN-アセチルグルコサミン残基を脱アセチル化する作用を有し得る程度に、NDSTのポリペプチドのＮ末端領域及びＣ末端領域を有しないことを特徴とするDNAである。
【００１４】
N-脱アセチル化・N-硫酸基転移酵素とは、ヘパリン骨格を有する糖鎖のN-アセチルグルコサミン残基のN-脱アセチル化およびN-硫酸化の両方の反応を触媒する酵素であり、２種類の酵素活性を示す単一のポリペプチドからなるものを意味する。
【００１５】
本明細書中におけるヘパリン骨格とはヘキスロン酸とグルコサミンがα又はβ1,4グリコシド結合した二糖を基本単位とし、特にこの基本単位がα1,4グリコシド結合により2個以上結合した構造を指称する。本発明DNAがコードする部分ポリペプチドは、上記ヘパリン骨格を構成するN-アセチルグルコサミン残基を脱アセチル化する作用（本明細書においては、「NDA活性」ともいう）を有する。
【００１６】
なお、NDA活性を有するとは、部分ポリペプチドをコードするDNAを発現ベクターに挿入して宿主細胞（好ましくは微生物細胞）で発現させたときにその宿主細胞の抽出液においてNDA活性が検出されることをいい、より具体的には、後述の実施例に記載された方法に従ってNDA活性を測定した際に、該活性が検出されることをいう。
【００１７】
本発明DNAは、N-脱アセチル化・N-硫酸基転移酵素(NDST)のポリペプチドにおいて、そのＮ末端領域及びＣ末端領域を欠如したポリペプチドをコードする。Ｎ末端領域及びＣ末端領域は、それらが無いときに、発現により得られるポリペプチドがNDA活性を有する領域である。この様な活性を有するNDSTの部分ポリペプチドを以下「本発明ポリペプチド」と記載する。
【００１８】
Ｎ末端領域は、例えば、NDSTのポリペプチドのＮ末端膜貫通領域及びその領域からＮ末端までの部分を含むＮ末端領域である。Ｎ末端領域は、発現により得られる本発明ポリペプチドがNDA活性を有する限り、膜貫通領域よりＣ末端側の領域を含んでいてもよい。
【００１９】
本発明におけるＮ末端膜貫通領域とは、通常用いられるJ. KyteとR. F. Doolittleのハイドロパシープロット（J. Mol. Biol. 157(1982), 105-132）により、上記NDSTのポリペプチドのアミノ酸配列を解析した際に（ヒト及びラットに由来するNDSTのハイドロパシープロットによる解析結果の例を図１に示す）、疎水性領域として認識される20残基以上のアミノ酸からなる領域であって、一般的にII型膜タンパク質のＮ末端近辺に存在する領域を指称する（図１中の矢印で表した領域）。
【００２０】
Ｃ末端領域は、通常には、NDSTのポリペプチドのN-硫酸基転移酵素(NST)活性を担う領域及びその領域からNDSTのポリペプチドのＣ末端までの部分を含む領域である。Ｃ末端領域は、発現により得られる本発明ポリペプチドがNDA活性を有する限り、さらに長いものであっても短いものであってもよい。
【００２１】
翻訳されるNDSTのポリペプチドのＮ末端及びＣ末端を任意の長さで欠失させること自体は、通常の遺伝子組換え技術によって行うことができるので、本明細書の教示に基づいて、適切なＮ末端領域及びＣ末端領域を特定することは当業者にとって容易である。
【００２２】
また、本発明DNAの翻訳される領域は2000bp（2kbp）以下であることが好ましく、より好ましくは1700bp以下であり、最も好ましくは1600bp以下である。
【００２３】
この様な本発明DNAの好ましい例としては、例えば配列番号１に記載されたラットの塩基配列のうち塩基番号567〜1882又は567〜2116からなるDNA、又は配列番号４に記載されたヒトの塩基配列のうち塩基番号337〜1653又は337〜1887からなるDNA等が例示される。
【００２４】
本発明DNAは、NDA活性を示す本発明ポリペプチドをコードする限り、NDAのDNAの塩基配列（好ましくは配列番号３もしくは６に示す塩基配列又は配列番号３もしくは６の塩基番号１〜１３１７からなる塩基配列）又はそれに相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列を有する2kbp以下のDNAも包含する。このようなDNAも、上述したＮ末端領域に対応する配列を有しない。
【００２５】
尚、上記ストリンジェントな条件下とは、一般にハイブリダイゼーション法による核酸の検出法に用いられる条件を指称するが、例えば37.5％ホルムアミド、5×SSPE（塩化ナトリウム／リン酸ナトリウム／EDTA（エチレンジアミン四酢酸）緩衝液）、５×デンハルト溶液(Denhardt's solution)、0.5％ SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）存在下での42℃の条件が例示される。
【００２６】
本発明DNAによりコードされる本発明ポリペプチドは、NDA活性が害されない限り、他のポリペプチドと融合した融合タンパク質として調製してもよい。
【００２７】
本発明DNAによりコードされる本発明ポリペプチドは、NDA活性を有し、膜貫通領域を欠如しているので、膜貫通領域欠如型N-アセチルグルコサミン脱アセチル化酵素ともいう。
【００２８】
＜２＞本発明ベクター
本発明ベクターは上述の本発明DNAを含む発現ベクターである。
【００２９】
本発明ベクターは、本発明DNAを発現させることが可能な適当な発現ベクター（ファージベクター或いはプラスミドベクター等）に本発明DNAを導入したベクターである。上述の発現ベクターとしては本発明DNAを発現させる宿主細胞に適したものが選択される。そのような宿主＝ベクター系としては、COS細胞（例えばCOS-1細胞、COS-7細胞）、3LL-HK46細胞などの哺乳類細胞と、pEF-BOS、pCXN2(Niwa, H., Yamanura, K. and Miyazaki, J. (1991) Gene 108, 193-200)、pCMV-2（イーストマン コダック(Eastman Kodak)製）、pCEV18、pME18S（丸山ら,Med. Immunol., 20, 27(1990)）又はpSVL（ファルマシア バイオテック社製）等の哺乳類細胞用発現ベクターの組み合わせ、大腸菌（E. coli）と、pTrcHis（インビトロゲン社製）、pGEX（ファルマシア バイオテック社製）、pTrc99（ファルマシア バイオテック社製）、pKK233-3（ファルマシア バイオテック社製）、pEZZZ18（ファルマシア バイオテック社製）、pCH110（ファルマシア バイオテック社製）、pET（ストラタジーン社製）、pBAD（インビトロゲン社製）、pRSET（インビトロゲン社製）、及びpSE420（インビトロゲン社製）等の原核細胞用の発現ベクターとの組み合わせが挙げられる。その他、宿主細胞として昆虫細胞、酵母、枯草菌などが例示され、これらに対応する各種ベクターが例示される。特に宿主細胞としては大腸菌等の原核細胞が好ましく、ベクターとしてはそのような宿主細胞に本発明DNAを導入することができるファージベクター及びプラスミドベクターが好ましい。
【００３０】
本発明ベクターは、本発明DNAが転写され、ポリペプチドに翻訳された際にNDAとしての活性を示す方向に本発明DNAが挿入されていることが好ましい。また、本発明DNAがコードする本発明ポリペプチドを様々な融合タンパク質として発現させるように本発明ベクターを構築することも可能であるが、本発明ポリペプチドの融合タンパク質のみを発現させ、他の酵素活性を有するポリペプチドとの融合タンパク質を発現をさせないベクターを選択することが好ましい。本発明ベクターが本発明ポリペプチドの融合タンパク質を発現するように構築されている場合は、前記融合タンパク質は、本発明DNAがコードする本発明ポリペプチドと各種タグペプチド（例えばHis、FLAG、Protein A、CBP（Calmodulin Binding Protein）、GST（Glutathione S-Transferase）など）との融合タンパク質であることが好ましい。
【００３１】
また、本発明ベクターには、上述の本発明DNAの他に、NST活性を有するポリペプチドをコードするDNA（以下NST-DNA）を更に含んでも良いが、その場合は、NST-DNAと本発明DNAは上述のように本発明ポリペプチドと硫酸基転移酵素とが融合タンパク質として発現されないように、すなわち、別個のタンパク質として発現するように本発明ベクターを構築する必要がある。このような本発明ベクターを使用して、後述の形質転換体を調製し、これを増殖させることによって、後述の本発明酵素とNSTとの組成物（本発明組成物）を調製することも可能である。
【００３２】
本発明組成物により、例えばN-アセチルヘパロサンを脱アセチル化すると共にN-硫酸化することで、N-硫酸化ヘパロサンを得ることができる。
【００３３】
上記NST-DNAとしては好適には配列番号１の塩基番号1884〜3095もしくは2118〜3095からなる塩基配列を有するDNA、又は配列番号４の塩基番号1654〜2865もしくは1888〜2865からなる塩基配列を有するDNAが例示される。
【００３４】
＜３＞本発明形質転換体
本発明形質転換体は、本発明発現ベクターで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体、すなわち、本発明ベクターにより組換えられ、少なくとも本発明ポリペプチドを発現する形質転換体である。
【００３５】
上記宿主細胞の由来は、微生物の他、ほ乳類、鳥類、は虫類、甲殻類、昆虫類などでもよいが、特に増殖速度が速いことと、培養が容易であることから微生物が好ましく、特に大腸菌であることが好ましい。
【００３６】
本発明形質転換体は、常法に従って本発明ベクターを用いて宿主細胞を形質転換することにより容易に調製することができる。
【００３７】
尚、本発明形質転換体を増殖させることによって、本発明ポリペプチドを大量に発現させることが可能である。この増殖は形質転換体に応じて培養液等で行うことができるが、生体内で細胞を増殖させてもよい。
【００３８】
本発明形質転換体を培養液等の培地で増殖させる場合を培養と称するが、このような培養によって得られた培養物は、本発明形質転換体を、本発明DNAが発現するのに適した条件で培養することにより得ることができる。培養物（通常には培養後の培地及び細胞）から、酵素の精製に通常に使用される方法を組み合わせることによって、本発明酵素を得ることができる。
【００３９】
＜４＞本発明酵素
本発明酵素は、本発明形質転換体の増殖により得られうる酵素であって、ヘパリン骨格を有する糖鎖のN-アセチルグルコサミン残基を脱アセチル化する作用を有する膜貫通領域欠如型N-アセチルグルコサミン脱アセチル化酵素である。
【００４０】
本発明酵素は、本発明DNAによってコードされる本発明ポリペプチドを含み、通常には、公知のNDSTからそのＮ末端領域及びＣ末端領域が欠失した構造、例えば、公知のNDSTのNDA領域であって、該領域からＮ末端膜貫通領域及びＮ末端細胞内領域を欠失した構造を有する酵素である。
従って、本発明酵素は、公知のNDSTとは異なりNST活性を有しない。
【００４１】
このような本発明酵素のポリペプチド（すなわち、本発明ポリペプチド）のアミノ酸配列は配列番号２で示されるラットのNDSTのポリペプチドのアミノ酸番号41乃至479もしくは同41乃至557、又は配列番号５で示されるヒトのNDSTのポリペプチドのアミノ酸番号41乃至479、又は同41乃至557からなるポリペプチドが好ましくは例示されるが、上記酵素学的特徴及び構造的特徴を具備する限りにおいて特に限定はされない。
【００４２】
＜５＞本発明DNA等の調製法
本発明DNA、本発明発現ベクター、本発明形質転換体及び本発明酵素は、例えば下記調製法により調製することが可能である。
【００４３】
(1)全RNAの調製
本発明DNAは、NDSTを発現する細胞、好ましくはほ乳類の細胞の全RNAから調製することが可能である。そのような細胞としては例えば肝臓、脳などの動物の組織が好適である。これらの組織はほ乳類の組織であることが好ましく、より好ましくはヒト、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ヤギ、ブタ、マウス、ラット、及びモルモットがあげられるが、特に限定はされない。
【００４４】
全RNAの調製は、例えばトリアゾール試薬などを用いた方法、グアニジン・ホットフェノール法等の常法に従って行うことができる。
【００４５】
(2)全RNAから、本発明DNAの選択的増幅
(1)により得られた全RNAを用いてRT-PCR法等によって本発明DNAを選択的に増幅することができる。全RNAをRT-PCR法による増幅に用いてもよいが、オリゴdTカラム等を用いて予めmRNAのみを精製してRT-PCR法に用いてもよい。
【００４６】
具体的には、逆転写反応により合成されたcDNAを用いて、例えばPCR法の様な常法により本発明DNAを調製することができる。上記cDNAを鋳型としてPCR法により本発明DNAを増幅する場合は、目的とする本発明DNAの両端の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を有するプライマーを用いることが好ましい。このようなプライマーの好ましい例としては配列番号８（ラット用プライマー2）又は配列番号14（ヒト用プライマー２）に示す塩基配列を有するものと、配列番号12（ラット用プライマー6）、配列番号18（ヒト用プライマー6）、配列番号19（ヒト用プライマー7）又は配列番号13（ラット用プライマー7）に示す塩基配列を有するものとの組み合わせが挙げられる。このようにして特異的に増幅された本発明DNAは、例えばゲル電気泳動などの分子サイズや電荷などによる振り分け手段により分画し、目的の画分を常法に従って回収することができる。
【００４７】
(3)本発明DNAからの本発明ベクターの調製
上記で得られた本発明DNAを、宿主細胞に適した適当なベクターに常法に従って挿入する。例えば本発明DNAを大腸菌に導入する場合は、大腸菌において発現可能な発現ベクターに本発明DNAを挿入する。大腸菌TOP10株の場合はpTrcHisなどの発現ベクターが例示される。
【００４８】
(4)宿主細胞からの本発明酵素の調製
上記本発明ベクターの宿主細胞への導入は常法に従って行うことができる。例えば上述のpTrcHisに本発明を導入した本発明ベクターを使用して、本発明酵素の調製を行う場合は、本発明ベクターで例えば大腸菌TOP10を形質転換した後、アンピシリンを含有する培地（例えばLB培地など）で培養し、例えば37℃で5時間培養した後にイソプロピルチオ-β-D-ガラクトシド（IPTG）を添加して更に適当な条件（例えば37℃で3時間）培養する。培養液を分離して遠心分離し、菌体を回収した後、常法によりリン酸緩衝液で菌体を洗浄し、例えば凍結融解法等により菌体を破砕する。この菌体破砕液から本発明酵素を精製することが可能である。上記pTrcHisを使用して創製した本発明ベクターを使用する本発明酵素の調製法の態様においては、本発明酵素はタグペプチドであるHisタグとの融合タンパク質として発現しているため、例えば磁性ニッケルアガロースビーズを担体として使用するアフィニティークロマトグラフィーなどの方法により容易に本発明酵素を精製することが可能であり、また、抗His抗体を用いることで、容易に本発明酵素を識別することが可能である。
【００４９】
【実施例】
以下に、本発明を実施例により更に具体的に説明する。
【００５０】
＜１＞DNAフラグメントと発現用プラスミドの調製
ラット肝臓を採取し直ちに液体窒素で凍結しホモゲナイズした後、トリアゾール試薬（ギブコBRL社製）による方法で全RNAを抽出した。この全RNAからオリゴ(dT)-celluloseカラム（ファルマシア社製）を用いる方法でmRNAを精製した。このラット肝臓由来mRNA、オリゴ(dT)12-18あるいはランダムプライマー及び逆転写酵素（ギブコBRL社製）を用いて、55℃で60分間逆転写反応を行った後、リボヌクレアーゼ（RNase）H（ギブコBRL社製）でRNAを切断除去して、cDNAを調製した。
【００５１】
上記で得られたcDNAを鋳型として、pfu-DNAポリメラーゼ（ストラタジーン社製）を用いて、表１に示すセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを組み合わせて、PCR法を行い、それぞれ両端にHindIII切断配列を持つDNAフラグメントを増幅した。PCR反応は、まず94℃１分間の変性後、94℃で45秒間の変性、58℃で30秒間のアニーリング及び74℃で3分間の伸長からなる増幅反応を25サイクル行い、最後に74℃で10分間の伸長を行う条件で行った。このPCR反応液を、1.2% アガロースゲル電気泳動に付した後、Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）を使って精製し、各NDSTのDNAフラグメントを含むPCR産物を調製した（表１）。
【００５２】
【表１】
尚、ヒト由来のNDST（ヒト由来のNDSTをコードする塩基配列を配列番号４に示す）に関して同様に逆転写PCR法を行う場合、例えばヒトの脳、肝臓等の組織から抽出した全RNA又はmRNAを用い、プライマー１を配列番号14、プライマー２を配列番号15、プライマー３を配列番号16、プライマー４を配列番号17、プライマー６を配列番号19、プライマー７を配列番号18に示す塩基配列を有するものにそれぞれ変更することで同様に行うことができる。
【００５４】
各PCR産物を制限酵素HindIIIで処理し、挿入用DNAフラグメントを調製した。大腸菌発現ベクターpTrcHis（インビトロゲン社製）を制限酵素HindIIIで処理し、更に仔ウシ小腸由来アルカリ性フォスファターゼ（CIAP；NEB社製）で処理した後、上記制限酵素処理DNAフラグメントとT4DNAリガーゼ（NEB社製）を用いて連結（16℃、16時間）し、大腸菌コンピテント細胞（TOP10株）に導入してトランスフォーメーションし、アンピシリン耐性の陽性コロニーをクローニングした。クローニングした大腸菌からプラスミドを精製し、PCRや制限酵素処理、及び塩基配列の解析を行い、挿入DNAフラグメントが正方向で、タンパク質発現コドンのフレームが正しく入っている目的の発現プラスミドが導入された以下の大腸菌クローンを選択した。
【００５５】
【表２】
＜２＞組換えタンパク質の発現
＜１＞でクローニングされた各々の発現プラスミドを持つ大腸菌をアンピシリン（50 μg/ml）含有LB培地（50 ml）にて37℃で5時間培養し、イソプロピルチオ-β-D-ガラクトシド (IPTG)を最終濃度1 mMとなるように添加して更に37℃で３時間培養して、それぞれの組換えタンパク質の発現を誘導した。培養液を一部(1.5 ml) 採り、遠心分離で菌体を集め、20 mMのリン酸緩衝液（pH 7）100μlで懸濁し、液体窒素と40℃の水浴に交互に投入することによる凍結融解を３回繰り返して得た細胞懸濁液を、10%SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、ニトロセルロース膜を用いてウエスタンブロッティングを行った。発現された組換えタンパク質は、６残基のヒスチジンからなるHisタグを有している融合タンパク質なので、抗His抗体（QIAGEN社製）を用いた染色で確認することができる。
【００５７】
【表３】
発現タンパク質のうち、His-A, His-B, His-C及びHis-Dは予想される分子量位置でのバンドは実質的に検出されなかった。この原因としては発現量が少ないか、分解されたか、極端に不溶化された等が考え得るが、His-E、His-F、His-G、His-Hはバンドが現れたので分解されたという可能性は低く、又、膜貫通領域を有しないHis-Bもバンドが検出されなかったことから極端に不溶化されている可能性も低いと考えられる。これらの結果よりNDAのポリペプチド及びNSTのポリペプチドの両方のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド及び膜貫通領域を有するNDAのポリペプチドは活性を有する酵素を大量に調製する目的には適さないことが判明した。しかし、発現タンパク質His-E, His-F, His-G及びHis-Hははっきりした抗His抗体陽性バンドが、予想される分子量位置に見られ、目的の組換えタンパク質が生産されていることが分かった。
【００５９】
＜３＞NDA及びNSTの大腸菌発現用ベクターの構築
同種の（同一の複製起点を持つ）プラスミドは一細胞に一種類しか保持されないとする不和合性の原則があり（新遺伝子操作の基礎技術 (1996) 太田美智男編、菜根出版；p23）、同一大腸菌に両酵素活性を同時に発現させるためには、複製起点の異なるプラスミドを２種類使うか、一つのプラスミドに、翻訳され得る２種のタンパク質をコードするDNA配列を別々のポリペプチドを発現するように並べて挿入することが考えられる。本実施例では、後者の方法を検討した。
【００６０】
プラスミドpTrcHis-Eを鋳型として、プライマー8（塩基配列を配列番号20に示す）とプライマー9（塩基配列を配列番号21に示す）を用いて、PCR法により両端に制限酵素NcoI切断配列を持つHis-Eに相当するDNAフラグメントを増幅した。PCR反応は、合成酵素としてpfu-DNAポリメラーゼ（ストラタジーン社製）を用い、まず94℃，１分間の変性後、94℃，45秒間の変性、55℃，30秒間のアニーリング及び74℃, 1分50秒の伸長からなる増幅反応を10サイクル行い、次いで94℃，45秒間の変性、58℃，30秒間のアニーリング及び74℃, 1分50秒の伸長からなる増幅反応を20サイクル行い、最後に74℃，10分間の伸長を行う条件で行った。そのPCR反応液を、1.2% アガロースゲル電気泳動に付した後、Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）を使って精製し、各NDSTのDNAフラグメントを含むPCR産物を調製した。更にNcoIで処理して、挿入用DNAフラグメントを作成した。
【００６１】
プラスミドpTrcHis-H(2μg)をNcoI(50 U)で37℃において３時間処理した後、仔ウシ小腸由来アルカリ性フォスファターゼ（CIAP；NEB社製）で処理した。その開環プラスミドと上記制限酵素処理DNAフラグメントをT4DNAリガーゼ（NEB社製）を用いて連結（16℃、16時間）し、大腸菌コンピテント細胞（TOP10株）に導入してトランスフォーメーションし、アンピシリン耐性の陽性コロニーをクローニングした。クローニングした大腸菌からプラスミドを精製し、PCRや制限酵素処理、及び塩基配列の解析を行い、挿入DNAフラグメントが正方向で、タンパク質発現コドンのフレームが正しく入っている目的の発現プラスミド（pTrcHis-E:His-H）が導入された大腸菌をクローニングした。なお、プライマー９には、リボソーム結合サイトであるSD配列に相当する配列があり、得られた発現プラスミド中のHis-Hに相当する翻訳配列のすぐ上流にもSD配列が存在するように設計されている。
【００６２】
得られた発現プラスミドを持つ大腸菌を、＜２＞と同様に操作して組換えタンパク質発現を誘導させ、ウエスタンブロッティングを行ったところ、His-E(64 kDa)及びHis-H(43 kDa)に相当するバンドが見られ、両タンパク質（His-E及びHis-H）とも発現されていることが示された。
【００６３】
＜４＞酵素活性の測定
＜２＞及び＜３＞で得られた組換えタンパク質誘導大腸菌培養液を遠心処理して菌体を分離し、2 mlの酵素用緩衝液（10 mM TrisHCl pH 7.5, 0.1% Triton X100,10 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 20% グリセロール, 50 mM NaCl）を加え、氷冷下30秒３回超音波処理して菌体を破壊し、細胞懸濁液を調製した。これらを酵素液として用いた。酵素活性の測定には、受容体基質としてNST活性にはCDS（全脱硫酸化）-ヘパリン（生化学工業株式会社製）を、NDA活性とNST活性のカップリング活性にはK5（N-アセチルヘパロザン；大腸菌K5株から調製した莢膜多糖体）を各50μg/バイアル用いた。供与体基質としては[35S]-PAPS（3'-ホスホアデノシン5'-ホスホ硫酸；NEN社製）を１nmol（約 1.6μCi）/バイアル用い、50 mM HEPES (pH 7)、0.15 M NaCl, 0.75 mg/ml プロタミン塩酸を含む緩衝液中（全量 50μl/バイアル）で、上記酵素液は５ないし10μlを用いた。酵素反応は37℃で20分間行い、反応液をエタノール沈殿後、蒸留水20μlに懸濁し濾紙（東洋濾紙No.50）にスポットし、エタノール：1 M 酢酸アンモニウム混液（65:35(v/v)）を展開溶媒とした濾紙クロマトグラフィーを行い（室温２日間）、PAPSから高分子受容体基質に転移された硫酸基の量を、原点に残った[35S]-硫酸の放射活性を測定することで求めた。結果を表４に示す。
【００６４】
【表４】
以上により、His-GおよびHis-HはNST活性を持ち、それらと組み合わせてカップリング活性が出ることから、His-EとHis-FはNDA活性を持つことが分かった。また、His-EとHis-Hを共に別々のポリペプチドとして発現する大腸菌由来の酵素液(His-E:His-H)はNDA活性とNST活性の両活性を持つことが分かった。
【００６６】
【発明の効果】
本発明により、微生物においても発現可能な、NDAをコードするDNA及びそれを含むベクター等が提供され、NDAを大量調製することが可能となった。
【００６７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ヒト及びラットのNDSTのハイドロパシープロットを示す。
Claims (9)
- 配列番号３、配列番号６、配列番号３の塩基番号１〜１３１７、又は配列番号６の塩基番号１〜１３１７に示す塩基配列からなるＤＮＡ。
- 請求項１記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
- グルコサミン残基のアミノ基に硫酸基を転移する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを更に含む請求項２記載の発現ベクター。
- 請求項２又は３に記載の発現ベクターで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
- 宿主細胞が微生物である請求項４記載の形質転換体。
- 微生物が大腸菌である請求項５記載の形質転換体。
- 請求項４乃至６のいずれか１項に記載の形質転換体の増殖により得られる酵素であって、ヘパリン骨格を有する糖鎖のN-アセチルグルコサミン残基を脱アセチル化する作用を有する膜貫通領域欠如型N-アセチルグルコサミン脱アセチル化酵素。
- 配列番号２のアミノ酸番号４１〜４７９、配列番号２のアミノ酸番号４１〜５５７、配列番号５のアミノ酸番号４１〜４７９、又は配列番号５のアミノ酸番号４１〜５５７に示すポリペプチドからなるＮ−アセチルグルコサミン脱アセチル化酵素。
- 請求項７又は８に記載の膜貫通領域欠如型N-アセチルグルコサミン脱アセチル化酵素と、N-硫酸基転移酵素とを含む組成物。
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